CN110862960A - 一种新型脂肪干细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型脂肪干细胞培养方法，主要应用脂肪干细胞的原代培养，属于细胞工程技术领域，操作步骤包括：离心法去除上层油脂；等体积加入0.9%生理盐水，使用物理破碎脂肪组织，使脂肪干细胞和脂肪细胞成为单个细胞或细小细胞团；使用200目筛网过滤残渣，去除大颗粒脂肪和脂肪细胞，获取脂肪干细胞。与现有技术相比，本发明通过物理破碎脂肪组织，然后进行200目筛网过滤，使脂肪细胞和脂肪干细胞分离。然后将其收集后培养可直接得到原代脂肪干细胞，制备方法简单，成本较低，仅需消耗少量组织，且不会通过胶原酶消化而破坏脂肪干细胞。

Description

一种新型脂肪干细胞培养方法
技术领域
发明属于细胞工程技术领域，涉及一种脂肪干细胞的制备方法。
背景技术
脂肪干细胞（Adipose-derived Stem Cells, ASCs），是目前广泛应用于组织工程及再生医学研究领域的一种成体干细胞（Cowan CM,.Nat Biotechnol, 2004. 22:560-567）。脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能，在特定条件下可以向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、成内皮细胞和成神经细胞等多个方向分化。除此之外，脂肪干细胞还具有许多其他类型成体干细胞所不具备的优势，如脂肪组织来 源充足、取材方便、获取过程损伤轻微、无伦理学争议，平均每100mL的脂肪组织中可获得约1×106个干细胞，脂肪组织来源的细胞约有2%具有干细胞特征，远高于骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs）（约0.02% 的细胞具有干细胞特征）。 并且脂肪干细胞具有稳定的群体倍增率、自我更新潜能及良好的免疫相容性 (Strem BM,. TrendsBiotechnol,2005.24:1246-1253 )，其基因转染效率高、能稳定表达外源基因，已 广泛应用于再生医学的研究 (Gimble JM,. Circ Res, 2007: 1249-1260)。而且 ASCs 分化 为脂肪细胞的效率比 BMSCs 更高。因此，脂肪干细胞是组织工程研究理想的种子细胞之一，最有希望成为脂肪组织工程的种子细胞。
目前常用的脂肪干细胞分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经酶处理方法分离除去红细胞等成熟细胞后，采用含10%胎牛血清的培养基进行继代培养。但此方法把控酶的浓度和消化时间尤为重要，消化时间过长，容易造成大量目的细胞死亡，消化时间不足，目的细胞大量损失，现一般采用0.1%I型胶原酶37℃消化30min左右，虽然保证了细胞量，但是细胞由于被酶消化一段时间，部分细胞不能存活，对细胞原代培养数量造成一定影响。
发明内容
取抽脂手术获取的脂肪组织，脂肪组织转移至50ml离心管，每管40ml，800g，8分钟；离心后，去除上层油脂，下层脂肪组织转移至新的离心管中。
等体积加入0.9%生理盐水，使用物理破碎脂肪组织，使脂肪干细胞和脂肪细胞成为单个细胞或细小细胞团，使用200目筛网过滤残渣，去除大颗粒脂肪和脂肪细胞。
将过滤后的细胞悬液，离心，收集底部细胞，将获得的细胞使用含10%血清的高糖DMEM重悬，计数，以4×104/cm2浓度接种于直径100mm的细胞培养皿中，37℃、体积分数5%CO2培养箱里常规培养，隔日换液。
当细胞生长至80%-90%融合时，将贴壁细胞以1∶3的比例传代培养。取3代细胞检测表型是否合格。
表1 本方法和常规方法培养的第三代脂肪干细胞流式对比表
检测项目 CD29 CD90 CD105 CD14 CD34 CD45
标准 ≥95% ≥95% ≥95% ≤2 ≤2 ≤2
常规方法 98.5% 97.8% 98.7% 1.25% 1.42% 1.31%
本方法 99.1% 98.8% 99.6% 0.95% 0.83% 0.54%
由表1可知，本方法获得的细胞为脂肪间充质干细胞，且纯度优于常规方法获取的细胞。
表2 本方法和常规方法获取的原代脂肪干细胞生长情况
汇合度 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天
常规方法 10% 15% 20% 25% 30%
本方法 20% 30% 45% 65% 90%
由表2可知，本方法获得的脂肪干细胞在原代的起始数量高于常规方法，生长速率远远高于常规方法，有助于大量获取脂肪干细胞。

Claims (2)

1.一种新型脂肪干细胞培养方法，其特征在于，包括脂肪组织前处理、大颗粒脂肪及脂肪细胞去除、脂肪干细胞的分离和脂肪干细胞的培养。
2.根据权利要求1中所述大颗粒脂肪和脂肪细胞去除步骤，其特征在于，使用物理方法破碎脂肪组织，使脂肪干细胞和脂肪细胞成为单个细胞或细小细胞团，使用200目筛网过滤残渣，去除大颗粒脂肪和脂肪细胞。
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