JPH0459796A - アフィニティークロマトグラフィー用担体およびアンチトロンビン３の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は血液中の有用成分等の分離精製に用いられるヘ
パリンアフィニティークロマトグラフィー用担体および
アンチトロンビンｍの精製方法に関するものである。

［従来の技術］ ヘパリンはＤ−グルコサミン、Ｄ−グルクロン酸からな
る多糖のＮ−硫酸、Ｎ−アセチルおよび〇−硫酸置換体
であり、生体の肺や小腸に多く存在し、血液凝固阻止作
用、脂血清澄作用を持つ。このため血栓、栓塞症の治療
薬として使用されている。

また、アンチトロンビンｍ（以下ＡＴＩＩＩ）は血しよ
う中に存在する分子量６５，０００の糖タンパク質であ
り、血液の凝固阻害作用を有し、さらにこの阻害活性は
、ヘパリンの存在下において顕著に増大される。この活
性のためＡＴＲＩＩＩは、血液凝固系に異常を持つ患者
の治療薬として用いられている。

ヘパリンがＡＴ［［の活性を増大する理由は、いまだ完
全に解明されてはいないが、ヘパリンのＡＴＩＩＩへの
親和性が必須であることは明らかである。

この親和性（アフィニティー）を利用して、血しよう中
よりＡＴＩＩ［を精製する方法が、ヘパリンを担体に固
定化して使用するアフィニティークロマトグラフィーで
あり、ＡＴＩＩＩ精製の有効な方法として、また血液凝
固因子の精製方法として用いられている。ＡＴＩＩＩ精
製に使用した例としては、例えばアンダーソンらの米国
特許３．８４２，０６１号がある。

しかしながら、ヘパリンアフィニティークロマトグラフ
ィーは有用な分離精製法ではあるが、吸着する物質が複
数ある群特異性のアフィニティークロマトグラフィーに
属する。このため混合溶液からの精製において、目的成
分以外の物質も吸着してしまい、このクロマトグラフィ
ーのみで目的成分を高純度に精製することはできなかっ
た。

したがって、不純物を除去するために目的物質の溶出の
前に様々な洗浄工程を含めたり、さらに精製工程を追加
するなどの対策が取られているが、いずれの場合も目的
物質の回収率の低下、設備の増加等の問題を含んでいる
。

［発明が解決しようとする課題］ ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーが持つこれ
らの問題を解決するために、ヘパリンを結合させる担体
と該担体とヘパリンとの結合条件について鋭意研究を重
ねた結果、該担体のアミノ基量および該担体に対するヘ
パリンの固定化時のｐＨがＡＴＩＩＩの精製度、回収率
に著しく影響することを見いだし、この知見に基づいて
本発明を完成した。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、下記（１）〜　（５）の構成を有する。

（１）アミノ基を有する不溶性多孔質担体にヘパリンを
結合してなるアフィニティークロマトグラフィー用担体
。

（２）アミノ基を有する不溶性多孔質担体のアミノ基量
が乾燥重量当り３００以上１．５００μモル以下である
前記第（１）項に記載の担体。

（３）ヘパリンを不溶性多孔質担体に結合させるときの
ｐＨが８以上ｌＯ以下であることを特徴とする前記第（
１）項、または第（２）項に記載の担体。

（４）不溶性多孔質担体が糖骨格を有する前記第（１１
〜（３）項に記載の担体。

（５）前記第１１）〜　（４）項に記載の担体を使用す
ることを特徴とするアンチトロンビンｍの精製方法。

本発明はＡＴＩＩＩに対し選択性の高いアフィニティー
担体、およびこの担体を用いることを特徴とするＡＴＩ
ＩＩの精製方法よりなる。

以下本発明のアフィニティー担体について詳細に説明す
る。

担体にアミノ基を導入する方法は、特に限定されないが
例えば次の■〜■のような方法がある。

ノ化する方法、 ■エビハロヒドリンを三フッ化ホウ素等の触媒で水酸基
に付加した後アンモニアと反応する方法である。

■臭化シアンを用いる方法、すなわち、担体上の水酸基
をシアン酸エステルまたはイミドカルボネートに置換し
、これにアンモニアを付加する方法、 ■エピへロヒドリンを用いる方法、すなわち、担体の水
酸基をアルカリ置換し、ここにエビへロヒドリンのハロ
ゲンと脱塩させることでエポキシ基を導入後、アンモニ
アを付加してアミノ化する方法（詳細は有機合成化学、
第３８巻１２８〜１３８ページ（１９８０年））、 ■アミノ化エチレンオキサイドを用いる方法、す構造を
持つアミノエチレンオキサイドを無水条件下三フッ化ホ
ウ素等の触媒を用いて直接アミＮＨ。

Ｒ−０−ＣＨ２−ＣＨ−Ｃ１，−Ｘ　　　−Ｈ Ｒ−０−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＬ　　−ＮＨ２ＯＨ （Ｘ　　：　　Ｆ、Ｃ１，Ｂｒ、） 以上の様な方法でアミノ化された担体はアミノ基導入量
により、その後調整されるヘパリンアフィニティーの性
能に太き（影響を与える。具体的にはアミノ基の導入量
が担体の乾燥重量１ｇあたり３００〜１，５００μモル
である担体（以下高度アミノ化担体）にヘパリンを結合
させた場合と、該導入量が３００未満のアミノ基を持つ
担体に対しヘパリンを結合させた場合とでは、ＡＴＩＩ
＋の精製効率に大きな差が生じる。

すなわち高度アミノ化担体にヘパリンを固定化したアフ
ィニティー担体により、血しよう中のＡＴｍを精製する
と従来のヘパリンアフィニティー担体を使用した場合よ
りもＡＴｍ以外の物質であってヘパリンに親和性のある
物質の混入が抑えられ、その結果精製倍率、回収率とも
に高くなるのである。

ヘパリンのアミノ化担体への固定化は、アミノ化担体の
アミノ基とヘパリンの還元末端のアルデヒドでシッフ塩
基を形成させ、ついで還元剤を加えシッフ塩基を還元す
ることにより実施される。

具体的にはヘパリンを緩衝液中に溶解させ、ついでこの
溶液にアミノ化担体を加え一定時間撹拌しシッフ塩基を
形成させたあと、還元剤を添加してさらに一定時間撹拌
してシッフ塩基を還元することによりヘパリンを結合さ
せる。

本発明において用いるヘパリンは市販品をそのまま使用
でき特に限定はされない。例えばヘパリンナトリウム（
レオ製薬会社　ｔＲＥＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ
　ＰＲＯＤＵＣＴＳＩ製）がある。

固定化するヘパリンの量はアミノ化担体の乾燥重量１ｇ
あたり　１０〜１　、０ＯＯＢ好ましくは３０〜２００
ｍｇである。

ヘパリンを溶解する緩衝液の量は担体の湿重量（緩衝液
に懸濁した担体をブフナーろうとを用いて吸引濾過して
、余分の水を除去して得られる重量）に対し１〜１０倍
、好ましくは２〜３倍である。

また緩衝液へヘパリンを溶解する濃度は０．１ｍｇ／＋
ｎＪ２以上飽和濃度までの範囲であればよいが反応性と
経済性から好ましくは５〜５００ｍｇ／＋ｎＩ２である
。

還元剤としては水素化ホウ素ナトリウム以下の還元力を
有し水溶性のものであれば特に限定はされない。例えば
トリメチルアミノボラン、水素化シアノホウ素ナトリウ
ムが使用できる。この還元剤の濃度は使用される緩衝液
量に対し１〜５００ｍｇ／ｍｆｆであり、さらに好まし
くは５〜５０ｍｇ／ｍ℃で用いられる。

また、本発明の方法ではヘパリン結合時の反応溶液のｐ
Ｈをアルカリ側に調整して結合させることによってＡＴ
Ｉ［Ｔの精製倍率を増加できる。すなわちｐＨ１０以上
ではヘパリンが失活し、ｐＨ７以下では精製倍率が低下
するのでヘパリンな溶解する緩衝液のｐＨはｐＨ７〜１
０、好ましくは８〜９，８である。

濃度は１０〜５００ｍＭの緩衝液であれば特に限定され
ない。

ただしヘパリンの還元末端とシッフ塩基を形成する可能
性のある物質、例えばグリシン、トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン等を含んではならない。

使用される緩衝液の種類としては例えばリン酸ナトリウ
ム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝
液がある。

以上述べた高度アミノ化担体とｐＨの条件を組み合わせ
れば、すなわちアミノ基の導入量が乾燥型！１１ｇあた
り　３００〜１．５００μモルである担体にｐＨ８〜９
．５でヘパリンを結合さセればさらに精製度よく、回収
率よ＜　ＡＴＩＩＩを精製できる。

次に本発明のアフィニティー担体を用いたＡＴ用の精製
方法について記載する。ＡＴＩＩＩを精製する方法は通
常行われているクロマトグラフィーの方法に準じて実施
される。

参考例として例えばＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　
ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ　　Ｉ［Ｉ　　ｂｙ　ａｆｆ
ｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ。

Ｔｈｒｏｍｂｉｎ　Ｒｅｓ　　第５巻、４３９〜４５２
ページ（１９７４年）記載の方法がある。すなわちヘパ
リン固定化担体をカラムに充填し吸着バッファーを流し
て平衡化する。

ついでＡＴＩ含有溶液（例えば血しよう）を流して吸着
させる。ついで溶出緩衝液を流して吸着成分を溶出させ
ＡＴＩＩＩｌｒ画分を取得し、この画分を脱塩濃縮する
ことにより精製ＡＴＩＩＩを得ることができる。使用す
る緩衝液は特に限定されないが、吸着緩衝液としては例
えば０．０１〜０．５Ｍ食塩を含むロ、０５〜０，５Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６〜８、溶出緩衝液として
は例えば０．３Ｍ食塩を含む００１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液が使用できる。

この溶出を１ステツプで行うのでなく、例えば食塩濃度
にＯから０．５Ｍのグラジェント勾配をかけてフラクシ
ョネーションしたり、０から０，５Ｍの食塩濃度範囲で
細かく調製した各濃度の溶出液を用いてステップワイズ
法で溶出すれば、ヘパリンに対しＡＴＩＩＩよりも親和
性の弱いものと高いものが除去されるためにさらに高い
純度でＡＴＩＩＩを精製できる。

実施例１ セルロファインｃｐｃ　（チッソ■製の球状多孔性セル
ロース粒子、排除限界分子１００万以上、粒子径５３−
１１０μｍｌ、２５０ｇ　（湿重量）を２Ｌセパラブル
フラスコにいれこれに水酸化ナトリウム水溶液１０重量
％、５００ｍ℃を加え３０℃で１時間撹拌した。

ついでエピクロルヒドリン２００ｍｊ２を添加し３０℃
で２時間撹拌した後、ブフナーろうとで濾過し蒸留水３
して洗浄した。

得られたエポキシ化セルロ〜ス粒子を２Ｌ七゛パラプル
フラスコにいれアンモニア水（２５重量％）３５０ｍ℃
を加えて３０℃で２時間撹拌した。これを３Ｌビーカー
にいれ蒸留水的２Ｌと２０分撹拌し再び濾過した。この
撹拌、濾過による洗浄操作を５回繰り返しアミノ化セル
ロース粒子を得た。

得られた粒子２０ｇ　（湿重量）を１００＋ｎｊ２のビ
ーカーにいれ８０℃恒温器中で乾燥後、ケールタール法
によりチッソ含有量を測定した。この結果、乾燥粒子１
ｇあたりのチッソ含有量は５１００μｇであり、アミノ
基に換算すると　３６４μモルであった。

実施例２ 実施例１において水酸化ナトリウム濃度を２５重量％、
添加量４ＤＯｍｆｆにかえる以外、実施例１と同様に操
作しアミノ化セルロース粒子を得た。この粒子のチッソ
含有量を測定した結果、乾燥粒子１ｇあたり２８００μ
ｇであり、アミノ基に換算すると　２００μモルであっ
た。

実施例３ ０．５Ｌセパラブルフラスコ中でヘパリンナトリウム（
レオ製薬会社（ＬＥＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＰ
ＲＯＤＵＣＴＳ）製）５ｇを０．２Ｍリン酸ナトリウム
緩南港、ｐＨ９、１００ｍＪ２に溶かした。実施例２で
調整したアミノ化セルロース粒子１００ｇ　（湿重量）
を加え５０℃で２４時間反応した。

トリメチルアミノボラン（以下ＴＭＡＢ　：モトンチオ
コール（Ｍｏｒｔｏｎ　Ｔｈ１ｏｋｏｌ、　ＬＴＤｊ製
）１ｇを加え７２時間撹拌後さらにＴＭＡＢｌｇを加え
て４８時間撹拌した。反応溶液をブフナーろうとで濾過
し、濾紙上に得られた担体を蒸留水３Ｌで洗浄してヘパ
リン固定化セルロース粒子を得た。

担体に結合したヘパリン量は以下の方法で求めた。すな
わち、ヘパリンセルロース粒子２０ｇ　　（ｉｆｆｉ重
量）を実施例１と同じ操作で乾燥重量とチッソ含有量を
測定した。

ついで２０ｇ（湿重量）を００１Ｍリン酸緩衝液、ｐ）
１７．　３０ｍ℃に懸濁させ約１時間脱気してから］０
０＋ｎｊ２メスシリンダーに移し、１週間静置し、ヘパ
リン固定化セルロース粒子の体積を測定した。

方、反応に用いたヘパリン１ｇあたりの総チッソ量もケ
ールタール法で定量し、以下の計算式によりセルロース
粒子に対するヘパリン結合量を求めた。

ヘパリンセルロースの膨潤度 （ＩＩＩＩ２／乾燥重量９ｇ）＝ ヘパリンセルロース体積（ｍ℃）／ ヘパリンセルロース湿重量ｆ２０ｇｌ ヘパリンセルロース乾燥重量（ｇ）／ ヘパリンセルロース湿重量（２０ｇ） ヘパリン結合量（ｍｇ／乾燥重量９ｇ）＝［ヘパリンセ
ルロースの総チッソ量− アミノ化セルロースの総チッソ量］ ヘパリン結合量（ｍｇ／ｍβ）＝ ヘパリン結合量（ｍｇ／乾燥重量、　ｇｌヘパリンセル
ロ スの膨潤度（ｍ９１／乾燥重ｊ１．ｇ）実施例４ 実施例３においてアミノ化セルロース粒子を実施例１で
得られた物に代え、またリン酸ナトリウム緩衝液のｐＨ
を７に代える以外、実施例３と同様にしヘパリン固定化
セルロース粒子を得た。

実施例５ 実施例３においてアミノ化セルロース粒子を実施例１で
得られた物に代える以外、実施例３と同様にしヘパリン
固定化セルロース粒子を得た。

比較例１ 実施例３においてアミノ化セルロース粒子を実施例２で
得られた物に、またリン酸ナトリウム緩衝液のｐＨを７
に代える以外、実施例３と同様にしヘパリン固定化セル
ロース粒子を得た。

実施例６ 実施例３〜５及び比較例１で得られた各種ヘパリンセル
ロース担体と市販のヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ　
（ファルマシアＬＫＢ■製）をそれぞれポリプロピレン
製ミニカラム（φ９ｍｍ、生化学■製）に１ｍ℃充填し
０．１５Ｍ食塩を含む０、０１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７
（以下、吸着緩衝液）２０ｍｊ２で洗浄した。

クエン酸塩添加入標準血しよう（サイトロールＩ　（Ｃ
ｉ−ｔｒｏｌ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ、　Ｌｅｖｅｌ　Ｉ　１バクスターへルスケア（Ｂａ
ｘｔｅｒ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｃａｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ１社製）２＋ｎｊ２をカラムに添加し流速５０ｍβ
／ｈｒで流し、さらに吸着緩衝液２０ｍρを流して洗浄
した。この時の流出液は５０ｍ℃のメスシリンダー（メ
チルペンテン樹脂製）に回収した。

次にメスシリンダーを交換し１．５Ｍ食塩を含む００１
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７（以下溶出緩衝液）２０ｍ℃で溶
出した。添加血しよう、洗浄液、溶出液について蒸留水
をブランクにして紫外線吸収（波長２８０、以下０Ｄ２
８０）ならびにＡＴＩＩＩ測定キット（クロモレイトＡ
Ｔｍセット、■ヤトロン製）を用いてＡＴＩ［Ｉ活性を
測定した。

このキットで求められるＡＴＩＩＩ活性は正常人血しょ
う中のＡＴＩＩ＋活性を１００％とした場合の相対活性
値である。また、精製倍率は次の計算式で求めた。

実施例１〜５、比較例１で得られたヘパリン固定化セル
ロース粒子の総チッソ量とＡＴＩＩＩ吸着量の関係を表
１に示す。

実施例７ 実施例６で得た溶出液を膜型加圧濃縮器ノヴアセルｆＮ
ＯＶＡｃＥＬＬ、フィルター膜の排除限界分子量８００
０、ＦＩＬＴＲＯＮ　Ｃ０ＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）でｌ
／４０容量まで濃縮した。得られたサンプルをメルカプ
トエタノール−ドデシル硫酸ナトリウム溶液（１０重量
％メルカプトエタノール、５重量％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、２ｍＭエチレンジアミノ４酢酸を含む３０１ＩＩ
Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８）で１＝１に希釈し５分間
煮沸した。

このタンパク組成を電気泳動装置ファストシステム（Ｐ
ｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ、　　ファルマシア、ＬＫＢバ
イオテクノロジー社製、電気泳動ゲル：　ＰｈａｓｔＧ
ｅｌＧｒａｎｄｉｅｎｔ　８−２５）で電気泳動し、同
システムで銀染色した。この結果を第１図に示した。

実施例３〜５及び比較例１から得られたヘパリン固定化
セルロース粒子をカラムに充填し、これに人匍しようを
流しヘパリンに親和性のある物質を吸着させ洗浄後溶出
し、得られたタンパク質の電気泳動パターンを第１図に
示す。

実施例６において実施例５のヘパリン固定化セルロース
を用いて、次に示す操作を変更する以外同じ操作とした
。

ＡＴＩＩＩ吸着後、吸着緩衝液での洗浄操作を終えてか
らさらに０．１Ｍ食塩を含む０．１）ＩＭリンＨａ衝南
港ｐＨ７，２０ｍβで洗浄した。

次にメスシリンダーを交換し１Ｍ食塩を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝液、ｐＨ７で溶出した。

実施例１〜５，７及び比較例１で得られたヘパリン固定
化セルロース粒子の総チッソ量とＡＴｍ吸着量の関係を
表１にまとめた。

［発明の効果］ 表１が示すように従来品であるヘパリンセファロースＣ
Ｌ−６Ｂ、比較例１［低アミノ化セルロース粒子、反応
ｐＨ７］に比較し、反応ｐＨを９にするか（実施例３）
または高アミノ化セルロース粒子（実施例４）を用いる
ことでＡＴ［＋の精製倍率を改善でき、さらに高アミノ
化粒子と反応ｐＨ９を組み合わせることで（実施例５）
吸着量、精製倍率ともに大きく改善できる。これらの改
善がＡＴＩ［ｌ以外でヘパリンに親和性を持つ成分の吸
着が抑えられたために生じたことが第１図の電気泳動結
果かられかる。

以上述べたように本発明で得られるヘパリンアフィニテ
ィークロマトグラフィー用担体はＡＴＩＩＩに対して高
い選択性を有し、この担体を用いてＡＴＩＩＩを精製す
る方法は、ＡＴ［［Ｉを高純度かつ高回収率で精製でき
る優れた方法である。

Ｒｕｎ Ｎ。

実施例（比較例） 又はＣｏｎｔｒｏｌ 摘 比較例１　　　低チッソ 実施例３　　　低チッソ 実施例４　　　高チッソ 実施例５　　　高チッソ ヘパリンセファロース Ｌ−６１３ ６。

マーカー 要 （ｐＨ７） （ｐＨ９） （ｐＨ７） （ｐＨ９） 以 上

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例、比較例に係る各ヘパリンア
フィニティークロマトグラフィーに吸着した人血しょう
の電気泳動パターンを示す。 図面においてＲｕｎ　Ｎｏ、　１〜６と実施例又は比較
例Ｎｏ、若しくはＣｏｎｔｒｏｌとの関係は、下２のと
おりである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ基を有する不溶性多孔質担体にヘパリンを
   結合してなるアフィニティークロマトグラフィー用担体
   。
2. （２）アミノ基を有する不溶性多孔質担体のアミノ基量
   が乾燥重量当たり３００以上１，５００μモル以下であ
   る特許請求の範囲第（１）項に記載の担体。
3. （３）ヘパリンを不溶性多孔質担体に結合させるときの
   ｐＨが８以上１０以下であることを特徴とする特許請求
   の範囲第（１）項、または（２）項に記載の担体。
4. （４）不溶性多孔質担体が糖骨格を有する特許請求の範
   囲第（１）〜（３）項に記載の担体。
5. （５）特許請求の範囲第（１）〜（４）項に記載の担体
   を使用することを特徴とするアンチトロンビンIIIの精
   製方法。