BRPI0608170A2

BRPI0608170A2 - recipiente fechado contendo uma composição de um polipeptìdeo do fator vii ativado, processo para a preparação de um recipiente fechado contendo um polipeptìdeo do fator vii ativado, kit, e, método para a preparação de uma composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0608170A2
Application number: BRPI0608170-3A
Authority: BR
Inventors: Anne Charlotte Arentsen; Per Kaersgaard
Original assignee: Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2010-11-09
Also published as: MX2007013156A; KR101364003B1; US8703706B2; AU2006239117A1; JP2013151494A; CA2606343A1; WO2006114448A3; CN101184474A; RU2007136941A; US20080206225A1; EP1877037A2; JP2008539208A; JP5710656B2; RU2440810C2; CN101184474B; WO2006114448A2; KR20080008355A

Abstract

RECIPIENTE FECHADO CONTENDO UMA COMPOSIçãO DE UM POLIPEPTìDEO DO FATOR VII ATIVADO, PROCESSO PARA A PREPARAçãO DE UM RECIPIENTE FECHADO CONTENDO UM POLIPEPTìDEO DO FATOR VII ATIVADO, KIT, E, METODO PARA A PREPARAçãO DE UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA A presente invenção diz respeito a um recipiente fechado contendo uma composição de um polipeptídeo do Fator VII ativado em uma quantidade na faixa de 2,5 a 90 mg por ml em volume do recipiente. Ainvenção também diz respeito a vários processos para a preparação de tais recipientes fechados, um kit incluindo tais recipientes, e um método de uso do kit.

Description

"RECIPIENTE FECHADO CONTENDO UMA COMPOSIÇÃO DE UMPOLIPEPTÍDEO DO FATOR VII ATIVADO, PROCESSO PARA APREPARAÇÃO DE UM RECIPIENTE FECHADO CONTENDO UMPOLIPEPTÍDEO DO FATOR VII ATIVADO, KIT, E, MÉTODO PARA APREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um recipiente fechadocontendo uma composição de um polipeptídeo do Fator VII ativado em umaquantidade na faixa de 2,5 a 90 mg por mililitro de volume do recipiente. Ainvenção também diz respeito a vários processos para a preparação de taisrecipientes fechados, um kit que inclui tais recipientes, e um método de usodo kit.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O Fator VII, que se acha envolvido na cascata de coagulação,tem provado ser um agente terapêutico útil para tratar de uma variedade decondições patológicas. Conseqüentemente existe a necessidade crescente deformulações compreendendo os polipeptídeos do Fator VII ativados quesejam farmaceuticamente aceitáveis e apresentem uma eficácia clínicauniforme e predeterminada. Para certas aplicações terapêuticas, é necessárioadministrar uma quantidade razoavelmente grande de um polipeptídeo doFator VII ativado, por exemplo da ordem de 40 μg/kg de peso corporal ouainda mais.

A composição polipeptídica do Fator VII recombinantementeproduzida, comercialmente disponível, NovoSeven® (Novo Nordisk A/S,Dinamarca) é, por exemplo, apresentada como um frasco (volume dorecipiente de cerca de 3,0 ml) contendo 1,2 mg de Fator VIIa humanorecombinante, 5,84 mg de NaCl, 2,94 mg de CaCl2, 2 H2O, 2,64 mg deGlyGly, 0,14 mg de polissorbato 80, e 60,0 mg de manitol. Este produto éreconstituído a pH 5,5 por 2,0 ml de água para injeção (WFI) antes do uso,assim produzindo uma concentração do polipeptídeo do Fator VII de cerca de0,6 mg/ml.

Para aplicações terapêuticas em que a administração demaiores quantidades (por exemplo, 10 a 20 mg) de um polipeptídeo do FatorVII ativado (por exemplo, o Fator VIIa humano recombinantementeproduzido) seja necessária, é inconveniente utilizar uma formulação como acomposição NovoSeven®, porque um volume bem grande (por exemplo, 15a30 ml) necessita ser administrado, tipicamente por injeção.

Assim, existe a necessidade de produtos farmacêuticoslíquidos, assim como produtos farmacêuticos secados por congelamento, parareconstituição subseqüente, compreendendo um polipeptídeo do Fator VIIativado em que uma quantidade relativamente elevada do polipeptídeo doFator VII ativado esteja presente dentro de um certo volume do recipiente, pormeio do que o volume a ser administrado, tipicamente por injeção, causa ummínimo de inconveniência ao usuário final.

A WO 03/055512 Al apresenta uma composição aquosalíquida compreendendo (i) um polipeptídeo do fator VII; (ii) um agenteadequado para manter o pH na faixa de cerca de 4,0 a cerca de 8,0; (iii) umagente selecionado da lista de: um sal de cálcio, um sal de magnésio, ou umamistura destes; em que a concentração de (iii) seja de pelo menos 15 mM. Ainvenção apresentada no pedido de patente internacional parece ser aplicávelaos polipeptídeos do Fator VII em várias faixas de concentração, incluindouma faixa de concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml.

A WO 2004/000347 Al entre outras coisas apresenta umacomposição que, quando dissolvida em água, compreende um polipeptídeo doFator VII (0,6 a 10 mg/ml), cloreto de cálcio (5 a 20 mM), NaCl (0 a 50 mM),glicilglicina (0 a 15 mM), L-histidina (0 a 20 mM), manitol (20 a 40 mg/ml),sacarose (5 a 20 mg/ml), metionina (0 a 1 mg/ml), poloxâmero 188 (0,5 a 3mg/ml), em um pH na faixa de 5,0 a 7,0.A WO 2004/082708 Al apresenta uma composiçãofarmacêutica aquosa líquida compreendendo um polipeptídeo do Fator VII(0,1 a 10 mg/ml) e um agente de tamponamento adequado para manter o pHna faixa de cerca de 5,0 a cerca de 9,0; em que a relação molar dos íons decálcio não complexados (Ca2+) para o polipeptídeo do Fator VII é menor doque 0,5.

A WO 2004/112828 Al apresenta uma composição aquosalíquida compreendendo (i) um polipeptídeo do fator VII; (ii) um agenteadequado para manter o pH na faixa de cerca de 4,0 a cerca de 8,0; (iii) umagente selecionado da lista de: um sal de cálcio, um sal de magnésio, ou umamistura destes;

em que a concentração de (iii) seja de menos do que 15 mM; e(iv) um agente modificador da força iônica; em que a força iônica dacomposição é de pelo menos 200 mM. A invenção apresentada no pedido depatente internacional parece ser aplicável aos polipeptídeos do Fator VII emvárias faixas de concentração, incluindo uma faixa de concentração de cercade 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml.

A WO 2005/016365 Al apresenta uma composiçãofarmacêutica aquosa líquida compreendendo pelo menos 0,01 mg/ml de umpolipeptídeo do Fator VII (i); um agente de tamponamento (ii) adequado paramanter o pH na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 9,0; e pelo menos um agenteestabilizador (iii) compreendendo um motivo -C(=N-Z -R )-NH-Z -R (porexemplo uma benzamidina ou uma arginina). A invenção apresentada nopedido de patente internacional parece ser aplicável aos polipeptídeos doFator VII em várias faixas de concentração, incluindo uma faixa deconcentração de 0,01 a 20 mg/ml.

Embora vários pedidos de patente anteriores do requerenteinclua a opção de utilizar a respectiva invenção para soluções líquidas de umpolipeptídeo do Fator VII em faixa de concentração bem ampla, os exemplosde trabalho não exploraram a região superior de tais faixas de concentração,nem quaisquer dos pedidos de patente anteriores apresentaram ou previramum recipiente fechado compreendendo uma quantidade relativamente alta deum polipeptídeo do Fator VII ativado.

Acredita-se que isto seja por causa doentendimento geral de que o grau de degradação de um polipeptídeo do FatorVII, em particular a degradação de cadeia pesada, aumente dramaticamentecom a concentração dos polipeptídeos do Fator VII, não obstante as medidasgerais aplicadas com a finalidade de reduzir a degradação autocatalítica dopolipeptídeo do Fator VII ativado, e que um alto grau de degradaçãoproduzirá produtos que sejam inaceitáveis para a maior parte das aplicaçõesterapêuticas.

Além disso, acredita-se que o fato de que o produto comercialda técnica anterior compreenda quantidades relativamente elevadas de cálcio,possa tornar-se problemático quando grandes quantidades do ingrediente ativo(o polipeptídeo do Fator VII) sejam necessárias para o tratamento dascondições particulares. Altas quantidades de cálcio podem, portanto,necessitar de altas concentrações do polipeptídeo do Fator VII em umpequeno volume.

Para que se seja capaz de obter um recipiente fechado com umalto conteúdo de um polipeptídeo do Fator VII ativado por unidade de volumedo recipiente, uma massa altamente concentrada do polipeptídeo do Fator VIIativado purificado que possa ser dispensada no recipiente é necessária. Atéagora isto foi considerado difícil ou mesmo impossível, tendo em vista que opolipeptídeo do Fator VII ativado é uma serina protease que possui atividadeautoproteolítica, o que significa que a proteína catalisa a degradação delaprópria (ver, por exemplo, iiThe Use of RP-HPLC for measuring activationand cleavage of rFVIIa during purification" por I. Mollerup et al.,Biotechnol. Bioeng., vol. 48 (1995), 501-505 e iiStudies on coagulation factorVIIa autoproteolysis and formation of degradation products" por Τ. B.Hansen et ai. cartaz apresentado na ACS (2003). A degradação é causada pelaclivagem no lado C-terminal de Lys38, Arg290 e Arg315. Pela clivagem, aproteína perde sua função hemostática e, assim, seu efeito terapêutico. A taxade degradação é proporcional à concentração do polipeptídeo do Fator VIIativado na segunda ordem, como segue:

-d[FVIIa]/dt = k[FVIIa]2

em que [FVIIa] é a concentração do polipeptídeo do Fator VIIativado.

Isto significa que, se o polipeptídeo do Fator VII ativado forconcentrado, por exemplo 10 vezes, então esperar-se-á que a taxa dedegradação aumente 100 vezes.

Outra dificuldade de concentrar-se um polipeptídeo do FatorVII ativado é sua solubilidade, o que significa que o polipeptídeo do Fator VIIativado iniciará a precipitar-se quando ele alcance uma certa concentração emqualquer dado tampão.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores surpreendentemente observaram agoraser de fato possível preparar um produto farmacêutico conveniente (porexemplo um frasco, um carpule etc.) com uma alta e relevante quantidade deum polipeptídeo do Fator VII ativado, em que o grau de degradaçãoautocatalítica, em particular a degradação de cadeia pesada dos polipeptídeosdo Fator VII ativado, possa ser suprimido pela seleção adequada dascondições, e que o grau de degradação seja inferior ao esperado.

Assim, um primeiro aspecto da presente invenção diz respeitoa um recipiente fechado contendo uma composição de um polipeptídeo doFator VII ativado (i), referido recipiente compreendendo na faixa de 2,5 a 90mg do polipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro do volume dorecipiente.

O segundo aspecto da presente invenção diz respeito aprocessos para a preparação de um recipiente fechado compreendendo umpolipeptídeo do Fator VII ativado.

Um terceiro aspecto da presente invenção diz respeito a um kitcompreendendo (i) um primeiro recipiente fechado contendo uma composiçãofarmacêutica sólida de um polipeptídeo do Fator VII ativado e (ii) umsegundo recipiente contendo um solvente aquoso líquido para a referidacomposição farmacêutica sólida, em que o primeiro recipiente contenha umacomposição consistindo na faixa de 2,5 a 90 mg do polipeptídeo do Fator VIIativado por mililitro do volume do primeiro recipiente.

Um quarto aspecto da presente invenção diz respeito a ummétodo para a preparação de uma composição farmacêutica aquosa líquidapronta-para-uso de um polipeptídeo do Fator VII ativado de um kit, comoaqui definido, o método compreendendo misturar a composição farmacêuticasólida do primeiro recipiente com pelo menos uma fração do solvente aquosolíquido do segundo recipiente, de modo a formar a composição farmacêuticaaquosa líquida pronta-para-uso de um polipeptídeo do Fator VII ativado.

LISTA DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a densidade óptica OD600 como uma funçãoda concentração de FVIIa (mg/ml).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como mencionado acima, a presente invenção fornece umrecipiente fechado contendo uma composição de um polipeptídeo do FatorVII ativado (i), referido recipiente contendo na faixa de 2,5 a 90 mg dopolipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente.

O termo "fechado" significa que o conteúdo do recipiente ficaseparado do exterior. Assim, o recipiente é tipicamente construído de umamaneira tal que um se necessite quebrar o selo ou a tampa necessita serremovida antes que o conteúdo do recipiente se torne acessível. Nas formasde realização preferidas, o recipiente é hermético a água e a gás, por exemplo,o recipiente é também hermético ao ar de modo que ar ou umidade nãopossam entrar no interior do recipiente e dessa forma dê origem à degradaçãodo conteúdo. O espaço vazio do recipiente pode ser enchido com um gásinerte. O gás inerte pode ser selecionado dos grupos consistindo emnitrogênio, argônio etc.

O recipiente [por exemplo frasco, carpule ou cartucho (talcomo um carpule ou cartucho para um aplicador tipo caneta)] é tipicamenteproduzido de vidro ou plástico, em particular vidro, opcionalmente fechadopor um septo de borracha ou outro meio de fechamento que leve em conta apenetração com preservação da integridade da composição farmacêutica. Emuma modalidade o recipiente é um frasco, carpule ou cartucho fechados emum saco selado, por exemplo um saco de plástico selado, tal como umlaminado [por exemplo saco plástico laminado com metal (tal comoalumínio)].

Em uma variante interessante, o recipiente tem um material deparede interna selecionado de vidro revestido com sílica, vidro revestido comsilicona, polímeros de olefinas não cíclicas, polímeros de cicloolefinas ecopolímeros de cicloolefina/olefina linear, por exemplo como descrito nopedido anterior do requerente WO 2004/103398.

Quando usado neste relatório descritivo, o termo "produto"refere-se ao recipiente que inclui a composição do polipeptídeo do Fator VIIativado, isto é, o termo "produto" é tipicamente o produto comercial vendido,tal como um frasco, carpule ou cartucho contendo uma composição de umpolipeptídeo do Fator VII ativado.

O termo "composição" refere-se a uma mistura sólida oulíquida que inclua o polipeptídeo do Fator VII ativado e, opcionalmente, umou mais aditivos, por exemplo tampões, agentes estabilizantes, agentesmodificadores da tonicidade, etc. (ver abaixo).

O polipeptídeo do Fator VII ativado é como ainda definidoabaixo.

A expressão "ml em volume do recipiente" refere-se aovolume interno do recipiente em questão estabelecido como mililitros (ml),isto é, o volume do compartimento do recipiente em que o polipeptídeo doFator VII esteja presente.O volume do recipiente fechado (por exemplo,selado) pode ser definido mais precisamente como o volume do espaço vaziodo recipiente correspondente fechado e vazio, isto é, o volume do recipientenão ocupado pela tampa, pelo selo ou coisa parecida. Por exemplo, acomposição corrente NovoSeven® de polipeptídeo do Fator VIIrecombinantemente produzida, comercialmente disponível (Novo NordiskA/S, Dinamarca), é apresentada em três frascos diferentementedimensionados, (i) 4,3 ml ± 0,5 ml de volume, (ii) 7,1 ml ± 0,5ml de volume,e (iii) 13,5 ml ± 1,0 ml de volume. Nestes frascos, a tampa ocupa 0,44 ml dovolume do recipiente, isto é, o espaço vazio dos recipientes correspondentesfechados e vazios é (i) 3,86 ml ± 0,5 ml, (ii) 6,66 ml ± 0,5 ml e (iii) 13,06 ml± 1,0 ml.

O recipiente tipicamente compreende a faixa de 2,5 a 90 mg,tal como a faixa de 2,75 a 75 mg ou a faixa de 4 a 90 mg, do polipeptídeo doFator VII ativado por mililitro em volume do recipiente. Em algumas formasde realização, o recipiente compreende de 4 a 60 mg por mililitro em volume,tal como 4 a 50 mg por mililitro em volume, ou 5 a 25 mg por mililitro emvolume, ou 6 a 15 mg por mililitro em volume. Em outras modalidades, orecipiente compreende de 2,5 a 60 mg por mililitro em volume, tal como 2,5 a50 mg por mililitro em volume, ou 2,5 a 40 mg por mililitro em volume, ou2,5 a 30 mg por mililitro em volume. Para algumas aplicações terapêuticas, orecipiente pode compreender de 4 a 15 mg por mililitro em volume, ou de 6 a40 mg por mililitro em volume, ou 10 a 30 mg por mililitro em volume ou 25a 60 mg por mililitro em volume.

A composição do polipeptídeo do Fator VII ativado pode serou na forma solubilizada, por exemplo como uma solução aquosa ou umasuspensão, ou na forma seca, por exemplo na forma liofilizada.Composição na forma solubilizada

Em uma modalidade, o polipeptídeo do Fator VII ativadoacha-se na forma solubilizada, por exemplo em solução aquosa.

Preferivelmente a solução aquosa do polipeptídeo do Fator VII ativado é umacomposição farmacêutica líquida, em particular uma composiçãofarmacêutica pronta-para-uso do polipeptídeo do Fator VII ativado.

A expressão "solução aquosa" significa que o polipeptídeo doFator VII ativado é solubilizado em um solvente que é principalmenteconstituído de água, isto é, os solventes orgânicos constituem no máximo 5%, em particular no máximo 2 %, da composição.

De modo a tornar a solução aquosa útil para administraçãoparenteral direta a um mamífero, tal como um ser humano, é normalmentenecessário que o valor do pH da composição seja mantido dentro de limitesrazoáveis, tal como de cerca de 5,0 a cerca de 9,0. Para garantir um valor depH adequado sob as condições dadas, a composição farmacêutica tipicamentecompreende um agente de tamponamento (ii) adequado para manter o pH nafaixa de cerca de 5,0 a cerca de 9,0. Com outra finalidade de tornar a soluçãoaquosa mais estável durante a armazenagem e a manipulação, a soluçãopreferivelmente tem um pH na faixa de 5,0 a 7,0. Preferivelmente, o pH situa-se na faixa de 5,8 a 6,5 ou na faixa de 5,5 a 6,2, com uma preferênciaparticular para um pH na faixa de 5,8 a 6,2.

Sais de cálcio e sais de magnésio (iiia)

Em uma forma de realização, o agente de estabilização incluipelo menos um agente selecionado de sais de cálcio e sais de magnésio, emparticular de sais de cálcio.

Exemplos de sais de cálcio são o cloreto de cálcio, o acetato decálcio, o gliconato de cálcio, o levulato de cálcio, ou uma mistura destes.

Exemplos de sais de magnésio são o cloreto de magnésio, oacetato de magnésio, o sulfato de magnésio, o gliconato de magnésio, olevulato de magnésio, os sais de magnésio de ácidos fortes, ou uma misturadestes.

A concentração do (iiia) na solução aquosa é preferivelmentede pelo menos 15 mM, por exemplo 25 mM, tal como pelo menos 50 mM,pelo menos 100 mM, pelo menos 200 mM, pelo menos 400 mM, ou pelomenos 800 Mm.

Nas modalidades preferidas, o agente de estabilização (iiia) éselecionado de cloreto de cálcio, acetato de cálcio, cloreto de magnésio,acetato de magnésio, sulfato de magnésio, ou uma mistura destes; e o agentemodificador da força iônica (iv) é o cloreto de sódio ou uma mistura decloreto de sódio e pelo menos um agente adicional modificador da forçaiônica (ver mais abaixo).

Agente divalente de estabilização do tipo de metais daprimeira série de transição

Em outra modalidade, o agente de estabilização (iii) incluipelo menos um agente contendo metal (iiib), em que referido metal éselecionado do grupo consistindo em metais da primeira serie de transição doestado de oxidação +II.

Quando aqui usada, a expressão "metais da primeira série detransição do estado de oxidação +11" intenta incluir os metais titânio, vanádio,cromo, manganês, ferro, cobalto, níquel e cobre.

Embora o titânio e o vanádio possam existir no estado deoxidação +11 em ambientes aquosos, é mais típico selecionar o(s) metal(is)entre cromo, manganês, ferro, cobalto, níquel e cobre. Exemplos ilustrativosdos agentes contendo metal (iiib) correspondentes a estes metais são o cloretode cromo(II), o cloreto de manganês(II), o cloreto de ferro(II), o cloreto decobalto(II), o cloreto de níquel(II) e o cloreto de cobre(II). Deve ficarentendido que o agente contendo metal (iiib) pode compreender dois ou maismetais, por exemplo dois ou mais metais da primeira série de transição.Assim, em alguns casos, dois ou mais dos agentes acimamencionados podem ser usados em combinação.

Até aqui os metais mais promissores são o cobre e omanganês. Exemplos ilustrativos dos correspondentes agentes contendo metal(iiib) são o cloreto de cobre(II) e o cloreto de manganês(II).

A concentração do agente (ou agentes) contendo metal (iiib) étipicamente de pelo menos 1 μΜ. A concentração desejável (ou necessária)tipicamente depende do agente (ou agentes) contendo o metal selecionado,mais especificamente da afinidade de ligação do metal selecionado do estadode oxidação +11 ao polipeptídeo do Fator VII.

Em modalidades diferentes, o agente contendo metal (iiib) estápresente em uma concentração de pelo menos 5 μΜ, pelo menos 25 μΜ, pelomenos 50 μΜ, pelo menos 100 μΜ, pelo menos 200 μΜ, pelo menos 400μΜ, pelo menos 500 μΜ, pelo menos 800 μΜ, pelo menos 900 μΜ, pelomenos 1000 μΜ, pelo menos 5 μΜ, pelo menos 25 μΜ, pelo menos 50 μΜ,pelo menos 100 μΜ, pelo menos 200 μΜ, pelo menos 400 μΜ, pelo menos800 μΜ, pelo menos 900 μΜ, ou pelo menos 1000 μΜ.

Em várias modalidades, a relação molar entre o agentecontendo metal (iii) (Me2+) e o polipeptídeo de FVII [agente (iiib):FVII] éacima de 0,5; acima de 1; acima de 2; acima de 4; acima de 5; acima de 10;acima de 25; acima de 100; acima de 150; tal como, por exemplo, na faixa de0,5 a 250, tal como 0,5 a 150, 0,5 a 100; 0,5 a 25; 1 a 250; 1 a 100; 1 a 25; 1 a 10.

Em uma modalidade particular, o metal do agente contendometal (iiib) é o cobre e a concentração do referido agente é de pelo menos 5μΜ, tal como pelo menos 10 μΜ, ou pelo menos 15 μΜ.

Em outra modalidade particular, o metal do agente contendometal (iiib) é o manganês e a concentração do referido agente é de pelo menos100 μΜ, tal como pelo menos 500 μΜ, ou pelo menos 1 mM.Agente de estabilização do tipo benzamidina/arginina (iiic)

Em ainda outra modalidade, o agente de estabilização incluipelo menos um agente (iiic) compreendendo um motivoZ-R5 em que ZeZ independentemente são selecionados do grupoconsistindo em -O-, -S-, -NRh- e uma ligação única, em que Rh é selecionadodo grupo consistindo de hidrogênio, alquila C1.4, arila e arilmetila, e R1 e R2independentemente são selecionados do grupo consistindo de hidrogênio,alquila Ci_6 opcionalmente substituída, alquenila C2.6 opcionalmentesubstituída, arila opcionalmente substituída, heterociclila opcionalmentesubstituída, ou

ZeR são como definido acima e -C=N-Z -R faz parte deum anel heterocíclico, ou

ZeR são como definidos acima e -C-NH-Z -R faz parte deum anel heterocíclico, ou-C(=N-Z -R )-NH-Z -R forma um anel heterocíclico em que -Z1-R1-R2-Z2- é um bi-radical.

O termo "alquila CiV' inclui resíduos de hidrocarbonetosaturado acíclico e cíclico que têm de 1 a 6 átomos de carbono e que podemser lineares ou ramificados. Exemplos particulares são a metila, etila, n-propila, isopropila, ciclopropíla, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila,ciclopropilmetila, n-pentila, isopentila, n-hexila etc. De forma semelhante, otermo "alquila C 1.4" inclui resíduos de hidrocarboneto saturado acíclico ecíclico que têm de 1 a 4 átomos de carbono e que podem ser lineares ouramificados.

De forma semelhante, o termo "alquenila C2V inclui resíduosde hidrocarboneto acíclico e cíclico que têm de 2 a 6 átomos de carbono ecompreendem uma ligação insaturada, que pode ser linear ou ramificada.Exemplos de grupos alquenila C2.6 são vinila, alila, but-l-en-2-ila, but-2-en-l-ila, pent-l-en-ila e hex-l-en-ila.A expressão "opcionalmente substituída" em ligação com osgrupos alquila Ci_6 e alquenila C2-6 denota que o grupo em questão pode sersubstituído uma ou várias vezes, preferivelmente 1 a 3 vezes, por grupo(s)selecionado(s) do grupo consistindo de hidróxi, alcóxi C^6 (isto é, alquilóxiCi-ó), alquenilóxi C2.e, oxo (formando uma funcionalidade ceto ou aldeído),arila, arilóxi, arilcarbonila, heterociclila, heterociclilóxi, heterociclil-carbonila, amino, mono e di(alquila Ci_6)amino, halogênio, em que qualquerarila e heterociclila pode ser substituída como especificamente descrito abaixoquanto à arila e heterociclila opcionalmente substituída.

"Halogênio" inclui flúor, cloro, bromo e iodo.

Quando aqui usado, o termo "arila" denota um anel ou sistemade anel carbocíclico parcialmente aromático, tal como fenila, nafitila, 1,2,3,4-tetraidronaftila, antracila, fenantracila, pirenila, benzopirenila, fluorenila exantenila, entre os quais a fenila é um exemplo preferido.

O termo "heterociclila" intenta denotar um anel ou sistema deanel carbocíclico parcialmente aromático ou completamente aromático, emque um ou mais dos átomos de carbono tenham sido substituídos porheteroátomos, por exemplo átomos de nitrogênio (=N- ou -NH), de enxofre (-S-), e/ou de oxigênio (-0-). Exemplos de tais grupos heterociclila sãooxazolila, oxazolinila, oxazolidinila, isoxazolila, isoxazolinila,isoxazolidinila, oxadiazolila, oxadiazolinila, oxadiazolidinila, tiazolila,isotiazolila, pirrolila, pirrolinila, pirrolidinila, imidazolila, imidazolinila,imidazolidinila, pirazolila, piridinila, pirazinila, piridazinila, piperidinila,cumarila, furila, quinolila, benzotiazolila, benzotriazolila, benzodiazolila,benzoxozolila, diazolila, diazolinila, diazolidinila, triazolila, triazolinila,triazolidinila, tetrazol etc. Grupos heterocíclicos preferidos são os gruposmonocíclicos de 5, 6 ou 7 membros, tais como isoxazolila, isoxazolinila,oxadiazolila, oxadiazolinila, pirrolila, pirrolinila, diazolila, diazolinila,triazolila, triazolinila, imidazolila, imidazolinila etc.A expressão "anel heterocíclico" intenta significar um anelcorrespondente àquele definido sob "heterociclila".

Com relação aos termos "arila", "heterociclila" e "anelheterocíclico", a expressão "opcionalmente substituída" intenta denotar que ogrupo em questão pode ser substituído uma ou várias vezes, preferível 1 a 3vezes, pelo(s) grupo(s) selecionado(s) de hidróxi (o qual, quando presente emum sistema enol, pode ser representado na forma ceto tautomérica), alquilaC1-6, alquenila C2-6, fenila, benzila, alcóxi Ci.6, oxo (que pode ser representadona forma enol tautomérica), carbóxi, alcóxi Ci.6-carbonila, alquila Ci_6-carbonila, amino, mono e di(alquila C^amino, di-halogênio-alquila Ci.4, tri-halogênio-alquila C1.4, e halogênio. Os exemplos mais típicos dossubstituintes são hidroxila, alquila C1.4, fenila, benzila, alcóxi Cm, oxo,amino, mono e dimetilamino, e halogênio.

A par do fato de que ReR independentemente podem serselecionados do grupo consistindo em hidrogênio, alquila Ci_6 opcionalmentesubstituída, alquenila C2-6 opcionalmente substituída, arila opcionalmentesubstituída, heterociclila opcionalmente substituída, é também possível queuma parte do motivo C(=N-Z -R )-NH-Z -R possa fazer parte de um anelheterocíclico, enquanto a outra parte do motivo tenha o significado definidopara Z1, Z\ R1 e R , respectivamente. Em algumas modalidades interessantes,-C=N-Z1-R1 pode fazer parte de um anel heterocíclico selecionado do grupoconsistindo em um anel 1,2-diazol, um anel isoxazol, um anel 1,2,4-triazol eum anel 1,2,4-oxadiazol, ou - C-NH-Z -R pode fazer parte de um anelheterocíclico selecionado do grupo consistindo em um anel 1,2-diazolina, umanel isoxazolina, um anel 1,2,4-triazolina, e um anel 1,2,4-oxadiazolina. Taisanéis heterocíclicos podem ser substituídos como descrito acima.

Em algumas formas de realização, pelo menos um dentre R1 eR2 é hidrogênio, por exemplo, ambos são hidrogênio. Além disso, emalgumas modalidades, as quais possam ser combinadas com as modalidadesmencionadas anteriormente, pelo menos um dentre Z e Z é uma ligaçãoúnica, por exemplo, ambos são ligação única. Nas modalidades especiais, R1 eR são ambos hidrogênio, e ZeZ são ambos uma ligação única.

Acredita-se que o motivo -C(=N-Z!-R^-NH-Z2-R2 sejaparticularmente importante para o efeito de estabilização do agente deestabilização (iiic). Em particular, acredita-se que o motivoNH-Z-R imite um componente de arginina de um substrato para opolipeptídeo do Fator VII.

Nas modalidades mais específicas, o agente de estabilização(iiic) é pelo menos um selecionado do grupo consistindo de compostos deamidina compreendendo um motivo -C-Q=N-Z1-R^-NH-Z2-R2 e compostosde guanidina compreendendo um motivo >N-C(=N-Z1-R1 )-NH-Z2-R2.

Em algumas modalidades, o agente de estabilização (iiic) épelo menos um composto de amidina selecionado do grupo consistindo debenzamidinas compreendendo o motivo -C6H4-C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2, emque C6H4 denota um anel benzeno opcionalmente substituído, do qual abenzamidina (ReR são hidrogênio e Z e Z são uma ligação única)constitui uma modalidade particular.

Em outras de suas modalidades particulares, as benzamidinascompreendem o motivo >N-C6H4-C(=N-Z1 -R^-NH-Z2-R2, em que C6H4denota um anel benzeno opcionalmente substituído, isto é, uma o-amino-benzamidina, uma m-amino-benzamidina ou uma p-amino-benzamidina,dentre as quais as p-amino-benzamidinas, tais como a p-amino-benzamidina,são as mais correntemente promissoras.

Outros exemplos ilustrativos das p-amino-benzamidinas sãoaqueles apresentados pela Aventis na EP 1 162 194 Al, conforme, emparticular, aqueles definidos nas reivindicações 1 a 6 e nas seções [0009] a[0052], e na EP 1 270 551 Al, conforme, em particular, as reivindicações 1 e2 e as seções [0010] a [0032].Em outra modalidade, o agente de estabilização (iiic) é pelomenos um composto de guanidina selecionado do grupo consistindo decompostos de guanidina compreendendo um motivo -CH2-NH-CC=N-Z1-R1)-NH-Z -R . Exemplos de compostos de guanidina são aqueles selecionados dogrupo consistindo de arginina, derivados de arginina e peptídeos de 2 a 5resíduos de aminoácidos compreendendo pelo menos um resíduo de arginina.

A arginina constitui uma modalidade particular.

A expressão "derivados de arginina" inclui homólogos dearginina, argininas funcionalizadas N-terminais [por exemplo, derivados N-metilados e N-acilados (por exemplo acetilados)], argininas funcionalizadasC-terminais (por exemplo, derivados C-amidados, C-alquilamidados e C-alquilados), e suas combinações.

Como mencionado acima, o único motivo crucial dos agentesde estabilização é -C(=N-Z1-R1)-NH-Z2-R2. Outras partes do agente deestabilização podem também ser importantes, em particular com respeito àotimização do efeito estabilizador e à tolerância pelo paciente. Tipicamente, oagente de estabilização tem a fórmula Y-C(=N-Z -R )-NH-Z -R , em que Y éum radical orgânico. O radical Y é tipicamente selecionado de modo amelhorar a eficiência do efeito estabilizador. Igualmente, o radical Y podecompreender um ou mais outros motivos da fórmula -C(=N-Z -R )-NH-Z -R .

O peso molecular do agente de estabilização é tipicamente deno máximo 1000 Da, tal como no máximo 500 Da.

A concentração do agente (ou agentes) de estabilização étipicamente de pelo menos 1 μΜ. A concentração desejável (ou necessária)tipicamente depende do agente (ou agentes) de estabilização selecionado,mais especificamente da afinidade de ligação do agente de estabilizaçãoselecionado para o polipeptídeo do Fator VII.

Em diferentes formas de realização, o agente de estabilização(iiic) está presente em uma concentração de pelo menos 5 μΜ, pelo menos 10μΜ, pelo menos 20 μΜ, pelo menos 50 μΜ, pelo menos 100 μΜ, pelo menos150 μΜ, pelo menos 250 μΜ, pelo menos 500 μΜ, pelo menos 1 mM, pelomenos 2 mM, pelo menos 4 mM, pelo menos 5 mM, pelo menos 8 mM, pelomenos 9 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM,tal como na faixa de 20 a 2000 μΜ, na faixa de 50 a 5000 μΜ, na faixa de 0,1a 10 mM, na faixa de 0,2 a 20 mM, ou na faixa de 0,5 a 50 mM.

Em várias modalidades a relação molar entre o agente deestabilização (iii) e o polipeptídeo de FVII [agente (iiic):FVII] é: acima de0,1, acima de 0,5, acima de 1, acima de 2, acima de 5, acima de 10, acima de25, acima de 100, acima de 250, acima de 1000, acima de 2500 ou acima de5000, tal como, por exemplo, na faixa de 0,1 a 10000, 0,1 a 5000, 0,1 a 2500,0,1 a 1000, 0,1 a 250, 0,1 a 100, 0,1 a 25, 0,1 a 10, 0,5 a 10000, 0,5 a 5000,0,5 a 2500, 0,5 a 1000, 0,5 a 250, 0,5 a 100, 0,5 a 25, 0,5 a 10, 1 a 10000, 1 a5000, 1 a 2500, 1 a 1000, 1 a 250, 1 a 100; 1 a 25; 1 a 10, 10 a 10000, 10 a5000, 10 a 250, 1000 a 10000 ou 1000 a 5000.

Em uma modalidade, o agente de estabilização (iiic) é abenzamidina e a concentração do referido agente é de pelo menos 0,5 mM, talcomo de pelo menos 2 mM, embora se considere que as benzamidinassubstituídas possam ser mais potentes, razão por que elas podem seradicionadas em concentrações menores.

Em uma modalidade, o agente de estabilização (iiic) é aarginina e a concentração do referido agente é de pelo menos 2 mM, tal comode pelo menos 10 mM.

Deve ficar entendido que os agentes de estabilização acimamencionados (iiia), (iiib) e (iiic) podem ser usados em combinação.

Outros Aditivos

Igualmente, a composição pode ainda compreender um agentemodificador da tonicidade (v).

Como aqui usada, a expressão "agente modificador datonicidade" inclui agentes que contribuem para a osmolalidade da solução. Oagente modificador da tonicidade (v) inclui pelo menos um agenteselecionado do grupo consistindo em sais neutros, aminoácidos, peptídeos de2 a 5 resíduos de aminoácidos, monossacarídeos, dissacarídeos,polissacarídeos, e álcoois de açúcar. Em algumas formas de realização, acomposição compreende dois ou mais de tais agentes em combinação.

Por "sal neutro" denota-se um sal que não é nem um ácidonem uma base quando dissolvido em uma solução aquosa.

Em uma forma de realização, pelo menos um agentemodificador da tonicidade (v) é um sal neutro selecionado dos gruposconsistindo de sais de sódio, sais de potássio, sais de cálcio e sais demagnésio, tais como o cloreto de sódio, o cloreto de potássio, o cloreto decálcio, o acetato de cálcio, gliconato de cálcio, levulato de cálcio, cloreto demagnésio, acetato de magnésio, gliconato de magnésio e levulato demagnésio.

Em uma outra modalidade, o agente modificador da tonicidade(v) inclui cloreto de sódio em combinação com pelo menos um selecionadodos grupos consistindo em cloreto de cálcio, acetato de cálcio, cloreto demagnésio e acetato de magnésio.

Em ainda uma outra modalidade, o agente modificador datonicidade (v) é pelo menos um selecionado do grupo consistindo em cloretode sódio, cloreto de cálcio, sacarose, glicose e manitol.

Nas diferentes modalidades, o agente modificador datonicidade (v) está presente em uma concentração de pelo menos 1 mM, pelomenos 5 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 50 mM,pelo menos 100 mM, pelo menos 200 mM, pelo menos 400 mM, pelo menos800 mM, pelo menos 1000 mM, pelo menos 1200 mM, pelo menos 1500mM, pelo menos 1800 mM, pelo menos 2000 mM ou pelo menos 2200 mM.

Em uma série de modalidades, o agente modificador datonicidade (ν) está presente em uma concentração na faixa de 5 a 2200 mM,tal como 25 a 2200 mM, 50 a 2200 mM, 100 a 2200 mM, 200 a 2200 mM,400 a 2200 mM, 600 a 2200 mM, 800 a 2200 mM, 1000 a 2200 mM, 1200 a2200 mM, 1400 a 2200 mM, 1600 a 2200 mM, 1800 a 2200 mM ou 2000 a2200 mM; 5 a 1800 mM, 25 a 1800 mM, 50 a 1800 mM, 100 a 1800 mM,200 a 1800 mM, 400 a 1800 mM, 600 a 1800 mM, 800 a 1800 mM, 1000 a1800 mM, 1200 a 1800 mM, 1400 a 1800 mM, 1600 a 1800 mM; 5 a 1500mM, 25 a 1400 mM, 50 a 1500 mM, 100 a 1500 mM, 200 a 1500 mM, 400 a1500 mM, 600 a 1500 mM, 800 a 1500 mM, 1000 a 1500 mM, 1200 a 1500mM; 5 a 1200 mM, 25 a 1200 mM, 50 a 1200 mM, 100 a 1200 mM, 200 a1200 mM, 400 a 1200 mM, 600 a 1200 mM ou 800 a 1200 mM.

Em uma modalidade preferida da invenção, pelo menos umagente modificador da tonicidade (v) é um agente modificador da força iônica(iv).

Mais preferivelmente, a composição do recipiente da invençãocompreende um agente modificador da força iônica (iv). Conseqüentemente, asolução aquosa preferivelmente compreende um ou mais agentesmodificadores da força iônica (iv), bem como um ou mais agentesmodificadores da tonicidade (v) que não sejam agentes modificadores daforça iônica (iv).

Como aqui usada, a expressão "agente modificador da forçaiônica (iv)" inclui agentes que contribuem para a força iônica da solução. Osagentes incluem, porém sem limitar, sais neutros, aminoácidos, peptídeos de 2a 5 resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a composiçãocompreende dois ou mais de tais agentes em combinação.

Exemplos preferidos de agente modificador da força iônica(iv) são os sais neutros tais como o cloreto de sódio, cloreto de potássio,cloreto de cálcio e cloreto de magnésio [os últimos dois podemadicionalmente ser considerados como "agentes de estabilização" (veracima)]. Um agente preferido (iv) é o cloreto de sódio.

A expressão "força iônica" é a força iônica da solução (μ) queé definida pela equação: μ = 1/2 E([i](Zj2)), em que μ é a força iônica, [i] é aconcentração milimolar de um íon, e Zi é a carga (+ ou -) desse íons (ver, porexemplo, Solomon, Journal of Chemical Edueation, 78(12): 1691-1692,2001; James Fritz e George Schenk: Quantitative Analytical Chemistryy1979).

Em uma forma de realização da invenção, a força iônica dasolução aquosa é de pelo menos cerca de 50 mM, tal como, por exemplo, pelomenos cerca de 100 mM. Nas diferentes formas de realização da invenção, aforça iônica da solução aquosa é de pelo menos 200 mM, por exemplo é depelo menos 400 mM, tal como pelo menos 800 mM, pelo menos 1000 mM,pelo menos 1200 mM, pelo menos 1500 mM, pelo menos 1800 mM, pelomenos 2000 mM ou pelo menos 2200 mM. Em uma variante especial desta, aconcentração do(s) agente(s) de estabilização (iiia) (isto é, sais de cálcio e saisde magnésio) na solução aquosa é menor do que 15 mM, porém com apresença simultânea de NaCl de pelo menos 100 mM.

Em algumas formas de realização específicas, a concentraçãototal do agente modificador da tonicidade (v) e do agente modificador daforça iônica (iv) situa-se na faixa de 1 a 500 mM, tal como na faixa de 1 a 300mM, ou na faixa de 10 a 200 mM, ou na faixa de 20 a 150 mM, dependendodo efeito que quaisquer outros ingredientes possam ter sobre a tonicidade e aforça iônica.

Em uma forma de realização, a composição é isotônica; emoutra, é hipertônica.

O termo o "isotônica" significa "isotônica com soro", isto é,em cerca de 300 ± 50 miliosmol/kg. A tonicidade tem em mira ser umamedida da osmolalidade da solução antes da administração. O termo"hipertônica" em por objetivo designar níveis de osmolalidade acima do nívelfisiológico do soro, tal como os níveis acima de 300 ± 50 miliosmol/kg.

A composição pode também incluir um tensoativo não iônico.Os tensoativos (também conhecidos como detergentes) geralmente incluemaqueles agentes que protegem a proteína dos estresses induzidos pela interfacede ar/solução e dos estresses induzidos pela solução/superfície (por exemploresultando na agregação da proteína).

Tipos típicos de tensoativos não iônicos são os polissorbatos,poloxâmeros, éteres alquílicos de polioxietileno, copolímeros de bloco depolietileno/polipropileno, polietileno glicol (PEG), estearatos depolioxietileno e óleos de mamona de polioxietileno.

Exemplos ilustrativos de tensoativos não iônicos são oTween®, o polissorbato 20, o polissorbato 80, Brij-35 (éter dodecílico depolioxietileno), poloxâmero 188, poloxâmero 407, PEG8000, polióisPluronic®, éter polióxi-23-laurílico, Myrj 49 e Cremophor A.

Em uma forma de realização, o tensoativo não iônico se achapresente em uma quantidade de 0,005 a 2,0 % em peso.

Em uma outra forma de realização, a composição compreendeainda um antioxidante (vi). Em diferentes formas de realização, o antioxidanteé selecionado do grupo consistindo de L-metionina, D-metionina, análogos demetionina, peptídeos contendo metionina, homólogos de metionina, ácidoascórbico, cisteína, homocisteína, glutationa, cistina e cistationina. Em umaforma de realização preferida, o antioxidante é L-metionina.

A concentração do antioxidante (vi) situa-se tipicamente nafaixa de 0,1 a 5,0 mg/ml, tal como na faixa de 0,1 a 4,0 mg/ml, na faixa de 0,1a 3,0 mg/ml, na faixa de 0,1 a 2,0 mg/ml, ou na faixa de 0,5 a 2,0 mg/ml.

Em formas de realização particulares, a composição não incluium antioxidante; ao invés, a suscetibilidade do polipeptídeo do Fator VII àoxidação é controlada por exclusão do ar atmosférico. O uso de umantioxidante pode, naturalmente, também ser combinado com a exclusão do aratmosférico.

Acredita-se que as soluções aquosas adequadas, úteis para osrecipientes da invenção, preferivelmente tenham uma concentração dopolipeptídeo do Fator VII ativado de mais do que 5 mg/ml, ou mais do que 6mg/ml, tal como mais do que 7 mg/ml, ou mais do que 8 mg/ml, ou mais doque 9 mg/ml, ou mesmo mais do que 10 mg/ml.

A composição solubilizada dentro do recipiente de preferênciaé aquela em que o polipeptídeo do Fator VII ativado seja "estável" como aquidefinido.

Várias modalidades do recipiente fechado parecem serparticularmente interessantes, por exemplo:

(i) Um recipiente como definido neste relatório, em que asolução aquosa compreende:

pelo menos 2,5 mg por mililitro em volume do recipiente dopolipeptídeo do Fator VII ativado (i);

um agente de tamponamento (ii) adequado para manter o pHna faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,5;

em que a força iônica da solução aquosa é de pelo menos 50 mM.

(ii) Um recipiente como definido neste relatório, em que asolução aquosa compreende:

pelo menos 2,5 mg por mililitro do volume do recipiente dopolipeptídeo do Fator VII ativado (i);

pelo menos um agente estabilizador (iiia) selecionado dos saisde cálcio em uma concentração na faixa de pelo menos 15 mM;

em que a força iônica da solução aquosa é de pelo menos 50 mM.(iii) Um recipiente como definido neste relatório, em que asolução aquosa compreende:

pelo menos um agente estabilizador do tipo divalente demetais da primeira série de transição (iiib) em que a relação molar entre oagente estabilizador (iiib) e o polipeptídeo de FVII fica acima de 0,5;

em que a força iônica da solução aquosa é de pelo menos 50 mM; e

(iv) Um recipiente como definido neste relatório, em que asolução aquosa compreende:

pelo menos um agente estabilizador do tipo debenzamidina/arginina (iiic) em que a relação molar entre o agenteestabilizador (iiic) e o polipeptídeo de FVII fica acima de 0,1;

em que a força iônica da solução aquosa é de pelo menos 50 mM.

Composição na forma seca

Em outra forma de realização, a composição se acha na formaseca; em particular a composição tem um conteúdo de umidade de não maisdo que cerca de 3 %. Preferivelmente, a composição se acha na formaliofilizada.

A fim de estabilizar a composição contra a degradação e asforças de cisalhamento em combinação com o processo de secagem porcongelamento, é vantajoso incluir pelo menos um agente de estabilidade, emparticular pelo menos um agente de estabilidade selecionado do grupoconsistindo de a) uma combinação de um antioxidante com manitol; b) umacombinação de metionina com um poliol; c) uma combinação de umsacarídeo com manitol; d) uma combinação de sacarose com um poliol; e e)metionina.

A estabilização das composições liofilizadas dos polipeptídeosdo Fator VII ativados é descrita em mais detalhes na WO 2004/000347, quefica aqui incorporada como referência.

Antes do uso do produto, a composição liofilizada éreconstituída em um líquido útil para a aplicação terapêutica em questão,tipicamente em um tampão aquoso. Um tal tampão aquoso pode compreenderum solvente aquoso, um tampão (ii), um ou mais agentes estabilizadores (iii),um ou mais agentes modificadores da tonicidade (v), um ou mais agentesmodificadores da força iônica (iv), um antioxidante (vi), etc., como aquiacima descrito.

Em particular, o recipiente (com sua composição "seca")produz um recipiente como mais acima definido, após a reconstituição dacomposição com uma solução aquosa.

A composição seca dentro do recipiente é preferivelmenteaquela em que o polipeptídeo do Fator VII ativado é "estável", como definidoneste relatório.

Preparação de um recipiente que contém a composição dopolipeptídeo do Fator VII ativado.

O recipiente fechado da invenção pode ser preparado de váriasmaneiras, como será evidente do seguinte. Tipicamente, os processos para apreparação do recipiente fechado compreende as etapas de (i) estabelecer opolipeptídeo do Fator VII ativado em uma forma concentrada; (ii) se aindanão estiver presente no recipiente adequado, carregar pelo menos uma porçãodo polipeptídeo do Fator VII ativado (tipicamente em uma solução) norecipiente de modo que o recipiente compreenda entre 2,5 a 90 mg dopolipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente; (iii)opcionalmente liofilizar o polipeptídeo do Fator VII concentrado; e (iv) selaro recipiente de modo a que se tenha o recipiente fechado.

ad(i)

Exemplos de vários processos adequados para se obter umconcentrado do polipeptídeo do Fator VII são descritos mais abaixo.

ad (ii)

Se ainda não estiver presente no recipiente adequado, carregarpelo menos uma porção do polipeptídeo do Fator VII concentrado (oconcentrado) no recipiente de modo que o recipiente compreenda entre 2,5 a90 mg do polipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro em volume dorecipiente. Antes de carregar ou em combinação com a carga, o concentradopode ser modificado pela adição de um tampão (ii), um ou mais agentesestabilizadores (iii), um ou mais agentes modificadores da tonicidade (v), umou mais agentes modificadores da força iônica (iv), um antioxidante (vi), etc.como descrito mais acima, e o produto pode ser ainda purificado, por exemplopor processos cromatográficos, processos mecânicos (por exemplo, filtração,tal como a filtração estéril ou a filtração viral), de modo a prover um produtoadequado para armazenagem no recipiente. Um tal recipiente fechado épreferivelmente conforme aqui mais acima definido.

ad (iii)

Em algumas formas de realização importantes, o concentrado[possivelmente após a modificação, conforme descrito acima sob (ii)] pode,após a carga no recipiente, ser submetido à secagem por congelamento demodo a que se obtenha um produto seco para armazenagem (ver tambémacima), o qual possa ser reconstituído como descrito acima.

Tipicamente, o recipiente é um frasco, carpule, seringa etc. Emuma forma de realização, o recipiente tem pelo menos dois compartimentos(por exemplo um carpule) em que um primeiro compartimento contenha opolipeptídeo do Fator VII ativado. Em uma sua variante, o polipeptídeo doFator VII ativado do primeiro compartimento está na forma liofilizada, e osegundo compartimento contém um solvente aquoso para o referidopolipeptídeo do Fator VII ativado. Em outra sua variante, o polipeptídeo doFator VII ativado do primeiro compartimento está em solução aquosa, e osegundo compartimento contém um solvente aquoso para o referidopolipeptídeo do Fator VII ativado. Em ambos os casos, o objetivo é que seseja capaz de preparar uma composição pronta-para-uso como aqui maisacima definido.

ad (iv)

Como uma etapa final, o recipiente é fechado ou selado demodo a propiciar o recipiente fechado pelos meios convencionais, porexemplo de modo a formar um frasco, um carpule etc. O recipiente podesubseqüentemente ser rotulado e embalado.

Cromatografia de Troca de Anions (AIEC)

Em uma variante importante, o concentrado é obtido com ummaterial de troca de ânions e incluindo lavagem e/ou eluição com um tampãode um pH predeterminado.

De acordo com este aspecto da invenção, é certamentepossível obter uma concentração do polipeptídeo do Fator VII de até pelomenos 16 mg/ml, conforme a seção Experimental, e é portanto previsto queotimização adicional de acordo com as diretrizes fornecidas neste relatóriodescritivo tornará possível fornecer concentrações adequadas para prepararrecipientes fechados como aqui definido, em que a quantidade de umpolipeptídeo do Fator VII ativado se situe na faixa de 2,5 a 90 mg por mililitroem volume do recipiente.

Em uma variante fundamental, o processo para concentraçãode uma substância medicamentosa de um polipeptídeo do Fator VII, referidoprocesso da referida substância medicamentos compreende as etapas de:

(a) colocar em contato a substância medicamentosa com ummaterial de troca de ânions sob condições que facilitem a ligação de umaporção da referida substância medicamentosa ao referido material de troca deânions (esta etapa é também designada "carga");

(b) lavar o referido material de troca de ânions com um tampãode lavagem tendo um pH na faixa de 5,5 a 7,0 ou, alternativamente, na faixade 8,5 a 9,5, com a presença de Ca 1 a 7 mM; e

(c) eluir o referido material de troca de ânions com um tampão

de eluição tendo um pH na faixa de 3,0 a 7,0, e coletar uma solução maisconcentrada do polipeptídeo do Fator VII como um eluído em comparaçãocom a carga.

Um pré-requisito para se obter um polipeptídeo do Fator VIIconcentrado por AIEC é a intensificação da intensidade de eluição, enquantose mantém uma solubilidade ótima do polipeptídeo do Fator VII durante alavagem e a eluição. Isto é, por exemplo, obtido por:

(a) manter o pH durante a carga em cerca de 5,5 a 7,0 ou,alternativamente, na faixa de 8,5 a 9,5, com a presença de CaZT 1 a 7 mM.

(b) manter a força iônica durante a lavagem em 40 a 250 mM(por exemplo, NaCl), preferivelmente em 75 a 100 mM (uma força iônicaacima de 150 mM pode causar a "sangria" do polipeptídeo do Fator VII); e

(c) aumentar a concentração do cálcio e/ou a força iônica (porexemplo, NaCl) durante a eluição e/ou reduzir o pH durante a eluição, porexemplo da faixa de 5,0 a 7,0 para a faixa de 3,0 a 4,9, tal como em umgradiente ou como uma etapa.

Embora não a ele limitados, o processo AIEC particularmenteé exeqüível para substâncias medicamentosas de um polipeptídeo do FatorVII em "escala industrial" (ou "larga escala"). Pela expressão "escalaindustrial" denotam-se tipicamente processos em que o volume dascomposições líquidas do polipeptídeo do Fator VII seja de pelo menos 100litros, tal como de pelo menos 500 litros, por exemplo de pelo menos 1000litros, ou de pelo menos 5000 litros, ou em que o peso das composições sejade pelo menos 100 kg, tal como de pelo menos 500 kg, por exemplo de pelomenos 1000 kg, ou de pelo menos 5000 kg.

Etapa (a) - Colocar em contato a substância medicamentosacom um material de troca de ânions

Em uma primeira etapa do processo, a substânciamedicamentosa do polipeptídeo do Fator VII é colocada em contato com ummaterial de troca de ânions. O objetivo é facilitar a ligação de uma porção dareferida substância medicamentosa do polipeptídeo do Fator VII ao referidomaterial de troca de íons.

Pelo termo "porção" em ligação com a etapa (a), denota-sepelo menos 30 % (isto é, de 30 a 100 %) da massa do polipeptídeo do FatorVII presente na substância medicamentosa do polipeptídeo do Fator VII.Deve ficar entendido que, na maioria dos casos, é desejável ligar muito maisdo que 30 % da massa dos polipeptídeos do Fator VII, por exemplo pelomenos 50 %, ou pelo menos 70 %, ou uma porção preponderante. Pelaexpressão "porção preponderante" denota-se pelo menos 90 % da massa dopolipeptídeo do Fator VII presente na substância medicamentosa dopolipeptídeo do Fator VII. Preferivelmente, uma porção ainda mais elevada setorna ligada ao material de troca de ânions, por exemplo pelo menos 95 % damassa, ou pelo menos 98 % da massa, ou pelo menos 99 % da massa, ouainda substancialmente toda a massa do polipeptídeo do Fator VII presente nasubstância medicamentosa do polipeptídeo do Fator VII.

A substância medicamentosa do polipeptídeo do Fator VIItipicamente origina-se de um processo de produção em escala industrial, porexemplo uma cultura celular, um animal clonado (por exemplo vacas, porcos,carneiros, cabras e peixes) ou insetos, ou coisa parecida, em particular de umacultura celular.

O material de troca de ânions é preferivelmente um material detroca de ânions forte, por exemplo um material de troca de ânions tendogrupos de amônio quaternário. Exemplos comerciais de tais materiais são oQ-Sepharose Fast Flow, o Q-Sepharose High Performance e o Mono Q daAmersham Biosciences, o POROS HQ 50 da PerSeptive Biosystems, eToyopearl Super Q da Tosoh Biosciences.

Uma disposição mais comum do material de troca de ânions éno formato de uma coluna. A disposição em um recipiente de batelada énaturalmente também possível.

A substância medicamentosa do polipeptídeo do Fator VII étipicamente obtida diretamente de uma etapa de purificação precedente, ou deuma etapa de purificação precedente com ajuste subseqüente do pH, da forçaiônica, quelação dos íons de metal divalentes, etc., o que quer que sejanecessário.

O pH da substância medicamentosa antes e após a aplicação aomaterial de troca de ânions desempenha um papel para a formação dosprodutos de degradação, tal como o desGla-Fator VII e degradação de cadeiapesada. Assim, é preferível que a substância medicamentosa esteja na formalíquida e tenha um pH na faixa de 5,5 a 7,0, por exemplo 5,7 a 6,5, emparticular 5,8 a 6,5 ou 5,5 a 6,2, após aplicação ao material de troca de íons.Para valores do pH abaixo de cerca de 5,5, a tendência com vistas à formaçãode dímeros se torna evidente, especialmente sem cálcio presente.Alternativamente, a solução de carga tem um pH na faixa de 8,5 a 9,5 com apresença de pequenas quantidades de cálcio, por exemplo de 1 a 7 mM.

Tipicamente, a condutividade situa-se na faixa de 2 a 30mS/cm, tal como de 5 a 15 mS/cm. A temperatura da substânciamedicamentosa é tipicamente de 0 a 15 °C, tal como ao redor de 2 a 10 °C.A temperatura do material de troca de ânions com opolipeptídeo do Fator VII ligado, é tipicamente de 0 a 15 °C, tal como aoredor de 2 alO °C, por exemplo mantida dentro de uma faixa especificadamediante o uso de uma camisa de resfriamento e soluções de temperaturacontrolada.

O contato da substância medicamentosa do polipeptídeo doFator VII é tipicamente conduzido de acordo com os protocolosconvencionais, isto é, a concentração, a temperatura, a força iônica, etc. dasubstância medicamentosa podem ser como usual, e o material de troca deânions pode ser lavado e equilibrado antes da aplicação, como usual.

A carga do polipeptídeo do Fator VII situa-se tipicamente nafaixa de 10 a 40 g, por exemplo 15 a30 g, de polipeptídeo do Fator VII porlitro de matriz (material de troca de ânions na forma úmida), e a substânciamedicamentosa é tipicamente aplicada em um fluxo de 3 a 200 volumes decoluna por hora.

Etapa (b) — Etapa de lavagem

Após ligação da substância medicamentosa do polipeptídeo doFator VII aos materiais de troca de ânions, uma etapa de lavagem (b) éconduzida de modo a aplicar-se uma força iônica adequada para solubilidadeótima do polipeptídeo do Fator VII antes do início da eluição. Esta etapatambém proporciona a remoção do desGla-Factor VII quando realizada empH < 7,0.

Esta etapa de lavagem (b) é preferivelmente efetuada com umtampão de lavagem tendo um pH na faixa de 5,5 a 7,0. Em algumas formas derealização interessantes, o tampão de lavagem tem um pH de no máximo 6,8,ou no máximo 6,7, ou no máximo 6,6, ou no máximo 6,5, ou no máximo 6,4.Preferivelmente, o pH situa-se na faixa de 5,7 a 6,5, em particular de 5,8 a 6,5ou de 5,5 a 6,2. Em algumas formas de realização interessantes, tais como acarga na presença de pequenas quantidades de cálcio até 7 mM, o pH durantea lavagem é mudado de cerca de pH 9,0 a pH de 5,5 a 7,0.

A etapa de lavagem (b) é tipicamente conduzida em um fluxode 3 a 200 volumes de coluna por hora.

O tampão de lavagem é tipicamente uma solução aquosa quecompreende um agente de tamponamento, tipicamente um agente detamponamento compreendendo pelo menos um componente selecionado dosgrupos consistindo em ácidos e sais de MES, PIPES, ACES, BES, TES,HEPES, TRIS, histidina, imidazol, glicina, glicilglicina, glicinamida, ácidofosfórico, ácido acético (por exemplo acetato de sódio), ácido láctico, ácidoglutárico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido maléico e ácidosuccínico. Deve ficar entendido que o agente de tamponamento podecompreender uma mistura de dois ou mais componentes, em que a mistura écapaz de prover um valor de pH na faixa especificada. Como exemplos,podem ser mencionados o ácido acético e o acetato de sódio, etc.

O tampão de lavagem pode também compreender sais etc.,tipicamente uma concentração de ânions que sejam suficientes para realizaruma eluição do polipeptídeo do Fator VII da coluna, por exemplocorrespondente a uma força iônica de 40 a 250 mM. No pH 6,0, o tampão delavagem pode ter uma composição de 50 a 250 mM de NaCl, cerca de 10 mMde histidina (agente de tamponamento), pH 6,0. Em todos os casos, éimportante que a força iônica do tampão de lavagem seja suficientementeelevada de modo a evitar eventual precipitação do polipeptídeo do Fator VII,mas não tão elevada que a "sangria" do polipeptídeo do Fator VII venha acomeçar.

Deve ficar entendido que a etapa de lavagem (b) pode serconduzida mediante o uso de um, dois ou vários diferentes tampões delavagem, ou pela aplicação de um tampão de lavagem gradiente.

Etapa (c) -Etapa de eluição

Após a(s) etapa(s) de lavagem, o material de troca de ânions éeluído com um tampão de eluição, e uma substância medicamentosaconcentrada do polipeptídeo do Fator VII é coletada como um eluído.

Uma grande quantidade de variabilidade é possível para aetapa de eluição (c). Se a eluição for conduzida bem rapidamente, a formaçãode quantidades significativas de desGla-Factor VII e degradação da cadeiapesada podem ser impedidas, mesmo que a eluição seja conduzida em um pHacima de 7,0. Entretanto, de modo a evitar-se a formação de desGla-FactorVII e da degradação da cadeia pesada, é preferível que o tempão de eluiçãotambém tenha um pH na faixa de 3,0 a 7,0, tal como na faixa de 4,0 a 7,0. Emalgumas formas de realização, interessantes, o tampão de eluição tem um pHde no máximo 6,8, ou no máximo 6,7, ou no máximo 6,6, ou no máximo 6,5,ou no máximo 6,4.

Parece que a presença de íons de cálcio nas quantidades de 5 a25 mM reduz a degradação; ver também os comentários daqui por diante comrespeito à força iônica.

A etapa de eluição (b) é tipicamente conduzida em um fluxode 3 a 200 volumes de coluna por hora.

A eluição pode ser realizada de várias maneiras, tal como comum tampão de eluição compreendendo cátion(s) divalente(s), conduzir umaeluição competitiva utilizando uma alta concentração de certos ânions, ouusar um gradiente de pH, ou uma combinação do anteriormente mencionado.

Em uma forma de realização, a eluição é efetuada por meio deum tampão de eluição compreendendo um ou mais cátions divalentes. Aconcentração do(s) cátion(s) divalente(s) é tipicamente de pelo menos 5 mM,por exemplo de pelo menos 10 mM, por exemplo pelo menos 15 mM, ouainda de pelo menos 30 mM.

O(s) cátion(s) divalente(s) preferivelmente inclui(em) pelomenos um cátion divalente selecionado do grupo consistindo em Ca, Sr,Mg2+ e Ba2+. Tais cátions divalentes têm uma tendência de ligar-se aodomínio de Gla dos polipeptídeos do Fator VII, e dessa forma facilitarão aliberação da substância medicamentosa do polipeptídeo do Fator VII domaterial de troca de ânions. Em uma forma de realização preferida, o(s)cátion(s) divalente(s) inclui(em) Ca .

O tampão de eluição tipicamente tem uma concentração do(s)cátion(s) divalente(s) de pelo menos 5 mM, tal como na faixa de 5 a 100 mM,por exemplo na faixa de 10 a 50 mM.

Em uma variante, o tampão de eluição é um tampão gradienteem relação ao(s) cátion(s) divalente(s) (por exemplo, Ca ), por exemplo umtampão de gradiente em que a concentração inicial do(s) cátion(s) divalente(s)(por exemplo, Ca ) situa-se na faixa de 0 a 20 mM, e a concentração finaldo(s) cátion(s) divalente(s) (por exemplo, Ca ) do tampão gradiente situa-sena faixa de 15 a 100 mM.

Em outra forma de realização, a etapa de eluição (c) éconduzida por eluição competitiva da substância medicamentosa com um oumais ânions, por exemplo ânions mono-, di- ou trivalentes. Tais ânions sãotipicamente selecionados do grupo consistindo em cloreto, acetato, malonato,fosfato, carbonato, sulfato e nitrato; em particular consistindo em cloreto(Cl"), acetato e malonato.

Em uma variante, o tampão de eluição tem uma concentraçãode Cl" na faixa de 100 a 800 mM, por exemplo de 200 a 500 mM.Alternativamente, o tampão de eluição é um tampão gradiente em relação aoCl", por exemplo um tampão gradiente em que a concentração inicial do Cl"situa-se na faixa de 0 a 300 mM, e a concentração final do Cl" situa-se nafaixa de 300 a 1000 mM.

Em uma outra variante, o tampão de eluição tem umaconcentração de malonato na faixa de 100 a 800 mM, por exemplo de 200 a500 mM. Alternativamente, o tampão de eluição é um tampão gradiente emrelação ao malonato, por exemplo um tampão gradiente em que aconcentração inicial do malonato situa-se na faixa de 0 a 300 mM, e aconcentração final do malonato situa-se na faixa de 300 a 1000 mM.

Em uma outra variante, o tampão de eluição tem umaconcentração de acetato na faixa de 100 a 1000 mM, por exemplo de 400 a800 mM. Alternativamente, o tampão de eluição é um tampão gradiente emrelação ao acetato, por exemplo um tampão gradiente em que a concentraçãoinicial do acetato situa-se na faixa de 0 a 400 mM, e a concentração final doacetato situa-se na faixa de 400 a 1000 mM.

Em ainda outra forma de realização, o tampão de eluição é umtampão gradiente em relação ao pH. Em uma variante deste, o pH inicial dotampão gradiente situa-se na faixa de 5,0 a 7,0, e o pH final do tampãogradiente situa-se na faixa de 3,0 a 4,9.

Com respeito à etapa de eluição (c) em geral, é preferível que aforça iônica do tampão de eluição se situe na faixa de 100 a 1000 mM, talcomo de 200 a 800 mM (por exemplo, NaCl).

Usualmente, o material de troca de ânions é regenerado com afinalidade de uso subseqüente por uma seqüência de etapas.

O presente processo é particularmente útil para se obter umasubstância medicamentosa concentrada de um polipeptídeo do Fator VII, e, seas condições para as etapas (a) a (c), com relação ao pH, foremapropriadamente selecionadas, será ainda possível minimizar a formação deprodutos de degradação das estruturas do polipeptídeo do Fator VII e dessemodo aumentar a produção total do processo enquanto se obtém umaconcentração muito alta do polipeptídeo do Fator VII.

Assim, uma forma de realização preferida da presenteinvenção provê um processo para a purificação de uma substânciamedicamentosa de um polipeptídeo do Fator VII, dita substânciamedicamentosa compreendendo um eluído de pelo menos 5 mg/ml dopolipeptídeo do Fator VII, referido processo compreendendo as etapas de:(a) proceder ao contato a substância medicamentosa com ummaterial de troca de ânions sob condições que facilitem a ligação de umaparte da referida substância medicamentosa ao referido material de troca deânions, referida substância medicamentosa estando na forma líquida e tendoum pH na faixa de 5,5 a 7,0 ou, alternativamente, na faixa de 8,5 a 9,5 com apresença de 1 a 7 mM Ca2+ ;

(b) lavar o referido material de troca de ânions com um tampãode lavagem tendo um pH na faixa de 5,5 a 7,0 e uma força iônica na faixa de75 a 100mM de NaCl; e

(c) eluir o referido material de troca de ânions com um tampãode eluição, o tampão de eluição tendo um pH na faixa de 2,0 a 7,0 ecompreendendo um cátion bivalente tal como cálcio, o tampão de eluiçãotendo uma intensidade de eluição com relação ao cátion bivalente de 10 a 30mM na presença de 100 a 300 mM de NaCl; usar unicamente o cátionbivalente para a eluição da concentração que deve ser de pelo menos 50 mM ecoletar uma solução concentrada do polipeptídeo do Fator VII como umeluído, a substância medicamentosa purificada coletada compreendendo umaconcentração do polipeptídeo FVIIa de pelo menos 5 mg/ml sem nenhumaumento notável nos produtos de degradação do polipeptídeo FVIIa.

Hidroxiapatita

Em uma variante do processo AIEC acima, mutatis mutandís,o processo para a preparação de um recipiente fechado compreendendo umpolipeptídeo do Fator VII ativado inclui, mutatis mutandis, as etapas de:

(a) colocar em contato uma solução compreendendo umpolipeptídeo do Fator VII com um material de hidroxiapatita sob condiçõesque facilitem a ligação de uma parte do referido polipeptídeo do Fator VII aoreferido material de hidroxiapatita (por exemplo, carregado até cerca de 15mg/ml de gel na presença de cálcio 10 mM);

(b) opcionalmente lavar o referido material de hidroxiapatitacom um tampão de lavagem (por exemplo, com o primeiro tampão delavagem de fosfato 0,1 M, pH 6,8 e depois fosfato 10 mM, pH 6,8 );

(c) eluir o referido material de hidroxiapatita com um tampãode eluição tendo um pH na faixa de 5,5 a 7,0 e coletar o eluído dopolipeptídeo do Fator VII ativado;

(d) carregar pelo menos uma parte do eluído em um recipientede modo que o recipiente compreenda a faixa de 2,5 a 9,0 mg do polipeptídeodo Fator VII ativado por ml em volume do recipiente;

(e) opcionalmente liofilizar o eluído; e

(f) selar o recipiente de modo a prover um recipiente fechado.

Em uma variante disto, foi possível obter uma concentração demassa de 8 mg/ml.

Ultrafiltração

Ultrafiltração (UF) é uma técnica de separação conduzida porpressão, com base em membrana, usada para separar partículas extremamentepequenas e moléculas dissolvidas em fluídos. A base primária para aseparação é o tamanho molecular, embora outros fatores tais como aconformação e a carga da molécula possam também desempenhar um papel.

As moléculas maiores do que os poros da membrana serão retidas nasuperfície da membrana e concentradas durante o processo de ultrafiltração.

Uma bomba pode ser usada para gerar um fluxo contínuo da solução atravésda membrana, evitando a formação de moléculas concentradas na superfícieda membrana, e para a geração da pressão necessária para forçar a água (oulíquido) e as moléculas pequenas, tais como componentes do tampão, atravésdos poros da membrana.

As propriedades de retenção das membranas da ultrafiltraçãosão expressas como Corte do Peso Molecular (MWCO). Este valor refere-seao peso molecular aproximado (MW) de um soluto globular diluído (isto é,proteína típica) que é 90 % retidos pela membrana. Entretanto, umaconformação da molécula pode ter um efeito direto sobre sua retenção poruma membrana. Por exemplo, moléculas lineares como DNA podemencontrar seu caminho através dos poros que venham a reter uma espécieglobular do mesmo peso molecular.

A composição de partida para tornar-se concentrada peloprocesso de ultrafiltração é tipicamente da mesma natureza da composição departida do processo AIEC descrito acima. A força iônica situa-se tipicamentena faixa de 40 a 250 mM, e é desejável incluir um ou mais agentes auxiliarestais como carboidratos (por exemplo, sacarose, manitol etc.) bem comotampões, agentes modificadores da tonicidade e agentes modificadores daforça iônica como descrito quanto à composição final acima. O pH dacomposição de partida situa-se tipicamente na faixa de 5,5 a 7,0, em particularna faixa de 5,5 a 6,5. A precipitação do polipeptídeo do Fator VII éfreqüentemente observada em pH abaixo de 5,5. Alternativamente, o pH podesituar-se na faixa de 9,0 a 10,0. Na maioria dos casos, é preferíveldesenvolver o processo em uma temperatura baixa, por exemplo na faixa de 0a 15 0C, tal como ao redor de 2 a 10 0C.

Existem três aplicações genéricas para a ultrafiltração:

1. Concentração. A ultrafiltração é um processo muitoeficiente para a concentração de proteína diluída (usualmente mais de 90 % derecuperação).

2. Dessalinização e Troca de Tampão (Diafiltração). Aultrafiltração provê uma maneira muito conveniente e eficiente de remover outrocar os sais, remover detergentes, separar moléculas ligadas, removermateriais de baixo peso molecular, ou mudar rapidamente o ambiente iônicoou de pH.

3. Fracionamento. A ultrafiltração não realizará uma separaçãopronunciada de duas moléculas com pesos moleculares semelhantes. Asmoléculas a serem separadas devem diferir em pelo menos uma ordem degrandeza (IOx) no tamanho para uma separação eficaz.

Para uma descrição mais ampla da ultrafiltração, ver, porexemplo: iiMicrofiltration and ultrafiltration. Principies and Applications."por Leos J. Zeman e Andrew L. Zydney. Mareei Dekker, Inc. 270 MadisonAvenue, New York (1996).

Conseqüentemente, o recipiente da invenção pode também serpreparado por um processo que compreende as etapas de:

(a) submeter uma solução que compreenda um polipetídeo doFator VII a ultrafiltração e/ou diafiltração de modo a se obter uma soluçãoconcentrada do polipetídeo do Fator VII;

(b) carregar pelo menos uma parte da solução concentrada emum recipiente de modo que o recipiente compreenda a faixa de 2,5 a 90 mg dopolipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente;

(c) opcionalmente liofilizar a solução; e

(d) selar o recipiente de modo a prover um recipiente fechado.

Precipitação

A concentração das proteínas pode ser feita precipitando-se asproteínas e depois dissolvendo o precipitado em um volume menor do mesmoou de um novo tampão. A precipitação pode ser realizada ajustando-se o pHe/ou adicionando-se um agente de precipitação. Entretanto, os agentes deprecipitação podem influenciar as proteínas (desnaturação, por exemplosolventes orgânicos), e podem terminar no precipitado e desse modo nasolução após dissolver novamente o precipitado. Alguns agentes deprecipitação são bem tolerantes às proteínas e podem ainda estabilizá-las, e osagentes de precipitação residual podem ser removidos posteriormente, porexemplo, por dessalinização, diafiltração (troca de tampão), diálise ousecagem por congelamento (remoção de solventes orgânicos, como o etanol).

O PEG é um polímero altamente solúvel, não carregado,inflamável, sem nenhuma ou com muito pouca tendência a desnaturar asproteínas. As proteínas podem, entretanto, ser precipitadas pelo PEG em ummodo seguro e suave, sem aumentar a condutividade.

Um processo geral comum de precipitação de proteína é acristalização em alta concentração de um sal, usualmente sulfato de amônio(NH4)2SO4, por causa de sua alta solubilidade. O sulfato de amônio é tambémpreferido porque ele não interage com as proteínas e pode ainda ter um efeitoestabilizante sobre as proteínas.

A temperatura em que os processos são desenvolvidos étipicamente de O a 15 0C, tal como ao redor de 2 a 10 °C.

Conseqüentemente, o recipiente de acordo com a invençãopode também ser preparado por um processo que compreende as etapas de:

(a) combinar uma solução saturada de sulfato de amônio comuma solução que compreenda um polipetídeo do Fator VII de modo a facilitara precipitação do polipetídeo do Fator VII;

(b) redissolver o polipeptídeo do Fator VII precipitado em umsolvente aquoso de modo a preparar uma solução concentrada do polipeptídeodo Fator VII;

(c) opcionalmente dessalinizar a referida solução concentrada;

(d) carregar pelo menos uma parte da solução concentrada emum recipiente de modo a que o recipiente compreenda a faixa de 2,5 a 9,0 mgdo polipetídeo do Fator VII ativado por ml em volume do recipiente;

(e) opcionalmente liofilizar a solução; e

(f) selar o recipiente de modo a prover um recipiente fechado.Liofilização

A liofilização, ou secagem por congelamento, é realizadausando-se um princípio simples da física chamado sublimação. A sublimaçãoé a transição de uma substância do estado sólido para o estado gasoso, semprimeiro passar através de uma fase líquida intermediária. Para extrair a águade uma solução congelada de, por exemplo, proteínas, o processo deliofilização consiste em:

1. Congelar a solução de modo que a água na solução se torne gelo;

2. Sob vácuo, sublimar o gelo diretamente em vapor de água;

3. Retirar o vapor de água.

4. Uma vez o gelo esteja sublimado, os solutos (proteínas) sãosecados por congelamento e podem ser recuperados.

Para um descrição mais ampla da secagem por congelamento,ver por exemplo iiFreeze-DryingZLyophilization of Pharmaceutical andBiological Products, Segunda Edição, Série: Drugs and the PharmaeeutiealSciences, Volume: 137, Mareei Dekker, Inc. 270 Madison Avenue, New York(2004).

Conseqüentemente, o recipiente de acordo com a invençãopode também ser preparado por um processo que compreenda as etapas de:

(a) liofilizar uma solução que compreenda um polipeptídeo doFator VII de modo a obter-se uma composição do polipeptídeo do Fator VIItendo um conteúdo de umidade de não mais do que cerca de 3%;

(b) redissolver o polipeptídeo do Fator VII liofilizado em umsolvente aquoso de modo a preparar uma solução concentrada do polpeptídeodo Fator VII;

(c) opcionalmente dessalinizar a referida solução concentrada;

(d) carregar pelo menos uma parte da solução concentrada emum recipiente de modo a que o recipiente compreenda a faixa de 2,5 a 90 mgdo polipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente;

(e) opcionalmente liofilizar a solução; e

(f) selar o recipiente de forma a prover um recipiente fechado.

Uso do recipiente que contém a composição do polipeptídeodo Fator VII ativado

Os produtos farmacêuticos representados pelos recipientesfechados são particularmente úteis para aplicações terapêuticas em que umaquantidade razoavelmente grande do polipeptídeo do Fator VII ativado podeser provida com um recipiente. Assim, a presente invenção em particularprovê produtos farmacêuticos conforme aqui definido para uso como ummedicamento, mais particularmente para uso como um medicamento paratratar de uma síndrome responsiva ao Fator VII, tal como, por exemplo,distúrbios de sangramento, incluindo aqueles causados por deficiências doFator de coagulação (por exemplo, hemofilia A, hemofilia B, deficiência doFator XI de coagulação, deficiência do Fator VII de coagulação); portrombocitopenia ou doença de Von Willebrand, ou por inibidores do Fator decoagulação, e hemorragia intracerebral, ou sangramento excessivo dequalquer causa. As preparações podem também ser administradas a pacientesem associação com cirurgia ou outros traumas ou a pacientes que recebamterapia anticoagulante, em particular em que tais condições requeiram umadose de mais do que 40 μg/kg do peso corporal.

O termo "tratamento" é definido como o controle e otratamento de um paciente, por exemplo um mamífero, em particular um serhumano, com a finalidade de combater a doença, a condição ou o distúrbio einclui a administração de um polipeptídeo do Fator VII para prevenir ocomeço dos sintomas ou complicações, ou aliviar os sintomas oucomplicações, ou eliminar a doença, a condição ou o distúrbio. Ascomposições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, contendo umpolipeptídeo do Fator VII podem ser administradas parenteralmente apacientes em necessidade de um tal tratamento. A administração parenteralpode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa pormeio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta.

Alternativamente, a administração parenteral pode ser realizada por meio deuma bomba de infusão. Nas formas de realização importantes, a composiçãofarmacêutica é adaptada à injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosade acordo com os métodos conhecidos na técnica.

Um kit e um método para usar o kit.

Em vista do acima, a presente invenção também provê um kitincluindo o novo recipiente acima definido. Assim, a presente invenção provêum kit que compreende (i) um primeiro recipiente fechado contendo umacomposição farmacêutica sólida de um polipeptídeo do Fator VII ativado e(ii) um segundo recipiente contendo um solvente líquido, aquoso, para areferida composição farmacêutica sólida, em que o primeiro recipientecontém uma composição compreendendo a faixa de 2,5 a 9,0 mg dopolipeptídeo do Fator VII ativado por ml em volume do primeiro recipiente.

O primeiro recipiente, a composição e o polipeptídeo do FatorVII ativado, são em geral e especificamente conforme definido acima quantoao recipiente fechado.

Em uma modalidade, o primeiro recipiente e o segundorecipiente são dispostos como um carpule em que um compartimentocorresponde ao primeiro recipiente e o outro compartimento adjacentecorresponde ao segundo recipiente.

A presente invenção também provê o uso médico do kit, umprocesso para a preparação de uma composição farmacêutica aquosa líquidapronta-para-uso de um polipeptídeo do Fator VII ativado, de um kit conformedefinido acima, o método compreendendo misturar a composiçãofarmacêutica sólida do primeiro recipiente com pelo menos uma fração dosolvente líquido aquoso do segundo recipiente, de modo a formar acomposição farmacêutica líquida aquosa pronta-para-uso de um polipeptídeodo Fator VII ativado.

Em uma variante do método, essencialmente todo o solventelíquido aquoso do segundo recipiente é misturado com a composiçãofarmacêutica sólida do primeiro recipiente.

Polipeptídeo do Fator VII ativadoComo aqui usadas, as expressões "FVH", "polipeptídeo doFator VII" ou "polipeptídeo FVH" significam qualquer proteína quecompreenda a seqüência de aminoácidos 1 a 406 do Fator VIIa humano dotipo selvagem (isto é, um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidosapresentada na Patente U.S. n2 4.784.950), suas variantes, assim como ospolipeptídeos relacionados ao Fator VII, os derivados do Fator VII e osconjugados do Fator VII. Isto inclui variantes FVII, polipeptídeosrelacionados ao Fator VII, derivados do Fator VII e conjugados do Fator VIIapresentando atividade biológica substancialmente a mesma ou melhorada emrelação ao Fator VIIa humano do tipo selvagem.

A expressão "Fator VII" inclui os polipeptídeos do Fator VIIem sua forma não clivada (zimogênio), bem como aqueles que tenham sidoproteoliticamente processados para produzir suas respectivas formasbioativas, os quais podem ser designados de Fator Vila. Tipicamente, o FatorVII é clivado entre os resíduos 152 e 153 para produzir o Fator Vila. Taisvariantes do Fator VII podem apresentar diferentes propriedades em relaçãoao Fator VII humano, incluindo a estabilidade, a ligação fosfolipídica, aatividade específica alterada, etc.

Como aqui usado, "FVIIa humano tipo selvagem" é umpolipeptídeo que tem a seqüência de aminoácidos apresentada na Patente U.S.n- 4.784.950.

Como aqui usado, "polipeptídeos relacionados ao Fator VII"inclui polipeptídeos, incluindo variantes, em que a atividade biológica doFator VIIa tenha sido substancialmente modificada, tal como reduzida, emrelação à atividade do Fator VIIa do tipo selvagem. Estes polipeptídeosincluem, sem limitação, o Fator VII ou o Fator VIIa em que as alteraçõesespecíficas da seqüência de aminoácidos tenham sido introduzidas as quaismodifiquem ou rompam a bioatividade do polipeptídeo.

A expressão "derivado do Fator VII", como aqui usada, sedestina a designar um polipeptídeo FVII que apresente substancialmente igualou melhorada atividade biológica em relação ao Fator VII do tipo selvagem,em que um ou mais dos aminoácidos do peptídeo precursor tenham sidogeneticamente e/ou quimicamente e/ou enzimaticamente modificados, porexemplo por alquilação, glicosilação, PEGilação, acilação, formação de ésterou formação de amida, ou coisa parecida. Isto inclui, porém sem limitar, oFator VIIa humano PEGilado, o Fator VIIa humano PEGilado de cisteína evariantes destes. Exemplos não limitativos dos derivados do Fator VIIincluem os derivados de FVII Glico Pegilados como apresentados na WO03/31464 e nos pedidos de Patentes U.S. 20040043446, U.S. 20040063911,U.S. 20040142856, U.S. 20040137557, e U.S. 20040132640 (NeoseTechnologies, Inc.); os conjugados de FVII como apresentados nas WO01/04287, pedido de patente U.S 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465(Maxygen ApS) e WO 02/02764, pedido de patente U.S. 20030211094(University of Minnesota).

A expressão "atividade biológica melhorada" refere-se apolipeptídeos FVII com i) substancialmente a mesma, ou aumentada,atividade proteolítica em comparação com o Fator VIIa humano recombinantedo tipo selvagem ou ii) a polipeptídeos FVII substancialmente com a mesma,ou aumentada, atividade de ligação ao TF em comparação com o Fator VIIahumano recombinante do tipo selvagem, ou iii) a polipeptídeos FVIIsubstancialmente com a mesma, ou aumentada, meia-vida no plasmasangüíneo, em comparação com o Fator VIIa humano recombinante do tiposelvagem.

A expressão "Fator VIIa humano PEGilado" significa Fator VIIahumano, tendo uma molécula de PEG conjugada a um polipeptídeo do FatorVIIa humano. Deve ser entendido que a molécula de PEG pode ser ligada aqualquer parte do polipeptídeo do Fator Vila, incluindo qualquer resíduo deaminoácido ou componente carboidrato do polipeptídeo do Fator Vila. Aexpressão "Fator VIIa humano PEGilado de cisteína" significa o Fator VIIatendo uma molécula de PEG conjugada a um grupo sulfidrila de uma cisteínaintroduzida no Fator VIIa humano.

Exemplos não limitativos das variantes do Fator VII tendosubstancialmente a mesma, ou melhorada, atividade proteolítica emcomparação com o Fator VIIa humano recombinante do tipo selvagem,incluem S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998); variantes de FVIIa apresentando estabilidade proteolíticaaumentada conforme apresentado na Patente U.S. na 5.580.560; Factor VIIaque tenha sido proteoliticamente clivado entre os resíduos 290 e 291 ou entreos resíduos 315 e 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505,1995); formas oxidadas do Fator Vila, (Kornfelt et al., Arch. Biochem.Biophys. 363: 43-54, 1999); variantes de FVII como apresentadas naPCT/DK02/00189 (correspondente à WO 02/077218); e variantes de FVIIapresentando atividade proteolítica aumentada como apresentado na WO02/38162 (Scripps Research Institute); variantes de FVII tendo um domíniode Gla modificado e apresentado uma ligação de membrana intensificadacomo apresentado na WO 99/20767, patentes U.S. 6017882 e U.S. 6747003,pedido de patente U.S. 20030100506 (University of Minnesota) e WO00/66753, pedidos de patentes U.S. 20010018414, U.S. 2004220106 e U.S.200131005, patentes U.S. 6.762.286 e U.S. 6.693.075 (University ofMinnesota); e variantes de FVII como apresentadas nas WO 01/58935,patente U.S. 6.806.063, pedido de Patente U.S. 20030096338 (MaxygenApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO04/083361 (Maxygen ApS) e WO 04/111242 (Maxygen ApS), bem como naWO 04/108763 (Canadian Blood Services).

Exemplos não limitativos das variantes de FVII tendoatividade biológica aumentada em comparação com FVIIa do tipo selvagem,incluem as variantes de FVII apresentadas nas WO 01/83725, WO 02/22776,WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (correspondente à WO 03/027147),pedido de patente dinamarquesa PA 2002 01423 (correspondente à WO04/029090), pedido de patente dinamarquesa PA 2001 01627 (correspondenteà WO 03/027147); WO 02/38162 (Scripps Research Institute); e variantes deFVIIa com atividade intensificada como apresentado na JP 2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.).

Exemplos de variantes do fator VII incluem, sem limitação,L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, Vl 58T/M298Q-FVII, Vl 58D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVIIM298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVIIV15 8D/E296V/M298Q/L305V-F VII, V15 8D/E296V/M298Q/K3 3 7A-F VIIV158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVIIE296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII e S336G-FVII, L3 05V/K33 7A-F VII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVIIL305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVIIL305V/K337A/M298Q-FVII,L305V/K337A/V 15 8D-F VII,L305V/V 158D/E296V-FVII,L305V/V158T/E296V-FVII,L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,L305V/V 158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,L305V/V 158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,L3 05V/K33 7A/E296V-F VIIL305V/V 15 8D/M298Q-F VIIL305V/V158T/M298Q-FVIIL305V/E296V/M298Q-FVIIL305V/V158T/E296V/M298Q-FVIIL3 05V/V 15 8T/E296V/K33 7A-F VIIL305V/V 15 8D/E296V/K33 7A-F VIIS314E/K316Q-FVII,S314E/V15 8D-F VII,S314E/V158T-FVII,K316H/V15 8D-F VII,K316H/V15 8T-F VII,K316Q/V15 8D-F VII,S314E/L305V-FVII,S314E/E296V-FVII,K316H/L305V-FVII,K316H/E296V-FVII,K316Q/L305V-FVII,K316Q/E296V-FVII,S314E/K316H-F VIIS314E/K337A-FVIIS314E/M298Q-FVIIK316H/K33 7A-F VIIK316H/M298Q-FVIIK316Q/K33 7A-F VIIK316Q/M298Q-FVIIΚ316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-F VII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII,S314E/L305 V/V 15 8T-F VII, S314E/L3 05V/K337A/V15 8T-F VII,S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII,S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII,S314E/L305V/V 15 8D/E296V-F VII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII,S314E/L305V/V 158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,S314E/L305V/V 158T/E296V/M298Q-FVII,S314E/L3 05V/V 15 8T/K337A/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,S314E/L3 05V/V 15 8T/E296V/M298Q/K33 7A-FVII, K316H/L305V/K337A-F VII, K316H/L3 05V/V 158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII,K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII,K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII,K316H/L305V/V 158D/M298Q-FVII,K316H/L305V/V 158D/E296V-FVII,K316H/L305V/V 15 8T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII,K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V 158D/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,K316H/L305V/Vl 58D/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/V 15 8D/E296V/K337A-F VII,K316H/L305V/V 158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,Κ316H/L305V/V 158T/E296V/M298Q/K33 7A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L3 05V/V 15 8D-F VII, K316Q/L305V/E296V-FVII,K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII,Κ316Q/L305V/K337A/V 15 8T-F VII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,Κ316Q/L305V/V 158D/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V 158D/E296V-FVII,Κ316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, Κ316Q/L305V/V158T/E296V-FVII,Κ316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII,Κ316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,Κ316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,Κ316Q/L305V/Vl 58T/K337A/M298Q-FVII,Κ316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,Κ316Q/L305V/V 158D/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,Κ316Q/L305V/V 158D/E296V/M298Q/K33 7A-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/V 15 8D-F VII, F374Y/E296V-FVII,F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII,F3 74Y/L305V/K33 7A-F VII,F3 74Y/L3 05V/E296V-F VII,F3 74Y/L3 05V/V 15 8T-F VII,F3 74Υ/Κ337A/S314E-F VII,F374Y/K337A/M298Q-FVII,F374Y/K337A/V158D-FVII,F374Y/V158D/M298Q-FVII,F3 74Y/V 15 8T/S314E-FVII,F3 74Y/V 15 8Τ/Ε296V-F VII,F374Y/S314E/M298Q-FVII,F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII,F3 74Υ/Κ337A-F VIIF374Y/M298Q-FVIIF374Y/L3 05V-FVIIF374Y/L305V/V158D-FVIIF3 74Y/L3 05V/M298Q-F VIIF3 74Y/L3 05V/S314E-F VIIF3 74Υ/Κ337A/V 15 8T-F VIIF3 74Υ/Κ337Α/Ε296V-F VIIF3 74Y/V 15 8D/S314E-F VIIF374Y/V15 8D/E296V-FVIIF3 74Y/V 15 8T/M298Q-FVIIF3 74Υ/Ε296V/S314E-F VIIF3 74Y/E296V/M298Q-FVIIF3 74Y/L305V/K33 7Α/Ε296V-F VIIF3 74Y/L3 05V/K33 7A/M298Q-F VII,F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII,F3 74Υ/Κ337A/S314E/V15 8T-F VII,F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII,F3 74Υ/Κ337 A/V15 8T/M298Q-F VII,F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII,F3 74Υ/Κ3 3 7Α/Ε296V/V 15 8D-F VII,F3 74 Y/V 15 8D/S314E/E296V-F VII,F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII,F3 74Y/V15 8T/M298Q/E296V-F VII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII,F3 74Y/E296V/M298Q/K33 7A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII,F3 74Y/L3 05V/E296V/M298Q/S314E-F VII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/V15 8D/E296V/M298Q/S314E-F VII,F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII,F374 Y/V15 8D/M298Q/K337A/S314E-F VII,F374Y/V 15 8D/E296V/K33 7A/S314E-F VII,F374Y/L3 05V/V 15 8D/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L3 05V/V 15 8D/E296V/K337A-F VII,F374Y/L305V/V 15 8D/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII,F374Y/L305V/K337A/V158T-FVIIF3 74Y/L305V/V 15 8D/E296V-F VIIF3 74Y/L305V/V 15 8D/S314E-F VIIF374Y/L305V/E296V/V158T-FVIIF374Y/L305V/M298Q/V158T-FVIIF3 74Y/L305V/V 15 8T/S314E-F VIIF374Y/K337A/S314E/M298Q-FVIIF3 74Y/K33 7A/S314E/V15 8D-F VIIF3 74Y/K3 37A/V 15 8T/E296V-F VIIF374Y/K33 7A/M298Q/V15 8D-F VIIF374Y/V158D/S314E/M298Q-FVIIF3 74Y/V15 8D/M298Q/E296V-F VIIF3 74Y/V15 8T/S314E/M298Q-F VIIF3 74Y/E296V/S314E/M298Q-FVIIF374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,F3 74Y/V15 8T/E296V/M298Q/S314E-F VII,F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII,F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII,F3 74Y/L305V/V 15 8T/E296V/M298Q-F VII,F374Y/L305V/V 158T/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L3 05V/V 15 8T/E296V/K3 3 7A-F VII,F3 74Y/L305V/V 15 8T/M298Q/S314E-F VII,F3 74Y/L3 05V/V 15 8T/E296V/S314E-F VII,F3 74Y/E296V/M298Q/K3 3 7A/V15 8T/S314E-F VII,F3 74Y/V 15 8D/E296V/M298Q/K3 3 7A/S314E-F VII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-F VII,F3 74Y/L3 05V/E296V/K337A/V15 8T/S314E-F VII,F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V 15 8D/E296V/M298Q/K33 7A-FVII,F3 74Y/L3 05V/V 15 8D/E296V/K3 3 7A/S314E-F VII,F3 74Y/L3 05V/V 15 8D/M298Q/K337A/S314E-F VII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-F VII,F374Y/L305V/V 15 8D/E296V/M298Q/K337A/S314E-F VII, S52A-Fator VII, S60A-Fator VII; R152E-Fator VII, S344A-Fator VII, T106N-FVII,K143N/N145 T-F VII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII,R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; e FVII tendosubstituições, adições ou deleções na seqüência de aminoácidos de 304Arg a329Cys; e FVII tendo substituições, adições ou deleções na seqüência deaminoácidos de 153Ile a 223Arg.

Para os fins da invenção, a atividade biológica dospolipeptídeos do Fator VII ("atividade biológica do Fator VII") pode serquantificada pela medida da capacidade de uma preparação para promover acoagulação sangüínea com o uso de plasma deficiente do Fator VII etromboplastina, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. n° 5.997.864.Neste ensaio, a atividade biológica é expressa como a redução no tempo decoagulação em relação a uma amostra de controle e é transformada em"unidades do Fator VII" pela comparação com um padrão de soro humanoreunido contendo 1 unidade/ml de atividade do Fator VII. Alternativamente aatividade biológica do Fator VIIa pode ser quantificada por

(i) medir a capacidade do polipeptídeo do Fator VII paraproduzir o Fator X ativado (Fator Xa) em um sistema compreendendo o TFimplantado em uma membrana lipídica e Fator X. (Persson et al., J. Biol.Chem. 272: 19919-19924, 1997);

(ii) medir a hidrólise do Fator X em um sistema aquoso["Ensaio de Proteólise In Vitro" (Ensaio 2), abaixo];

(iii) medir a ligação física do polipeptídeo do Fator VII ao FTcom o uso de um instrumento com base na ressonância de plásmon superficial(Persson, FEBSLetts. 413: 359-363, 1997);

(iv) medir a hidrólise de um substrato sintético pelopolipeptídeo do Fator VII ["Ensaio de Hidrólise In Vitro" (Ensaio 1), abaixo]; e

(v) medir a geração da trombina em um sistema in vitroindependente do TF ["Ensaio de geração da trombina" (Ensaio 3, abaixo].

Em algumas formas de realização, o polipeptídeo do Fator VIIé o Fator VIIa humano, preferivelmente o Fator VIIa humano produzidorecombinantemente.

Em outras formas de realização, o polipeptídeo do Fator VII éuma variante da seqüência do Fator VII.

Em algumas formas de realização, o polipeptídeo do Fator VIItem uma glicosilação diferente do Fator VII humano do tipo selvagem.

Em várias formas de realização, por exemplo aquelas em que opolipeptídeo do Fator VII seja um polipeptídeo relacionado ao Fator VII ouuma variante da seqüência do Fator VII, a relação entre a atividade dopolipeptídeo do Fator VII e a atividade do Fator VIIa humano nativo (FVIIado tipo selvagem) é de pelo menos cerca de 1,25, preferivelmente pelo menoscerca de 2,0, ou 4,0, o mais preferível de pelo menos cerca de 8,0, quandotestada no "Ensaio de Proteólise In Vitro (Ensaio 2), como descrito nopresente relatório descritivo.

Em algumas formas de realização, os polipeptídeos do FatorVII são polipeptídeos relacionados ao Fator VII, em particular variantes, emque a relação entre a atividade do referido polipeptídeo do Fator VII e aatividade do Fator VIIa humano nativo (FVIIa do tipo selvagem) é de pelomenos cerca de 1,25, testada no "Ensaio de Hidrólise In Vitro" (ver Ensaio 1abaixo); em outras formas de realização, a relação é de pelo menos cerca de2,0; em outras formas de realização, a relação é de pelo menos cerca de 4,0.

As composições de acordo com a presente invenção são úteiscomo composições estáveis e, preferivelmente, prontas-para-uso, dospolipeptídeos do Fator VII. As composições são tipicamente estáveis por pelomenos seis meses e, preferivelmente, até 36 meses, quando armazenadas emtemperaturas variando de 2 0C a 8 °C.

O termo "Estável" denota que (i) após a armazenagem de 6meses em 2 0C a 8 0C, a composição conserva pelo menos 50 % de suaatividade biológica inicial medida por um ensaio de coágulo de um estágio(Ensaio 4), ou (ii) após armazenagem por 6 meses em 2 0C a 8 °C, o aumentono conteúdo dos produtos de degradação de cadeia pesada é no máximo de 40% (p/p) do conteúdo inicial do polipeptídeo do Fator VII.

A expressão "conteúdo inicial" diz respeito à quantidade depolipeptídeo do Fator VII adicionado a uma composição após a preparação dacomposição.

Preferivelmente, a composição estável conserva pelo menos 70%, tal como pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, oupelo menos 95 %, se sua atividade biológica após armazenagem por 6 mesesem 2 a 8 °C.

Preferivelmente, em várias formas de realização, o aumento noconteúdo dos produtos de degradação da cadeia pesada nas composiçõesestáveis é de não mais do que cerca de 30 % (p/p), não mais do que cerca de10 % (p/p), não mais do que cerca de 5 % (p/p), ou não mais do que cerca de3 % (p/p), do conteúdo inicial do polipeptídeo do Fator VII.

Em uma forma de realização preferida, a composição (i) após aarmazenagem por 6 meses em 20 0C a 28 °C, conserva pelo menos 50 % desua atividade biológica inicial medida por um ensaio de coágulo de umestágio (Ensaio 4) ou (ii) após armazenagem por 6 meses em 20 0C a 28 °C, oaumento no conteúdo dos produtos de degradação de cadeia pesada é de nomáximo 40 % (p/p) do conteúdo inicial do polipeptídeo do Fator VII. Em umaforma de realização mais preferida, a composição (i), após armazenagem por6 meses em 37 0C a 43 °C, conserva pelo menos 50 % de sua atividadebiológica inicial medida por um ensaio de coágulo de um estágio (Ensaio 4),ou (ii) após armazenagem por 6 meses em 37 0C a 43 °C, o aumento noconteúdo dos produtos de degradação de cadeia pesada é de no máximo 40 %(p/p) do conteúdo inicial do polipeptídeo do Fator VII.

Preparação e purificação dos polipeptídeos do Fator VII

O Fator VIIa purificado humano, adequado para uso napresente invenção, é preferivelmente produzido pela tecnologia recombinantedo DNA, por exemplo como descrito por Hagen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 83: 2412-2416, 1986, ou como descrito na Patente Européia ns 0 200421 (ZymoGenetics, Inc.).

O Fator VII também pode ser produzido pelos métodosdescritos por Broze e Majerus, J. Biol Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 e porHedner e Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983. Estes métodosproduzem o Fator VII sem quantidades detectáveis de outros Fatores dacoagulação sangüínea. Uma preparação do Fator VII ainda mais purificadapode ser obtida pela inclusão de uma filtração em gel adicional como a etapafinal de purificação. O Fator VII é então transformado no Fator VIIa ativadopor meios conhecidos, por exemplo por várias proteínas plasmáticasdiferentes, tais como os Fatores XIIa, IXa ou Xa, Alternativamente, comodescrito por Bjoern et ai. (Research Disclosure, 269 setembro de 1986, pp.564-565), o Fator VII pode ser completamente ativado pela sua passagematravés de uma coluna de cromatografia de troca de íons, tal como a Mono Q®(Pharmacia fine Chemicals) ou coisa parecida, ou por autoativação emsolução.

Os polipeptídeos relacionados ao Fator VII podem serproduzidos pela modificação do Fator VII do tipo selvagem ou pelatecnologia recombinante. Os polipeptídeos relacionados ao Fator VII comseqüência de aminoácidos alterada em comparação com o Fator VII do tiposelvagem, podem ser produzidos pela modificação da seqüência de ácidosnucléicos codificando o Fator VII do tipo selvagem ou pela alteração doscódons de aminoácidos ou pela remoção de alguns códons de aminoácidos noácido nucléico codificando o Fator VII natural por meios conhecidos, porexemplo pela mutagênese específica do sítio.

Será evidente àqueles habilitados na técnica que substituiçõespodem ser feitas fora das regiões críticas à função da molécula do Fator VIIae ainda resultarem em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácidosessenciais à atividade do polipeptídeo do Fator VII, e portantopreferivelmente não sujeitos a substituição, podem ser identificados de acordocom procedimentos conhecidos na técnica, tais como a mutagênese dirigidaao sítio ou a mutagênese de varredura da alanina. (ver, por exemplo,Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica maisrecente, as mutações são introduzidas em cada resíduo positivamentecarregado na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadasquanto ao coagulante, respectivamente a atividade de ligação cruzada paraidentificar os resíduos de aminoácidos que são críticos à atividade damolécula. Os sítios da interação de substrato-enzima podem também serdeterminados pela análise da estrutura tridimensional conforme determinadopor técnicas tais como a análise de ressonância magnética nuclear, acristalografia ou a rotulagem de fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos etal., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of MolecularBiology 224: 899-904; Wlodaver et al, 1992, FEBSLetters 309: 59-64).

A introdução de uma mutação na seqüência de ácido nucléicopara trocar um nucleotídeo por outro nucleotídeo, pode ser realizada pelamutagênese dirigida ao sítio com o uso de qualquer dos métodos conhecidosna técnica. Particularmente útil é o procedimento que utiliza um vetor deDNA de filamento duplo superespiralado com um inserto de interesse e doisiniciadores sintéticos contendo a mutação desejada. Os iniciadores deoligonucleotídeos, cada um complementar aos filamentos opostos do vetor, seestendem durante a ciclagem da temperatura por meio da Pfu DNApolimerase. Na incorporação dos iniciadores, um plasmídeo transformadocontendo quebras escalonadas é gerado. Em seguida à ciclagem datemperatura, o produto é tratado com DpnI que seja específico para o DNAmetilado e hemimetilado para digerir o padrão de DNA precursor e paraselecionar quanto ao DNA sintetizado contendo mutação. Outrosprocedimentos conhecidos na técnica para criar, identificar e isolar variantestambém podem ser usados, tais como, por exemplo, o rearranjo dos genes outécnicas de apresentação de fagos.

A separação dos polipeptídeos de suas células de origem podeser obtida por qualquer processo conhecido na técnica, incluindo, semlimitação, a remoção do meio de cultura celular contendo o produto desejadode uma cultura de células aderentes; centrifugação ou filtração para removeras células não aderentes; e outros.

Opcionalmente, os polipeptídeos do Fator VII podem ser aindapurificados. A purificação pode ser obtida com o uso de qualquer processoconhecido na técnica, incluindo, sem limitação, a cromatografia de afinidade,tal como, por exemplo, em uma coluna de anticorpos anti-Fator VII (ver, porexemplo, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097, 1986; e Thim et al.,Biochem. 27: 7785, 1988); a cromatografia de interação hidrofóbica; acromatografia de troca de íons; a cromatografia de exclusão de tamanho;procedimentos eletroforéticos [por exemplo, a focalização isoelétrica (IEF)preparativa], a solubilidade diferencial (por exemplo, a precipitação do sulfatode amônio), ou extração e outros. Ver, de forma geral, Scopes, ProteinPurification, Springer-Verlag, New York, 1982; e Protein Purification, J. C.Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989. Em seguidaà purificação, a preparação preferivelmente contém menos do que 10 % empeso, mais preferível menos do que 5 % e o mais preferível menos do que 1%, dos polipeptídeos não do Fator VII derivado da célula hospedeira.

Se não completamente ativados na preparação do concentradodo polipeptídeo do Fator VII, os polipeptídeos do Fator VII podem serativados por clivagem proteolítica, usando-se o Fator XIIa ou outras proteasestendo especificidade semelhante à tripsina, tal como, por exemplo, o FatorIXa, a calicreína, o Fator Xa e a trombina. Ver, por exemplo, Osterud et al.,Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, Patente U.S. n° 4.456.591; e Hedner etal., J. Clin. Invest. 71: 1836 (1983). De forma alternativa, os polipeptídeos doFator VII podem ser ativados pela sua passagem através de uma coluna decromatografia de troca de íons, tal como a Mono Q® (Pharmacia) ou coisaparecida, ou pela autoativação em solução.

EXPERIÊNCIASMétodos gerais

Ensaios adequados para determinar a atividade biológica dospolipeptídeos do Fator VII

Os polipeptídeos do Fator VII úteis de acordo com a presenteinvenção podem ser selecionados por ensaios adequados que podem serrealizados como testes preliminares in vitro simples. Assim, o presenterelatório descritivo apresenta um teste simples (intitulado "Ensaio deHidrólise In Vitro"*) quanto à atividade dos polipeptídeos do Fator VII.

Ensaios da Hidrólise In Vitro (Ensaio 1)

O Fator VIIa e o polipeptídeo do Fator VII nativos (tiposelvagem) (ambos daqui por diante referidos como "Fator Vila") podem serensaiados quanto às atividades específicas. Eles podem também ser ensaiadosem paralelo para se comparar diretamente suas atividades específicas. Oensaio é realizado em uma placa microtituladora (MaxiSorp, Nunc,Dinamarca). O substrato cromogênico D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288,Chromogenix, Suécia), concentração final de 1 mM, é adicionado ao FatorVIIa (concentração final de 100 nM) em HEPES 50 mM, pH 7,4, contendoNaCl 0,1 M, CaCl2 e 1 mg/ml de albumina de soro bovino. A absorbância em405 nm é medida continuamente em uma leitora de placas SpectraMax® 340(Molecular Devices, USA). A absorbância desenvolvida durante umaincubação de 20 minutos, após a subtração da absorbância em um reservatóriobranco não contendo nenhuma enzima, é usada para calcular a relação entreas atividades do polipeptídeo do Fator VII e o Fator VIIa do tipo selvagem:

Relação = (polipeptídeo do Fator VIIA405 nm)/(Fator VIIa dotipo selvagem A405)

Com base nisso, um polipeptídeo do Fator VII com umaatividade menor, ou comparável, ou mais elevada, do que o Fator VIIa nativo,pode ser identificado, tal como, por exemplo, os polipeptídeos do Fator VIIem que a relação entre a atividade do polipeptídeo do Fator VII e a atividadedo Fator VII nativo (FVII do tipo selvagem) seja de cerca de 1,0 versus acimade 1,0.

A atividade dos polipeptídeos do Fator VII pode também sermedida com o uso de um substrato fisiológico tal como o Fator X ("Ensaio daProteólise In Vitro"), adequadamente em uma concentração de 100 a 1000nm, em que o Fator Xa gerado é medido após a adição de um substratocromogênico adequado (por exemplo, S-2765). Além disso, o ensaio deatividade pode ser desenvolvido na temperatura fisiológica.

Ensaio da Proteólise in Vitro (Ensaio 2)

O Fator VIIa e o polipeptídeo do Fator VII nativos (tiposelvagem) (ambos daqui por diante referidos como "Fator Vila") sãoensaiados em paralelo para se comparar diretamente suas atividadesespecíficas. O ensaio é realizado em uma placa microtituladora (MaxiSorp,Nunc, Dinamarca). O Fator VIIa (10 nM) e o Fator X (0,8 microM) em 100 μΐde HEPES 50 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,1 M, CaCl2 5 mM e 1 mg/ml dealbumina de soro bovino, são incubados por 15 minutos. A clivagem do FatorX é então interrompida pela adição de 50 μΐ de HEPES 50 mM, pH 7,4,contendo NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM e 1 mg/ml de albumina de soro bovino.A quantidade do Fator Xa gerado é medida pela adição do substratocromogênico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Chromogenix,Suécia), concentração final de 0,5 mM. A absorbância em 405 nm é medidacontinuamente em uma leitora de placas SpectraMax® 340 (MolecularDevices, USA). A absorbância desenvolvida durante 10 minutos, após asubtração da absorbância em um reservatório branco não contendo FVIIa, éusada para calcular a relação entre as atividades proteolíticas do polipeptídeodo Fator VII e do Fator VIIa tipo selvagem:

Relação = (polipeptídeo do Fator VII A405 nm)/(Fator VIIatipo selvagem A405)

Com base nisso, um polipeptídeo do Fator VII com umaatividade menor, comparável, ou mais elevada, do que o Fator VIIa nativo,pode ser identificado, tal como, por exemplo, os polipeptídeos do Fator VIIem que a relação entre a atividade do polipeptídeo do Fator VII e a atividadedo Fator VII nativo (FVII do tipo selvagem) seja de cerca de 1,0 versus acimade 1,0.

Ensaio da geração da trombina (Ensaio 3)

A capacidade dos polipeptídeos do Fator VII de gerar trombinapode ser medida em um ensaio (Ensaio 3) compreendendo todos os Fatores decoagulação pertinentes e inibidores em concentrações fisiológicas (sem FatorVIII quando imitando as condições de hemofilia A) e plaquetas ativadas(como descrito na página 543 em Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99,542-547 que fica aqui incorporado como referência).

Ensaio de Coagulação de um estágio (Ensaio de Coágulo)(Ensaio 4)

Os polipeptídeos do Fator VII podem também ser ensaiadosquanto a atividades específicas ("atividade de coágulo") mediante o uso deum ensaio de coagulação de um estágio (Ensaio 4). Com esta finalidade, aamostra a ser testada é diluída em tampão PIPES 50 mM (pH 7,2), 1 % deBSA e 40 μΐ são incubados com 40 μΐ de plasma deficiente de Fator VII e 80ml de Innovin® Dade-Bhering; cat. n° B4212-50). Os tempos de Coagulação(tempos de coagular) são medidos e comparados com uma curva padrãousando-se um padrão de referência em um ensaio de linhas paralelas.

Degradação da cadeia pesada e formas oxidadas (Ensaio 5)

Nos exemplos desenvolvidos abaixo, o conteúdo de produtosde degradação de cadeia pesada e o conteúdo de formas oxidadas sãodeterminados por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) como descrito noseguinte:

A HPLC de fase reversa foi desenvolvida em uma colunaproprietária de sílica ligada a butila de 4,5 χ 150 mm com um tamanho departícula de 5 μπι e tamanho de poro de 300 Â. Temperatura da coluna: 70°C. Tampão A: 0,1 % v/v de ácido trifluoroacético. Tampão B: 0,09 % v/v deácido trifluoroacético, 80 % v/v de acetonitrila. A coluna foi eluída com umgradiente linear de X até (X + 13) % de B em 30 minutos. X foi ajustado demodo que FVIIa eluísse com um tempo de retenção de aproximadamente 26minutos. Taxa de fluxo: 1,0 ml/minuto. Detecção: 214 nm. Carga: 25 μg deF Vila.

Conteúdo de agregados (Ensaio 6)

Nos exemplos de trabalho abaixo, o conteúdo dos agregados édeterminado por HPLC de exclusão de tamanho (SE-HPLC) não desnaturantecomo descrito no seguinte:

A cromatografia de exclusão de tamanho não desnaturante foidesenvolvida em uma coluna Waters Protein Pak 300 SW, 7,5 χ 300 mm como uso de 0,2 M de sulfato de amônio, 5 % de 2-propanol, pH 7,0, como fasemóvel. Taxa de fluxo: 0,5 ml/minuto. Detecção: 215 nm. Carga: 25 μg deFVIIa.

Determinação do conteúdo de estruturas de desGla-polipeptídeo do Fator VII

O conteúdo das estruturas de desGla-polipeptídeo do Fator VIIem relação às estruturas de polipeptídeo do Fator VII de comprimentocompleto é determinado por SDS-PAGE. A 150 μΐ da amostra sãoadicionados 50 μΐ do tampão de amostra (sem redução, NuPAGE) e ebulidospor 5 minutos. Uma amostra de 10 μΐ é carregada a 12 % de BisTris NuPAGEGel (Invitrogen). O gel é desenvolvido em 200 Volts, 120 mA por 55minutos. O gel é manchado com o uso de solução azul brilhante decoomassie, desprovido da mancha e secado. O conteúdo relativo do desGla-polipeptídeo do Fator VII é calculado como a área da banda de desGla-polipeptídeo do Fator VII dividida pelas áreas da banda do polipeptídeo doFator VII em aproximadamente 50 kDa e da banda de desGla-polipeptídeo doFator VII em aproximadamente 45 kDa.

Alternativamente, o conteúdo das estruturas de desGla-polipeptídeo do Fator VII pode ser determinado por HPLC de troca de ânions.O método separa os polipeptídeos do Fator VII menos o domínio de Gla dospolipeptídeos do Fator VII intactos. O conteúdo dos polipeptídeos do FatorVII menos o domínio de Gla é expresso em percentuais da área de picorelacionada ao polipeptídeo do Fator VII. Como a coluna analítica é usadauma DNAPac PA-100, 250 χ 4 mm (Dionex Corp.). A coluna é eluída comum gradiente linear de 0 a 0,5 M de acetato de amônio em pH 9,0 durante 30minutos em um fluxo de 1,0 ml/minuto. A absorbância em 280 nm doefluente é monitorada.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos ilustram a invenção. Estes exemplossão incluídos para fins ilustrativos apenas e não se destinam, sob qualquerhipótese, a limitar o escopo da invenção reivindicada.

Exemplo 1:

A concentração é realizada em uma coluna de cromatografiade troca de ânions (AIEC) [1,6 cm de diâmetro interno χ 7,5 cm decomprimento = 15 ml de volume da coluna (CV)] adensada com meioAmersham Q-sepharose Fast Flow, equilibrada com uma solução contendoNaCl 50 mM, citrato trissódico 20 mM, pH 7,0. A carga é de 12 CVs de umasolução contendo 1,4 mg/ml de FVIIa, seguido por uma lavagem de 7 CVusando NaCl 50 mM, citrato trissódico 20 mM, pH 7,0. A eluição é realizadacom o uso de um gradiente de etapa em NaCl 50 mM, citrato trissódico 20mM, pH 4,2. A purificação inteira é realizada em uma taxa de fluxo de 40CV/h e uma temperatura de 5 °C. O pico do produto elui apósaproximadamente 3,3 CV e o eluído é ajustado a pH 6,0/NaOH. Aconcentração do eluído é de 3,3 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 2A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (mesmotamanho da anterior) adensada com meio Amersham Q-sepharose Fast Flow,equilibrada com uma solução contendo EDTA 10 mM, Histidina 10 mM, pH6,0. A carga é de 12 CVs de uma solução contendo 1,4 mg/ml de FVIIa,seguido por uma lavagem de 5 CV usando NaCl 175 mM, histidina 10 mM,pH 6,0 e uma lavagem 2 de 5 CV com o uso de NaCl 50 mM, histidina 10mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se um gradiente de etapa em CaCl230 mM, NaCl 50 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10 mM. Apurificação inteira é realizada em uma taxa de fluxo de 40 CV/h e umatemperatura de 5 °C. O pico do produto elui após aproximadamente 1,9 CV.A concentração do eluído é de 6,1 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 3

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (mesmotamanho da anterior) adensada com meio Amersham Q-sepharose Fast Flow,equilibrada com uma solução contendo EDTA 10 mM, Histidina 10 mM, pH6,0. A carga é de 12 CVs de uma solução contendo 1,4 mg/ml de FVIIa,seguido por uma lavagem de 5 CV usando NaCl 50 mM, histidina 10 mM, pH6,0. A eluição é realizada usando-se um gradiente de etapa em CaCl2 30 mM,NaCl 50 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10 mM. A purificaçãointeira é realizada em uma taxa de fluxo de 40 CV/h e uma temperatura de 5°C. O pico do produto elui após aproximadamente 1,9 CV. A concentração doeluído é de 5,4 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 4

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (mesmotamanho da anterior) adensada com meio Amersham Q-sepharose Fast Flow,equilibrada com uma solução contendo EDTA 10 mM, Histidina 10 mM, pH6,0. A carga é de 12 CVs de uma solução contendo 1,4 mg/ml de FVIIa,seguido por uma lavagem de 5 CV usando-se NaCl 50 mM, histidina 10 mM,pH 6,0. A eluição é realizada usando-se um gradiente de etapa em CaCl2 10mM, NaCl 50 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10 mM. A purificaçãointeira é realizada em uma taxa de fluxo de 40 CV/h e uma temperatura de 5°C. O pico do produto elui após aproximadamente 2,2 CV. A concentração doeluído é de 4,6 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 5

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (domesmo tamanho da anterior) adensada com meio Q-sepharose Fast Flow daAmersham, equilibrada com uma solução contendo EDTA 10 mM, Histidina10 mM, pH 6,0. A carga é de 12 CVs de uma solução contendo 1,4 mg/ml deFVIIa, seguido por uma lavagem de 5 CV usando-se NaCl 50 mM, histidina10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se um gradiente de etapa emCaCl2 10 mM, NaCl 100 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10 mM. Apurificação inteira é realizada em uma taxa de fluxo de 40 CV/h e umatemperatura de 5 °C. O pico do produto elui após aproximadamente 1,4 CV.

A concentração do eluído é de 9,1 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 6

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (mesmotamanho da anterior) adensada com meio Q-sepharose Fast Flow daAmersham, equilibrada com uma solução contendo EDTA 10 mM, Histidina10 mM, pH 6,0. A carga é de 12 CVs de uma solução contendo 1,4 mg/ml deFVIIa, seguido por uma lavagem de 5 CV usando-se NaCl 50 mM, histidina10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se um gradiente de etapa emCaCl2 10 mM, NaCl 200 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10 mM. Apurificação inteira é realizada em uma taxa de fluxo de 40 CV/h e umatemperatura de 5 0C. O pico do produto elui após aproximadamente 1,4 CV.A concentração do eluído é de 10,0 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 7

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (demesmo tamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo EDTA 10 mM, Histidina10 mM, pH 6,0. A carga é de 11 CVs de uma solução contendo 1,4 mg/ml deFVIIa, seguido por uma lavagem de 5 CV usando-se NaCl 50 mM, histidina10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se um gradiente de etapa emCaCl2 10 mM, NaCl 100 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10 mM. Oequilíbrio, a carga e a lavagem são realizados em uma taxa de fluxo de 80CV/h e uma temperatura de 5 0C e a eluição é desenvolvida em 40 CV/h. Opico do produto elui após aproximadamente 1,5 CV. A concentração doeluído é de 6,6 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 8

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (de mesmo tamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo EDTA 10 mM, Histidina10 mM, pH 6,0. A carga é de 11 CVs de uma solução contendo 1,4 mg/ml deFVIIa, seguido por uma lavagem de 5 CV usando-se NaCl 50 mM, histidina10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se um gradiente de etapa emCaCl2 10 mM, NaCl 200 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10 mM. Oequilíbrio, a carga e a lavagem são realizados em uma taxa de fluxo de 80CV/h e uma temperatura de 5 0C e a eluição é desenvolvida em 40 CV/h. Opico do produto elui após aproximadamente 1,4 CV. A concentração doeluído é de 16,0 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 9

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (mesmotamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo EDTA 10 mM, Histidina10 mM, pH 6,0. A carga é de 11 CVs de uma solução contendo 1,4 mg/ml deFVIIa, seguido por uma lavagem de 5 CV usando-se NaCl 50 mM, histidina10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se um gradiente linear durante 5CV em CaCl2 30 mM, NaCl 100 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10mM. O equilíbrio, a carga e a lavagem são realizados em uma taxa de fluxode 80 CV/h e uma temperatura de 5 0C e a eluição é desenvolvida em 40CV/h. O pico do produto elui após aproximadamente 3,0 CV. A concentraçãodo eluído é de 8,2 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 10

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (mesmotamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo glicilglicina 10 mM,CaCl2 5 mM, pH 9,0. A carga é de 22 CVs de uma solução contendo 0,7mg/ml de FVIIa e CaCl2 5 mM, seguido por uma lavagem de 5 CV com o usode NaCl 50 mM, histidina 10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-seum gradiente linear durante 5 CV em CaCl2 30 mM, NaCl 100 mM,tamponada em pH 6,0 por histidina 10 mM. A carga e a lavagem sãorealizadas em uma taxa de fluxo de 120 CV/h e uma temperatura de 5 0C e aeluição é desenvolvida em 40 CV/h. O pico do produto elui apósaproximadamente 2,9 CV. A concentração do eluído é de 7,8 mg/ml medidapor RP-HPLC.

EXEMPLO 11

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (mesmotamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo glicilglicina 10 mM,CaCl2 5 mM, pH 9,0. A carga é de 22 CVs de uma solução contendo 0,7mg/ml de FVIIa e CaCl2 5 mM, seguido por uma lavagem 1 de 5 CV com ouso de NaCl 50 mM, histidina 10 mM, pH 6,0 e uma lavagem 2 de 2 CV como uso de histidina 10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se umgradiente linear durante 5 CV em CaCl2 50 mM, tamponada em pH 6,0 porhistidina 10 mM. A carga e a lavagem são realizadas em uma taxa de fluxo de120 CV/h e uma temperatura de 5 0C e a eluição é desenvolvida em 40 CV/h.

O pico do produto elui após aproximadamente 3,2 CV. A concentração doeluído é de 7,3 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 12

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (mesmotamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo glicilglicina 10 mM,CaCl2 5 mM, pH 9,0. A carga é de 22 CVs de uma solução contendo 0,7mg/ml de FVIIa e CaCl2 5 mM, seguido por uma lavagem 1 de 5 CV com ouso de CaCl2 5 mM, histidina 10 mM, pH 6,0 e uma lavagem 2 de 2 CV como uso de histidina 10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se umgradiente linear durante 5 CV em CaCl2 50 mM, tamponada em pH 6,0 porhistidina 10 mM. A carga e a lavagem são realizadas em uma taxa de fluxo de120 CV/h e uma temperatura de 5 0C e a eluição é desenvolvida em 40 CV/h.O pico do produto elui após aproximadamente 3,2 CV. A concentração doeluído é de 6,4 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 13

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (domesmo tamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo glicilglicina 10 mM,CaCl2 5 mM, pH 9,0. A carga é de 22 CVs de uma solução contendo 0,7mg/ml de FVIIa e CaCl2 5 mM, seguido por uma lavagem 1 de 5 CV com ouso de CaCl2 5 mM, histidina 10 mM, pH 6,0 e uma lavagem 2 de 2 CV como uso de histidina 10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada usando-se umgradiente de etapa em CaCl2 50 mM, tamponada em pH 6,0 por histidina 10mM. A carga e a lavagem são realizadas em uma taxa de fluxo de 120 CV/h euma temperatura de 5 0C e a eluição é desenvolvida em 40 CV/h. O pico doproduto elui após aproximadamente 1,3 CV. A concentração do eluído é de16,0 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 14

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (domesmo tamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo glicilglicina 10 mM,CaCl2 5 mM, pH 9,0. A carga é de 22 CVs de uma solução contendo 0,7mg/ml de FVIIa e CaCl2 5 mM, seguido por uma lavagem de 6 CV com o usode CaCl2 5 mM, histidina 10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada com o uso deum gradiente linear durante 5 CV em CaCl2 50 mM, tamponada em pH 6,0por histidina 10 mM. A carga e a lavagem são realizadas em uma taxa defluxo de 120 CV/h e uma temperatura de 5 0C e a eluição é desenvolvida em40 CV/h. O pico do produto elui após aproximadamente 2,8 CV. Aconcentração do eluído é de 7,8 mg/ml medida por RP-HPLC.

EXEMPLO 15

A concentração é realizada em uma coluna de AIEC (demesmo tamanho da anterior) adensada com meio POROS 50 HQ da AppliedBiosystems, equilibrada com uma solução contendo glicilglicina 10 mM,CaCl2 5 mM, pH 9,0. A carga é de 22 CVs de uma solução contendo 0,7mg/ml de FVIIa e CaCl2 5 mM, seguido por uma lavagem de 6 CV com o usode CaCl2 5 mM, histidina 10 mM, pH 6,0. A eluição é realizada com o uso deum gradiente linear durante 2 CV em CaCl2 50 mM, tamponada em pH 6,0por histidina 10 mM. A carga e a lavagem são realizadas em uma taxa defluxo de 120 CV/h e uma temperatura de 5 0C e a eluição é desenvolvida em40 CV/h. O pico do produto elui após aproximadamente 2,0 CV. Aconcentração do eluído é de 9,0 mg/ml medida por RP-HPLC.

As condições do desenvolvimento e os dados analíticos sobreo eluído dos Exemplos 1 a 15 descritos acima, são apresentados na Tabela 1(abaixo).<table>table see original document page 69</column></row><table>PRECIPITAÇÃO

EXEMPLO 16

A 250 ml de solução em massa de rFVIIa, com umaconcentração de 1,2 mg de rFVIIa/ml em um tampão contendo NaCl 50 mM,CaCl2 10 mM, glicilglicina 10 mM, pH 6,4, foram adicionados 112,5 g desulfato de amônio (65 % de saturação). Após 15 minutos com agitação suave,a solução foi centrifugada por 1 hora em aproximadamente 4000 G (4500rpm) em uma Heraus Sorvall Labofuge a 4 °C. O precipitado foi dissolvidoem 30 ml de um tampão contendo NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, histidina 10mM, pH 6,0, e filtrado através de um filtro de 0,2 μιη. A concentração dorFVIIa no precipitado redissolvido foi medida em 8,3 mg/ml por OD28O e em7,8 mg/ml por RP-HPLC. O nível de degradação da cadeia pesada foi de 8,3% antes da precipitação e de 8,5 % após a precipitação. Houve uma levequeda no GD-FVIIa e um leve aumento nos oligômeros/dímeros naprecipitação (Tabela 2).

TABELA 2

RESULTADOS DAS ANÁLISES ANTES E APÓS A PRECIPITAÇÃOCOM SULFATO DE AMÔNIO.

<table>table see original document page 70</column></row><table>

ULTRAFILTRAÇÃO

EXEMPLO 17

Um Sistema Labscale TFF (Millipore, equipado com umDispositivo de Filtro Pellicon XL com membrana Biomax 30 kD (MilliporePXB030A50) foi usado para ultrafiltração (UF) de 247 ml de massa derFVIIa. A UF foi realizada em 2 a 8 0C com um fluxo através da membranade 20 a 30 ml/minuto, e uma pressão de entrada de 1 a 1,5 bar. Antes da UF, amassa continha 1,2 mg/ml de rFVIIa em um tampão com NaCl 50 mM, CaCl210 mM, Glicilglicina 10 mM, pH 6,05. À massa foi adicionado citrato atéuma concentração final de 20 mM e depois foi concentrada no sistema de UFaté um volume de 80 ml. Uma diafiltração foi realizada em volume constante,usando-se 400 ml de um tampão contendo NaCl 200 mM, citrato 1 mM, pH6,0. Após a diafiltração, a solução foi concentrada ainda até um volume de 40ml. A concentração do rFVIIa após a diafiltração/concentração foi de 6,3mg/ml medida tanto por OD2so quanto por SEC-HPLC. Nenhuma mudançasignificativa foi observada nos níveis de degradação da cadeia pesada, de GD-FVIIa ou dos polímeros, mas o nível de oligômeros/dímeros aumentoulevemente (Tabela 3).

TABELA 3

RESULTADOS DAS ANÁLISES ANTES E APÓS A DIAFILTRAÇÃO/CONCENTRAÇÃO POR UF.

<table>table see original document page 71</column></row><table>

EXEMPLO 20

O mesmo sistema de UF do Exemplo 17 foi usado para aconcentração da massa do rFVIIa sem diafiltração. Antes da concentração, ovolume da massa de rFVIIa era de 189 ml e a concentração do rFVIIa era de1,1 mg/ml em um tampão com NaCl 50 mM, CaCl2 10 mM, Glicilglicina 10mM, pH 6,05. CaCl2 foi adicionado, de modo que a concentração final doCaCl2 foi reforçada a um total de 30 mM. Após a concentração por UF, ovolume da solução ficou em 23 ml e a concentração do rFVIIa ficou em 7,1mg/ml medida por OD280 e em 7,6 medida por SEC-HPLC. Nenhumamudança significativa foi observada nos níveis da degradação da cadeiapesada, no GD-FVIIa, nos polímeros ou nos oligômeros/dímeros de antes daUF até após a UF (Tabela 4).

TABELA 4RESULTADOS DAS ANÁLISES ANTES E APÓS A ADIÇÃO DO CaCl2 ECONCENTRAÇÃO PELA UF.

<table>table see original document page 72</column></row><table>

EXEMPLO 19

O mesmo sistema de UF do Exemplo 17 foi usado para aconcentração da massa do rFVIIa sem diafiltração. Antes da concentração, ovolume da massa de rFVIIa era de 188 ml e a concentração do rFVIIa era de1,1 mg/ml em um tampão com NaCl 50 mM, CaCl2 10 mM, Glicilglicina 10mM, pH 6,81. Sacarose foi adicionada até concentração final de 3 % (p/p).Após a concentração por UF, o volume da solução ficou em 25 ml e aconcentração do rFVIIa ficou em 8,3 mg/ml medida por OD280 e em 8,8medida por SEC-HPLC. Nenhuma mudança significativa foi observada nosníveis da degradação da cadeia pesada, no GD-FVila, nos polímeros ou nosoligômeros/dímeros de antes da UF até após a UF (Tabela 5).

TABELA 5

RESULTADOS DAS ANÁLISES ANTES E APÓS A ADIÇÃO DESACAROSE E CONCENTRAÇÃO POR UF.

<table>table see original document page 72</column></row><table>

EXEMPLO 20

Uma concentração de rFVIIa de 1,5 mg/ml a 12,0 mg/ml foirealizada como no Exemplo 19, mas com 3 % (p/p) de manitol adicionados nolugar da sacarose. A solução ficou visualmente transparente durante aconcentração e nenhuma mudança significativa foi observada nos níveis dadegradação da cadeia pesada, da oxidação, do GD-FVIIa, dos polímeros oudos oligômeros/dímeros de antes da UF até após a UF.

EXEMPLO 21O mesmo sistema de UF do Exemplo 17 foi usado para aconcentração da massa do rFVIIa sem diafiltração. Antes da concentração, ovolume da massa de rFVIIa era de 203 ml e a concentração do rFVIIa era de1,3 mg/ml em um tampão com NaCl 50 mM, CaCl2 10 mM, Glicilglicina 10mM, pH 6,62. NaCl foi adicionado, de modo que a sua concentração finalfosse reforçada até um total de 100 mM. Após a concentração pela UF5 ovolume da solução ficou em 19 ml e a concentração do rFVIIa ficou em 11,6mg/ml medida por OD280 e em 11,7 medida por SEC-HPLC. Nenhumamudança significativa foi observada nos níveis da degradação da cadeiapesada, no GD-FVIIa, nos polímeros ou nos oligômeros/dímeros de antes daUF até depois da UF (Tabela 6).

TABELA 6

RESULTADOS DAS ANÁLISES ANTES E APÓS A ADIÇÃO DE NaCl ECONCENTRAÇÃO PELA UF.

<table>table see original document page 73</column></row><table>

EXEMPLO 22

O mesmo sistema de UF do Exemplo 17 foi usado para aconcentração da massa do rFVIIa sem diafiltração. Antes da UF, a massacontinha 1,42 mg/ml de rFVIIa em um tampão com NaCl 50 mM, CaCl2 10mM, Glicilglicina 10 mM, pH 6,0. CaCl2 foi adicionado, de modo que a suaconcentração final fosse reforçada até um total de 30 mM. A massa foiconcentrada no sistema de UF até uma concentração de 25,3 mg/ml medidapor OD2So e em 24,1 mg/ml medida por SEC-HPLC. A solução ficouvisualmente transparente durante a concentração, e a OD600 apenas aumentoupara 0,014 no final da concentração. Nenhuma mudança significativa foiobservada nos níveis da degradação da cadeia pesada, na oxidação, no GD-FVIIa, nos polímeros ou nos oligômeros/dímeros de antes da UF até depois daUF (Tabela 6).TABELA 6

RESULTADOS DAS ANÁLISES ANTES E APÓS A ADIÇÃO DE CaCL2E CONCENTRAÇÃO POR UF.

<table>table see original document page 74</column></row><table>

EXEMPLO 23

Um Sistema Labscale TFF (Millipore), equipado comDispositivo de Filtro Pellicon XL com membrana de 30 kD Biomax(Millipore η2 PXB030A50) foi usado para ultrafiltração (UF) de 234 ml demassa de rFVIIa. A UF foi realizada em 2 a 8 0C com um fluxo através damembrana de 20 a 30 ml/minuto, e uma pressão de entrada de 1 a 1,5 bar.Antes da UF5 a massa continha 1,3 mg/ml de rFVIIa em um tampão comNaCl 50 mM, CaCl2 10 mM, Glicilglicina 10 mM, pH 5,53. A massa foiconcentrada no sistema de UF5 e durante a concentração a aparência foiinspecionada e as amostras foram medidas quanto à transparência por OD6oo·Quando a massa foi concentrada até 42 ml (concentração calculada de 7,2mg/ml), a solução tornou-se visualmente não transparente, e um precipitadofoi formado em uma amostra que havia sido deixada durante a noite em 2 a 8°C. Quando a solução foi ainda concentrada a 34 ml (concentração calculadade 8,9 mg/ml), os precipitados foram claramente observados. A OD6ooaumentou levemente durante a primeira parte da concentração, mas aumentouabruptamente quando a solução concentrada foi abaixo de 34 ml (Figura 1).

Em todos os exemplos acima relacionados à ultrafiltração,nenhuma mudança significativa na atividade específica (IU por μg dopolipeptídeo do Fator VII) medida pelo ensaio do coágulo (Ensaio 4) foiobservada.

FABRICAÇÃO DAS COMPOSIÇÕES E ESTABILIDADE

EXEMPLO 24

De modo a pesquisar a estabilidade de uma formulaçãoconcentrada de rFVIIa, a seguinte composição foi produzida:

15 mg/ml de rFVIIa (correspondentes a 3,9 mg de rFVIIa porml em volume do frasco)

1,55 mg/ml de Histidina1,32 mg/ml de Glicilglicina5,84 mg/ml de Cloreto de sódio1,47 mg/ml de Cloreto de cálcio25,0 mg/ml de Manitol10,0 mg/ml de Sacarose0,07 mg/ml de Tween 80pH = 5,50

A composição foi preparada de uma solução em massapurificada (15,6 mg/ml). Os excipientes foram adicionados à solução emmassa, a solução resultante foi filtrada estéril com o uso de filtro demembrana esterilizada (tamanho de poro de 0,2 mícron ou equivalente). 1,0ml da solução resultante foi carregado em frascos estéreis de vidro(aproximadamente 3,86 ml). Os frascos foram secados por congelamento,tampados e selados com tampas do tipo flip-off de alumínio.

A estabilidade foi seguida em 25 °C:

<table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table>

<table>table see original document page 76</column></row><table>

EXEMPLO 25

20 mg/ml de rFVIIa (correspondentes a 13,0 mg de rFVIIa porml em volume do frasco)

2,34 mg/ml de Cloreto de sódio

1,55 mg/ml de Histidina

5,15 mg/ml de Cloreto de cálcio 2H20

25,0 mg/ml de Manitol

10,0 mg/ml de Sacarose

0,07 mg/ml de Tween 80

0,5 mg/ml de Metionina

pH = 6,00

A composição foi preparada de uma solução em massapurificada (20 mg/ml). Os excipientes foram adicionados à solução em massa,a solução resultante foi filtrada estéril com o uso de filtro de membranaesterilizada (tamanho de poro de 0,2 mícron ou equivalente). 2,5 ml dasolução resultante foram carregados em frascos estéreis de vidro(aproximadamente 3,86 ml). Os frascos foram secados por congelamento,tampados e selados com tampas do tipo flip-ojf de alumínio.<table>table see original document page 77</column></row><table>

EXEMPLO 26

20 mg/ml de rFVIIa (correspondentes a 20 mg de rFVIIa porml em volume do cartucho)

1,55 mg/ml de Histidina5,15 mg/ml de Cloreto de cálcio 2H201,22 mg/ml de Inibidor 0008pH = 6,50

A composição foi preparada de uma solução em massapurificada (20 mg/ml). Os excipientes foram acrescentados à solução emmassa, a solução resultante foi filtrada estéril com o uso de um filtro demembrana esterilizada (tamanho de poro de 0,2 mícron ou equivalente). 3,0ml da solução resultante foram carregados em cartucho estéril de vidro(aproximadamente 3,0 ml) e selados com tampa de alumínio.

<table>table see original document page 77</column></row><table>

EXEMPLO 27

5 mg/ml de rFVIIa (correspondentes a 5 mg de rFVIIa por mlem volume do cartucho)1,55 mg/ml de Histidina

122,5 mg/ml de Cloreto de cálcio 2H20

2,45 mg/ml de acetato de sódio

pH = 6,50

A composição foi preparada de uma solução em massapurificada (7,1 mg/ml). Os excipientes foram acrescentados à solução emmassa, a solução resultante foi filtrada estéril com o uso de um filtro demembrana esterilizada (tamanho de poro de 0,2 mícron ou equivalente). 3,0ml da solução resultante foram carregados em cartucho estéril de vidro(aproximadamente 3,0 ml) e selados com tampa de alumínio.

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Claims

1. Recipiente fechado contendo uma composição de umpolipeptídeo do Fator VII ativado (i), referido recipiente caracterizado pelofato de que compreende a faixa de 2,5 a 90 mg do polipeptídeo do Fator VIIativado por ml em volume do recipiente.

2. Recipiente de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende de 5 a 25 mg do polipeptídeo do Fator VIIativado por mililitro em volume do recipiente.

3. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do Fator VIIativado se acha em solução aquosa.

4. Recipiente de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que a solução é uma composição farmacêutica liquida, emparticular uma composição farmacêutica pronta-para-uso.

5. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e 4, caracterizado pelo fato de que a solução tem um pH na faixa de 5,0 a 7,0.

6. Recipiente de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a solução compreende um agente de tamponamento (ii).

7. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que a solução ainda compreende um ou maisagentes estabilizantes (iii).

8. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende um oumais agentes modificadores da força iônica (iv).

9. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, caracterizado pelo fato de que a força iônica da solução aquosa é depelo menos 200 mM.

10. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações-3 a 9, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa tem uma concentraçãodo polipeptídeo do Fator VII ativado de mais do que 5 mg/ml.

11. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações-3 a 10, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende:pelo menos 2,5 mg por mililitro em volume do recipiente dopolipeptídeo do Fator VII ativado (i);um agente de tamponamento (ii) adequado para manter o pHna faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,5;em que a força iônica da solução aquosa é de pelo menos 50 mM.

12. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações-3 a 10, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende:pelo menos 2,5 mg/ml do polipeptídeo do Fator VII ativado (i);um agente de tamponamento (ii) adequado para manter o pHna faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,5;pelo menos um agente estabilizante (iiia) selecionado dos saisde cálcio em uma concentração na faixa de pelo menos 15 mM;em que a força iônica da solução aquosa é de pelo menos 50 mM.

13. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações-3 a 10, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende:pelo menos 2,5 mg/ml do polipeptídeo do Fator VII ativado (i);um agente de tamponamento (ii) adequado para manter o pHna faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,5;pelo menos um agente estabilizante do tipo divalente de metaisda primeira série de transição (iiib) em que a relação molar entre o agenteestabilizante (iiib) e o polipeptídeo de FVII fica acima de 0,5;em que a força iônica da solução aquosa é de pelo menos 50 mM.

14. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 10, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende:pelo menos 2,5 mg/ml do polipeptídeo do Fator VII ativado (i);um agente de tamponamento (ii) adequado para manter o pHna faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,5;pelo menos um agente estabilizante do tipo debenzamidina/arginina (iiic) em que a relação molar entre o agenteestabilizante (iiic) e o polipeptídeo de FVII fica acima de 0,1;em que a força iônica da solução aquosa é de pelo menos 50 mM.

15. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que a composição tem um conteúdo deumidade de não mais do que cerca de 3 %.

16. Recipiente de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a composição se acha na forma liofilizada.

17. Recipiente de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a composição compreende pelo menos umagente de estabilidade selecionado do grupo consistindo de a) umacombinação de um antioxidante com manitol; b) uma combinação demetionina com um poliol; c) uma combinação de um sacarídeo com manitol;d) uma combinação de sacarose com um poliol; e e) metionina.

18. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que, após a reconstituição da composiçãocom uma solução aquosa, produz um recipiente de acordo com qualquer umadas reivindicações 3 a 14.

19. Recipiente de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos doiscompartimento em que um primeiro compartimento contém o polipeptídeo doFator VII ativado.

20. Recipiente de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do Fator VII ativado do primeirocompartimento se acha na forma liofilizada, e o segundo compartimentocontém um solvente aquoso para o referido polipeptídeo do Fator VII ativado.

21. Recipiente de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do Fator VII ativado do primeirocompartimento se acha em solução aquosa, e o segundo compartimentocontém um solvente aquoso para o referido polipeptídeo do Fator VII ativado.

22. Processo para a preparação de um recipiente fechadocontendo um polipeptídeo do Fator VII ativado como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 21, referido processo caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:a) colocar em contato uma solução compreendendo umpolipeptídeo do Fator VII com um material de troca de ânions sob condiçõesque facilitem a ligação de uma parte do referido polipeptídeo do Fator VIIcom o referido material de troca de ânions;b) lavar referido material de troca de ânions com um tampãode lavagem tendo um pH na faixa de 5,5 a 7,0 ou, alternativamente, na faixade 8,5 a 9,5, com a presença de 1 a 7 mM de Ca ; ec) eluir referido material de troca de ânions com um tampão deeluição tendo um pH na faixa de 3,0 a 7,0, e coletar o eluído do polipeptídeodo Fator VII ativado;d) carregar pelo menos uma parte do eluído em um recipiente,de modo que o recipiente compreenda a faixa de 2,5 a 90 mg do polipeptídeodo Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente;e) opcionalmente liofilizar o eluído; ef) selar o recipiente de modo a obter um recipiente fechado.

23. Processo para a preparação de um recipiente fechadocontendo um polipeptídeo do Fator VII ativado como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 21, referido processo caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:(a) colocar em contato uma solução contendo um polipeptídeodo Fator VII com um material de troca de ânions, sob condições que facilitema ligação de uma parte do referido polipeptídeo do Fator VII ao referidomaterial de troca de ânions, enquanto mantém o pH da solução em cerca de 5,5 a 7,0 ou, alternativamente, na faixa de 8,5 a 9,5, com a presença de 1 a 7mM de Ca+;(b) opcionalmente lavar referido material de troca de ânionscom um tampão de lavagem, enquanto se mantém a força iônica em 40 a 250mM;(c) eluir referido material de troca de ânions, enquanto seaumenta a concentração de cálcio e/ou a força iônica (por exemplo NaCl)durante a eluição e/ou reduzindo-se o pH durante a eluição, e coletar o eluídodo polipeptídeo do Fator VII ativado;(d) carregar pelo menos uma parte do eluído em um recipiente,de modo a que o recipiente contenha a faixa de 2,5 a 90 mg do polipeptídeodo Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente;(e) opcionalmente liofilizar o eluído; e(f) selar o recipiente de modo a obter um recipiente fechado.

24. Processo para a preparação de um recipiente fechadocontendo um polipeptídeo do Fator VII ativado como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 21, referido processo caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:(a) colocar em contato uma solução compreendendo umpolipeptídeo do Fator VII com um material de hidroxiapatita, sob condiçõesque facilitem a ligação de uma parte do referido polipeptídeo do Fator VII aoreferido material de hidroxiapatita;(b) opcionalmente lavar o referido material de hidroxiapatitacom um tampão de lavagem;(c) eluir referido material de hidroxiapatita com um tampão deeluição tendo um pH na faixa de 5,5 a 7,0, e coletar o eluído do polipeptídeodo Fator VII ativado;(d) carregar pelo menos uma parte do eluído em um recipiente,de modo a que o recipiente contenha a faixa de 2,5 a 90 mg do polipeptídeodo Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente;(e) opcionalmente liofilizar o eluído; e(f) selar o recipiente de modo a obter um recipiente fechado.

25. Processo para a preparação de um recipiente fechadocontendo um polipeptídeo do Fator VII ativado como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 21, referido processo caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:(a) combinar uma solução saturada de sulfato de amônio comuma solução que compreenda um polipetídeo do Fator VII de modo a facilitara precipitação do polipetídeo do Fator VII;(b) redissolver o polipeptídeo do Fator VII precipitado em umsolvente aquoso de modo a preparar uma solução concentrada do polipeptídeodo Fator VII;(c) opcionalmente dessalinizar a referida solução concentrada;(d) carregar pelo menos uma parte da solução concentrada emum recipiente de modo a que o recipiente contenha a faixa de 2,5 a 9,0 mg dopolipetídeo do Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente;(e) opcionalmente liofilizar a solução; e(f) selar o recipiente de modo a obter um recipiente fechado.

26. Processo para a preparação de um recipiente fechadocontendo um polipeptídeo do Fator VII ativado como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 21, referido processo caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:(a) submeter uma solução que compreenda um polipetídeo doFator VII a ultrafiltração e/ou diafiltração de modo a que se obtenha umasolução concentrada do polipetídeo do Fator VII;(b) carregar pelo menos uma parte da solução concentrada emum recipiente de modo a que o recipiente compreenda a faixa de 2,5 a 90 mgdo polipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente;(c) opcionalmente liofilizar a solução; e(d) selar o recipiente de modo a que se obtenha um recipientefechado.

27. Processo para a preparação de um recipiente fechadocontendo um polipeptídeo do Fator VII ativado como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 21, referido processo caracterizado pelo fato deque compreende as etapas de:(a) liofilizar uma solução que compreenda um polipeptídeo doFator VII de modo a obter-se uma composição do polipeptídeo do Fator VIItendo um conteúdo de umidade de não mais do que cerca de 3%;(b) redissolver o polipeptídeo do Fator VII liofilizado em umsolvente aquoso de modo a preparar uma solução concentrada do polpeptídeodo Fator VII;(c) opcionalmente dessalinizar a referida solução concentrada;(d) carregar pelo menos uma parte da solução concentrada emum recipiente de modo a que o recipiente compreenda a faixa de 2,5 a 90 mgdo polipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro em volume do recipiente;(e) selar o recipiente de forma a obter um recipiente fechado.

28. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende (i) umprimeiro recipiente fechado contendo uma composição farmacêutica sólida deum polipeptídeo do Fator VII ativado e (ii) um segundo recipiente contendoum solvente aquoso líquido para a referida composição farmacêutica sólida,em que o primeiro recipiente contém uma composição compreendendo a faixade 2,5 a 90 mg do polipeptídeo do Fator VII ativado por mililitro em volumedo primeiro recipiente.

29. Kit de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelofato de que o primeiro recipiente e o segundo recipiente é disposto como umcarpule, em que um compartimento corresponde ao primeiro recipiente eoutro compartimento adjacente corresponde ao segundo recipiente.

30. Método para a preparação de uma composiçãofarmacêutica aquosa líquida pronta-para-uso de um polipeptídeo do Fator VIIativado proveniente de um kit como definido em qualquer uma dasreivindicações 28 e 29, o método caracterizado pelo fato de que compreendemisturar a composição farmacêutica sólida do primeiro recipiente com pelomenos uma fração do solvente aquoso líquido do segundo recipiente, de modoa formar a composição farmacêutica aquosa líquida pronta-para-uso de umpolipeptídeo do Fator VII ativado.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que essencialmente todo o solvente aquoso líquido do segundorecipiente é misturado com a composição farmacêutica sólida do primeirorecipiente.