JPH02253156A - 分取クロマトグラフィ及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は分取クロマトグラフィ及びその装置に関する
。さらに詳しくは、化学工業、薬品、食品、生化学等の
分野においてクロマトグラフィの手法により分取又はリ
サイクル分取する技術の改良に関する。

（ロ）従来の技術 分取クロマトグラフィは溶出液のクロマトグラムをモニ
タしながら分画を行う方法であるが、この技術において
はしばしば分離カラム、移動相のコストを考慮してリサ
イクル分取クロマトグラフィが用いられる。この方法は
クロマトグラフのカラムから溶出した目的成分を含む溶
出バンドをカラム入り口に再度導入して分離効果を高め
る方法である。

このようなリサイクル分取クロマトグラフィを行う装置
としては基本的には、移動相供給部、試＝４ 料導入部、分離カラム、検出部及び流路切換手段をこの
順に有する分析流路と、該流路の流路切換手段に接続さ
れ該流路から移送される溶出液から所定の目的成分を含
有する溶出液バンド（フラクンヨン）を採取するよう構
成されたフラクションコレクタと、上記流路切換手段か
ら前記分析流路の少なくとも分離カラムの前段に連通ず
るよう設けられるリサイクル流路とからなるものが知ら
れている。

上記装置の検出部では通常、単一波長あるいは屈折計で
例えばベースラインのレベルと傾き等でモニタを行い、
クロマトグラムの形状を監視しながら目的成分のクロマ
トピーク形状からその精製度（以下ピーク精製度という
）を予想して、リサイクル必要回数や分画のタイミング
を判断している。

一方、一般分析においてフォトダイオードアレイ検出器
により多波長吸収データを取り込み、分析後に目的成分
と考えられるピークのいわゆる立ち上がり点、頂点、立
ち下がり点のスペクトル一致度を計算し、これに基づい
て目的成分純度の目安とする方法が行われている。

（ハ）発明が解決しようとする課題 しかしながら、高精製成分であってらオーバロードによ
るピークの変形が生じたり、夾雑成分が未分離であるに
もかかわらず単一ピーク形状を与えることがあり、クロ
マトグラムの形状からピク精製度を正確に判断すること
が困難な場合がある。

また、上記後者で述べたフォトダイオードアレイを分取
クロマトグラフィに応用した場合、ピク精製度をクロマ
トグラフィの分析流路上で判断することができず、分取
を行うためには再度注入する必要がある。これでは操作
上手間であり、時間を要することとなる。

この発明はかかる状況に鑑み為されたものであり、ピー
ク精製度の判断を分取クロマトグラフィの分析流路上で
行いうる分取クロマトグラフィ及びその装置を提供しよ
うとするものである。

（ニ）課題を解決するための手段 かくしてこの発明によれば、所定の目的成分を含有する
試料を液体クロマトグラフィに付し、溶出する液をフォ
トダイオードアレイ検出器を通過さ仕ることにより該溶
液の多波長吸光スペクトルをモニタし、時間、波長、吸
光度をパラメータとする三次元クロマトグラムを記憶し
、上記三次元クロマトグラムの特定の波長についてのク
ロマトグラムを読み出して、目的ピークの上記フォトダ
イオードアレイ検出器通過を検知し、上記目的ピークに
おける立ち上がり、立ち下がり及び頂点の多波長吸光ス
ペクトルを、上記三次元クロマトグラムから読み出して
これらの一致度を判断し、上記判断に基づいて、一致度
が所定値以上の溶出液を採取することを特徴とする分取
クロマトグラフィが提供される。

この発明の分取クロマトグラフィは、ことにリサイクル
分取を行う場合に好適なものである。

この発明の分取クロマトグラフィにおいて、クロマトグ
ラフィに付して得られる溶出液はその三次元クロマトグ
ラムがフォトダイオードアレイ検出器によりモニタされ
る。上記三次元クロマトグラムは、時間、波長及び吸光
度をパラメータとするものである。上記モニタは少なく
とも目的成分の溶出液バンドについて行われ、このモニ
タされる三次元クロマトグラムは記憶される。

目的成分の溶出バンドについてモニタを行う場合、その
モニタ時間は、通常、目的成分の標品の保持時間を基準
としその前後に所定範囲をもって設定される。上記モニ
タは微小時間毎に行われることが好ましく、例えば０．
０１〜１　ｓｅｃ等が挙げられる。

上記記憶された三次元クロマトグラムに対して、特定波
長のクロマトグラムが読み出され、この読み出されたク
ロマトグラムに基づいて目的成分に相当するクロマトピ
ークが検出される。この検出は、例えばピークの傾き、
半値幅、保持時間等のパラメータを設定して行うことが
できる。

上記検出により目的成分のクロマトピークと確認された
ものについて、そのピークの立ち上がり、立ち下がり及
び頂点の多波長吸光スペクトルが再び読み出される。こ
の場合ピーク立ち上がり及び立ち下がりについては、ピ
ーク検出位置に近い方が好ましいが実際はクロマトグラ
ムのベース変動の影響等を排除するため、それぞれの検
出位置からそのピークの頂点に向かう内側の所定（立置
か選択される。これについては後述する実施例の記載が
参照される。

上記のピーク各部について読み出された多波長吸光スペ
クトルは、互いに比較され、そのスペクトルパターンの
一致度が判断される。この一致度は、例えば波形解析等
の手法に基づいて２つの波形パターン間の対応度を数値
的に表わすことにより把握できる。従ってこの得られる
数値に対して所定値（いわゆる閾値）を設定し、この所
定値以上のものを一致と判断することができる。詳しく
は後述する、実施例の記載が参照される。

この発明のクロマトグラフィにおいて、上記スペクトル
パターンの一致度判断で上記のごとき３つの特定位置で
のスペクトルパターンの一致度が所定値以上のとき、更
に、これらのスペクトルパターンのいずれかを、予め記
憶された目的成分の標準スペクトルパターンと比較して
これらの一致度を判断することにより、このピークが目
的成分のピークであると同定しうる手順を含むものであ
ってもよい。

上記のごとく、一致度が所定値以上と判断されたピーク
は、ピーク精製度が高いものと判断され、該ピークに相
当する溶出液バンドは採取されることとなる。

以上のピーク精製度の判断は、カラムから溶出した目的
成分を含む溶出液バンドをカラム入り口部に再度導入し
て分取するリサイクル分取クロマトグラフィに好適なも
のである。

従ってこの発明はまた、移動相供給部、試料導入部、分
離カラム、フォトダイオードアレイ検出器及び流路切換
手段をこの順に有する分析流路と、該流路の流路切換手
段に接続され該流路から移送される溶出液から所定の目
的成分を含有するフラクションを採取するよう構成され
たフラクションコレクタと、上記流路切換手段から前記
分析流路の少なくとも分離カラムの前段に連通ずるよう
設けられる戻し流路と、前記検出器を通過する溶出液を
一旦上記戻し流路に移送して再分離する間に、該検出器
から得られろ上記溶出液のデータに基づいて再分離後の
溶出液を分取しうるよう上記流路切換手段の切換作動を
制御する制御部からなり、上記制御部が、（ａ）上記フ
ォトダイオードアレイ検出部でモニタされる溶出液の時
間、波長及び吸光度をパラメータとする三次元クロマト
グラムを記憶する記憶部と、（ｂ）上記記憶部に記憶さ
れた三次元クロマトグラムから特定波長についてのクロ
マトグラムを読み出して目的ピークを検出し、このピー
クにおける立ち上がり、立ち下がり及び頂点の多波長吸
光スペクトルを上記記憶部から読みだし、これらの多波
長吸光スペクトルのパタンを比較する比較部と、（ｃ）
上記比較部から出力される信号値に基づいてパターンの
一致度を判断する判断部と、（ｄ）上記判断部によって
一致度が所定値以上と判断される溶出液をフラクション
コレクタに移送し、かつ該一致度が所定値に満たない溶
出液を戻し流路に移送しうるよう上記流路切換手段に作
動を指令しうる流路切換手段作動部とから構成されるこ
とを特徴とする分取クロマトグラフ装置を提供すること
ができろ。

この発明の分取クロマトグラフ装置において、戻し流路
は分析流路の少なくとも分離カラムの前段に接続される
。この場合通常の移動相供給部における移動相貯留槽と
送液手段との間に接続されることが好ましい。上記の流
路構成には、当該分野で公知のリサイクル分取が可能に
構成された装置を利用することができる。

この発明の装置において、移動相供給部、試料導入部、
分離カラム及びフラクションコレクタは、当該分野で公
知のものをそのまま用いることができる。また上記分析
流路に設けられる流路切換手段は後述する制御部からの
制御信号に基づいて分別供給しうる構成とする以外は、
当該分野で公知の構成のものを用いることができる。

この発明の装置において上記流路切換手段の切換作動を
制御する制御部は、記憶部、比較部、判＝１２ 断部及び流路切換手段作動部から構成される。上記制御
部は、ＣＰＵを用いて構成されることが好ましＬ’Ｍ。

該制御部では、記憶部、比較部及び判断部の一連の信号
処理により得られる信号てらって流路切換手段作動部が
、前述しｆコごとき一致度が所定値以上と判断された溶
出液についてはフラクションコレクタにフローアウトし
、一方上記一政変が所定値に満たない溶出液については
戻し流路に移送するよう上記流路切換手段に切換作動を
指令する制御信号を出力するよう構成される。

（以下余白） （ホ）作用 この発明によれば、分離カラムから溶出される液の多波
長吸光スペクトルのモニタにより得られる三次元クロマ
トグラムに基づいて、その特定波長のクロマトグラムか
ら目的成分のピークが検出され、このピークの立ち上が
り、立ち下がり及び頂点の多波長吸光スペクトルのスペ
クトルパターンが比較され、これらの一致度が所定値以
上をもってピーク精製度が判断され、このピークに相当
する溶出液が採取されることとなる。

以下実施例によりこの発明の詳細な説明するが、これに
よりこの発明は限定されるものではない。

（へ）実施例 実施例１ 第１図はこの発明の分取液体クロマトグラフ装置の一例
の構成説明図である。上記図において、分取液体クロマ
トグラフ装置（１）は、移動相貯留槽（２）、送液ポン
プ（３）、試料注入部（４）、分離カラム（５）、フォ
トダイオードアレイ検出器（６）、流路切換弁（７）を
この順に有する分析流路（ａ）と、上記流路切換弁（７
）に接続され、上記流路（ａ）から順次移送される溶出
液について所定の目的成分を含有する溶出液バンド（以
下フラクション）を採取するよう構成されたフラクショ
ンコレクタ（８）と、上記流路切換弁（７）から分析流
路（ａ）の移動相貯留槽（２）と送液ポンプ（３）との
間に接続されるリサイクル流路（ｂ）と、上記検出器（
６）で得られる信号を処理して上記流路切換弁（７）を
作動する制御部（９）とから主として構成されている。

上記分離カラム（５）には、充填剤（ＯＤＳ７粒子径１
５μｍ）、直径５０ｍｍ、カラム長２５ｃｍの分収用カ
ラムが用いられている。

フォトダイオードアレイ検出器（６）は、全波長領域に
わたる光を照射する光源と５００個程鹿のフォトダイオ
ードを有し、分離カラム（５）から移送されるフラクシ
ョンのうちの少なくとも目的成分のフラクションについ
て多波長吸光スペクトルを経時的（約０．１ｓｅｃ毎）
にモニタできるように構成されている。

上記流路切換弁（７）には三方電磁弁が用いられ、分析
流路（ａ）をフラクションコレクタに連通ずる側（以下
フローアウト位置）と、分析流路（ａ）をリサイクル流
路（ｂ）に連通ずる側（以下リサイクル位置）とに切換
え接続できるよう構成されている。

フラクションコレクタ（８）は、流路切換弁（７）に接
続される分取用ボート群及びこれらのポート群に対応し
て用意されるフラクション貯蔵用ボトル群とから構成さ
れている。

上記制御部（９）は、ＣＰ　Ｕ　（９１）を内蔵して記
憶部（９２）、比較部（９３）、判断部（９４）及び流
路切換弁作動部（９５）から構成され、上記フォトダイ
オードアレイ検出器（６）からの出力信号を処理して上
記流路切換弁（７）を作動するよう構成される。

記憶部（９２）ではフォトダイオードアレイ検出器（６
）により経時的にモニタされる多波長吸光スペクトルに
ついて、時間、波長及び吸光度をパラメタとする三次元
クロマトグラムを記憶すると共に、目的成分の標品のス
ペクトルパターン（以下標品パターン）を同パラメータ
に基づいて予め記憶される。

比較部（９３）では、上記記憶部（９２）に記憶された
三次元クロマトグラムから特定波長についてのクロマト
グラムが読みだされ、このクロマトグラムから所定のピ
ークが検出され、このピークにおける立ち上がり、立ち
下がり及び頂点の多波長吸光スペクトル（以下スペクト
ルパターン）が上記記憶部（９２）から読みだされ、こ
れらの３つの吸光スペクトルパターンについての信号が
比較される。

また、これらの３つのスペクトルパターンのうちの１つ
が、上記記憶部（９２）で記憶された標準バタンと比較
される。

上記ピークの検出は、ピーク検出傾き（ｓ　１ｏｐｅ）
、ピーク半値幅（ｗｉｄｔｈ）及びピーク頂点とリサイ
クルＸ回後の保持時間ｔ　Ｒｘの誤差％（ｗｉｎｄｏｗ
）をピーク検出パラメータとして行われる。そしてこの
検出されたピークにおける頂点の位置は、このピクを与
えるクロマトグラム信号の微分信号をモニタすることに
より決定される。一方立ち上がり及び立ち下がりの位置
は、ベースライン変動等の影響を避けるため、これらの
ピーク検出位置と頂点との１．２内分点となる位置に設
定される。

判断部（９４）では、上記比較部から出力される信号値
に基づいてスペクトルパターンが２つずつその一致度が
判断される。

流路切換弁作動部（９５）では、上記判断部によって一
致度が所定値以上と判断されたピークに相当する溶出液
がフラクションコレクタ（８）にフロアウドされ、一致
度が所定値に満たないと判断されたピークに相当する溶
出液がリサイクル流路（ｂ）に移送されろよう、前記流
路切換弁（７）の作動を指令するよう構成されている。

上記判断部（９４）においては下記数式に基づいて２つ
の吸収スペクトルＳ１（λ）、Ｓ２（λ）（λ波長）の
間のスペクトルパターンの一致度を演算処理し、ΣＳ１
（λ）・Ｓｔ（λ） 上記得られる数値に対しであるスレッンユホールド値（
Ｆ）を設定して、上記演算結果がこのスレノシュホール
ド値（Ｆ）以上のとき流路切換弁作動部（９５）にフロ
ーアウト位置に設定する信号を、Ｆ未満のときリサイク
ル位置に設定する信号を出力するように設定される。な
おスレッシュホールド値（Ｆ）は概ね０９９〜０．９９
９９が用いられる。

以上のごとく構成された分取液体クロマトグラフ装置（
１）の作動を、Ｘ回のリサイクル分取を行う場合につい
て説明する。

１）まず、分取時と同一クロマト条件に設定して、分取
目的の成分の標品を試料注入部に注入する。このとき標
品の保持時間（Ａ）とそのスペクトル（標品パターン、
Ｓ）を記憶する。

２）上記保持時間（Ａ）と、リサイクル流路（ｂ）を移
送される時間Ｂ　（Ｂ　：リサイクル流路容積を流速で
割ったもの）から、リサイクルＸ回後の保持時間ＬＲｘ
は、ｔＲｘ＝Ａｘ＋Ｂ（ｘ−１）となる。

上記保持時間をもとにしてフォトダイオードアレイ検出
器（６）の動作条件を設定する。

■リサイクル分画（流路切換弁（７）の切換え）タイミ
ングとフォトダイオードアレイ検出器のデータ取り込み
タイミングを１．保持時間の前後（Ｃ）、（Ｄ）で設定
する。

■フォトダイオードアレイ検出器の波長りにおけるクロ
マトグラム上でのピーク検出パラメータ（Ｅ　：　５ｌ
ｏｐｅ、ｗｉｄｔｈ、ｗｉｎｄｏｗ、　）を設定する。

■ピークスペクトルー政変のスレッシュホルド値（Ｆ’
）を設定する。

■標品パターン（Ｓ）とピーク頂点スペクトルとの一致
度のスレッシュホールド値（Ｇ）を設定する。

■フラクションコレクタ（８）条件（Ｈ）を設定する。

すなわちスタート信号導入後の分画ピーク番号、分画レ
ベル、５ｌｏｐｅ等を設定する。

以上の条件設定後、試料を注入しリサイクル分取を開始
する。なお、リサイクルＸ回目の目的ピークと時間との
関係は、第３図に示すクロマトグラムの模式図を参照に
して説明するものとする。

・ａ）時間ｔＲｘ（Ｉ　　Ｃ）のとき、流路切換弁（７
）をリサイクル位置に切換え、フォトダイオードアレイ
検出器（６）でモニタされるデータの取り込みを開始す
る。

・ｂ）　フォトダイオードアレイ検出器（６）で目的成
分を含ごピークを、検出パラメータ（Ｅ）によって確認
し、ピーク立ち上がり時間（１）、頂点時間（ｊ）、立
ち下かり時間（ｋ）を測定する。

・ｃ）時間ｔＲｘ（１十〇）のとき、流路切換弁（７）
をフローアウト位置に切換え、フォトダイオードアレイ
検出器（６）でモニタされるデータの取り込みを終了す
る。

・ｄ）　フォトダイオードアレイ検出器（６）で取り込
まれたデータから、ピークの（ｉ）点と（０点とのｌ：
２内分点である（１′）点、および、同ピークの（ｊ）
と（ｋ）との２：ｌ内分点である（ｋｏ）点（いずれも
第３図参照）をまず算出し、次いで（ｉｏ）と（Ｊ）点
、（Ｊ）と（ｋｏ）点それぞれのスペクトルパターンの
一致度を、上式（１）に基づいて演算する。

・ｅ）上記演算値が共にスレッシュホールド値（Ｆ）を
超えているがどうかを判断する。この結果、共に超えて
いるときは次のｆ）ステップに進み、超えていないとき
はステップａに戻る。

・ｆ）　　（ｊ）点と標品パターン（Ｓ）との一致度を
上式（１）に基づいて演算する。

・ｇ）上記演算値がスレッシュホールド値（Ｇ）を超え
ているかどうかを判断する。この結果、超えているとき
は次のステップｈに進み、超えていないときはステップ
ａに戻る。

・ｈ）　フラクションコレクタ（８）にスタート信号を
出力する。

・ｉ）フラクションコレクタ条件（Ｈ）により分画を開
始する。

上記一連の作動が、Ｘ回すサイクルされる溶出液につい
て繰返されることとなる。なお、以上の作動を具体的に
示す一例のフローチャートを第４図に示す。

以上のことから装置（１）によれば、リサイクル分取に
おいてピーク精製度を判断しかっ標品との同定を行って
１分取することができると共に、分画タイミング、リサ
イクル必要回数等を判断して精製度の高い分画を得るこ
とができる。

（ト）発明の効果 この発明によれば、溶出液のクマトグラムのピク精製度
を判断して分取することができる。またこのことからリ
サイクル分取する場合のリサイクル必要回数や分画タイ
ミングを決定することが容易となる。さらに標品スペク
トルとのスペクトル一致度を確認でき、同定情報が得ら
れる。またさらにリサイクル分離を繰返しても標品スペ
クトルと一致しない場合、保持挙動が極めて酷似した夾
雑成分の重なりが考えられ、分離条件の再検討の必要性
が分かることとなる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の分取液体クロマトグラフ装置の一例
の構成説明図、第２図はリサイクルＸ回目における目的
成分のクロマトグラムを示す模式図、第３図は第１図の
装置のリサイクル分取作動の一例を示すフローチャート
図である。 （以下余白） （２）・・・・・・移動相貯留槽、（３）・・・・・・
送液ポンプ、（４）・・・・試料注入部、　　（５）・
・・・分離カラム、（６）・・・・・フォトダイオード
アレイ検出器、（７）・・流路切換弁、 （８）・・・・・フラクションコレクタ、（９）・・・
・・制御部、　　　（９１）・・・・ＣＰＵ、（９２）
・・・・・記憶部、　　　（９３）・・・・・・比較部
、（９４）・・・・・・判断部、 （９５）・・・・・・流路切換弁作動部、（ａ）・・・
・・・分析流路、　　　（ｂ）・・・・リサイクル流路
。 ｏｌ 手続補正 １大 Ｂ（方式） ％式％ 発明の名称 分取クロマトグラフィ及びその装置 代表者 西へ條 實 補正命令の日付 平成 １年 ７月 ４日（全送日） 補正の対象 図面の第３図 ７、補正の内容 別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、所定の目的成分を含有する試料を液体クロマトグラ
   フィに付し、溶出する液をフォトダイオードアレイ検出
   器を通過させることにより該溶液の多波長吸光スペクト
   ルをモニタし、時間、波長、吸光度をパラメータとする
   三次元クロマトグラムを記憶し、 上記三次元クロマトグラムの特定の波長についてのクロ
   マトグラムを読み出して、目的ピークの上記フォトダイ
   オードアレイ検出器通過を検知し、上記目的ピークにお
   ける立ち上がり、立ち下がり及び頂点の多波長吸光スペ
   クトルを、上記三次元クロマトグラムから読み出してこ
   れらの一致度を判断し、 上記判断に基づいて、一致度が所定値以上の溶出液を採
   取することを特徴とする分取クロマトグラフィ。 ２、請求項１記載の分取クロマトグラフィにおいて一致
   度が所定値以上と判断された目的ピークについて、この
   ピークにおけるいずれかの多波長吸光スペクトルを、さ
   らに、予め記憶された目的成分の標準スペクトルパター
   ンと比較してこれらの一致度を判断し、この判断に基づ
   いて、一致度が所定値以上の溶出液を目的成分と同定し
   て採取することを特徴とする分取クロマトグラフィ。 ３、移動相供給部、試料導入部、分離カラム、フォトダ
   イオードアレイ検出器及び流路切換手段をこの順に有す
   る分析流路と、該流路の流路切換手段に接続され該流路
   から移送される溶出液から所定の目的成分を含有するフ
   ラクションを採取するよう構成されたフラクションコレ
   クタと、上記流路切換手段から前記分析流路の少なくと
   も分離カラムの前段に連通するよう設けられる戻し流路
   と、前記検出器を通過する溶出液を一旦上記戻し流路に
   移送して再分離する間に、該検出器から得られる上記溶
   出液のデータに基づいて再分離後の溶出液を分取しうる
   よう上記流路切換手段の切換作動を制御する制御部から
   なり、 上記制御部が、 （ａ）上記フォトダイオードアレイ検出部でモニタされ
   る溶出液の時間、波長及び吸光度をパラメータとする三
   次元クロマトグラムを記憶する記憶部と、 （ｂ）上記記憶部に記憶された三次元クロマトグラムか
   ら特定波長についてのクロマトグラムを読み出して目的
   ピークを検出し、このピークにおける立ち上がり、立ち
   下がり及び頂点の多波長吸光スペクトルを上記記憶部か
   ら読みだし、これらの多波長吸光スペクトルのパターン
   を比較する比較部と、 （ｃ）上記比較部から出力される信号値に基づいてパタ
   ーンの一致度を判断する判断部と、（ｄ）上記判断部に
   よって一致度が所定値以上と判断される溶出液をフラク
   ションコレクタに移送し、かつ該一致度が所定値に満た
   ない溶出液を戻し流路に移送しうるよう上記流路切換手
   段に作動を指令しうる流路切換手段作動部 とから構成されることを特徴とする分取クロマトグラフ
   装置。