FR2511686A1 - Procede pour la purification de riboflavine-5'-monophosphate - Google Patents
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Abstract
ON SOUMET LE RIBOFLAVINE-5-MONOPHOSPHATE BRUT A LA CHROMATOGRAPHIE EN UTILISANT UNE COLONNE GARNIE AVEC UNE RESINE ECHANGEUSE D'ANIONS FAIBLEMENT BASIQUE AYANT UN SQUELETTE D'ESTER D'ACIDE POLYACRYLIQUE OU POLYMETHACRYLIQUE RETICULE, DANS LEQUEL AU MOINS UNE PARTIE DES GROUPES ESTERS EST TRANSFORMEE EN GROUPES AMIDES DE FORMULE GENERALE: (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE R REPRESENTE UN GROUPEOUDANS LESQUELS N EST UN ENTIER DE 2 A 6, M EST UN ENTIER DE 2 A 4 ET R ET R SONT CHACUN UN ATOME D'HYDROGENE OU UN GROUPE ALKYLE EN C-C ET R A LA MEME DEFINITION QUE R OU REPRESENTE UN ATOME D'HYDROGENE OU UN GROUPE ALKYLE EN C-C POUR OBTENIR UNE FRACTION DE RIBOFLAVINE-5-MONOPHOSPHATE 2 CONTENANT UNE QUANTITE REDUITE D'IMPURETES 3, 4 A PARTIR DE L'ELUAT DE LA COLONNE.
Description
La présente invention concerne un procédé pour la purification de
riboflavine-5 '-monophosphate (ci-après dénommé '-FMN) Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour l'obtention du 5 'FMN contenant une quantité réduite d'impuretés à partir de 5 '-FMN brut contenant des impuretés telles que riboflavine, riboflavine-4 'monophosphate (ci-après dénommé 4 '-FMN), esters d'acide
riboflavinepolyphosphorique et autres dérivés de riboflavine.
Le 5 '-FMN est un composé qui joue un rôle tout à fait
vital comme coenzyme pour diverses réactions enzymatiques dans l'orga-
nisme et on l'utilise comme additif de produits pharmaceutiques,
d'aliments et de produits alimentaires En outre, le 5 '-FMN est lar-
gement utilisé comme produit de départ pour le flavine-adéninedinuclfo-
tide (ci-après dénommé FAD) qui est utilisé comme agent thérapeutique
contre les déficiences en vitamine B 2.
Dans l'industrie, on produit ordinairement le 5 '-FMN par réaction de la riboflavine avec un agent phosphorylant tel que le chlorure de phosphoryle En conséquence, le 5 '-FMN produit contient des impuretés telles que riboflavine n'ayant pas réagi, 4 '-FMN, riboflavine-4 ',5 'cyclophosphate et acide riboflavinepolyphosphorique formés comme sousproduits Comme ces impuretés ont des structures analogues à
celle du 5 '-FMN, il est difficile de séparer ce dernier des premières.
En particulier, le 4 '-FMN a une structure très analogue à celle du '-FMN et il est donc extrêmement difficile de le séparer de ce
dernier.
L'invention a pour objet un procédé pour obtenir du '-FMN contenant une quantité réduite d'impuretés à partir de 5 '-FMN
contenant du 4 '-FMN.
Selon l'invention, on peut obtenir une fraction de 5 '-FMN contenant une quantité réduite d'impuretés à partir d'éluats en soumettant le 5 '-FMN brut à la chromatographie en utilisant une colonne garnie avec une résine échangeuse d'anions faiblement basique ayant un squelette d'ester d'acide polyacrylique ou polyméthacrylique réticulé dans lequel au moins une partie des groupes estersest transformée en groupes amides représentés par la formule générale: R 1 -CON (l) R 2 /% 3 dans laquelle R 1 représente un groupe /-CH 2 n N ou R 4 " 4 R -CH 2-CH 2-N-)-m R 4, dans lesquels N est un entier de 2 à 6, m est un entier de 2 à 4 et R 3 et R 4 sont chacun un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C 1-C 6 et R 2 a la même définition que R 1 ou représente
un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C 1-C 6.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la
description qui va suivre en référence aux dessins annexes dans lesquels:
les figures 1 et 2 représentent chacuneun chromatogramme obtenu en soumettant le 5 '-FMN à la chromatographie selon le procédé de l'invention Dans ces figures, les chiffres 1, 2, 3 et 4 désignent la riboflavine, le 5 '-FMN, le 4 '-FMN et un composant X tel que défini à la page 5 ci-après, respectivement, la figure 3 représente les variations de p H de l'éluat de la colonne lorsque l'on soumet le 5 '-FMN brut à la chromatographie
selon le procédé de l'invention.
La présente invention concerne un procédé pour la purification du 5 '-FMN brut contenant du 4 '-FMN par chromatographie sur colonne en utilisant commne matériau de garnissage de la colonne
une résine échangeuse d'anions faiblement basique spécifique conte-
nant des groupes amides Des exemples de résines échangeuses d'anions
faiblement basiques que l'on peut utiliser comme matériau de garnis-
sage de la colonne sont celles ayant une structure dans laquelle
une partie au moins des groupes esters d'un ester d'acide poly-
acrylique ou polyméthacrylique réticulé est transformée en groupes amides représentés par la formule suivante: R 1
-CON ( 1)
R 2
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dans laquelle R 1 représente un groupe représenté par les formules suivantes: /R 3 2 c 2 >n *-N ( 2)
R 4
ou R
-CH 2-CH 2-N -R ( 3)
dans lesquelles N est un entier de 2 à 6, m est un entier de 2 à 4 et R 3 et R 4 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C 1-C 6 et R 2 a la même définition que R 1 ou bien représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C 1-C 6 Dans la formule ( 1), lorsque R 1 représente un groupe de formule ( 2), R 1 est ordinairement un groupe diméthylaminoalkyle ou diéthylaminoalkyle et R 2 a la même définition que Rl,ou bien R 2 est un atome d'hydrogène Par contre, lorsque R 1 représente un groupe de formule ( 3), R 2 est ordinairement un atome d'hydrogène et R 3 et R 4 sont chacun un atome d'hydrogène, un groupe
méthyle, un groupe éthyle ou leurs mélanges.
La résine échangeuse d'anions faiblement basique contenant des groupes amido décrite ci-dessus qui est utilisée selon l'invention peut être préparée par polymérisation en suspension d'un ester d'acide acrylique, par exemple acrylate de méthyle ou acrylate d'éthyle,ou
d'un ester correspondant d'acide méthacrylique,et d'un agent réticu-
lant, par exemple divinylbenzèneen milieu aqueux par un procédé connu pour former un copolymère réticulé que l'on fait ensuite réagir avec une amine représentée par la formule générale: R 1
H-N ( 4)
R-2 dans laquelle R et R ont la même définition que dans la formule ( 1), 1 pour transformer ainsi les groupes esters en groupes amides, puis 2 si pour transformer ainsi les groupes esters en groupes amides, puis, si on le désire, on alkyle encore les groupes amino par traitement
avec un agent alkylant Comme 5 '-FMN brut est à soumettre à la chroma-
tographie, on peut ordinairement utiliser tel quel un 5 '-FMN obtenu par réaction de la riboflavine avec un agent phosphorylant, par exemple le chlorure de phosphoryle Ce 5 '-FMN brut contient comme impuretés
de l'acide riboflavinepolyphosphorique et d'autres dérivés de ribo-
flavine et de la riboflavine n'ayant pas réagi, en plus du 4 '-FMN.
Bien entendu,' on peut également utiliser du 5 '-FMN brut dont on a préalablement séparé des impuretés relativement faciles à séparer
comme la riboflavine n'ayant pas réagi.
La chromatographie est effectuée de manière très simple en introduisant une quantité spécifiée d'une solution de 5 '-FMN
bmt àla partie supérieure d'une colonne garnie avec la résine échan-
geuse d'anions faiblement basique décrite ci-dessus, puis en alimentant la colonne avec un éluant de manière classique pour développer la colonne On prépare de préférence la colonne en la garnissant avec la résine échangeuse d'anions faiblement basique de telle manière que la hauteur du lit de garnissage soit de l'ordre de 0,5 à 10 m, de préférence de 1 à 4 m On utilise de préférence la résine échangeuse d'anions faiblement basique sous une forme carboxylate, qui a été traitées par des acides carb Qxyliques tels que l'acide
formique, l'acide acétique et l'acide carbonique.
Lorsque l'on utilise cette résine sous la forme carboxylate, la bande d'adsorption du 5 '-FMN dans la colonne ne s'étale pas et le 5 '-FMN peut donc etre récupéré à partir de l'éluat de la colonne à une concentration élevée Au contraire, lorsque l'on n'utilise pas la résine sous la forme carboxylate, on
préfère utiliser un mélange d'une résine sous la forme chlorhy-
drate ou sel lun autre acide inorganique et une résine sous la forme base libre Cependant, lorsque la résine est totalement sous la
forme sel d'acide inorganique ou base libre, il est géné-
ralement difficile de réaliser une bonne séparation On alimente la colonne avec le 5 '-FMN brut sous forme d'une solution dans un solvant convenable de telle manière que sa quantité soit dans la gamme de 0,5 à 20 g, de préférence de 1 à 5 g,par litre de la résine échangeuse
d'anions faiblement basique dans la colonne.
On utilise ordinairement une solution aqueuse d'un sel comme révélateur Le p H du révélateur est de préférence dans la gamme de 2 à 5 Des exemples de sels comprennent le chlorure d'ammonium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, etc De manière très simple, on utilise comme révélateur une solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,1-5 % en poids; cependant, il est préférable d'utiliser une solution aqueuse tamponnée de chlorure de sodium auquel on a ajouté un agent tampon, tel qu'acide formique-formiate de sodium ou
acide acétique-acétate de sodium La vitesse d'écoulement du révéla-
teur est avantageusement de 0,05 à 5 ml/h.
Lorsque l'on développe le 5 '-FMN brut avec une solution aqueuse de chlorure de sodium selon le procédé de l'invention, la riboflavine quitte d'abord la colonne comme indiqué dans les dessins annexés. Ensuite, le 4 '-FMN et un composant considéré comme étant
soit le riboflavine-4 '-5 '-cyclophosphate, soit le riboflavine-3 '-mono-
phosphate (composant dénommé ci-après composant X) commencent à passer et enfin le 5 '-FMN commence à s'écouler hors de la colonne Les courbes d'élution du 4 '-FMN et du composant X et celle du 5 '-FHN se chevauchent; cependant, comme les courbes diffèrent l'une de
l'autre par la forme, on peut obtenir le 5 '-FMN purifié par fraction-
nement de la dernière portion de la courbe d'élution du 5 '-FMN.
L'élution de l'acide riboflavinepolyphosphorique est considérablement
retardée La chromatographie est ordinairement effectuée à la tempé-
rature ambiante (par exemple environ 20 à 30 C).
Les exemples et exemples comparatifs suivants illustrent
l'invention sans toutefois en limiter la portée.
La résine échangeuse d'anions faiblement basique utilisée dans les exemples est préparée de la manière suivante: On polymérise en suspension de l'acrylate d'éthyle et du divinylbenzène industriel (teneur en divinylbenzène: 56 %) dans un milieu aqueux par un procédé classique pour préparer un copolymère
acrylate d'éthyle-divinylbenzène du type gel ayant un degré de réti-
culation de 3 %.
On charge dans un autoclave 200 g de ce copolymère qui a été séché et 1000 g de NN-diméthylpropylènediamine et on fait réagir le mélange à 190 C pendant 20 h On sépare le produit de réaction par filtration et on le lave suffisamment,successivement par l'eau, par l'acide chlorhydrique IN, par l'eau, par l'hydroxyde
de sodium aqueux i N et par l'eau.
La résine échangeuse d'anions faiblement basique ainsi obtenue a une capacité d'échange d'ions de 1,1 meq/g, une teneur en eau de 69 %, et un diamètre moyen de particules de 350/um L'analyse de chaque composant dans les exemples ci-après est effectuée par chromatographie en phase liquide haute vitesse dans les conditions suivantes À Colonne: fabriquéepar la Société Waters Co, Ltd sous le nom de "/u-Bondapack C 18 " Eluant: solution d'acétate d'ammonium 0,015 M dans le mélange éthanol-eau ( 21:79 en volume) Débit: 1,0 ml/min Température: température ambiante (c'est-àdire environ 20
à 30 C)
Détection: dans l'UV, à 254 nm Dans les conditions précédentes, les composants ayant des temps de rétention de 3, 7, 9, 11 et 34 min sont identifiés avec l'acide riboflavinepolyphosphorique, le composant X, le 4 '-FMN, le '-FMN et la riboflavine, respectivement. Les concentrations sont indiquées par conversion de
l'adsorption à 254 nm en celle du 5 '-FMN.
EXEMPLE 1
On introduit une résine échangeuse d'anions faiblement basique sous la forme base libre dans une grande quantité de solution aqueuse de chlorure de sodium à 1 % en poids qui a été ajustée à p H 3,8 par l'acide chlorhydrique IN, et on agite le mélange de manière que la résine et la solution aqueuse atteignent un état d'équilibre On garnit un tube de verre ayant un diamètre intérieur de 15 mm avec 215 ml de la résine ainsi traitée pour obtenir une colonne de
chromatographie On introduit dans cette colonne 172 ml d'une solu-
tion aqueuse de FMN brut contenant 3540 mg/l de 5 '-FMN, 635 mg/l de
4 '-FMN, 300 mg/l de riboflavine, ll O mg/1 d'acide riboflavinepoly-
phosphorique et 420 mg/1 du composant X (riboflavine-4 '-5 'cyclophosphate ou riboflavine-3 '-monophosphate) à la partie supérieure de la colonne à un débit de 0,25 ml/h On fait passer à travers la colonne comme éluant une solution aqueuse contenant 0,83 g/l d'acide formique et g/1 de chlorure de sodium qui a été ajustée à p H 3,8 par l'hydroxyde
de sodium 1 N, à un débit de 0,25 ml/h On obtient ainsi un chromato-
gramme représenté à la figure 1 L'acide riboflavinepolyphosphorique n'est pas élué de la colonne jusqu'à ce qu'il ait passé à travers la colonne 3 1 d'éluant Dans cet exemple, toutes les opérations sont
effectuées à la température ambiante (c'est-à-dire environ 20 à 30 C).
EXEMPLE 2
On introduit une résine échangeuse d'anions faiblement basique sous la forme base libre dans une grande quantité d'une solution aqueuse d'acide formique O,018 N qui a été ajustée à p H 3,8 par l'hydroxyde de sodium IN et on agite le mélange de manière que la résine et la solution aqueuse atteignent l'équilibre On garnit un tube de verre ayant un diamètre intérieur de 15 mm avec 430 ml de
la résine ainsi traitée pour obtenir une colonne de chromatographie.
En utilisant cette colonne, on effectue la chromatographie du FMN brut de la même manière qu'à l'exemple 1 On obtient ainsi
un chromatogramme représenté à la figure 2.
La figure 3 représente les variations de p H de l'éluat
de la colonne.
Après avoir fait passer à travers la colonne 4 ml du
même éluant que celui utilisé à l'exemple 1, on fait passer succes-
sivement 0,5 1 d'acide chlorhydrique 2 N et 1 litre d'hydroxyde de sodium 1 N On fait ensuite passer à travers la colonne une solution aqueuse d'acide formique qui a été ajustée à p H 3,8 par l'hydroxyde de sodium 1 N, pour mettre ainsi la résine en équilibre avec la solution
aqueuse d'acide formique.
En utilisant cette colonne, on effectue la chromatographie du FMN brut de la même manière qu'à l'exemple 1 On obtient ainsi
un chromatogramme semblable à celui obtenu à l'exemple 1.
EXEMPLE COMPARATIF
On effectue la chromatographie du FMN brut de la même
manière qu'à l'exemple 2, sauf que l'on utilise comme matière de -
garnissage de la colonne une résine échangeuse d'anions faiblement basique contenant des radicaux fonctionnels du type diméthylbenzyl- amine, fabriquée par la société demanderesse sous le nom Diaion WA 30 '
ou contenant des radicaux fonctionnels du type diméthylbenzyléthanol-
amine, fabriquée par la société demanderesse sous le nom de"Diaion
PA 408 " ou contenant des radicaux fonctionnels du type N-lS -(N',N',N'-
triméthylammonium)alkyll-amide fabriquée par la société Rhom and Haas Co sous le nom d"'Amberlite IRA 458, respectivement Cependant, le '-FMN n'est pas sensiblement séparé du 4 '-FMN En outre, la sépara-
tion du 5 '-FMN et des autres impuretés est mauvaise.
Il est entendu que l'invention n'est pas limitée aux
modes de réalisation préférés décrits ci-dessus à titre d'illustra-
tion et que l'homme de l'art pourra y apporter des modifications
sans sortir du cadre de l'invention.
Claims (1)
- R E V E N D I C A T I ONProcédé pour la purification de riboflavine-5 '-monophos-phate, caractérisé en ce qu'on soumet le riboflavine-5 '-monophosphate brut à la chromatographie en utilisant une colonne garnie avec une rdsine échangeuse d'anions faiblement basique ayant un squelette d'ester d'acide polyacrylique ou polyméthacrylique réticulé, dans lequel au moins une partie des groupes esters est transformée en groupes amides de formule générale: /R 1-CON ( 1)R 2 /R 3 dans laquelle R 1 représente un groupe -(CH 2 N ou R 4 R -(CH 2CH 2-N-R 4, dans lesquels N est un entier de 2 a 6, m est un entier de 2 à 4 et R 3 et R 4 sont chacun un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C -C 6 et R 2 a la même définition que R 1 ou représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C 1-C 6 pour obtenir une fraction de riboflavine-5 '-monophosphate contenant une quantitéréduite d'impuretés à partir de l'éliat de la colonne.
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Non-Patent Citations (3)
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EP0336214A1 (fr) * | 1988-03-31 | 1989-10-11 | BASF Aktiengesellschaft | Procédé de purification de sels de riboflavine-5'-monophosphate, en particulier de monosodium-riboflavine-5'-monophosphate |
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