CH652723A5 - Verfahren zur reinigung von riboflavin-5'-monophosphat. - Google Patents

Description

652723

2

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Reinigung von rohem Riboflavin-5'-monophosphat, das als Verunreinigung Riboflavin-4'-monophos-phat enthält, dadurch gekennzeichnet, dass man das rohe Riboflavin-5' -monophosphat unter Verwendung einer mit einem schwachbasischen Anionenaustauscherharz gefüllten Säule säulenchromatographiert, wobei das Anionenaustauscherharz ein Gerüst aus einem vernetzten Ester von Polya-crylsäure oder Polymethacrylsäure ausweist, in welchem mindestens ein Teil der Esterbindungen in Amidbindungen der Formel

Ri

-CON-

~\R2

worin Ri eine Gruppe der Formel

(I)

-R3

-^ch2-)-N/

n \R4

(2)

oder

R3

(3)

—{-CH2 - CH2 - N-)-R4 m darstellt, in denen n für eine ganze Zahl von 2-6, m für eine ganze Zahl von 2-4, und R3 und R4 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Alkyl mit 1-6 C-Atomen stehen, und R2 die gleiche Bedeutung hat wie Ri oder Wasserstoff oder Alkyl mit 1 -6 C-Atomen bedeuten, umgewandelt ist, und dass man aus der Säule eine Fraktion von gereinigtem Riboflavin-5'-monophosphat eluiert.

zu schaffen, das die Herstellung von 5'-FMN mit einem verminderten Gehalt an Verunreinigungen aus rohem, 4'-FMN enthaltendem 5'-FMN ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemässe, im s Patentanspruch definierte Verfahren gelöst.

Im nachstehenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielsweise erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

10 Fig. 1 und 2 Chromatogramme, die durch Chromatographie von hohem 5'-FMN nach dem erfmdungsgemässen Verfahren erhalten wurden, wobei die Kurven 1,2,3 und 4 Riboflavin-5 ' -FMN, 4' -FMN bzw. eine X-Komponente darstellen, und ls Fig. 3 Veränderungen des pH-Wertes eines Eluats aus der Säule bei Chromatographie von rohem 5'-FMN nach dem erfmdungsgemässen Verfahren.

Wenn in der Formel I gemäss Patentanspruch Ri eine 20 Gruppe der Formel 2 bedeutet, ist Ri üblicherweise Dimethyl-aminoalkyl oder Diäthylaminoalkyl, und R2 hat dieselbe Bedeutung wie Ri oder steht für Wasserstoff. Andererseits ist, wenn Ri in der Formel I eine Gruppe der Formel 3 bedeutet, R2 üblicherweise Wasserstoff, und R3 und R4 bedeuten gleich 25 oder verschieden je Wasserstoff, Methyl oder Äthyl.

Das im erfmdungsgemässen Verfahren verwendet, Amido-gruppen enthaltene, schwachbasische Anionenaustauscherharz kann hergestellt werden durch Suspensionspolymerisation eines Acrylsäureesters, wie Methyl- oder Äthylacrylat, 30 oder eines entsprechenden Methacrylsäureesters, mit einem Vernetzungsmittel, wie Divinylbenzol, in einem wässrigen Medium nach bekannter Methode unter Bildung eines vernetzten Copolymers, das anschliessend mit einem Amin der Formel

35

Ri

H-N-

\R2

(4)

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von rohem Riboflavin-5'-monophosphat, das im nachstehenden als «5'-FMN» bezeichnet wird, das als Verunreinigung Riboflavin-4'-monophosphat, das im nachstehenden als «4'-FMN» bezeichnet wird, enthält.

Das rohe 5' -FMN kann auch andere Verunreinigungen, wie Riboflavin, Riboflavin-polyphosphorsäureester und andere Riboflavinderivate enthalten.

5' -FMN ist eine Verbindung, die eine sehr vitale Rolle als Coenzym für verschiedene Enzymreaktionen im lebenden Körper darstellt und als Zusatzmittel in pharmazeutischen Zubereitungen, Nahrungsmitteln und Futtermitteln verwendet wird. Weiterhin wird 5 ' -FMN weitverbreitet verwendet als Ausgangsmaterial für Flavin-adenin-Dinucleotid, das im nachstehenden als «FAD» bezeichnet und als therapeutisches Mittel gegen Vitamin-B2-Mangel verwendet wird.

Industriell wird 5'-FMN üblicherweise hergestellt durch Reaktion von Riboflavin mit einem Phosphorylierungsmittel, wie Phosphorylchlorid. Solcherart hergestelltes 5'-FMN enthält Verunreinigungen, wie unreagiertes Riboflavin, 4'-FMN, Riboflavin-4'-5'-cyclophosphatund Ribo-flavin-polyphosphorsäure, die als Nebenprodukte gebildet werden.

Da diese Verunreinigungen ähnliche Strukturen aufweisen, wie 5'FMN, ist es schwierig, diese Verunreinigungen abzutrennen. Insbesondere 4'-FMN hat eine sehr analoge Struktur zu derjenigen von 5' -FMN und es ist daher äusserst schwierig, diese beiden Substanzen voneinander zu trennen.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren

40

worin Ri und R2 dieselbe Bedeutung haben wie in der Formel (1) umgesetzt wird, um die Esterbindungen in Amidbindungen umzuwandeln, wonach gewünschtenfalls die Wasserstoffatome der Aminogruppen durch Behandlung mit einem 45 Alkylierungsmittel weiterhin alkyliert werden können.

Als Ausgangsmaterial für die Chromatographie nach dem erfmdungsgemässen Verfahren wird üblicherweise ein rohes 5 ' -FMN, das durch Reaktion von Riboflavin mit einem Phosphorylierungsmittel, wie Phosphorylchlorid erhältlich so ist, als solches verwendet. Solches rohes 5'-FMN enthält als Verunreinigungen ausser 4'-FMN Riboflavin-Polyphosphor-säure und andere Riboflavinderivate sowie unreagiertes Riboflavin.

Selbstverständlich kann auch rohes 5' -FMN verwendet 55 werden, aus welchem vorgängig leicht abtrennbare Verunreinigungen, wie unreagiertes Riboflavin, entfernt wurden.

Die Chromatographie kann äusserst leicht durchgeführt werden, indem ein bestimmter Mengenanteil einer Lösung von rohem 5'-FMN in den oberen Teil einer mit dem vorste-60 hend beschriebenen, schwachbasischen Anionenaustauscherharz gefüllten Teil einer Säure eingeleitet und danach auf konventionelle Art ein Entwickler zur Entwicklung der Säule eingeleitet wird. Die Säule wird vorzugsweise hergestellt, indem das schwachbasische Anionenaustauscherharz sol-65 cherart in die Säule eingefüllt wird, dass die Höhe der eingefüllten Schicht 0,5-10 m, vorzugsweise 1-4 m beträgt. Das schwachbasische Anionenaustauscherharz wird vorzugsweise in Form eines carbonsäurebeladenen Typs, der mit

652 723

einer Carbonsäure, wie Ameisen-, Essig- oder Kohlensäure behandelt wurde, eingesetzt.

Bei Verwendung derartiger Harze vom Carbonsäure bela-denen Typ, breitet sich das Adsorptionsband von 5'-FMN in der Säule nicht aus, sodass 5'-FMN aus dem Säuleneluat in hoher Konzentration gewonnen werden kann. Wenn im Gegensatz dazu kein Harz von Carbonsäure beladenen Typ verwendet wird, ist es empfehlenswert, ein Gemisch eines mit Salzsäure oder einer andern Mineralsäure beladenen Typs und eines freien Typs einzusetzen. Wenn das Harz jedoch vollständig ein mit Mineralsäure beladener oder freier Typ ist, ist es im allgemeinen schwierig, eine gute Trennung zu erzielen. Das rohe 5' -FMN wird zweckmässig in Form einer Lösung in einem Lösungsmittel solcherart in die Säule eingeleitet, dass dessen Mengenanteil üblicherweise im Bereich von 0,5-20 g, vorzugsweise 1-5 g, pro dm3 des schwachbasischen Anionenaustauscherharzes in der Säule beträgt. Üblicherweise wird als Entwickler eine wässrige Lösung eines Salzes eingesetzt. Der pH-Wert des Entwicklers liegt vorzugsweise im Bereich von 2-5. Geeignete Salze sind beispielsweise Ammonium-, Natrium- und Caliumchlorid und dergleichen. Am einfachsten wird eine 0,1-5 gew.%-ige wässrige Lösung von Natriumchlorid als Entwickler eingesetzt, wobei es jedoch zu bevorzugen ist, eine gepufferte derartige wässrige Lösung von Natriumchlorid zu verwenden, welcher ein Puffer, wie Ameisensäure/Natriumformiat oder Essig-säure/Natriumacetat, zugesetzt wurde. Die Durchflussrate des Entwicklers liegt zweckmässig im Bereich von 0,05-5 m/h.

Wenn rohes 5'-FMN im erfmdungsgemässen Verfahren mit einer wässrigen Natriumchloridlösung entwickelt wird, fliesst zuerst Riboflavin aus der Säule, wie in den Zeichnungen dargestellt. Danach beginnen 4'-FMN und eine Komponente, die entweder als Riboflavin-4'5'-cyclophos-phat oder Riboflavin-3' -monophosphat betrachtet und als X-Komponente bezeichnet wird, und schlussendlich 5'-FMN aus der Säule zu fliessen. Die Ausflusskurven von 4'-FMN und der X-Komponente und diejenige von 5'-FMN überschneiden einander, da sich jedoch die Kurven in der Form voneinander unterscheiden, ist gereinigtes 5' -FMN erhältlich durch Fraktionierung der letztgenannten Portion der Ausflusskurve von 5'-FMN. Der Ausfluss von Ribo-flavin-polyphosphorsäure ist beträchtlich verzögert. Die Chromatographie wird üblicherweise bei Zimmertemperatur von beispielsweise 20-30°C ausgeführt.

In den nachstehenden Beispielen und im Vergleichsversuch wird die Erfindung eingehend erläutert.

Das in den Beispielen verwendete, schwachbasische Anionenaustauscherharz wurde beispielsweise folgendermassen hergestellt:

Äthylacrylat und industrielles Divinylbenzol mit einem Divinylbenzolgehalt von 56 Gew.% wurden nach konventioneller Methode in einem wässrigen Medium suspensionspo-lymerisiert, wobei ein Äthylacrylat/Divinylbenzol-Copo-lymer vom Geltyp mit einem Vernetzungsgrad von 3% erhalten wurde.

200 g des erhaltenen, getrockneten Copolymers und 1000 g N,N-Diemthylpropylendiamin, wurden in einen Autoclaven gefüllt und das Gemisch wurde während 20 h bei 190°C reagieren gelassen. Das Reaktionsprodukt wurde abfiltriert und dann nacheinander mit Wasser, IN Salzsäure, Wasser, einer 1N wässrigen Lösung von Natriumhydroxyd und Wasser gründlich gewaschen.

Das erhaltene, schwachbasische Ionenaustauscherharz hatte eine Ionenaustauschkapazität von 1,1 val/kg, einen Wassergehalt von 69 Gew.% und eine durchschnittliche Teil-chengrösse von 350 um.

In den Beispielen wurde die Analyse jeder Komponente durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeit-Chromatographie unter den nachstehenden Bedingungen ausgeführt:

Säule: «jj.-Bondapack» C 18 von Waters Co., Ltd. Elutionsmittel: 0,015 M Lösung von Ammoniumacetat in 5 Methanol/Wasser im Volumen Verhältnis von 21:79 Durchflussrate: 1,0 ml/min.

Temperatur: Zimmertemperatur von 20-30°C Messung: UV 254 nm io Unter den vorstehenden Bedingungen wurden die Komponenten mit Retentionszeiten von 3,7,9,11 bzw. 34 min als Riboflavin-polyphosphorsäure, X-Komponente, 4'-FMN, 5' -FMN bzw. Riboflavin identifiziert. Die Konzentrationen sind dargestellt durch Umwandlung der Absorbtion bei UV 15 254 nm in diejenige von 5'-FMN.

Beispiel 1

Ein schwachbasisches Anionenaustauscherharz vom freien Typ wurde zu einer grossen Menge einer 1 gew.%-igen wäss-20 rigen Lösung von Natriumchlorid, deren pH-Wert mit IN Salzsäure auf 3,8 gestellt worden war, gegeben und das Gemisch wurde solange gerührt, bis das Harz und die wässrige Lösung einen Gleichgewichtszustand erreicht hatten. Zur Herstellung einer Säule für Chromatographie wurden 25 215 cm3 des erhaltenen Harzes in ein Glasrohr mit 15 mm lichter Weite gefüllt. In die erhaltene Säule wurden 172 ml einer wässrigen Lösung von rohem FMN, enthaltend 3540 mg/1 5'-FMN, 635 mg/1 4'-FMN, 300 mg/1 Riboflavin, 110 mg/1 Riboflavin-polyphosphorsäure und 30 420 mg/1 einer X-Komponente, die als entweder

Riboflavin-4'-5'-cyclophosphat oder Riboflavin-3'-monophosphat erachtet wurde, in den oberen Teil der Säule mit einer Durchflussrate von 0,25 m/h eingeleitet. Eine wässrige Lösung, enthaltend 0,83 g/1 Ameisensäure und 10 g/1 Natri-35 umchlorid, die mit IN Natronlauge auf den pH-Wert 3,8 gestellt worden war, wurde als Entwickler mit einer Durchflussrate von 0,25 m/h durch die Säule geleitet. Es wurde dabei das in Fig. 1 dargestellte Chromatogramm erhalten. Die Riboflavin-polyphosphorsäure floss nicht aus der Säule, 40 bevor 31 des Entwicklers durch die Säule gelaufen waren. In diesem Beispiel wurden alle Operationen bei Zimmertemperatur von 20-30°C ausgeführt.

Beispiel 2

45 Ein schwachbasisches Anionenaustauscherharz vom freien Typ wurde zu einer grossen Menge 0,018N wässriger Ameisensäure gegeben, die mit IN Natronlauge auf den pH-Wert 3,8 gestellt worden war. Das Gemisch wurde solange gerührt, bis das Harz und die wässrige Ameisensäure einen Gleichge-50 wichtszustand erreicht hatten. Zur Herstellung einer Säule für Chromatographie wurden 430 cm3 des erhaltenen Harzes in ein Glasrohr mit 15 mm lichter Weite gefüllt.

Unter Verwendung der erhaltenen Säule wurde rohes FMN chromatographiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. 55 Dabei wurde das in Fig. 2 dargestellte Chromatogramm erhalten. In Fig. 3 ist die Veränderung des pH-Wertes des aus der Säule laufenden Eluats dargestellt.

Nach Durchlauf von 4 ml des gleichen Entwicklers wie in Beispiel 1 durch die Säule, wurden nacheinander 0,512N 6o Salzsäure und 11 IN Natronlauge durch die Säule geleitet. Weiterhin wurde eine 0,018N wässrige Ameisensäure, deren pH-Wert mit IN Natronlauge auf 3,8 gestellt worden war, durch die Säule geleitet, um das Harz in einen Gleichgewichtszustand mit der wässrigen Ameisensäure zu bringen. 65 Unter Verwendung der erhaltenen Säule wurde die Chromatographie von rohem FMN ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Es wurde dabei ein gleiches Chromatogramm erhalten, wie in Beispiel 1.

652723

4

Vergleichsversuch

Rohes FMN wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehen mit der Ausnahme chromatographiert, dass als Füllmaterial 3 verschiedene, handelsübliche Ionenaustauscherharze eingesetzt wurden, nämlich:

1) «Diaion» WA30 von Mitsubishi Chemical Industries Ltd., ein schwachbasisches Anionenaustauscherharz mit funktionellen Radikalen vom Dimethylbenzylamin-Typ;

2) «Diaion» PA408 von Mitsubishi Chemical Industries Ltd., ein schwachbasisches Anionenaustauscherharz mit funktionellen Radikalen vom Dimethylbenzyläthanolamin-Typ;

3) «Amberlite» IRA458 von Rhom & Haas Co., ein starkbasisches Anionenaustauscherharz mit funktionellen Radikalen von N-[co-(N',N',N'-Trimethylammonium)-alkyl]-amid-Typ.

s

5'-FMN wurde jedoch praktisch nicht von 4'-FMN getrennt. Weiterhin war die Abtrennung von 5 ' -FMN von anderen Verunreinigungen schlecht.

Im vorstehenden wurde die Erfindung unter Bezugnahme io auf besondere Ausführungsformen erläutert. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass im definierten Rahmen der Erfindung zahlreiche Veränderungen und Modifikationen möglich sind.

B

1 Blatt Zeichnungen