CN117511976A - 一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Tnnt2H2B‑mCherry报告细胞系的构建方法及应用，属于生物技术领域。本发明利用CRISPR‑Cas9基因组编辑技术在小鼠胚胎干细胞R1中定点整合，将荧光蛋白基因敲入到Tnnt2基因起始密码子上游，使其融合表达，通过荧光强度直接指示Tnnt2基因的表达水平。本发明的Tnnt2H2B‑mCherry报告细胞系可以实时观察和研究Tnnt2基因的表达情况，用于跟踪和可视化心肌细胞的发育过程，研究心脏发育的分子机制、心血管疾病的发病机制、药物筛选和治疗效果评估，为心脏病理生理学和药物研发提供了新的工具和方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的构建方法及应用。
背景技术
Tnnt2基因是心脏发育和分化中的重要调控基因，在心肌细胞中高度表达，而在其他细胞类型中表达极低或不表达。这使得Tnnt2基因成为心肌细胞的标志性和特异性基因，可用于鉴定、分离和定位心肌细胞。Tnnt2基因的异常表达或突变与多种心血管疾病的发生和发展相关，如心肌肥厚、心房纤颤和心肌病等。因此，Tnnt2基因在心肌细胞肌纤维收缩调节、心肌细胞类型特异性表达以及心脏发育和心血管疾病研究中具有重要的功能和应用。
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)是一类多能性干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，可以分化为包括神经元、心肌细胞、肌肉细胞等在内的三个胚层各种细胞类型。在体外，胚胎干细胞可以通过定向分化为特定细胞类型，如心肌细胞、神经细胞等，为组织工程提供不断的供应，并具有潜在治疗疾病的能力。目前，综合运用形态特征、细胞功能特征、细胞标志物、基因表达分析、免疫组化染色等方法，可以准确地鉴定和识别心肌细胞，并进一步进行心肌细胞的纯化和表征。但受主观性、疾病发展的动态性、个体间基因表达的差异性、染色的稳定性、抗体的特异性和灵敏性等的局限，无法实现心肌细胞的实时观察和研究。因此，亟需一种能够实时跟踪和可视化心肌细胞表达的有效平台，以更全面地了解和观察心肌细胞特异性基因表达，为心脏病理生理学和药物研发提供了新的工具和方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的构建方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，所构建的Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系实现了实时观察和研究Tnnt2基因的表达情况，实时跟踪和可视化心肌细胞的发育过程。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的构建方法，包括将H2B-mCherry敲入到Tnnt2基因的5’端起始密码子的上游，筛选稳定表达荧光蛋白的Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的步骤。
优选的是，所述构建方法包括以下步骤：
构建靶向Tnnt2基因的5’端起始密码子的sgRNA的表达载体，以及含有荧光蛋白表达元件的重组载体；
将所述sgRNA的表达载体和所述重组载体共转染干细胞，经培养、筛选，获取稳定表达荧光蛋白的Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系。
优选的是，所述重组载体包括如下元件：
上游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
H2B-mCherry序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
PolyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
新霉素抗性-PolyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；以及
下游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
优选的是，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
优选的是，所述sgRNA的表达载体和所述重组载体的质量比为1:2，所述培养的条件为37℃5％CO2恒温培养，所述筛选为采用新霉素抗性筛选。
本发明还提供一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系，利用所述的构建方法构建。
本发明还提供所述的Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系在下述(1)-(6)任一项中的应用：
(1)在跟踪和可视化心肌细胞的发育过程中的应用；
(2)在心脏发育的分子机制的研究中的应用；
(3)在心血管疾病的发病机制的研究中的应用；
(4)在制备Tnnt2基因相同位点荧光报告动物模型中的应用；
(5)在心血管疾病药物筛选中的应用；
(6)在制备心血管疾病治疗效果评估模型中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术在小鼠胚胎干细胞R1中定点整合，将荧光蛋白基因敲入到Tnnt2基因起始密码子上游，Tnnt2和荧光蛋白通过H2B连接肽段形成融合蛋白，H2B的存在保证mCherry能够特异性在细胞核内表达，使其融合表达，筛选得到Tnnt2H2B-mCherry报告细胞系，即形成了稳定表达荧光蛋白的细胞模型，通过荧光强度直接指示Tnnt2基因的表达水平。本发明的Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系可以实时观察和研究Tnnt2基因的表达情况，用于跟踪和可视化心肌细胞的发育过程，研究心脏发育的分子机制、心血管疾病的发病机制、药物筛选和治疗效果评估，为心脏病理生理学和药物研发提供了新的工具和方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明利用CRISPR-Cas9技术敲入Tnnt2 H2B-mCherry的原理示意图；
图2为本发明报告细胞系的PCR鉴定电泳图；M：标准DNA分子；P1+p2：P1和P2引物扩增产物；P3+p4：P3和P4引物扩增产物；
图3为本发明Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系分化为心肌细胞的荧光显微镜图；
图4为本发明Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系分化为心肌细胞的免疫荧光染色结果；
图5为本发明Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系分化为心肌细胞分化过程中Tnnt2基因的表达水平变化。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明涉及的SEQ ID NO:1-6所示序列均为南京擎科生物科技有限公司合成。
实施例1构建Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的载体
1)重组载体构建包括合成上游同源臂(SEQ ID NO:1)、H2B-mCherry红色荧光蛋白(SEQ ID NO:2)、PolyA(SEQ ID NO:3)、新霉素抗性-PolyA序列(SEQ ID NO:4)和下游同源臂(SEQ ID NO:5)。
2)针对小鼠细胞Tnnt2位点设计靶向Tnnt2起始密码子的sgRNA，在PX459(Addgeneplasmid#62988)载体上插入针对Tnnt2位点的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.6；
实施例2Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的筛选和鉴定。
如图1所示构建Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的示意图，包括重组载体荧光蛋白表达元件H2B-mCherry-polyA-mclNeo-polyA和PX459表达载体共同转染至小鼠胚胎干细胞R1内，基于同源重组的修复方式，H2B-mCherry-polyA-mclNeo-polyA将精准的整合到Tnnt2起始密码子处，Tnnt2 H2B-mCherry基因融合表达，获得Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系，重组载体中的mclNeo有助于通过新霉素筛选和鉴定阳性细胞。
具体步骤如下：
(1)转染前，35mm培养皿中R1细胞融合度达80％，加入0.25％胰蛋白酶溶液消化至单个细胞，按照125μL opti-MEM与2.5μg sgRNA表达载体和重组载体(质粒质量比1：2)比例，混合均匀后加入4μL lipo8000转染试剂，逐渐滴加到消化后的小鼠胚胎干细胞R1中，轻轻混匀，置于37℃5％CO2恒温培养箱中培养。
(2)转染12h后，更换新鲜培养基。继续培养36h后，0.25％的胰蛋白酶消化细胞，含500μg/mL的新霉素培养液筛选细胞。
(3)10天后，在显微镜下挑选单克隆细胞，传代至24孔板，利用PCR正向反向引物P1与P2，P3与P4分别扩增单克隆细胞的基因组；
P1：5‘-CCTTAATTAACAGTCCCTGTTCAGAGGTAAGACA-3’；
P2：5‘-CAGTCACTATGGTCGACCGTAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’；
P3：5‘-CCGCTTCCTCGTGCTTTACG-3’；
P4：5‘-TTGGCGCGCCGTGACAGGACATCAAGACTCACTG-3’。
PCR热循环程序为：98℃10s、60℃30s、72℃1min重复35个循环、72℃5min，产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送擎科生物科技有限公司测序鉴定。
通过上述PCR和鉴定结果，获得整合单拷贝基因数的H2B-mCherry-polyA-mclNeo-polyA细胞系，结果见图2，测序比较分析。
实施例3Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的功能及报告能力评估
(1)Tnnt2 H2B-mCherry细胞按照5x104个细胞/mL的细胞密度接种，20μL/滴加至10mL培养皿的皿盖，翻转皿盖37℃5％CO2条件下培养2天。
(2)将聚集的细胞转移至低吸附性培养皿，加入分化培养液(含15％胎牛血清的DMEM培养液，并添加0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/L的β-巯基乙醇)诱导分化悬浮培3天，转移至含分化培养液的24孔细胞培养板中，每2天换一次新鲜的培养液，继续培养10天明显观察到有细胞自发性收缩、跳动及红色荧光表达的阳性细胞，见图3，荧光强度可以指示Tnnt2基因表达水平。
(3)使用4％多聚甲醛固定细胞10min后，DPBS轻轻洗涤3次，每次5分钟，随后用0.1％TritonX-100室温作用30min，DPBS再次洗涤3次，每次5分钟；加入抗Tnnt2抗体(1∶200)，4℃冰箱内过夜孵育，DPBS轻轻冲洗3次，加入GoatAnti-Mouse lgGAF 488标记的二抗，37℃避光孵育1h。最后加入DAPI荧光染色试剂室温孵育3min，在荧光显微镜下观察并拍照记录。
Tnnt2免疫荧光染色结果显示表达红色蛋白的心肌细胞Tnnt2为阳性，说明Tnnt2H2B-mCherry细胞系可以用来观察和研究Tnnt2基因的表达情况，用于跟踪和可视化心肌细胞的发育过程，见图4。
(4)收集分化过程中0天、5天、10天、15天的细胞样品，参照Trizol RNA提取说明方法提取RNA，并进行浓度测定。根据反转录试剂盒说明书进行RNA反转录，并参考Fast SYBRGreen Master Mix说明书操作进行扩增，扩增反应体系为：ddH2O 7ul，正向、反向引物(10μmol/L)各1μL，Fast SYBR Green Master Mix 10μL，cDNA产物1μL。具体程序为：94℃加热5min，94℃孵育30s，60℃反应30s，72℃孵育20s，从第2步开始进40个循环反应，72℃延伸10min。针对内参基因GAPDH对靶基因的Ct值进行归一化，对照样品进一步归一化靶基因Tnnt2的相对表达，数据采用法分析。每次对每个样品的三个生物重复和三次技术重复进行测试。
扩增引物如表1所示。
表1
荧光定量PCR结果显示，见图5，随着诱导分化时间的延长，Tnnt2的表达水平显著提高(***p<0.01)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系的构建方法，其特征在于，包括将H2B-mCherry定点敲入到Tnnt2基因的5’端起始密码子的上游，筛选稳定表达荧光蛋白的Tnnt2H2B-mCherry报告细胞系的步骤。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
构建靶向Tnnt2基因的5’端起始密码子的sgRNA的表达载体，以及含有荧光蛋白表达元件的重组载体；
将所述sgRNA的表达载体和所述重组载体共转染干细胞，经培养、筛选，获取稳定表达荧光蛋白的Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体包括如下元件：
上游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
H2B-mCherry序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
PolyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
新霉素抗性-PolyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；以及
下游同源臂，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的表达载体和所述重组载体的质量比为1:2，所述培养的条件为37℃5％CO2恒温培养，所述筛选为采用新霉素抗性筛选。
6.一种Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的构建方法构建。
7.如权利要求6所述的Tnnt2 H2B-mCherry报告细胞系在下述(1)-(6)任一项中的应用：
(1)在跟踪和可视化心肌细胞的发育过程中的应用；
(2)在心脏发育的分子机制的研究中的应用；
(3)在心血管疾病的发病机制的研究中的应用；
(4)在制备Tnnt2基因相同位点荧光报告动物模型中的应用；
(5)在心血管疾病药物筛选中的应用；
(6)在制备心血管疾病治疗效果评估模型中的应用。
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