DE69312205T2

DE69312205T2 - Reinigungsmethode von Rohprodukt

Info

Publication number: DE69312205T2
Application number: DE69312205T
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Furusawa; Katsuhiko Hirota; Hirofumi Kuroda; Masahiko Tsujii
Original assignee: Eisai Chemical Co Ltd
Current assignee: Eisai Chemical Co Ltd
Priority date: 1992-10-14
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 1997-12-11
Anticipated expiration: 2013-10-09
Also published as: EP0592962A1; DE69312205D1; EP0592962B1; JPH07174747A; US5547580A; JP3025590B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG:

Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reinigungsverfahren für ein Rohprodukt durch Säulenchromatografie, in welchem methanolhaltiges n-Hexan und/oder n-hexanhaltiges Methanol als Extraktionsmittel verwendet wird.

Beschreibung des Standes der Technik:

Eine Vielzahl von Verfahren wurde bis heute zur Reinigung von Rohprodukten angewendet. Von diesen wurde die in der Separationsleistung hervorragende Säulenchromatografie häufig verwendet.
In der Säulenchromatografie an Silicagel (kann im folgenden als "Silicagelsäule" bezeichnet werden) wird eine aus einer Vielzahl von Komponenten bestehende Rohproduktmischung an Silicagel als festem Träger (stationärer Zustand) adsorbiert, und die Komponenten werden dann getrennt und gereinigt, wobei besonders Gebrauch gemacht wird von den Unterschieden zwischen den Komponenten im Adsorptionskoeffizienten und dem Verteilungskoeffizienten an die stationäre Phase und eine mobile Phase, indem im allgemeinen nacheinander das Mischungsverhältnis einer Mehrzahl von Lösungsmitteln variiert wird, um die Polarität des Extraktionsmittels zu verändern.
In der Säulenchromatografie an Vinylalkohol-Copolymer (kann im folgenden als "Polymersäule" bezeichnet werden) werden Trennung und Reinigung durchgeführt, indem Gebrauch gemacht wird von den Unterschieden zwischen den Komponenten im Absorptionskoeffizienten an den Träger und in der Geschwindigkeit, mit der sie durch die Poren des festen Trägers hindurchlaufen.
Wenn deshalb eine Rohproduktmischung eine Vielzahl von Komponenten umfasst oder eine Rohproduktmischung Komponenten mit physikalischen Eigenschaften (Adsorptionskoeffizient, Verteilungskoeffizient, etc.) ähnlich denen der zu reinigen beabsichtigten Komponente enthält, kann eine ausreichende Trennung und Reinigung nicht vollständig erreicht werden, es sei denn, das Mischungsverhältnis eines Extraktionsmittels wird schrittweise verändert. Demgemäss wurden bis heute Kombinationen von in jedem Verhältnis frei mischbaren Lösungsmitteln gewählt.
Beispielsweise wird in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 44316/1990 ein Trennungs- und Reinigungsverfahren offenbart, in dem Rohlecithin an einer Silicagelsäule adsorbiert wird, und ein niederes Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und einem Wassergehalt von bis zu 20 Vol.% wird dann verwendet.
Daneben offenbart die JP-OS Nr. 277457/1989 ein Verfahren, in welchem Rohlecithin an einer Silicagelsäule adsorbiert wird, und dann mit einem gemischten Lösungsmittelsystem von Ethanol/Wasser/n-Hexan getrennt und gereinigt wird.
Weiterhin offenbart die JP-OS Nr. 145891/1986 ein Verfahren, in welchem Rohlecithin an einer Silicagelsäule adsorbiert wird, und dann mit einer Mischung von Petrolether mit einem Siedepunkt von 40 bis 80ºC, einem niederen Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Wasser abgetrennt und gereinigt wird.
Viele Stoffe, wie Silicagel, Aluminiumoxid, Kieselgur, Polymerkügelchen und Ionenaustauscherharze, werden als feste Träger für die Säulenchromatografie verwendet. Kieselgur soll jedoch in der Trennkraft nicht ausreichend sein als fester Träger für die Chromatografie. Ausserdem sind die lonenaustauscherharze teuer und sind dahingehend eingeschränkt, dass die zu trennende und zu reinigende Substanz ionisch sein muss. Deshalb werden vom gesamtindustriellen Gesichtspunkt, einschliesslich Trennleistung, Leistungsfähigkeit der Arbeitsweise und Wirtschaftlichkeit, im allgemeinen häufig Silicagel und Aluminiumoxid verwendet.
JP-A-61-176597 beschreibt die Verwendung von Aluminiumoxid als festem Träger in einer Chromatografiesäule, die mit n-Hexan-Methanol mit einem Methanolgehalt von über 68,4 % oder mit n-Hexan-Ethanol mit einem Ethanolgehalt von 15 bis 80 Gew.-% insbesondere 20 bis 50 Gew.%, eluiert wird.
JP-A-55-159797 beschreibt ein Verfahren für die Reinigung von Coenzym Q unter Verwendung eines synthetischen kohlenstoffhaltigen Adsorptionsharzes als festem Träger in einer chromatografiesäule zur Eluierung mit Methanol oder n-Hexan.
JP-A-3-011086 beschreibt eine Umkehrphasen-Mitteldruck- Verteilungschromatografiesäule und ein isokratisches Extraktionsmittel, das eine Mischung typischerweise aus 5 bis 20 Vol.% Wasser, 15 bis 30 Vol.% eines Chlorkohlenwasserstoffs und 50 bis 80 Vol.% eines niederen Alkohols ist.
Aluminiumoxid besitzt den Vorzug, dass, wenn es einer sauren oder basischen Behandlung unterzogen wird, die die Rohproduktmischung darstellenden Komponenten unter besonderer Verwendung eines pH-Unterschieds zwischen den Komponenten getrennt werden können. Es besitzt jedoch Nachteile darin, dass seine Adsorptionsfähigkeit zu stark ist, um die beabsichtigten einzelnen Komponenten vollständig zu eluieren, und abhängig von der Art der Komponenten wirkt das Aluminiumoxid eines festen Trägers selbst als Katalysator, der einige Komponenten mit dem im festen Träger und/oder den Lösungsmitteln enthaltenen Wasser hydrolysiert, was zu einer Reduzierung der Reinheit der Komponenten während der Trennung führt. Deshalb kann Aluminiumoxid nicht zur Trennung und Reinigung von allen Rohprodukten eingesetzt werden.
Andererseits besitzt das Trenn- und Reinigungsverfahren durch die Silicagelsäule einen Vorzug darin, dass die beabsichtigten Komponenten zuverlässig getrennt werden können. Selbst wenn die ausfliessende Flüssigkeit zur Wiedergewinnung der Lösungsmittel konzentriert wird, können sie jedoch nicht wiederverwendet werden, da das Mischungsverhältnis der Lösungsmittel nicht konstant bleibt. Deshalb werden die Lösungsmittel nur einmal verwendet und dann verworfen. Wenn ein Wasser/Alkohol- System als mobile Phase verwendet wird, wie in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 44316/1990 und der JP-OS Nr. 277457/1989 offenbart, verschlechtert sich weiterhin das Silicagel des festen Trägers in einem besonders deutlichen Ausmass. Eine aufgebaute Säule kann deshalb nicht wiederverwendet werden.
Es gibt deshalb eine Nachfrage nach der Entwicklung eines Verfahrens, das die oben beschriebenen Nachteile, die mit den herkömmlichen Reinigungsverfahren oder den Verfahren durch Säulenchromatografie zusammenhängen, verbessern kann und es ermöglicht, wirkungsvollen Gebrauch von den Resourcen zu machen, und das ebenso die Wirtschaftlichkeit weiter steigern kann, während die Trennleistung in einem ebenso hohen oder höheren Masse wie die der herkömmlichen Verfahren beibehalten wird.
Im Hinblick auf die Wiederverwendung der Lösungsmittel zur Trennung und auf die Reduktion der Produktionskosten vor dem oben beschriebenen Hintergrund wurde versucht, die zurückgewonnenen Lösungsmittel zu rektifizieren, um ein spezielles Lösungsmittel zu sammeln. Es werden jedoch enorme Energiemengen benötigt, um einen Rektifikationsapparat zu betreiben, und darüber hinaus bilden viele Lösungsmittelsysteme azeotrope Mischungen, so dass die Reinheit des speziellen Lösungsmittels durch die Rektifizierung allein nicht höher als bis zu einem festen Niveau erhöht werden kann. In den meisten Fällen wird deshalb die Wirtschaftlichkeit im Gegenteil eher verschlechtert. Zusätzlich liegt ein Nachteil darin, dass, wenn Wasser im Extraktionsmittel verwendet wird, ein fester Träger, wie Silicagel, sich deutlich verschlechtert, so dass er ungeeignet für die Wiederverwendung wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Unter dem Gesichtspunkt der vorhergehenden Umstände haben die Autoren der vorliegenden Erfindung umfassende Untersuchungen durchgeführt hinsichtlich eines Extraktionsmittels, das die Bedingungen erfüllt, dass es einen festen Träger nicht verschlechtert und wiedergewonnene Lösungsmittel ohne Durchführung einer Rektifizierung wiederverwendet werden können, im Hinblick auf die Lösung der oben beschriebenen Nachteile der herkömmlichen Lösungsmittelsysteme zur Säulenchromatografie an Silicagel. Als ein Ergebnis haben die Autoren der vorliegenden Erfindung unerwartet gefunden, dass, wenn zwei Komponenten von methanolhaltigem n-Hexan und/oder n-hexanhaltigem Methanol als Extraktionsmittel verwendet werden, Trenn- und Reinigungswirkungen mindestens gleich denen der herkömmlichen Trennmittel erreicht werden können, und dass wiedergewonnene Lösungsmittel wiederverwendet werden können, allein durch erneutes Mischen derselben, so dass sich eine obere Schicht und eine untere Schicht voneinander abtrennen, was zur Vollendung der vorliegenden Erfindung führte; die obigen zwei Komponenten wurden bisher nicht in der Trennung und Reinigung durch eine Silicagelsäule verwendet, da sie nicht in einem beliebigen freien Verhältnis gemischt werden können.
Demgemäss ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Trenn- und Reinigungsverfahren durch Säulenchromatografie zur Verfügung zu stellen, welches eine hervorragende Wirtschaftlichkeit besitzt, während eine hohe Trennleistung beibehalten wird.
Unter einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird deshalb ein Reinigungsverfahren eines Rohprodukts durch Säulenchromatografie zur Verfügung gestellt, welches die Schritte umfasst:
Adsorbieren des Rohprodukts, ausgewählt aus Lecithin, Indometacinfarnesyl, Menatetrenon, Phytonadion, Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure und Coenzym Q&sub0;, an einem festen Träger;
Eluieren des Rohprodukts durch Spülen der Säule mit einem Extraktionsmittel, das n-hexanhaltiges Methanol und/oder methanolhaltiges n-Hexan ist, erhältlich durch sorgfältiges Mischen von n-Hexan und Methanol und Trennen der resultierenden Mischung in eine obere Schicht aus methanolhaltigem n-Hexan und eine untere Schicht aus n-hexanhaltigem Methanol;
wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass der feste Träger Silicagel ist.
Das obige und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden auf einfache Weise anerkannt werden aus den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die im folgenden ausführlich beschrieben werden.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN

In der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendbares Silicagel kann jedes beliebige Silicagel sein, solange es zur Verwendung in der Säulenchromatografie geeignet ist. Es ist jedoch bevorzugt, diejenigen mit einer Teilchengrösse von 80 bis 500 Mesh zu verwenden. Beispiele dafür können einschliessen Silicagel ["Micro Bead Silica Gel 4B", Handelsname (200 bis 350 Mesh)], hergestellt von Fuji-Davison Chemical, Ltd., Japan.
Die zu verwendende Menge des festen Trägers (Silicagel) beträgt im allgemeinen das 1- bis 100-fache, bevorzugt 2- bis 500-fache, besonders bevorzugt 3- bis 10-fache des Gewichts des zu behandelnden Rohprodukts.
Die hier verwendeten Begriffe "n-hexanhaltiges Methanol" und "methanolhaltiges n-Hexan" bedeuten eine Methanolschicht bzw. eine n-Hexanschicht, die sich voneinander abtrennen nach sorgfältigem Durchmischen der beiden Lösungsmittel unter Rühren. Dem n-Hexangehalt und dem Methanolgehalt in den jeweiligen Schichten ist keine Beschränkung auferlegt. Im allgemeinen sind der n-Hexangehalt im n-hexanhaltigen Methanol und der Methanolgehalt im methanolhaltigen n-Hexan bei Raumtemperatur 15 bis 35 Gew.% bzw. 3 bis 10 Gew.%.
Bezüglich der Menge der zu verwendenden Lösungsmittel wird methanolhaltiges n-Hexan in einem Anteil von 2 bis 200 Volumenteilen, bevorzugt 10 bis 150 Volumenteilen, besonders bevorzugt 20 bis 100 Volumenteilen pro Volumenteil des festen Trägers verwendet. In ähnlicher Weise wird n-hexanhaltiges Methanol in einem Anteil von 1 bis 50 Volumenteilen, bevorzugt 5 bis 40 Volumenteilen, und besonders bevorzugt 10 bis 30 Volumenteilen pro Volumenteil des festen Trägers verwendet.
Eine Silicagelsäule wird nach der Praxis der vorliegenden Erfindung hergestellt. Als Füllverfahren in diesem Fall können entweder ein Nassverfahren, in welchem Silicagel in einem Lösungsmittel suspendiert wird, um die suspension in eine Säule zu füllen, oder ein Trockenverfahren verwendet werden, in welchem trockenes Silicagel in eine Säule gefüllt wird, und ein Lösungsmittel wird dann hinzugegeben. Das gleiche soll für die Herstellung einer Polymersäule gelten.
Keine besondere Beschränkung ist der Temperatur auferlegt, bei der das Rohprodukt am festen Träger adsorbiert wird, und an die Temperatur, bei der man das Lösungsmittel durch die Säule zur Trennung der einzelnen Komponenten fliessen lässt. Das Verfahren wird jedoch im allgemeinen in einem Bereich von -20 bis 40ºC durchgeführt.
In der vorliegenden Erfindung ist der Flussgeschwindigkeit des Lösungsmittels keine Beschränkung auferlegt. Die Raumgeschwindigkeit (SV) beträgt jedoch im allgemeinen 0,01 bis 20, bevorzugt 0,05 bis 15, und besonders bevorzugt 0,1 bis 10.
Nach Beendigung der Eluierung des beabsichtigten Produkts lässt man Methanol durch die Säule in einem Anteil von 1 bis 10 Volumenteilen pro Volumenteil des festen Trägers fliessen, und dann lässt man 1 bis 10 Volumenteile n-Hexan hindurchfliessen, wodurch die Regenerierung des festen Trägers erlaubt wird. Daneben ermöglicht es dieses Verfahren, den festen Träger wiederholt zu regenerieren.
Die durch Konzentrierung des ausgeflossenen Lösungsmittels und Waschen nach der Regenerierung der Säule wiedergewonnenen Lösungsmittel können wieder unter Rühren vermischt werden, wodurch die so getrennte Methanolschicht und n-Hexanschicht als Extraktionsmittel wiederverwendet werden.
Auf der Seite des zu trennenden Rohprodukts bedeutet der Begriff "Lecithin" im allgemeinen eine Mischung von verschiedenen Phospholipiden, bestehend prinzipiell aus Phosphatidylcholin natürlichen Ursprungs, oder Phosphatidylcholin selbst als einem Synonym. Phosphatidylcholin ist eine Mischung von Homologen der Fettsäureester des Glycerophosphorylcholins, wobei die Fettsäurereste natürliche Fettsäurereste sind, die identisch oder voneinander verschieden sind. Spezielle Beispiele der Fettsäurereste können einschliessen Lauroyl-, Myristoyl-, Palmitoyl-, Stearoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl- und Linolenoylgruppen und dergleichen.
Aus Eigelb, Sojabohnen, Erdnüssen, Sonnenblumen, Rapssamen und dergleichen extrahierte Rohprodukte werden weithin als Rohlecithin verkauft. Der Zusammensetzung des Rohlecithins ist gemäss der vorliegenden Erfindung keine Beschränkung auferlegt, und diejenigen, die von irgendwelchen Stoffen abstammen oder ein oder mehrere Homologe des Phosphatidylcholins enthalten, können deshalb eingeschlossen sein. Sie können ebenso entweder natürlich oder synthetisch sein. Es besteht daher kein Bedarf für ihre Vorbehandlung vor der Reinigung.
Die vorliegende Erfindung wird hernach durch die folgenden Beispiele speziell beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf und durch diese Beispiele allein beschränkt ist.

BEISPIEL 1 - Reinigung von Lecithin

Eine Silicagelsäule wurde hergestellt durch Füllen von 160 g (Trockenmasse) Silicagel ["Micro Bead Silica Gel 4B", Handelsname (200 bis 350 Mesh); Produkt der Fuji- Davison Chemical, Ltd.; das gleiche soll im folgenden gelten] in eine 40 mm breite und 300 mm hohe Säule, Hindurchfliessenlassen durch die Säule von Methanol in einer Menge von etwa dem 2-fachen Volumen der Säule, und dann Hindurchfliessenlassen durch die Säule von methanolhaltigem n-Hexan in einer Menge von etwa dem 2-fachen Volumen der Säule.
Eigelblecithin (extra-reines Reagens; Produkt der Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) wurde in einer Menge von 35,9 g in 2 l methanolhaltigem n-Hexan aufgelöst. Die resultierende Lösung liess man durch die Säule bei Raumtemperatur hindurchfliessen. Danach liess man 12 l methanolhaltiges n-Hexan bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Min. (SV = 0,15) durch die Säule fliessen, um eine ausfuessende Flüssigkeit zu sammeln (Ausflussmedium (1)). Weiterhin liess man 17 l methanolhaltiges n-Hexan mit der gleichen Durchflussgeschwindigkeit hindurchfliessen, um eine weitere ausfliessende Flüssigkeit zu sammeln (Ausflussmedium (2)). Danach liess man 4 l n-hexanhaltiges Methanol mit der gleichen Durchflussgeschwindigkeit hindurchfliessen, um eine weitere ausfuessende Flüssigkeit zu sammeln (Ausflussmedium (3)). Ausflussmedium (2) wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um 10,1 g Phosphatidylcholin als hochreines Produkt zu erhalten. Weiterhin wurden die anderen Ausflussmedien ebenso unter reduziertem Druck aufkonzentriert, um Rohphosphatidylethanolamin aus dem Ausflussmedium (1) und Rohlysophosphatidylcholin aus dem Ausflussmedium (3) zu erhalten.

BEISPIELE 2 BIS 5 - Reinigung von Lecithin

Die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt, um die folgenden Ergebnisse, wie in Tabelle 1 gezeigt, zu erhalten. TABELLE 1 Ergebnisse der Herstellung von hochreinem Phosphatidylcholin aus Rohlecithin

BEISPIEL 6 - Reinigung von Indometacinfarnesyl

Eine Säule aus rostfreiem Stahl (100 mm breit x 1000 mm lang) wurde mit 4 kg industriellem Silicagel (200 bis 300 Mesh, mittlere Porengrösse: 70 Å) gefüllt, und 1 kg Rohindometacinfarnesyl (Reinheit: 94,2 %), erhalten durch Kondensation von Indometacin und Farnesol, wurde in 3 l n-Hexan aufgelöst, und die resultierende Lösung liess man mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 16 l/h (SV = 2) durch die Säule fliessen, wodurch Indometacinfarnesyl am Silicagel adsorbiert wurde.
Dann liess man 37 l methanolhaltiges n-Hexan mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 16 l/h (SV = 2) hindurchfliessen, um Indometacinfarnesyl zu eluieren. Das Ausflussmedium wurde aufkonzentriert, um 940 g Indometacinfarnesyl (Reinheit: 99,6 %) zu erhalten.

BEISPIEL 7 - Reinigung von Menatetrenon

Eine Glassäule (40 mm breit x 300 mm lang) wurde mit 156 g industriellem Silicagel (200 bis 300 Mesh, mittlere Porengrösse: 70 Å) gefüllt, und 15,6 g Rohmenatetrenon (Reinheit: 67,3 %), erhalten durch Kondensation von Menadiolmonoacetat und Geranyllinabol, wurden in 50 ml n-Hexan aufgelöst, und man liess die resultierende Lösung mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Min. (SV = 1) durch die Säule fliessen, wodurch Menatetrenon am Silicagel adsorbiert wurde.
Dann liess man 360 ml methanolhaltiges n-Hexan mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Min. (SV = 1) hindurchfliessen, um Menatetrenon zu eluieren. Das Ausflussmedium wurde aufkonzentriert, um 9,8 g Menatetrenon zu erhalten (Reinheit: 97,8 %).

Claims

1. Verfahren zur Reinigung eines Rohprodukts durch Säulenchromatografie, umfassend die Schritte:

Adsorbieren des Rohprodukts, ausgewählt aus Lecithin, Indometacinfarnesyl, Menatetrenon, Phytonadion, Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure und Coenzym Q&sub0;, an einem festen Träger,

Eluieren des Rohprodukts durch Spülen der Säule mit einem Extraktionsmittel, das n-hexanhaltiges Methanol und/oder methanolhaltiges n-Hexan ist, erhältlich durch sorgfältiges Vermischen von n-Hexan und Methanol und Trennen der resultierenden Mischung in eine obere Schicht von methanolhaltigem n-Hexan und eine untere Schicht von n-hexanhaltigem Methanol,

wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass der feste Träger Silicagel ist.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin die obere Schicht 3 bis 10 Gew.% Methanol und die Restmenge von n-Hexan umfasst, und die untere Schicht 15 bis 35 Gew.% n-Hexan und die Restmenge von Methanol umfasst.