MXPA06012720A

MXPA06012720A - Metodo de diferenciacion de celulas neurales de las celulas de tallo embrionario.

Info

Publication number: MXPA06012720A
Application number: MXPA06012720A
Authority: MX
Inventors: Jens Richter; Yves-Alain Barde; Miriam Bibel; Kerry Lee Tucker
Original assignee: Novartis Forschungsstiftung
Priority date: 2004-05-05
Filing date: 2005-05-04
Publication date: 2007-01-16
Also published as: US20080171350A1; GB0410011D0; KR20070015563A; AU2005238202A1; CA2563570A1; RU2006142742A; CN1997733A; EP1747266A2; BRPI0510572A; JP2007535957A; AU2005238202B2; RU2407790C2; WO2005105986A3; WO2005105986A2

Abstract

Se proporciona un metodo para inducir la diferenciacion de celulas de tallo embrionario en los precursores neuronales, asi como un ensayo para las celulas precursoras o progenitoras neuronales, y un metodo para identificar agentes que inhiban o reduzcan el aumento en la degeneracion de neuritas.

Description

neuronales derivados de las células de tallo embrionario contienen una variedad de diferentes subtipos neuronales, así como de células no neuronales, incluyendo células gliales. La falta de números suficientemente grandes de células con fenotipos definidos y uniformes, es una importante dificultad en la neurobiología. No ha habido un método para la generación de neuronas a partir de las células de tallo embrionario que conduzca a números consistentes de neuronas, o a una población definida de ellas, de tal manera que no hay poblaciones celulares homogéneas disponibles en cantidades suficientes para caracterizar las neuronas cerebrales empleando planteamientos bioquímicos. También, las relaciones linaje de las neuronas con sus precursores inmediatos han permanecido poco claras. Con respecto al uso de las neuronas derivadas de las células de tallo embrionario para trasplante, es deseable obtener células progenitoras definidas que den lugar a la progenie conocida, opuestamente a una mezcla de células que incluyen algunas que puedan continuar dividiéndose y formando tumores (referencias 3, 4). Las células heterologas también pueden interferir con las señales tróficas y/o de guía a partir del tejido huésped, que promueven la integración del tejido implantado en el cerebro. El tipo de células implantadas es funcionalmente importante, por ejemplo, se pueden requerir neuronas dopaminérgicas en particular para tratar enfermedades tales cómo la enfermedad de Parkinson, de tal manera que es deseable tener un mayor control sobre el precursor y los sub-tipos de células neuronales generados para estas aplicaciones médicas. Se necesita una reducción de la heterogeneidad celular con el fin de reducir los efectos secundarios indeseables, bajar el riesgo de tumores, y mejorar el potencial terapéutico mediante el incremento de la proporción de células que tengan el linaje neuronal deseado. Recientemente, se ha hecho progreso a través del uso de señales inductivas y de factores de transcripción para enriquecer sustancialmente los subtipos de neuronas, incluyendo en particular las neuronas dopaminérgicas y las neuronas motoras. Por consiguiente, los factores de transcripción como Nurrl (referencia 5), o el co-cultivo de las células de tallo con otros tipos (referencia 6), aumentan notoriamente la generación de las neuronas dopaminérgicas, mientras que la adición de factores extrínsecos, incluyendo el de erizo sónico, aumenta aquélla de las neuronas motoras, que también mostraron integrarse en el tejido huésped después del trasplante (referencia 7). Pero a pesar de este progreso, se conoce todavía muy poco acerca de la generación in vitro de precursores neuronales definidos que puedan dar lugar a fenotipos neuronales especificados. Existen un número de diferentes protocolos que describen la generación de células neuronales y gliales (referencias 14, 15, 25-31). Como se realizó anteriormente con la línea celular de carcinoma embrionario P19, el tratamiento de los agregados de células pluripotentes con ácido retinoico desencadena la diferenciación neuronal (referencia 32). Subsecuentemente, se ha observado que el tratamiento de los cuerpos embrioides (EBs) derivados de las células de tallo embrionario con ácido retinoico, también promueve la expresión neural y reprime la expresión genética mesodérmica (referencia 33). Los cuerpos embrioides son agregados tridimensionales que se presentan por la acumulación y proliferación de las células de tallo embrionario. Los cuerpos embrioides se pueden producir mediante el cultivo de células de tallo embrionario sobre un sustrato al cual no se pueden adherir, típicamente un plato de cultivo bacteriano (ver, por ejemplo, la referencia 41). Un método para generar células neurales a partir de células de tallo embrionario, como se ejemplifica en Bain y colaboradores (referencia 14) y en Li y colaboradores (referencia 10), incluye los pasos de: Cultivar células de tallo embrionario; Formar cuerpos embrioides; Poner en contacto los cuerpos embrioides con ácido retinoico (RA); Disociar los cuerpos embrioides; y Aplicar y cultivar las células de cuerpos embrioides disociadas.

Usualmente, el cultivo de células de tallo embrionario inicial se hace sobre un soporte de capa de células de alimentación (fibroblastos inactivados), para mantener a las células de tallo embrionario en una forma de colonia de células de tallo embrionario pluripotentes no diferenciadas. Se cree que los fibroblastos soportan el estado no diferenciado de las células de tallo embrionario. Se puede incluir el factor inhibidor de leucemia (LIF) en el medio de cultivo, con el objeto de inhibir la diferenciación. Sin embargo, se ha observado que inclusive en la presencia del factor inhibidor de leucemia, algunas células de tallo embrionario tienen tendencia a diferenciarse, y que durante la formación de los cuerpos embrioides, se pueden observar células de diferentes linajes (referencias 3, 34).

En los métodos descritos en Bain y colaboradores y en Li y colaboradores (referencias 10, 14, 15), las células de tallo embrionario cultivadas se trataron con tripsina y/o se trituraron en pequeños grumos, los cuales entonces se sembraron en un cultivo celular no adherente para la formación de los cuerpos embrioides. Las células se cultivaron durante 4 días sin ácido retinoico, y luego durante 4 días con ácido retinoico en el medio, después de lo cual, los cuerpos embrioides se disociaron y se aplicaron sobre platos recubiertos de laminina. Las células aplicadas se cultivaron en un medio que contenía suero. Empleando este método, Bain y colaboradores reportan la producción de un cultivo que consiste en una población de células planas que se adhieren apretadamente al sustrato recubierto con laminina, y una población de células tipo neuronas que quedaron en su mayor parte encima de las células planas. Se observó que alrededor del 38 por ciento de las células tenían una morfología neuronal después de 2 días de cultivo. Estos cultivos fueron de una composición mixta consistente en diferentes tipos de neuronas, en especial neuronas GABAérgicas.

Algunos planteamientos han hecho uso de marcadores de selección de precursores neuronales, eliminando de esta manera las células diferentes de los precursores neuronales durante el procedimiento de diferenciación. Los progenitores neuronales generados a partir de células de tallo embrionario, se han definido en su mayor parte mediante la expresión de marcadores de filamentos intermedios, tales como nestina (referencia 9), o mediante factores de transcripción, tales como los genes sox (referencia 10). Li y colaboradores utilizaron la solución de linaje para enriquecer sus poblaciones de células heterogeneicas para las células que expresaban Sox2, mediante la eliminación de las negativas para Sox2 (referencia 10). Aunque los métodos de selección han probado ser útiles para enriquecer los precursores neuronales, está dudoso si se pueden utilizar los precursores seleccionados con el fin de generar fenotipos neuronales definidos. Los datos disponibles en Lee y colaboradores indican que las células positivas para Sox pueden dar lugar a la mayoría de los tipos de células que se encuentran en el sistema nervioso central (CNS), opuestamente a un sub-linaje definido. Por consiguiente, aunque la selección de las células positivas para Sox puede aumentar la proporción de células precursoras neuronales en una población derivada de células de tallo embrionario, parece poco probable que se pueda utilizar esta selección para enriquecer específicamente un solo subtipo de precursores neuronales o neuronas. Se han establecido otros métodos sin utilizar ácido retinoico.

Por ejemplo, los métodos de ejemplo utilizados en Okabe y colaboradores (referencia 27, referencia 43), no utilizaron ácido retinoico, pero incluyeron un paso intermedio de cultivar los cuerpos embrioides formados sobre un sustrato adherente en un medio especial antes de la disociación. También se utiliza un paso intermedio en Abe y colaboradores (referencia 30), en donde los cuerpos émbrioides cultivados se transfieren a un sustrato sobre el cual pueden adherirse. Entonces se cultivan en el estado adherido antes de la disociación con tripsina. Algunos métodos, tales como aquéllos de Abe y colaboradores (referencia 30) y de Okabe y colaboradores (referencia 27) han incluido el uso del factor de crecimiento de fibroblastos básico. Abe y colaboradores subsecuentemente utilizaron inhibidores mitóticos, que causaban la muerte de las neuronas y de las células no neuronales (referencia 30). La Presente Invención Hemos descubierto medios mediante los cuales se puede optimizar la diferenciación de las células de tallo embrionario hasta células neurales, con el fin de producir ventajas sorprendentes en términos de la generación de linajes de células neurales definidos y homogeneidad de las poblaciones de células neurales. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona mejores métodos para inducir y/o promover el desarrollo y/o la diferenciación de las células de tallo embrionario en neuronas o en células precursoras o progenitoras neuronales, para generar células neurales a partir de las células de tallo embrionario in vitro. En las modalidades preferidas, los métodos de la invención permiten la producción de una población de células neurales sustancialmente homogénea, en donde las células neurales son sustancialmente todas de un solo linaje neuronal definido, fenotipo, tipo celular, y/o están en la misma etapa de diferenciación. Como se describe con detalle en alguna otra parte en la presente, ideamos procedimientos para obtener precursores neuronales homogéneos, los cuales se identificaron como células gliales radiales. Durante el cultivo subsecuente, las células gliales radiales derivadas de las células de tallo embrionario se diferenciaron progresivamente en neuronas piramidales. Los precursores y las neuronas generados mediante los métodos de la invención son sustancialmente homogéneos, mostrando un porcentaje de rendimiento más alto de células neuronales de un solo linaje, comparándose con los métodos de la técnica anterior. Por lo tanto, en las modalidades más preferidas, los métodos de la invención pueden producir poblaciones sustancialmente puras de células gliales radiales y de neuronas piramidales, una de las poblaciones neuronales más importantes de la corteza, que ha sido difícil de generar en la técnica anterior utilizando células de tallo embrionario. Dado el alto nivel de homogeneidad de las células precursoras/progenitoras neurales producidas mediante la presente invención, estas células son adecuadas para una diferenciación adicional y/o maduración, con el fin de producir células neuronales de un linaje definido. Las células precursoras/progenitoras se pueden diferenciar para producir neuronas piramidales, como se muestran en la presente, o se pueden manipular mediante factores extrínsecos o intrínsecos con el objeto de generar otras poblaciones neuronales. La ventaja en los números de células y en la homogeneidad proporcionada por la presente invención, contrasta con las células producidas mediante los métodos de la técnica anterior de neurogénesis y diferenciación de células neurales, y con los números limitados de neuronas primarias que se pueden preparar a partir de cerebros de ratones o de ratas. Los estudios bioquímicos fueron anteriormente obstaculizados por los números limitados de células neurales que se podían producir convenientemente mediante los métodos de la técnica anterior. La presente invención facilita el estudio de los mecanismos bioquímicos y genéticos involucrados en el desarrollo de células neurales, en especial en la transición desde los precursores neurales hasta las células neuronales. Las células de tallo embrionario se pueden fácilmente manipular genéticamente y producir en números ilimitados, y la presente invención es idealmente adecuada para la producción de grandes números de neuronas de un linaje definido para estudio bioquímico. En adición, debido a que las células de tallo embrionario se pueden manipular genéticamente o aislar a partir de ratones portadores de mutaciones relevantes, la presente invención facilita la comparación de las neuronas de tipo silvestre y mutantes, y la identificación de los mecanismos que ocasionan la pérdida de tipos específicos de células en las enfermedades neurodegenerativas. Aunque es fácil la manipulación genética de las células de tallo embrionario, la manipulación de las neuronas primarias es extremadamente difícil, en especial la manipulación estable. La manipulación genética de las células de tallo embrionario puede proporcionar una línea modificada homogénea en donde la progenie entera contenga la misma mutación, y esto se puede lograr en 1 ó 2 meses, mientras que el establecimiento de una línea de ratón con una mutación estable puede tomar años. Por consiguiente, mediante la provisión de métodos para producir células precursoras, progenitoras, y neuronales in vitro a partir de células de tallo embrionario, la presente invención elimina la necesidad de establecer líneas de ratones transgénicos, y de esta manera permite estudiar las neuronas mutantes en un nivel que anteriormente no era práctico. Los métodos de la invención también proporcionan un sistema de ensayo celular para neuronas (por ejemplo, elongación de neuritas, muerte de células neuronales, neurogénesis, y sinaptogénesis). Estos ensayos se necesitan en el campo, pero su uso y desempeño han estado limitados debido a que no se podían producir convenientemente las neuronas en cantidades eficientes. La presente invención hace posible que se produzcan neuronas en mayores cantidades y con una homogeneidad mucho mayor que antes, permitiendo de esta manera la realización de ensayos neuronales. Las neuronas y/o células precursoras/progenitoras neuronales producidas mediante la invención, también son adecuadas para aplicaciones médicas, tales como implante en el cerebro para tratar una enfermedad neurodegenerativa o pérdida neuronal. Debido a la mayor homogeneidad de las células neurales del subtipo . deseado, como son producidas por la presente invención, se mejora el potencial terapéutico del tratamiento, y se reduce el riesgo de tumores en seguida de la implantación. Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a métodos para producir o generar células neurales, por ejemplo neuronas y/o células precursoras/progenitoras neuronales, para promover o inducir la diferenciación de las células de tallo embrionario en células precursoras o progenitoras neuronales, y a métodos para promover o inducir la diferenciación o maduración de las células precursoras o progenitoras hasta neuronas. La presente invención se refiere a un método in vitro mejorado para inducir y/o promover el desarrollo y/o la diferenciación de las células de tallo embrionario (ES) hasta células precursoras o progenitoras neuronales, o neuronas, y/o para producir o generar células neurales, comprendiendo el método: Cultivar células de tallo embrionario; Formar cuerpos embrioides (EBs); Poner en contacto los cuerpos embrioides con ácido retinoico (RA); y Disociar los cuerpos embrioides; en combinación con una o más características o pasos adicionales descritos posteriormente en la presente. En los métodos de la invención, las células de cuerpos embrioides disociadas, son células precursoras neuronales o células progenitoras neuronales. De esta manera, la disociación de los cuerpos embrioides puede producir un cultivo de células precursoras o progenitoras neuronales. Opcionalmente, el método comprende además: Aplicar las células de cuerpos embrioides disociadas, obteniendo de esta manera un cultivo aplicado de células precursoras o progenitoras neuronales. El método puede comprender el cultivo de las células precursoras o progenitoras neuronales para producir neuronas. Por consiguiente, en algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden aplicar y cultivar las células de cuerpos embrioides disociadas, para producir neuronas. Los métodos de la presente invención comprenden además una o más características/pasos como se describen más adelante. Cualquier característica o paso se puede utilizar solo o se puede utilizar en combinación con cualquier otra característica o paso, a menos que el contexto lo indique de otra manera.

Cultivo de Células de tallo embrionario Sin Alimentador De preferencia , el método comprende cultivar células de tallo embrionario en ausencia de células alimentadoras (típicamente , fibroblastos inactivados) . Los métodos pueden incluir el cultivo inicial de células de tallo embrionario con células alimentadoras, seg uido por el cultivo sin células alimentadoras . Las células alimentadoras se pueden d iluir y remover mediante el paso repetido de las células de tallo embrionario . Se prefiere que se lleve a cabo cuando menos uno, más preferiblemente cuando menos dos pasos sin célu las alimentadoras, antes de la formación de los cuerpos embrioides. Por consiguiente, las células alimentadoras de preferencia están ausentes del cu ltivo de célu las de tallo embrionario utilizadas para la formación de los cuerpos embrioides. El "paso" comprende disociar las células, y volver a aplicar un número de células. Por ejemplo, el paso puede comprender separar/disociar las células del plato de cultivo (normalmente utilizando tripsina) , d isociar los ag regados de células, y volver a aplicar un número de células de tallo embrionario disociadas (cultivo ad herente) , y cultivar las células de tallo embrionario. Los med ios de cultivo apropiados se describen en cualquier otra parte de la presente. Opcionalmente se puede inclu ir el factor inhibidor de leucemia (LI F) en el medio de cu ltivo de células de tallo embrionario. Selección v Aplicación de las Células de tallo embrionario para la Formación de los Cuerpos Embrioides Hemos reconocido que el estado proliferativo de las células de tallo embrionario afecta a su pluripotencia, y que la densidad de las células aplicadas en el método tiene un impacto sobre su capacidad y tendencia a diferenciarse. Hemos encontrado que, mediante la selección y aplicación de las células de tallo embrionario en proliferación a una densidad celular controlada, se pueden obtener mayores números de precursores neuronales que tengan un linaje celular definido, y se pueden producir menos células heterogéneas. De preferencia, los métodos de la invención comprenden seleccionar células de tallo embrionario altamente proliferativas y/o morfológicamente homogéneas para la formación de los cuerpos embrioides. De una manera preferible, los métodos comprenden aplicar un número medido/estimado/definido/determinado o densidad de estas células de tallo embrionario para la formación de los cuerpos embrioides. Preferiblemente, el método comprende seleccionar un número medido, estimado, definido, o determinado de células de tallo embrionario para aplicarse en la producción de los cuerpos embrioides. El método de preferencia comprende medir, estimar, observar, o determinar: El estado de proliferación de las células de tallo embrionario (el cual se puede medir o estimar mediante la determinación del tiempo de duplicación, el aumento en el número de células, o cualquier otra medida apropiada); La morfología de las células de tallo embrionario; y/o El número o la densidad de las células de tallo embrionario aplicadas para la formación de los cuerpos embrioides. Por consiguiente, de preferencia, las células se aplican en una densidad medida, estimada, o determinada. La medición, estimación, o determinación del número de células puede ser mediante cualquier método conocido en la materia, por ejemplo el cual comprende contar las células en un área dada bajo el microscopio, o utilizar contadores de células convencionales como Casy®1 (Scharfe System GmbH). La morfología celular se puede observar mediante observación microscópica. Cada uno de estos puntos se discute con mayor detalle más adelante. Producción y selección de células altamente proliferativas. Las células altamente proliferativas pueden ser células producidas mediante un método particular de cultivo, como se describe en la presente. Hemos encontrado que el estado de proliferación de las células de tallo embrionario se puede variar a través del método de cultivo de las células de tallo embrionario. El cultivo o paso de células de tallo embrionario de preferencia produce células altamente proliferativas. De preferencia, el paso se repite aproximadamente cada 2 días, y el cultivo de células de tallo embrionario de preferencia comprende cuando dos pasos sobre células alimentadoras, seguidos por cuando menos dos pasos sin células alimentadoras. Las células de tallo embrionario se deben privar de alimentadoras en un estado altamente proliferativo, por ejemplo dividiendo un plato de 10 centímetros de células de tallo embrionario sobre células alimentadoras, y volviendo a aplicar (por ejemplo, tomando 1/4 por volumen de la suspensión celular, y volviendo a aplicar en el volumen original del medio) sin alimentadoras, se debe dar un cultivo de células de tallo embrionario 60 por ciento confluentes ya nuevamente al día siguiente. El paso sin alimentadoras puede comprender aplicar aproximadamente 0.5 x 105 células por centímetro cuadrado. De una manera preferible, el cultivo de células de tallo embrionario comprende medir, estimar, o determinar el número o la densidad de las células aplicadas para el cultivo de células de tallo embrionario. Las células de tallo embrionario altamente proliferativas pueden ser células de tallo embrionario producidas mediante el cultivo o el paso de las células de tallo embrionario sustancialmente como sigue (normalmente sin células alimentadoras): La aplicación de las células de tallo embrionario a una densidad de entre aproximadamente 0.3 x 105 y de 4 x 105 células por centímetro cuadrado, por ejemplo entre aproximadamente 0.5 y 2 x 105, y de preferencia de aproximadamente 1 x 105 células por centímetro cuadrado; y Recuperar/disociar las células de tallo embrionario 2 días después de la aplicación, y opcionalmente volver a aplicar. Las células de tallo embrionario se deben recuperar mediante división (disociación) 2 días después de la aplicación. Normalmente, este procedimiento de cultivo (paso) se debe llevar a cabo cuando menos dos o tres veces, antes de seleccionar las células altamente proliferativas para la formación de los cuerpos embrioides. Por ejemplo, se pueden aplicar aproximadamente 2 x 106 células en un plato de cultivo celular de 10 centímetros cuadrados. El procedimiento anterior normalmente permite que se recuperen entre 10 x 106 y 35 x 106 células por 10 centímetros cuadrados después de 2 días, por ejemplo entre 10 y 20 x 106. El estado de proliferación se puede medir en términos del tiempo de duplicación de las células de tallo embrionario. Los métodos de la invención pueden comprender medir el tiempo de duplicación de las células de tallo embrionario, y seleccionar las células altamente proliferativas. Por ejemplo, las células altamente proliferativas pueden tener un tiempo de duplicación de 8 horas o menos, de 16 horas o menos, o de 24 horas o menos, normalmente entre 8 y 24 horas. Características morfológicas. Las células de tallo embrionario utilizadas para la formación de los cuerpos embrioides de preferencia son morfológicamente homogéneas, en donde todas o sustancialmente todas las células de tallo embrionario tienen las mismas o similares características morfológicas. De preferencia, los métodos de la invención comprenden seleccionar las células de tallo embrionario morfológicamente homogéneas para la formación de los cuerpos embrioides, y aplicar estas células para la formación de los cuerpos embrioides. De una manera preferida, todas o sustancialmente todas (por ejemplo, cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 98 por ciento, o cuando menos el 99 por ciento) las células de tallo embrionario seleccionadas para la formación de cuerpos embrioides, tienen una o más, y más preferiblemente todas las siguientes características morfológicas (en cultivo, sin células alimentadoras): crecimiento n una monocapa plana; las células vecinas no están en contacto directo unas con otras (pero no obstante, están densamente empacadas); núcleos grandes; muchos nucléolos; las células no crecen unas encima de otras o en forma de tipo colonia. De una manera preferible, las células están densamente empacadas, por ejemplo las células están en una densidad de aproximadamente 20 x 106 células por plato de 10 centímetros cuadrados (2 x 106 células por centímetro cuadrado), de preferencia en una densidad de entre aproximadamente 10 y 30 x 106 células, por ejemplo de 15 a 25 x 106 células, por plato de 10 centímetros cuadrados. El método puede comprender observar una o más características morfológicas preferidas de las células de tallo embrionario, y/o seleccionar las células que tengan una o más de estas características. La morfología celular también se ha utilizado como un indicador del estado de proliferación. Las células altamente proliferativas de preferencia tienen una o más, y de preferencia todas las características morfológicas anteriormente mencionadas.

De una manera preferible, todas las células de tallo embrionario cultivadas se derivan a partir de una sola célula de tallo embrionario, por ejemplo, un paso anterior del método puede comprender seleccionar una sola colonia de células de tallo embrionario, y cultivas las células de tallo embrionario a partir de esa colonia. De esta manera se puede incrementar la uniformidad y homogeneidad, incluyendo la homogeneidad morfológica, de las células de tallo embrionario en el cultivo. Densidad de aplicación Para la formación de los cuerpos embrioides, las células altamente proliferativas así generadas y/o las células morfológicamente homogéneas, normalmente se deben aplicar utilizando entre alrededor de 0.5 x 106 y 5 x 106 células por 15 mililitros de medio de cultivo para la formación de los cuerpos embrioides, de preferencia de 2.5 a 2.5 x 106 células, por ejemplo 3 x 106 en 15 mililitros del medio. Normalmente se deben aplicar entre aproximadamente 0.3 y 3.5 x 105 células'ml"1 , de preferencia de 1.6 a 2.5 x 105 células«ml"1, más preferiblemente 2 x 105 células»ml"1. Un volumen preferido es de 15 mililitros del medio, aunque se pueden utilizar 10 mililitros, o entre 10 y 15 mililitros, normalmente en platos de 10 centímetros. La densidad de las células aplicadas para la formación de los cuerpos embrioides se debe ajustar de acuerdo con el estado de proliferación de las células de tallo embrionario utilizadas. Por consiguiente, si el cultivo de células de tallo embrionario es más denso, entonces se deben aplicar más células, mientras que, si el cultivo es menos denso, entonces se deben aplicar menos células. Hemos encontrado que se obtienen los mejores resultados utilizando las células de tallo embrionario que proliferen más rápidamente. Como un ejemplo, las células de tallo embrionario de una morfología homogénea que tengan un tiempo de duplicación de entre aproximadamente 12 y 16 horas, se pueden seleccionar y aplicar en una densidad de aproximadamente 0.5 x 105 células por centímetro cuadrado. Disociación de Células En los métodos de la invención en general, la disociación de las células de preferencia comprende disociar las células (células de tallo embrionario o cuerpos embrioides) para formar una suspensión de células individuales que sustancialmente carezcan de agregados de más de 2 ó 3 células. De preferencia, la suspensión es de células enteramente disociadas individualmente (es decir, la suspensión no tiene agregados de células). De una manera preferible, más del 90 por ciento, del 95 por ciento, del 98 por ciento, o del 99 por ciento de las células en la suspensión, están disociadas individualmente. De una manera preferible, menos del 5 por ciento de las células en la suspensión forman agregados de 4 ó más células. Se puede utilizar tripsina (por ejemplo, al 0.05 por ciento) y/o trituración para disociar las células, empleando los métodos descritos con detalle en cualquier otra parte de la presente. Las células de tallo embrionario se deben disociar bien antes de aplicarse para la formación de los cuerpos embrioides. Por consiguiente, de preferencia los métodos de la invención comprenden disociar las células de tallo embrionario para formar una suspensión de células individuales que carezcan sustancialmente de agregados de más de 2 ó 3 células. De una manera preferible, la suspensión es de células enteramente disociadas individualmente (es decir, la suspensión no tiene agregados de células). De preferencia, más del 90 por ciento, del 95 por ciento, del 98 por ciento, o del 99 por ciento de las células en la suspensión, están disociadas individualmente. Preferiblemente, menos del 5 por ciento de las células en la suspensión forman agregados de 4 ó más células. Los métodos de la invención pueden comprender determinar o estimar el nivel de disociación de las células de tallo embrionario. De preferencia, los métodos comprenden disociar las células de tallo embrionario, y seleccionar una suspensión de células disociadas de acuerdo con la invención. Se puede emplear observación microscópica o contadores de células convencionales, para determinar o estimar el grado de disociación. Por ejemplo, utilizando el contador de células Casy®1, se detectan picos de células en diámetros más altos si hay agregados presentes. Disociación Directa de las Células de Cuerpos Embrioides Los cuerpos embrioides se cultivan en un cultivo en suspensión, y luego se disocian las células de cuerpos embrioides, produciendo una suspensión de células de cuerpos embrioides disociadas. Normalmente, los cuerpos embrioides se disocian después de 8 días, es decir, el octavo día en seguida de la aplicación de las células para la formación de los cuerpos embrioides, o 4 días después de la adición del ácido retinoico. La disociación se puede llevar a cabo antes o después de esto, pero normalmente es entre 3 y 5 días después de la adición del ácido retinoico. La persona experta en la materia puede determinar experimentalmente el tiempo óptimo para la disociación. De una manera preferible, los cuerpos embrioides no se aplican sobre el sustrato adherente antes de la disociación, sino que en su lugar, se mantienen en el cultivo no adherente hasta la disociación de las células. Por consiguiente, los cuerpos embrioides de preferencia se deben disociar antes de la aplicación, y no se deben aplicar directamente. La disociación de los cuerpos embrioides normalmente comprende incubar los cuerpos embrioides con tripsina (normalmente al 0.05 por ciento, o entre el 0.01 y el 0.5 por ciento). De preferencia, los métodos de la invención comprenden filtrar la suspensión de cuerpos embrioides disociados para remover los grumos de células, por ejemplo las células se pueden filtrar a través de una malla o cernidor, típicamente una malla o cernidor de nylon. Normalmente se utiliza una malla o cernidor de células de 40 mieras. En las modalidades de la invención, el diámetro de poro o de malla es de preferencia de cuando menos 20, 30, ó 40 mieras, y preferiblemente de 100, 80, 60, ó 50 mieras o menos.

Almacenamien to de Células efe Cuerpos Embrioides Los métodos de la invención pueden comprender almacenar las células de cuerpos embrioides disociadas, por ejemplo congelar las célu las en nitrógeno líquido. Por ejemplo, el almacenamiento puede comprender centrifugar las células, volver a suspender las células después de la centrifugación en u n med io de cuerpos embrioides + su lfóxido de dimetilo al 1 0 por ciento, y congelar las células en n itrógeno l íqu ido. Por consig uiente, en alg unas modalidades, el método comprende disociar los cuerpos embrioides, y almacenar las célu las de cuerpos embrioides disociadas. De esta manera se puede obtener un su min istro conveniente y fácil de precursores neurales. Los suministros congelados se pueden descongelar como y cuando sea necesario, por ejemplo para la aplicación y el cultivo con el fin de prod ucir neuronas. La posibilidad de almacenar estos precursores pa ra uso posterior no se ha publicado previamente en el campo. Normalmente las célu las se descongelan e in mediatamente después de descongela rse se vuelven a suspender en el med io, típicamente 1 0 mililitros de medio de N2 , se centrifugan (típicamente durante 5 min utos a 1 ,000 revoluciones por min uto, a temperatu ra ambiente) , y se vuelven a suspender (normalmente en el medio de N2) . Densidad de Aplicación de las Células de Cuerpos Embrioides Disociadas En los aspectos en donde se aplican las células de cuerpos embrioides, hemos encontrado q ue la densidad de aplicación de las células de cuerpos embrioides es importante para la sobrevivencia y diferenciación celular. La aplicación demasiado delgada reduce la sobrevivencia celular, mientras que la aplicación demasiado densa afecta adversamente a la velocidad de la diferenciación. La densidad de la aplicación también afecta a la pureza del cultivo, es decir, a la cantidad de células no neuronales contra neuronales. De una manera preferible, se deben aplicar entre aproximadamente 0.5 x 105 y 2.5 x 105 células de cuerpos embrioides disociados por centímetro cuadrado, por ejemplo, entre aproximadamente 1 y 2 x 105, más preferiblemente entre aproximadamente 1 y 1.5 x 105 células por centímetro cuadrado. Los métodos de la invención pueden comprender medir, estimar, o determinar el número o la densidad de células de cuerpos embrioides aplicadas, empleando los métodos descritos en cualquier otra parte de la presente. Cambio de Medio de Cultivo Notoriamente, hemos observado que se logra un gran aumento en la sobrevivencia celular si se cambia el medio de cultivo aproximadamente 2 horas después de aplicar las células de cuerpos embrioides disociadas. Este descubrimiento abre la posibilidad de producir cultivos neuronales de largo plazo, lo cual hasta ahora ha sido poco común en el campo. En este contexto, el cambio del medio de cultivo significa refrescar o reemplazar el medio de cultivo. El nuevo medio de preferencia es de la misma composición que el medio en donde se aplicaron originalmente o previamente las células de cuerpos embrioides disociadas, es decir, se utiliza el mismo tipo de medio. Se podría utilizar un medio de una composición similar, pero de preferencia la composición es la misma que se utilizó previamente. Por ejemplo, el medio puede ser un medio de N2. De conformidad con lo anterior, los métodos de la invención de preferencia comprenden cambiar el medio de cultivo en seguida de la disociación de los cuerpos embrioides, y aplicar las células de cuerpos embrioides disociadas en el medio de cultivo. De preferencia, el medio de cultivó se cambia entre aproximadamente 1 y 6 horas después de la aplicación. El medio de cultivo se puede cambiar dentro de 6 horas de la aplicación, de preferencia dentro de 5, 4, ó 2.5 horas después de la aplicación. El medio de cultivo se puede cambiar después de cuando menos aproximadamente 1 hora, 1.5 horas, ó 2 horas después de la aplicación. Más preferiblemente, el medio de cultivo se cambia entre aproximadamente 1 y 3 horas después de la aplicación, de una manera más preferible entre aproximadamente 1.5 y 2.5 horas, y de una forma muy preferible en aproximadamente 2 horas. Cultivo de Células de Cuerpos Embrioides Disociadas Aplicadas Las células de cuerpos embrioides disociadas de preferencia se aplican en el medio de N2. Después de dos días, de preferencia se cambia el medio hasta un medio adecuado para la diferenciación neuronal, tal como el "medio completo" (ver los Ejemplos). La elección y composición del medio pueden depender del linaje neuronal deseado. Por ejemplo, el medio completo utilizado en la presente se basó en un medio de Brewer, y se diseñó para promover el desarrollo de neuronas piramidales. Se pueden seleccionar otros medios o factores para soportar un linaje neuronal diferente, por ejemplo Shh (erizo sónico) para producir motoneuronas colinérgicas. Encontramos que los precursores producidos de acuerdo con la presente invención fueron capaces de diferenciarse en un número de linajes neuronales específicos diferentes, incluyendo motoneuronas, en seguida de la implantación en embriones de pollo. En algunas modalidades, se prefiere que el medio de cultivo no contenga P3. El medio completo utilizado en la presente se basó en medio de Brewer, pero se omitió el P3 de la composición. Es posible que el P3, que se encuentra en el suero fetal de becerro, pueda inhibir la diferenciación neuronal. De preferencia, no se utiliza un medio neurobasal. Típicamente se utiliza el medio neurobasal + suplemento B27 (ambos disponibles en GIBCO) en la técnica anterior para el cultivo neuronal. Sin embargo, hemos observado que el medio neurobasal puede promover el desarrollo de células gliales, en lugar del desarrollo de células neuronales. Por consiguiente, el uso del medio neurobasal puede conducir a la presencia indeseable de células gliales entre las células neuronales producidas. En contraste, el medio completo utilizado en la presente parece suprimir el desarrollo de células g I i a les a favor del desarrollo neuronal. De una manera preferible, las células aplicadas (células de cuerpos embrioides disociadas, células precursoras/progenitoras neuronales) se cultivan en ausencia de suero, o no se cultivan en la presencia de suero. (Se puede utilizar suero para inactivar la tripsina después de la disociación celular, pero entonces se debe remover, por ejemplo, mediante centrifugación, para granular las células, y para remover de una manera sustancialmente completa el sobrenadante). De una forma preferible, no hay factores de crecimiento (en especial EGF, FGF/bFGF, y PDFG) en el medio de cultivo, y las células precursoras o progenitoras no se cultivan en la presencia de estos u otros factores de crecimiento. Los métodos pueden comprender cultivar neuronas, y las neuronas también de preferencia no se cultivan en la presencia de suero, y de preferencia no se cultivan en la presencia de factores de crecimiento, en especial EGF, FGF/bFGF, ó PDFG. Adicionalmente, los métodos de la invención no requieren, y de preferencia no incluyen, pasos de selección positiva o negativa, por ejemplo selección genética de Sox-2, para enriquecer las células neurales o las neuronas, aunque si se desea, se pueden emplear tales procedimientos de selección. Los métodos de la presente invención producen poblaciones de células neurales sustancialmente homogéneas, inclusive sin un paso de selección. De una manera preferible, los métodos de la presente invención no incluyen un paso de selección negativa contra los tipos de células no neurales o no neuronales (por ejemplo, las células que se están dividiendo). De preferencia, los métodos de la invención no incluyen un paso de selección positiva, para enriquecer las células neurales o las neuronas. Los métodos de selección conocidos incluyen la selección genética, por ejemplo selección de Sox-2 contra células negativas para Cox-2, y poner en contacto las células con un agente de selección negativa, con el fin de inhibir y/o aniquilar las células no neurales o no neuronales, por ejemplo poner en contacto las células con un anti-mitógeno, tal como AraC ó FRDU, para inhibir y/o aniquilar las células que se estén dividiendo. Células de Tallo Embrionario Las células de tallo embrionario son células de tallo pluripotentes aisladas a partir de la masa celular interna del blastocito de mamífero. Las células de tallo embrionario utilizadas en la invención pueden ser de cualquier mamífero, el cual puede ser humano o no humano, tal como conejillo de indias, rata, ratón u otro roedor, gato, perro, cerdo, oveja, cabra, res, caballo, o primate, por ejemplo mono. Típicamente se utilizan células de tallo embrionario de ratón. En la presente invención, las células de tallo embrionario normalmente son células pluripotentes, y no células totipotentes, y no son capaces de producir células germinales. Las células de tallo embrionario utilizadas en los ejemplos de la presente, son pluripotentes. Opcionalmente, se pueden utilizar células de tallo embrionario totipotentes. Se conocen un número de líneas de células de tallo embrionario en la técnica, y se pueden utilizar en la presente invención (por ejemplo, J1, E14). Se pueden utilizar células de tallo embrionario diseñadas para permitir los procedimientos de selección, por ejemplo la selección de Sox-2. Como se describe en cualquier otra parte de la presente, las células de tallo embrionario utilizadas en la presente invención pueden ser líneas celulares dirigidas o líneas genéticamente manipuladas que contengan un gen introducido o un gen mutado, o que sobre-expresen un gen endógeno. Se pueden utilizar líneas de células de tallo embrionario que comprendan un gen reportero operativamente enlazado con un promotor (por ejemplo, un promotor para la expresión específica de la neurona). Describimos el uso de una línea Tau-GFP en la presente. Las propiedades del locus Tau incluyen altos niveles de expresión relevante de ADNcs insertados, alta eficiencia de recombinacíón, expresión solamente en las neuronas, y eliminaciones de Tau que no tienen un fenotipo aparente. Utilizamos el locus tau para insertar el ADNc que se vaya a investigar. Tau puede ser fácilmente reemplazado por diferentes ADNcs, o se pueden insertar ADNcs en el locus Tau (de tal manera que su expresión se enlace operativamente con el promotor Tau), con el fin de establecer rápidamente un alto nivel de expresión estable específicamente en las neuronas (referencia 42).

Células Neurales Como se utiliza en la presente, una célula neural es una célula del sistema nervioso, e incluye una célula de tallo neural, una célula precursora o progenitora neuronal, y una neurona (célula neuronal), a menos que el contexto lo indique de otra manera. Los términos "neurona" y "célula neuronal" se utilizan de una manera intercambiable. "Célula de tallo" significa cualquier tipo de célula que pueda auto-renovarse, y si es una célula multipotente o de tallo neural, puede dar lugar a todos los tipos de células del sistema nervioso, incluyendo neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Una célula de tallo puede expresar uno o más de los siguientes marcadores: Oct-4; Sox1-3; antígenos embrionarios específicos de la etapa (SSEA-1, -3, y -4) (Tropepe y colaboradores, 2001, Neuron 30, 65-78). Una célula de tallo neural puede expresar uno o más de los siguientes marcadores: Nestina; receptor de neurotrofina p75; Notchl, SSEA-1 (Cápela y Temple, 2002, Neuron 35, 865-875). "Célula progenitora neural" significa una hija o descendiente dé una célula de tallo neural, con un fenotipo diferenciado más y/o un potencial de diferenciación reducida más, comparándose con la célula de tallo. La célula precursora significa cualquier otra célula que esté o que no esté en una relación de linaje directa con las neuronas durante el desarrollo, pero que, bajo condiciones ambientales definidas, se pueda inducir para transdiferenciarse o rediferenciarse, o adquirir un fenotipo neuronal.

"Linaje" significa la progenie de, o las células derivadas a partir de, un tipo de célula definido. El "sub-linaje" significa un subtipo de cierto linaje. Detección de Marcadores e Identificación de Tipos de Células Los métodos de la invención de preferencia producen una población de células en donde cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento de las células son células precursoras/progenitoras neuronales, por ejemplo células gliales radiales, o neuronas, por ejemplo neuronas piramidales. Los métodos preferiblemente comprenden identificar cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 98 por ciento, o cuando menos el 99 por ciento de las células como células precursoras/progenitoras neuronales, por ejemplo células gliales radiales, o neuronas, por ejemplo neuronas piramidales. Los métodos de cultivo de células neuronales de la invención de preferencia producen una población de células que tienen menos del 5 por ciento de astrocitos, por ejemplo menos del 4 por ciento, del 3 por ciento, del 2 por ciento, o del 1 por ciento. Los métodos de la presente invención, como se describen anteriormente, de preferencia son tales que logran estas proporciones. La presente invención proporciona métodos para lograr, producir, o generar estas proporciones de células, utilizando uno o más pasos o características del método, como se describen anteriormente. Los métodos de la invención pueden comprender identificar las células de cuerpos embrioides disociadas como los precursores neuronales, o (en seguida del cultivo en plato) como neuronas. El método puede comprender determinar, observar, o confirmar que cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento de las células, e identificar que cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 98 por ciento, o cuando menos el 99 por ciento de las células, son células precursoras/progenitoras neuronales, por ejemplo células gliales radiales, o neuronas, por ejemplo neuronas piramidales. Típicamente, menos del 5 por ciento de las células producidas a través de los métodos de cultivo de células neuronales descritos en la presente son astrocitos, por ejemplo menos del 4 por ciento, del 3 por ciento, del 2 por ciento, o del 1 por ciento. El linaje celular y/o el tipo de célula se puede determinar mediante la observación de la morfología celular, por ejemplo mediante inspección microscópica. El método puede comprender la observación de la morfología de la célula precursora/progenitora neuronal, o la morfología de la célula neuronal, en cuando menos estas proporciones de células generadas. Las precursoras/ progenitoras neuronales pueden ser alargadas, y/o pueden tener una morfología de huso bipolar. El linaje neuronal se puede determinar mediante la observación de la morfología neuronal, por ejemplo las neuronas piramidales son de una forma triangular, y tienen extensiones neuríticas ramificadas, mientras que las neuronas colinérgicas tienen una morfología bipolar. Las células generadas de acuerdo con los métodos de la invención, de una manera alternativa o adicional, se pueden identificar a través de la detección de marcadores, típicamente marcadores de superficie celular reconocidos por los anticuerpos. El método puede comprender la detección de la presencia de uno o más marcadores, cuya presencia indique que la célula es de un linaje o sub-linaje particular, o un tipo o sub-tipo de célula particular. La persona experta conoce los marcadores que se pueden identificar y utilizar como una indicación del linaje o del tipo de célula. Por ejemplo, el método puede comprender la detección de la presencia del marcador Pax6 sobre las células, y la identificación de las células como precursores neuronales, por células gliales radiales. Otros marcadores que se pueden detectar incluyen Nestina, RC2 y BLBP, que están presentes sobre las células gliales radiales, y p75, GluR1, sinaptofisina, Trks (por ejemplo, TrkA, TrkB, TrkC), y APP, que están presentes sobre ciertas células neuronales. El método puede comprender la detección de un alto porcentaje de células que expresen los marcadores de precursores neuronales, por ejemplo cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento de las células, y la identificación de cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 98 por ciento, o cuando menos el 99 por ciento de las células, como precursoras neuronales. El método puede comprender la detección de un alto porcentaje de células que expresen los marcadores de células neuronales, por ejemplo cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento de las células, y la identificación de cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 98 por ciento, o cuando menos el 99 por ciento de las células, como neuronas, de preferencia neuronas de un linaje definido, por ejemplo neuronas piramidales o neuronas dopaminérgicas. Por consiguiente, el método puede producir poblaciones sustancialmente homogéneas de células precursoras neuronales o de neuronas. Cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 85 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, cuando menos el 95 por ciento, cuando menos el 98 por ciento, o cuando menos el 99 por ciento de las células pueden ser del mismo tipo/linaje o subtipo/linaje, por ejemplo precursoras neuronales del mismo tipo, tales como células gliales radiales o neuronas del mismo linaje, tales como neuronas piramidales. Los ejemplos de la presente proporcionan detalles del transcurso del tiempo de expresión de diferentes marcadores y del desarrollo morfológico a través del tiempo. Los métodos de la invención pueden comprender la detección de marcadores y/o la observación de la morfología particular en ciertos tiempos después de la disociación del cuerpo embrioide (como se observa en los Ejemplos), por ejemplo la observación de la morfología neuronal menos de 2 días después de la disociación del cuerpo embrioide, y/o la detección de la expresión de los receptores Trk después de aproximadamente 7 días. Por ejemplo, en la presente se demuestra que aproximadamente el 99 por ciento de las células producidas mediante un método de la invención fueron células gliales radiales, como se indica por la detección de la expresión de RC2+ por el 99 por ciento de las células de cuerpos embrioides disociadas. También se demuestra en la presente que cuando menos el 80 por ciento de las neuronas se pueden producir rutinariamente mediante los métodos de la invención, como se indica mediante la medición de la expresión o el conteo de vGLUTI y GFP después de aproximadamente 7 días después de la disociación de los cuerpos embrioides. Los porcentajes se pueden calcular como el porcentaje de células viables o como el porcentaje de células que expresen un marcador nuclear, por ejemplo DAPI o Hoechst. Formación de Cuerpos Embrioides y Tratamiento con Ácido Retinoico En los métodos de la invención en general, se forman cuerpos embrioides y se cultivan en el medio de cultivo. Durante la formación y cultivo de los cuerpos embrioides, el medio de cultivo típicamente se cambia cada 2 días. Normalmente, en los métodos de la invención, los cuerpos embrioides se cultivan en la presencia de ácido retinoico durante uno o más días, típicamente durante 2, 3, ó de preferencia 4 días, o hasta 5, 6, 7, u 8 días. Los cuerpos embrioides se pueden cultivar inicialmente en ausencia de ácido retinoico durante uno o más días, normalmente entre 2 y 6 días, típicamente durante 2, 3, o de preferencia 4 días, o hasta 5 ó 6 días antes del contacto con el ácido retinoico. Bain y colaboradores y Li y colaboradores utilizaron un procedimiento de 4-día/4+día. La persona experta puede seleccionar una concentración apropiada de ácido retinoico. Por ejemplo, la concentración puede ser, por ejemplo, de cuando menos 0.25 µ?, de cuando menos 0.5 µ?, o de cuando menos 1 µ?. La concentración puede ser, por ejemplo, de 10 µ? ó menos, de 7.5 µ? ó menos, o de 5 µ? ó menos. De una manera preferible, la concentración es de entre 0.5 y 5 µ? inclusive. Por ejemplo, la concentración puede ser de 1 µ? ó de 5 µ?. Ensayos Celulares Neurales Los aspectos adicionales de la presente invención proporcionan métodos de ensayo celular llevados a cabo con células precursoras o progenitoras neuronales, o con células neuronales, que normalmente son células generadas in vitro (no son neuronas primarias), y de preferencia son células producidas mediante un método de la invención. Los métodos de ensayo pueden incluir un método de la invención como se describe en la presente, para producir células precursoras o progenitoras neuronales, o neuronas. Los métodos de la invención pueden comprender llevar a cabo un método de la invención como se describe en la presente para la diferenciación neural (que produce células precursoras o progenitoras neuronales, o neuronas), y además pueden comprender los pasos de un método de ensayo celular descrito en la presente. Por consiguiente, los métodos de diferenciación neural descritos anteriormente, se pueden utilizar en el contexto de los ensayos. Además, debido a que hemos proporcionado cultivos/ poblaciones sustancialmente homogéneas de células precursoras o progenitoras neuronales o de células neuronales por primera vez, la invención proporciona además métodos de ensayo llevados a cabo con cultivos/poblaciones sustancialmente homogéneas de células precursoras o progenitoras neuronales o de células neuronales, que pueden o no producirse mediante los métodos de diferenciación neural de la presente invención, pero que normalmente se producen mediante los métodos in vi tro. Los métodos de ensayo de la invención pueden comprender detectar, cuantificar, observar, o determinar una o más características de las células precursoras o progenitoras neuronales, o neuronas ("características neuronales"), por ejemplo el crecimiento neurítico o la elongación/degeneración de neuritas, la forma neuronal, la muerte celular neurona!, la neurogénesis, la diferenciación neuronal, la actividad eléctrica, la sinaptogénesis, y/o los marcadores de células neuronales. En algunas modalidades, los métodos de ensayo de la presente invención pueden comprender un método de diferenciación neural descrito en la presente para producir células precursoras o progenitoras neuronales o células neuronales, en donde el método incluye además cultivar las células de tallo embrionario y/o los cuerpos embrioides bajo una condición de prueba; y detectar, cuantificar, observar, o determinar una o más características neuronales de las células precursoras o progenitoras neuronales o de las células neuronales. En otras modalidades, los métodos de ensayo de la presente invención pueden comprender cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales bajo una condición de prueba; y detectar, cuantificar, observar, o determinar una o más características neuronales de las células. Opcionalmente, las células se pueden producir y/o cultivar de acuerdo con los métodos de diferenciación neural descritos en cualquier otra parte de la presente. Los métodos de ensayo pueden comprender opcionalmente comparar las características neuronales bajo la condición de prueba ("cultivo de prueba") con las características neuronales de las células cultivadas bajo una segunda condición ("cultivo de control"), opcionalmente con los datos históricos de las células cultivadas bajo una segunda condición. Los métodos pueden comprender cultivas las células bajo la segunda condición. Por consiguiente, los métodos de ensayo pueden comprender un método de diferenciación neural descrito en la presente para producir células precursoras o progenitoras neuronales, o células neuronales, incluyendo cultivar células de tallo embrionario o cuerpos embrioides bajo una primera y una segunda condición; y comparar una o más características neuronales de las células precursoras o progenitoras neuronales o de las células neuronales cultivadas bajo la primera condición, con la misma característica o características neuronales de las células precursoras o progenitoras neuronales o de las células neuronales cultivadas bajo la segunda condición, respectivamente. El cultivo bajo la condición de prueba o primera condición, puede comprender poner en contacto las células con un compuesto de prueba, o exponer a las células a un compuesto de prueba, o cultivar las células en la presencia de un compuesto de prueba, el cual se puede agregar o incluir en el medio de cultivo. El cultivo bajo la segunda condición puede comprender cultivar las células en ausencia del compuesto de prueba, o no poner en contacto las células con, o exponer a las células a, el compuesto de prueba. El compuesto de prueba puede ser cualquier molécula, y puede ser de una biblioteca de compuestos de prueba. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula de ARN de doble cadena (ARNds), y el cultivo bajo la primera condición de prueba comprende exponer a las células de tallo embrionario o a las células de cuerpos embrioides a la molécula de ARN de doble cadena, inhibiendo de esta manera un gen en las células a través de la interferencia del ARN (ARNi). Se ha encontrado que el ARNds es todavía más efectivo en el silenciamiento de genes, que ambas cadenas en sentido o antisentido solas (Fire A. y colaboradores, Nature, Volumen 391 (1998)). El silenciamiento mediado por el ARNds es específico del gen, y con frecuencia se denomina como ARN de interferencia (ARNi) (ver también Fire (1999) Trends Genet. 15:358-363, Sharp (2001) Genes Dev. 15:485-490, Hammond y colaboradores (2001) Nature Rev. Genes 2:1110-1119 y Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2:239-245). La interferencia del ARN es un proceso de dos pasos. Primero, se disocia el ARNds dentro de la célula para producir ARNs de interferencia cortos (ARNsis) de una longitud de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos, con fosfato terminal 5' y colgaduras cortas 3' (de aproximadamente 2 nucleótidos). Los ARNsis dirigen la secuencia de ARNm correspondiente específicamente para la destrucción (Zamore P. D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750 (2001)). El ARNi se puede inducir eficientemente utilizando dúplexes de ARNsi químicamente sintetizado de la misma estructura con extremos colgantes 3' (Zamore PD y colaboradores, Cell, 101, 25-33 (2000)). Se ha demostrado que los dúplexes de ARNsi sintéticos suprimen específicamente la expresión de los genes endógenos y heterólogos en un amplio rango de líneas celulares de mamífero (Elbashir S. M. y colaboradores, Nature, 411, 494-498 (20001)). Se pueden utilizar dúplexes de ARNsi que contengan entre 20 y 25 pares de bases, más preferiblemente entre 21 y 23 pares de bases, de la secuencia que se vaya a inhibir. De una manera alternativa, el ARNsi se puede producir a partir de un vector, in vitro (para su recuperación y uso) o in vivo. En otras modalidades, el compuesto de prueba puede ser un ácido nucleico (ADN, ADNc, ó ARN), que codifique opcionalmente un gen, por ejemplo ADNc. Por consiguiente, el compuesto de prueba puede ser un vector que codifique un gen, en donde las células que se expongan al ácido nucleico o al vector den como resultado que se exprese el gen en las células. En una modalidad, el vector puede comprender una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, tanto en la orientación en sentido como anti-sentido, de tal manera que, cuando se expresen como ARN, las secciones en sentido y anti-sentido se asocien para formar un ARN de doble cadena. Este puede ser, por ejemplo, un ARN de doble cadena largo (por ejemplo, de más de 23 nucleótidos), el cual se puede procesar en la célula para producir ARNsis para el ARNi (ver, por ejemplo, Myers (2003) Nature Biotechnology 21 :324-328). En otras modalidades, el compuesto de prueba puede ser un anticuerpo. Los métodos de ensayo pueden identificar de esta manera un compuesto o una condición que aumente o reduzca la característica de interés. Normalmente las comparaciones se llevan a cabo con células néuronales, por ejemplo una semana después de aplicar las células de cuerpos embrioides disociadas. Los cultivos de prueba y de control son típicamente dos cultivos separados, cultivados bajo condiciones de otra manera idénticas. Cuando la condición es la presencia de un compuesto de prueba, en especial cuando es ácido nucleico, el cultivo bajo la primera condición o condición de prueba puede comprender exponer las células (típicamente las células de tallo embrionario o las células de cuerpos embrioides disociadas) al compuesto de prueba, y después cultivar las células. Las características néuronales (por ejemplo, el crecimiento neurítico o la elongación de neuritas) se pueden detectar provocando o permitiendo la expresión de un gen reportero específico de neuronas, y detectando o cuantifícando la expresión del gen reportero. El gen reportero puede codificar una proteína fluorescente, por ejemplo la proteína fluorescente verde (GFP). Un gen reportero se puede dirigir hacia, o se puede enlazar operativamente con, un locus o promotor específico de neuronas, tal como el locus o promotor Tau para la expresión específica en las neuronas. Ya se ha descrito la expresión del gen reportero específico de las neuronas a partir del locus Tau (Tucker y colaboradores (42)). La expresión del gen reportero se empareda tan pronto como se diferencia la célula en una neurona, y solamente en las neuronas, y no en los precursores o en otros tipos de células, en el sistema nervioso. Los métodos de la invención que incluyen ensayos de células neuronales pueden utilizar una línea celular (células de tallo embrionario) que contenga un gen reportero que tenga expresión específica de las neuronas, estando el gen reportero operativamente enlazado con un promotor o locus expresado solamente en las neuronas (por ejemplo, la línea Tau-GFP como se describe en cualquier otra parte de la presente). La invención también proporciona métodos de ensayo para identificar un agente que inhiba o reduzca el aumento en una característica neuronal producido por una condición que se sepa que aumenta esa característica, o asociada con un aumento en la característica (por ejemplo, en algunas modalidades, en donde la condición sea el cultivo en la presencia del péptido beta amiloide), es decir, identificando un agente que reduzca o inhiba los efectos asociados con esta condición. Este ensayo puede comprender: Cultivar células precursoras o progenitoras neuronales, o células neuronales, en la presencia de un agente de prueba, y bajo una condición que se sepa que aumenta, o que está asociada con un aumento en, la característica neuronal; Cultivar células precursoras o progenitoras neuronales, o células neuronales, en ausencia del agente de prueba, y bajo una condición que se sepa que aumenta la característica neuronal; Cuantificar o determinar los niveles de la característica neuronal; y Comparar los niveles de la característica neuronal en la presencia del agente de prueba, con los niveles de la característica neuronal en ausencia del agente de prueba; En donde un nivel más bajo de la característica neuronal en la presencia del agente de prueba, comparándose con la ausencia del agente de prueba, indica que el agente inhibe o reduce un aumento en la característica neuronal producida por, o asociada con, la condición. Una condición que se sepa que aumenta, o que está asociada con un aumento en, la característica neuronal, puede ser una condición identificada mediante un método de ensayo de la invención, como una condición que aumente la característica neuronal. Por ejemplo, cuando el compuesto de prueba es un ácido nucleico (por ejemplo, ARNds), el cultivo bajo una condición que se sepa que aumenta la característica neuronal, puede comprender exponer a las células al ácido nucleico, y luego cultivar las células. El cultivo con el agente de prueba, y el cultivo bajo la condición, se pueden llevar a cabo de una manera simultánea, o el cultivo con el agente de prueba se puede llevar a cabo antes del cultivo bajo la condición, o el cultivo bajo la condición se puede llevar a cabo antes del cultivo con el agente de prueba. La persona experta puede determinar un orden apropiado, y en algunas modalidades, se puede preferir un orden sobre otro orden. Por ejem plo , las células de prefe rencia se exponen al ácido n ucleico , y luego se cu ltiva n en la presencia del agente de prueba . Elongación o generación de neuritas Los métodos de la invención pueden comprender cuantificar el crecimiento neu rítico, la elongación de neu ritas, o la degeneración de neu ritas. La cuantificación puede comprender determinar los niveles de expresión de una proteína específica de neu ritas, en donde un nivel más alto de expresión indica u n nivel más alto de crecimiento de neuritas y/o elongación de neu ritas, y/o u n nivel más bajo de degeneración de neu ritas, y en donde un n ivel más bajo de expresión indica u n nivel más bajo de crecimiento de neuritas y/o elongación de neu ritas y/o un nivel más alto de degeneración de neuritas . La cuantificación puede comprender provocar o permitir la expresión de u n gen reportero específico de neuronas , y medir los niveles de expresión del gen reportero, cuantificando de esta manera el crecimiento neu rítico, la elongación de neuritas, o la degeneración de neuritas. Por ejemplo, cuando el gen reportero codifica una proteína fluorescente, tal como la proteína fluorescente verde, la medición de los niveles de expresión comprende medir la fluorescencia. Los métodos de la invención pueden comprender cuantificar el crecimiento neurítico, la elongación de neuritas, o la degeneración de neuritas, med iante el contacto de las neuronas con el anticuerpo para u n marcador de neuritas (por ejemplo, tubulina , neu rofilamento, sinaptofisina), la determinación o cuantificación del enlace del anticuerpo con el marcador, y de esta manera se detecta o se cuantifica el sobre-crecimiento o elongación neurítica. El contacto de las neuronas con el anticuerpo se puede llevar a cabo con extractos celulares, después de Usar las células (por ejemplo, en un Western blot). De una manera alternativa, las neuronas enteras se pueden poner en contacto con el anticuerpo. Los métodos de ensayo pueden comprender cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales, o las células neuronales, bajo una primera y una segunda condición, respectivamente, y comparar los niveles de crecimiento de neuritas, la elongación o degeneración de las células precursoras o progenitoras neuronales o de las células neuronales bajo la primera condición, con las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales cultivadas bajo la segunda condición, respectivamente. Por ejemplo, cuando los niveles de crecimiento, elongación, o degeneración de neuritas son más altos (por ejemplo, como se indica por un nivel incrementado/disminuido de expresión de proteína específica de neuritas, ver anteriormente) en las células cultivadas bajo la primera condición, que en las células cultivadas bajo la segunda condición, esto indica que la primera condición (en relación con la segunda condición) aumenta el crecimiento, la elongación, o la degeneración de neuritas, respectivamente. En una modalidad preferida, el cultivo bajo la primera condición comprende cultivar las células en la presencia de un compuesto de prueba, en donde el compuesto de prueba de preferencia es el péptido-ß amiloide (?ß) (como se deriva a partir de la proteína precursora amiloide, APP). La invención proporciona métodos de ensayo para identificar un agente que inhiba o reduzca el aumento en la degeneración de neuritas, producido por una condición que se sepa que aumenta la degeneración de neuritas (por ejemplo, en donde la condición es cultivar en la presencia del péptido beta amiloide), es decir, identificar un agente que reduzca o inhiba los efectos asociados con esta condición. El ensayo puede comprender: Cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales en la presencia de un agente de prueba y bajo una condición que se sepa que aumenta la degeneración de neuritas; Cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales, o las células neuronales, en ausencia del agente de prueba, y bajo una condición que se sepa que aumenta la degeneración de neuritas; Cuantificar o determinar los niveles de degeneración de neuritas en la presencia y en ausencia del agente de prueba; y Comparar los niveles de degeneración de neuritas en la presencia del agente de prueba, con los niveles de degeneración de neuritas en ausencia del agente de prueba; En donde un nivel más bajo de degeneración de neuritas en la presencia del agente de prueba, comparándose con la ausencia del agente de prueba, indica que el agente inhibe o reduce el aumento en la degeneración de neuritas producido por, o asociado con, la condición. Como se indica anteriormente, la comparación de los niveles de degeneración de neuritas puede comprender comparar los niveles de expresión de proteína específica de neuritas, en donde un nivel más alto de expresión (nivel más bajo de degradación) en la presencia del agente de prueba, comparándose con la ausencia del agente de prueba, indica que el agente de prueba inhibe o reduce el aumento en la degeneración de neuritas producido por la condición. La condición puede ser la presencia de un compuesto, el cual puede ser un compuesto identificado mediante un método de ensayo de la invención como capaz de aumentar la degeneración de neuritas, el péptido ?ß. Muerte celular neuronal Existe una necesidad de ensayos de muerte celular neuronal en el campo, y estos ensayos son proporcionados por la presente invención. Los ensayos de muerte celular neuronal se pueden utilizar para probar o determinar la sensibilidad de las neuronas o de una población de células neuronales a una condición dada, por ejemplo la presencia de uno o más compuestos, por ejemplo para identificar una condición (por ejemplo, un compuesto) que aumente o reduzca la muerte celular neuronal. Por ejemplo, un ensayo de acuerdo con la presente invención puede comprender: Cultivar neuronas bajo una primera condición ("cultivo de prueba"); Cultivar neuronas bajo una segunda condición ("cultivo de control"); Cuantificar o determinar la muerte celular neuronal bajo las primera y segunda condiciones; y Comparar los niveles de muerte celular neuronal bajo la primera condición, con los niveles de muerte celular neuronal bajo la segunda condición; En donde un nivel más alto de muerte celular neuronal bajo la primera condición, comparándose con aquél bajo la segunda condición, indica que la primera condición aumenta la muerte celular; y/o En donde un nivel más bajo de muerte celular neuronal bajo la primera condición, comparándose con aquél bajo la segunda condición, indica que la primera condición reduce la muerte celular neuronal. En los ensayos de muerte celular neuronal, en especial en los ensayos para identificar una condición que reduzca la muerte celular neuronal, las neuronas de preferencia están genéticamente predispuestas a la apoptosis. Por ejemplo, las neuronas pueden expresar el receptor de neurotrofina p75, y/o pueden expresar una proteína apoptótica (por ejemplo, una caspasa) operativamente enlazada a un promotor específico de neuronas (por ejemplo, el locus Tau). De conformidad con lo anterior, las células de tallo embrionario utilizadas en la presente invención para producir neuronas para los ensayos de muerte celular neuronal, pueden expresar una proteína apoptótica (por ejemplo, una caspasa) operativamente enlazada a un promotor específico de neuronas (por ejemplo, el locus Tau). Los ensayos de muerte celular neuronal se pueden utilizar para identificar un agente que inhiba o reduzca el aumento en la muerte celular neuronal producida por una condición que se sepa que aumente la muerte celular neuronal, es decir, un agente que reduzca o inhiba el efecto de esta condición. El ensayo puede comprender: Cultivar neuronas en la presencia de un agente de prueba y bajo una condición que se sepa que aumenta la muerte celular neuronal; Cultivar neuronas en la ausencia del agente de prueba y bajo la condición que se sepa que aumenta la muerte celular neuronal; Cuantificar o determinar los niveles de muerte celular neuronal en la presencia y en ausencia del agente de prueba; y Comparar los niveles de muerte celular neuronal en la presencia del agente de prueba, con los niveles de muerte celular neuronal en ausencia del agente de prueba; En donde un nivel más bajo de muerte celular neuronal en la presencia del agente de prueba, comparándose con aquél en ausencia del agente de prueba, indica que el agente inhibe o reduce el aumento en la muerte celular neuronal producido por la condición.

La muerte celular puede ser determinada mediante métodos conocidos en la materia, por ejemplo mediante la determinación de los mecanismos de inducción de apoptosis en las neuronas. Las indicaciones de la muerte celular que se pueden determinar incluyen la inducción de proteínas apoptóticas (por ejemplo, caspasas, en especial caspasa-3, ver la referencia 43), el teñido con yoduro de propidio, y/o la fragmentación del ADN, y/o la alteración del nucleosoma (detectable, por ejemplo, mediante el enlace del anticuerpo al ADN y/o a la proteína de histona, ver la referencia 44). Neurogénesis y Diferenciación Neuronal Los métodos de la invención pueden incluir ensayos para neurogénesis o diferenciación neuronal, en donde se detecta y/o se cuantifica la producción o la generación de neuronas, o la diferenciación de las células de tallo embrionario y/o de las células precursoras y/o progenitoras neuronales. El método puede comprender detectar y/o cuantificar uno o más marcadores específicos de neuronas. Los métodos de la invención pueden comprender monitorear los niveles de neurogénesis para uno o más subtipos o linajes neuronales particulares, o los niveles de neuronas en general, dependiendo de los marcadores seleccionados. La generación de neuronas de linajes definidos se puede ensayar, mediante la detección y/o cuantificación de los marcadores específicos del linaje. Los métodos pueden comprender poner en contacto las células con un anticuerpo para un marcador celular, y determinar el enlace, en donde la presencia del marcador (y por consiguiente, el enlace del anticuerpo) indica que la célula es de un tipo, subtipo, linaje, o sub-linaje particular. Los métodos pueden comprender determinar o cuantificar los niveles de enlace de anticuerpo, y de esta manera determinar o cuantificar los niveles de diferenciación, la etapa de diferenciación de las células, y/o el porcentaje de células de un tipo, subtipo, linaje, o sub-linaje particular, o en una etapa de diferenciación particular. En cualquier otra parte de la presente están contenidos más detalles sobre la detección de los marcadores y la identificación de los tipos de células, y la persona experta en este campo conoce los marcadores adecuados. Los métodos de ensayo de diferenciación neuronal de la invención son adecuados para determinar los marcadores que se pueden utilizar para identificar las células de tallo embrionario y/o las células neurales en etapas de diferenciación particulares, o para identificar el tipo o subtipo de la célula, y de esta manera, indican el estado de diferenciación de la célula o del tipo o subtipo de célula. Por ejemplo, los métodos de ensayo pueden comprender inducir o permitir la diferenciación de las células de tallo embrionario para producir células precursoras o progenitoras neuronales, y/o cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales para producir neuronas (de preferencia empleando métodos de diferenciación neural, como se describen en cualquier otra parte de la presente); comparar los niveles de expresión de las proteínas en las células en una etapa de diferenciación, con los niveles de expresión de las proteínas en las células en una segunda etapa de diferenciación; e identificar las proteínas cuyo nivel de expresión difiera en las células en las primera y segunda etapas de diferenciación. Una diferencia en los niveles de expresión indica que la proteína se puede utilizar como un marcador para indicar el estado de diferenciación, el tipo o subtipo de la célula, y/o para distinguir las células en los primero y segundo estados de diferenciación. Los niveles de expresión se pueden comparar empleando cualquier método apropiado, el cual puede ser determinado por una persona experta. De preferencia, se compara la expresión de las proteínas expresadas en la superficie celular, por ejemplo, poniendo en contacto las células o un extracto celular con una biblioteca de expresión superficial de anticuerpos, y determinando el enlace. Por ejemplo, el método puede comprender comparar la expresión de las proteínas en las células precursoras/progenitoras neuronales (por ejemplo, las células gliales radiales) con las células de tallo embrionario. La diferencia en los niveles de expresión, por ejemplo, puede ser de cuando menos 1.2 veces, de cuando menos 1.5 veces, de cuando menos 1.6 veces, de cuando menos 1.8 veces, de cuando menos 2 veces, de cuando menos 3 veces, de cuando menos 5 veces, de cuando menos 10 veces, o mayor. La expresión se puede detectar en las células en la primera etapa de diferenciación, y puede no detectarse en todas las células en una segunda etapa de diferenciación. Actividad eléctrica Los niveles de actividad eléctrica, por ejemplo la actividad eléctrica que indica la abertura de un canal específico (por ejemplo, un canal de iones) en las neuronas, se pueden observar, detectar, determinar, o cuantificar.

Se pueden utilizar métodos de ensayo para identificar un compuesto capaz de modular la actividad eléctrica de las neuronas. Los métodos pueden comprender cultivar neuronas bajo una primera condición, cultivar neuronas bajo una segunda condición, y comparar la actividad eléctrica de las neuronas cultivadas bajo la primera condición, con la actividad eléctrica de las neuronas cultivadas bajo la segunda condición, respectivamente. Una diferencia en la actividad eléctrica indica que la condición modula la actividad eléctrica. Sinaptogénesis Los métodos de ensayo pueden comprender detectar o cuantificar la sinaptogénesis en las células neuronales. La detección o cuantificación puede comprender medir la actividad electrofisiológica de las células, y/o detectar o medir la expresión de uno o más marcadores que indiquen la sinaptogénesis, por ejemplo sinaptofisina. Comparación de Neuronas Genéticamente Distintas La presente invención proporciona métodos para la comparación de una célula precursora o progenitora neuronal o neurona de referencia (normalmente de tipo silvestre), con una célula precursora o progenitora neuronal o neurona mutante, teniendo las neuronas diferentes genotipos. El método puede incluir un método descrito anteriormente para producir células neurales. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona un método que comprende: Proporcionar un primero y un segundo cultivo de células neuronales o de células precursoras o progenitoras neuronales, en donde las células del primer cultivo tienen un genotipo diferente de las células del segundo cultivo; y Comparar las células precursoras o progenitoras neuronales o neuronas del primer cultivo, con las células precursoras o progenitoras neuronales o neuronas del segundo cultivo. Se pueden comparar las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales con y sin una mutación en un gen de interés. La mutación puede ser, por ejemplo, la supresión de todo o parte del gen, la supresión de todo o parte del promotor y/o potenciador del gen, o la sustitución de uno o más nucleótidos en la región codificante, en el promotor, o en el potenciador. Normalmente, la mutación da como resultado un nivel alterado (reducido o incrementado) de expresión del gen, o la expresión de una proteína mutada (por ejemplo, truncada o que contenga una o más supresiones o sustituciones en su secuencia de aminoácidos). De una manera alternativa, las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales del primer cultivo, pueden contener un gen introducido (por ejemplo un gen insertado o un ADNc insertado), o pueden sobre-expresar un gen endógeno, mientras que las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales del segundo cultivo no lo hacen. Las células de tallo embrionario se pueden manipular genéticamente, y se pueden inducir mutaciones en las células de tallo embrionario, o las células de tallo embrionario se pueden aislar a partir de un animal que lleve una mutación, por ejemplo una célula de tallo embrionario de ratón que tenga una mutación de interés. Los métodos de la presente invención pueden utilizar las células de tallo embrionario con y sin la mutación de interés, para generar células neurales, por ejemplo neuronas o células progenitoras/precursoras neuronales con y sin la mutación de interés, respectivamente. Por consiguiente, la presente invención puede producir células neurales mutantes y de tipo silvestre, por ejemplo neuronas o células progenitoras/precursoras neuronales. La comparación entre las células neurales producidas a partir de diferentes tipos de células de tallo embrionario (uno que tenga una mutación de interés, y el otro no), por ejemplo, se puede llevar a cabo para identificar un mecanismo responsable de, o que contribuya a, la pérdida de un tipo de célula neural en una enfermedad neurodegenerativa, y para identificar los objetivos relevantes en los fenotipos de la enfermedad.

En algunas modalidades, el método puede comprender producir las células precursoras/progenitoras neuronales o las neuronas a partir de un primero y un segundo cultivo de células de tallo embrionario, respectivamente, en donde las células de tallo embrionario de los primero y segundo cultivos tengan diferentes genotipos. Opcionalmente, las células precursoras/progenitoras neuronales o las neuronas se pueden producir a partir de células de tallo embrionario mediante los métodos de la invención, como se describe en cualquier otra parte de la presente. Las células de tallo embrionario del primer cultivo pueden contener una mutación en un gen de interés, mientras que las células de tallo embrionario del segundo cultivo no contengan la mutación (por ejemplo, las células de tipo silvestre). De una manera alternativa, las células de tallo embrionario del primer cultivo pueden contener un gen introducido, o pueden sobre-expresar un gen endógeno, mientras que las células de tallo embrionario del segundo cultivo no. Como una alternativa a la utilización de células de tallo embrionario genéticamente distintas, se pueden manipular genéticamente las células de cuerpos embrioides disociadas. Los métodos pueden comprender transfectar un primer cultivo de células de cuerpos embrioides disociadas, o de células precursoras o progenitoras neuronales, con una construcción de ácido nucleico, cambiando de esta manera el genotipo de las células del primer cultivo, comparándose con las células del segundo cultivo. Por ejemplo, la construcción de ácido nucleico puede codificar un gen endógeno, o puede codificar un gen de interés que contenga una mutación. Estos métodos de la invención normalmente comprenden permitir la expresión (normalmente la expresión transitoria, que dura aproximadamente 2, 3, ó 4 días) a partir de la construcción de ácido nucleico. El método puede comprender cultivar las células con el fin de producir células neuronales. Las células del primer cultivo se compararían con las células precursoras/progenitoras neuronales o con las células neuronales de un segundo cultivo, en donde que las células del segundo cultivo no contengan la construcción de ácido nucleico, el gen introducido, y/o la mutación. La comparación de las células precursoras o progenitoras neuronales o de las neuronas puede comprender comparar (y normalmente determinar o cuantificar) una o más características, tales como el crecimiento neurítico o la elongación de neuritas, la forma neuronal, la muerte celular neuronal, la neurogénesis, la diferenciación neuronal, la actividad eléctrica, la sinaptogénesis, y/o los marcadores de células neuronales. En otras modalidades, la comparación puede comprender comparar la lectura del gen de interés, por ejemplo el gen introducido o mutado o sobre-expresado, o los efectos de ese gen. La naturaleza de la lectura depende del gen, pero puede ser determinada por la persona experta para un gen dado. Por consiguiente, los mecanismos de señalización neuronal se pueden aclarar, bloquear, y/o manipular. La comparación de las células precursoras o progenitoras neuronales o de las células neuronales puede comprender comparar una o más características de las células bajo una condición de prueba, y se pueden emplear los métodos de comparar genéticamente distintas células precursoras o progenitoras neuronales o células neuronales en el contexto de los métodos de ensayo descritos en cualquier otra parte de la presente. Por consiguiente, en las modalidades preferidas, los primero y segundo cultivos de células se cultivan cada uno bajo una condición de prueba, y se comparan las características neuronales de las células. Otros métodos y variaciones son como se describen anteriormente para los ensayos celulares. Por ejemplo, el cultivo bajo la condición de prueba puede comprender cultivar en la presencia del péptido ?ß. Anticuerpos Como se utiliza en la presente, "anticuerpo" o "anticuerpos", cubre cualquier sustancia o sustancias de enlace específico que tengan un dominio de enlace con la especificidad requerida. Por lo tanto, este término cubre fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales, y homólogos de anticuerpos, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio de enlace de inmunoglobulina, ya sea natural o sintético. Por consiguiente, se incluyen las moléculas quiméricas que comprendan un dominio de enlace de inmunoglobulina, fusionado con otro polipéptido. La clonación y expresión de los anticuerpos quiméricos se describen en las Patentes Europeas Números EP-A-0120694 y EP-A-0125023. Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo entero pueden llevar a cabo la función de los antígenos de enlace. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpos son: (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL, y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios V1 y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E. S. y colaboradores, Nature 341, 544-546 (1989)), el cual consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) moléculas de Fv de una sola cadena (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están enlazados por un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de enlace de antígeno (Bird y colaboradores, Science, 242, 423-426, 1988; Huston y colaboradores, PNAS EUA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros de Fv de una sola cadena biespecíficos (Publicación Número PCT/US92/09965), y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión genética (Publicación Internacional Número WO 94/13804; P. Holliger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 906444-6448, 1993). Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, comprendiendo cada polipéptido un primer dominio que comprende una región de enlace de una cadena ligera de inmunoglobulina, y un segundo dominio que comprende una región de enlace de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando los dos dominios enlazados (por ejemplo, mediante un enlazador peptídico), pero siendo incapaces de asociarse uno con el otro para formar un sitio de enlace de antígeno: los sitios de enlace de antígeno se forman mediante la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero, con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (Publicación Internacional Número WO 94/13804). Los anticuerpos se pueden modificar en un número de maneras, por ejemplo se pueden marcar, por ejemplo con una marca fluorescente que permita que se cuantifique el enlace del anticuerpo mediante la medición de los niveles de la fluorescencia. Otros diferentes aspectos y modalidades de la presente invención serán aparentes para los expertos en la materia, en vista de la presente divulgación. Todos los documentos mencionados en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Ahora se ilustrarán ciertos aspectos y modalidades de la invención a manera de ejemplo solamente, y con referencia a la Figura 1, la cual muestra el porcentaje de células positivas para Pax-6 en puntos del tiempo seleccionados, después de aplicar las células de cuerpos embrioides disociadas. Pax-6 es expresado inicialmente por la mayoría de las células, pero desaparece rápidamente. Los resultados representan el promedio de cuatro experimentos independientes llevados a cabo con dos líneas celulares de tallo embrionario diferentes. Se expresan como % +_ SD con el 100 por ciento como el número de núcleos positivos para DAPI. Ejemplos Cultivo de Células de Tallo Embrionario El procedimiento que conduce a la generación de neuronas a partir de células de tallo embrionario, involucró los siguientes pasos, resumidos como sigue: 1. Las células cultivadas sobre una capa alimentadora crecen como colonias, mientras que, después de privarse de alimentador, crecen como una monocapa plana. 2. Las células de tallo embrionario sobre platos bacterianos no adherentes, forman agregados celulares (cuerpos embrioides) que crecen en suspensión. 3. Después de 4 días de formación de cuerpos embrioides, se agregó ácido retinoico durante otros 4 días. 4. Los cuerpos embrioides se disociaron después de un total de 8 días, y se aplicaron sobre platos recubiertos con PDL/laminina en un medio de N2. 5. El medio de N2 se cambió después de 2 horas, y nuevamente después de 12 a 24 horas. En esta etapa, la mayoría de las células precursoras tienen una morfología en forma de huso. El medio de diferenciación neuronal se agrega después de 30 a 48 horas. Este procedimiento se desarrolló utilizando células de tallo embrionario que expresaban GFP a partir del locus tau (referencia 13). La expresión de GFP a partir de un promotor endógeno permitió la visualización de las neuronas y de sus procesos bajo luz ultravioleta, y la utilizamos para maximizar la generación de las células fluorescentes. Después de la descongelación, las células de tallo embrionario se cultivaron primero sobre células alimentadoras por dos a tres pasos, y luego se privaron progresivamente de células alimentadoras. Entonces se utilizaron números definidos (3 x 106) de células para formar agregados (cuerpos embrioides, EBs), que se incubaron en platos bacterianos no adhesivos (plato de 10 centímetros, 15 mililitros del medio) durante 8 días. Después de 4 días, se agregó ácido retinoico (RA, 5 µ?), y se dejaron durante los últimos 4 días. Un paso importante fue la selección de las células de tallo embrionario privadas de alimentador con una morfología plana homogénea y un alto índice de proliferación (ver Materiales y Métodos). Después de 8 días, los cuerpos embrioides se disociaron con una suspensión recién preparada de tripsina, y se aplicaron sobre un sustrato consistente en poli-D-lisina (PDL) y laminina. Se encontró que la densidad de aplicación (1.5 x 105 células/centímetro cuadrado) es crucial, debido a que, en densidades más bajas, las células tendían a morir rápidamente. Las células disociadas se aplicaron en un medio sin suero que se cambió 2 horas después de la aplicación para remover la suciedad y las células muertas. El medio de cambio nuevamente después de 1 día (aproximadamente 24 horas). Después de 48 horas, el medio fue reemplazado por un medio sin suero enriquecido con complementos (referencia 12). En adición a las células de tallo embrionario que expresaban GFP desde ambos alelos de tau, también utilizamos más de 7 líneas celulares de tallo embrionario diferentes, con resultados que fueron indistinguibles de aquéllos reportados en este estudio. Éstas incluyen las células de tallo embrionario J1 y E14 de tipo silvestre, así como J1 con GFP en uno o ambos de los alelos de tau. También aislamos cuatro líneas celulares de tallo embrionario diferentes a partir de blastocítos de fondos mixtos de BL6/SV129, y los sometimos a nuestro protocolo de diferenciación, con resultados similares.

Precursores neuronales Las células de tallo embrionario se diferenciaron en una población homogénea de células gliales radiales. Las células disociadas a partir de los cuerpos embrioides adoptan una morfología en forma de huso alargada y distinta, que recuerda a la forma de células gliales radiales (ver la referencia 16). La imagen de contraste de fases ilustró la morfología de huso bipolar a las 2 horas de la diferenciación. Estas células se identificaron como células precursoras neurales mediante teñido con un anticuerpo para la proteína de filamento intermedia nestina (referencia 9). Dos horas después de la aplicación, se encontró que la gran mayoría de las células eran positivas para la nestina, al compararse con el número total de células aplicadas cuantificadas por el teñido nuclear (Tabla I). Entonces utilizamos RC2, un marcador expresado por todas las células gliales radiales, y se encontró que casi todas las células eran positivas (Tabla I). El teñido con anticuerpos para la proteína de enlace de lípido de cerebro (BLBP), un antígeno que también es expresado por las células gliales radiales en el sistema nervioso central en desarrollo (referencia 18), confirmó además la identidad de las células recién disociadas de los cuerpos embrioides (Tabla I). El factor de transcripción de homeodominio Pax-6 es expresado por todas las células radiales corticales (referencia 19), y se encontró que esencialmente todas las células de los cuerpos embrioides lo expresan antes de su disociación, lo cual significa que, en esta etapa, ya son precursoras. La cuantificación 2 horas después de la aplicación reveló que la gran mayoría de las células todavía eran positivas para Pax-6 (Figura 1), y que su expresión disminuía rápidamente a través de los siguientes días, para quedar esencialmente ausente después de 7 días (Figura 1 ). Tabla 1 Porcentaje de precursores neuronales 2 horas después de la aplicación. La nestina, RC2, BLBP, Pax-6, se analizaron mediante inmunocitoquímica 2 horas después de la aplicación de los cuerpos embrioides disociados. Se determinó el porcentaje (+_ SD) de células positivas en relación con el número total de células teñidas por el marcador nuclear DAPI. Diferenciación neuronal Las células con una morfología neuronal empezaron a aparecer dentro de menos de 2 días después de la disociación de los cuerpos embrioides. Todas las células que se diferenciaron expresaban GFP, indicando que eran neuronas, una conclusión apoyada por los experimentos de teñido en donde se utilizó un anticuerpo que reconoce una forma de tubulina específica de las neuronas. Después de 4 días, aproximadamente el 85 por ciento de las células eran positivas para GFP y para tubulina. Tanto mediante contraste de fases como mediante fluorescencia, nos sorprendimos por la apariencia notoriamente homogénea de los cuerpos de células neuronales. Con el tiempo en cultivo, adoptaban crecientemente la forma piramidal observada con las células aisladas a partir del hipocampo de roedor (referencia 20). Cuando se tiñeron con los anticuerpos para sinaptofisina, se vieron numerosos racimos revistiendo los procesos positivos para GFP, indicando que se puede desarrollar el contacto sináptico en nuestros cultivos. Con el fin de probar si estas neuronas utilizan glutamato como neurotransmisor, teñimos las células con un anticuerpo para el transportador de glutamato vesicular, vGlutl, una proteína de membrana expresada por la mayoría de las neuronas piramidales en la corteza cerebral y en el hipocampo (referencia 21). Después de 7 días en cultivo, el 93 + 4.7 por ciento de las células se tiñeron con los anticuerpos de vGlutl. Los descubrimientos con los anticuerpos de vGlutl son consistentes con la identificación de las neuronas como células piramidales. Al final de la primera semana en seguida de la disociación de los cuerpos embrioides, menos del 0.1 por ciento de las células tiñeron positivo para lsl-1, hidroxilasa de tirosina, y acetil-transferasa de colina. Menos del 5 por ciento fueron positivas para GABA después de 3 semanas. Con el objeto de identificar las proteínas expresadas durante la transición desde las células gliales radiales hasta las neuronas, llevamos a cabo los análisis Western blot utilizando neuronas diferenciadas in vitro preparadas a diferentes intervalos de tiempo.

Aunque es indetectable en los Usados de células g Males radiales, la subunidad GluR1 del receptor de AMPA, como sinaptofisina, fue claramente detectable después de unos cuantos días de cultivo. Los niveles de GluR1 y de proteína sinaptofisina aumentaron a medida que las neuronas empezaron a diferenciarse. Debido a que las neuronas piramidales expresan altos niveles de receptores TRK, tanto en la corteza cerebral como en el hipocampo (referencia 22), también analizamos su expresión utilizando un anti-suero dirigido contra el dominio intracelular de estos receptores de neurotrofina. Aunque los receptores Trk fueron difícilmente detectables en el día 5, sus niveles aumentaron dramáticamente durante los siguientes días. Se observó una expresión sustancial de receptores Trk después de aproximadamente 7 días in vitro, después de cuyo tiempo, aumentó dramáticamente. Inversamente, se encontró que los niveles del receptor de neurotrofina p75 declinan durante el transcurso de la maduración neuronal, de una manera muy parecida a como lo hacen in vitro (referencia 23). Finalmente, probamos la expresión de la proteína precursora amiloide (APP). Se ha demostrado que esta proteína de membrana es expresada por las células gliales radiales (referencia 24), así como por un número de células, incluyendo las neuronas posteriormente en el desarrollo. Nuestros resultados demuestran que, a diferencia de otras proteínas de membrana probadas, la proteína precursora amiloide es claramente detectable en los Usados de células gliales radiales. Los niveles de expresión aumentan subsecuentemente, presumiblemente como una consecuencia de la maduración neuronal que incluye un notorio crecimiento de los procesos neuronales. Diferenciación in vivo de los Precursores Implantados Se probó el potencial de desarrollo de las células precursoras neuronales de la invención, implantándolas en embriones de pollo, en donde podrían diferenciarse en diferentes linajes neuronales específicos, incluyendo motoneuronas. Electro fisiología Los experimentos electrofisiológicos mostraron que las neuronas formaban sinapsis, mostraban APs, y eran muy homogéneas en las características electrofisiológicas. Las neuronas eran principalmente glutamatérgicas (conocidas como bloqueadoras de las corrientes sinápticas con teñido con NBQX, vGAT), con alguna entrada GABAérgica (bloqueo con bicuculina, o de otra manera el cultivo no sobrevivía). La electrofisiología mostró claramente que no hubo otros tipos de células neuronales presentes bajo las condiciones empleadas. Con el fin de caracterizar las propiedades electrofisiológicas de nuestras neuronas derivadas de células de tallo embrionario, se llevaron a cabo registros de sujeción de parche de célula entera, sobre las células que habían estado en cultivo durante 10 y hasta 22 días. Todas las células investigadas (n=22) mostraron potenciales de acción espontáneos o inducidos por la despolarización, y en todos los casos éstos pudieron bloquearse mediante la aplicación de tetrodotoxina. También, las características electrofisiológicas de las células investigadas indicaron que eran regularmente homogéneas con respecto a sus propiedades funcionales, que eran similares a las previamente descritas para las neuronas piramidales. Se pudieron observar corrientes sinápticas espontáneas (SSCs), las cuales podían ser completamente bloqueadas mediante la adición de NBQX/AP-5 y bicuculina, o de NBQX/AP-5 solamente. Estos resultados indican que las neuronas derivadas de células de tallo embrionario forman sinapsis funcionales que utilizan glutamato como neurotransmisor. Debido a que estos experimentos también revelaron la presencia de sinapsis-GABA funcionales en los cultivos de largo plazo, cuantificamos el número de neuronas-GABA después de tres semanas. Con los anticuerpos para el transportador vesicular vGAT, encontramos que aproximadamente el 5 por ciento de las células eran positivas para este marcador después de tres semanas. De una manera consistente con la falta de teñido para los neurotransmisores no relacionados con el sistema de glutamato y GABA, no detectamos actividad sináptica alguna que pudiera no ser atribuida al glutamato o a GABA. DISCUSIÓN Utilizando células de tallo embrionario de ratón, encontramos las condiciones que conducen a la generación de una población virtualmente pura de precursores neuronales definidos como células gliales radiales. Estas células pasan entonces a generar una población homogénea de neuronas con las características de las células piramidales. Cuando son altamente proliferativas, las células de tallo no comprometidas se seleccionan para la formación de los cuerpos embrioides, y encontramos que el tratamiento con ácido retinoico convierte toda la población celular hasta un tipo definido de precursor neuronal. La selección de células de tallo embrionario no comprometidas es importante, debido a que se ha observado que inclusive en la presencia de LIF, algunas células de tallo embrionario tienen tendencia a diferenciarse, y que, durante la formación del cuerpo embrioide, con frecuencia se pueden observar células de diferentes linajes (para las revisiones, ver las referencias 3, 34). Con el fin de seleccionar las células de tallo embrionario altamente proliferativas en seguida de la remoción progresiva de las células alimentadoras, monitoreamos la velocidad de división mediante conteo de células, la apariencia encontraste de fases de las células, así como el grado de confluencia que alcanzan antes de iniciar la formación de los cuerpos embrioides con un número definido de células. Ya se ha reportado la presencia de células gliales radiales en los cuerpos embrioides no disociados, utilizando ya sea células de tallo embrionario, o bien células de carcinoma embrionario P19 (referencia 35). Cuando se aplicaron los cuerpos embrioides sobre un sustrato de polilisina, se pudieron observar células alargadas que migraban radialmente, alejándose de los cuerpos embrioides, y se transformaban progresivamente en astrocitos (referencia 35). La identificación de las células que obtuvimos mediante la disociación de los cuerpos embrioides, se basa en su morfología y en su cuantificación en el teñido con los anticuerpos RC2, BLBP, y Pax-6. Anteriormente se ha demostrado que este conjunto de marcadores es expresado por las células gliales radiales en la corteza (referencias 11, 16). Se debe observar el hecho de que no todas las células gliales radiales expresan Pax-6. En particular, aquéllas localizadas en la eminencia gangliónica, no expresan Pax-6, y no son neurogénicas (referencia 11). Es interesante que recientemente se ha demostrado que la adición de ácido retinoico a los cuerpos embrioides conduce a la inducción del antagonista de señalización de Wnt, sFRP2 (referencia 36). Entonces es concebible que la inhibición de la señalización de Wnt por parte de las moléculas presentes en el cerebro anterior en desarrollo, hace que las células adopten un fenotipo de células gliales radiales. El patrón de expresión espacial y temporal de sFRP1 es compatible con esta vista (referencia 37). Bajo nuestras condiciones in vitro, es crucial la adición del ácido retinoico (referencia 38). Aunque después de 4 días de tratamiento con ácido retinoico virtualmente todas las células expresan Pax en los cuerpos embrioides, no se pudieron observar células positivas para Pax-6 en ausencia de ácido retinoico, y no se obtuvieron neuronas en seguida de la disociación de los cuerpos embrioides no tratados. Aunque parece poco probable que el ácido retinoico tenga un papel fisiológico sobre la inducción de Pax-6 en la corteza en desarrollo, éste puede bien ser el caso en otras partes del sistema nervioso central en desarrollo. En realidad, aunque Pax-6 tiene un patrón restringido de expresión en el sistema nervioso central que incluye a la corteza cerebral, también se expresa en mucho del tubo neural ventral durante el desarrollo, y los resultados recientes sugieren que el ácido retinoico derivado de somita tiene un papel fisiológico en el patrón ventral del tubo neural (referencias 39, 40). Con respecto a los cuerpos embrioides tratados con ácido retinoico, Renoncourt y colaboradores (referencia 28) y Wichterle y colaboradores (referencia 7) también observaron que algunas células de los cuerpos embrioides eran positivas para Pax-6 en seguida del tratamiento con ácido retinoico. Sin embargo, también se observaron células positivas para Pax-7 con una abundancia similar (referencia 7), sugiriendo la heterogeneidad en la composición celular de los cuerpos embrioides tratados con ácido retinoico. Sobre un sustrato policatiónico recubierto con laminina, las células gliales radiales pierden rápidamente su morfología en forma de huso típica. Cuando se utilizan nuestras líneas de EGP-ES, observamos que el número de células fluorescentes aumentó rápidamente, y que las neuronas también fueron notoriamente similares con respecto a sus formas y al tamaño de sus cuerpos celulares. Para el cuarto día en seguida de la disociación, virtualmente todas las células ya tenían características neuronales. Al aumentar el tiempo, esencialmente todas las neuronas adoptaron una forma piramidal, y también se encontraron positivas para un transportador vesicular de glutamato. Todas las células se tiñeron en todos los tiempos sin importar su identidad. En contraste, menos del 0.1 por ciento de las células fueron claramente positivas cuando se tiñeron después de una semana en cultivo con los anticuerpos para lsl-1, hidroxilasa de tirosina, o acetil-transferasa de colina. Menos del 5 por ciento fueron positivas para vGAT después de tres semanas. La ausencia de GABA y de teñido con lsl-1 descarta un número de interneuronas y neuronas de proyección larga, incluyendo en particular las motoneuronas, muchas de las cuales también se derivan a partir de las células positivas para Pax-6 in vivo. Presumiblemente, necesita haber señales inductivas, tales como el erizo sónico presentes, para impulsar la progenie de células gliales radiales positivas para Pax-6 a lo largo de esta senda de diferenciación particular (referencia 7). El fenotipo glutamatérgico de nuestras neuronas es consistente con su identidad como neuronas piramidales corticales, como lo indica su forma. Más importante, esta indicación está en línea con la observación de que estas neuronas se derivan todas a partir de células gliales radiales. En realidad, Malatesta y colaboradores (referencia 11) demostraron recientemente que la progenie de las células gliales radiales corticales son neuronas piramidales que pueblan todas las capas corticales, así como el hipocampo. Por consiguiente, nuestras condiciones de cultivo podrían describirse como "permisivas", permitiendo un programa de diferenciación intrínseco a las células gliales radiales, para desplegarse in vitro. En línea con esto, el medio que utilizamos fue inicialmente desarrollado para soportar la sobrevivencia y la diferenciación de las neuronas piramidales aisladas a partir del hipocampo de roedor embrionario (referencia 12). Una propiedad de este medio también es la de prevenir o reprimir la multiplicación de las células, tales como los astrocitos. Se esperaría que estas células estarían presentes en nuestros cultivos, debido a que también pertenecen a la progenie de las células gliales radiales. Utilizando anticuerpos de GFÁP, observamos el desarrollo de unos cuantos astrocitos ramificados en nuestro cultivo. Sin embargo, sus números fueron muy pequeños (en el intervalo del 1 al 2 por ciento del número total de células después de tres semanas). La uniformidad relativa de nuestros cultivos neuronales nos alentó a examinarla expresión de las proteínas de membrana que se sabe que son expresadas en puntos del tiempo de desarrollo específicos. En línea con los resultados in vivo (referencia 23), encontramos que la expresión de p75 está estrechamente correlacionada con la apariencia de las neuronas en nuestros cultivos, y subsecuentemente disminuye. En contraste, aunque la expresión del receptor Trk es indetectable en los primeros puntos del tiempo, aumenta dramáticamente después de unos cuantos días, sugiriendo que las neuronas se desarrollan en sincronía. Los altos niveles de expresión del receptor Trk son una características de las neuronas piramidales in vivo (referencia 22). Los experimentos de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa sugieren que tanto TrkB como TrkC contribuyen a la señal obtenida utilizando los anticuerpos pan-Trk, mientras que la expresión de TrkA es apenas detectable después de los primeros pocos días in vitro. En contraste con los receptores p75 y Trk, la APP es claramente detectable ya dos horas después de la disociación de los cuerpos embrioides, y sus niveles aumentan durante el transcurso de la diferenciación neuronal. Esto está en línea con los resultados de los experimentos de inmunohistoquímica, que indican que la APP marca específicamente las células gliales radiales en la corteza de roedor en desarrollo (referencia 24). Materiales y Métodos Material Los ingredientes del medio de cultivo de células de tallo embrionario se obtuvieron en Gibco, el LIF fue de Chemicon, el PDL y los suministros de N2 y medio completo de Sigma. La fracción en polvo de albúmina de suero bovino V fue de Gibco. La laminina se aisló a partir de sarcoma de Engelbreth-Holm-Swarm (Roche). El ácido retinoico se obtuvo en Sigma, y no se observaron diferencias en los resultados cuando se utilizaron diferentes lotes. Anticuerpos Los anticuerpos primarios para la inmunocitoquímica fueron el anticuerpo monoclonal de ratón anti-nestina (rat401, lgG1, 1:10; Developmental Studies Hybridoma Bank, DSHB), el anticuerpo monoclonal de ratón RC2 (IgM; 1:4; DSHB), el anticuerpo policlonal de conejo anti-BLBP (1:2000; amablemente proporcionado a M. Goetz por N. Heintz, Rockefeller University, Nueva York), el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pax6 ( IgG 1 ; 1:100; DSHB), el anticuerpo monoclonal de ratón anti- tubulina III (lgG2b; 1:100; Sigma), y el anticuerpo policlonal de conejo anti-vGlut1 (1:5000; SYSY). Se utilizaron los anti-sueros acoplados con Cy2 ó Cy3 específicos de la sub-clase, como anticuerpos secundarios. Para el Western blot, utilizamos el anticuerpo monoclonal de ratón anti-sinaptofisina (lgG1; 1:1000; Sigma), el anticuerpo policlonal de conejo anti-GluR1 (1:1000, Upstate), el anticuerpo policlonal de conejo anti-Trk (C-14, sc-11; 1:1000, Santa Cruz), el anticuerpo policlonal de conejo anti-APP (1:3000; amablemente proporcionado por P. Paganetti, Novartis, Basilea), y el anticuerpo policlonal de conejo anti-p75 (1:2000, Promega). Medio Medio de tallo embrionario (500 mililitros): DMEM 410 mililitros. FCS 75 mililitros (inactivado por calor a 55°C en 30 minutos). LIF 5 mililitros. Glutamina 5 mililitros. Aminoácidos 5 mililitros. no esenciales. ß-MeOH 5 microlitros.

Medio de cuerpos embrioides (500 mililitros): DMEM 440 mililitros. FCS 50 mililitros. Glutamina 5 mililitros. Aminoácidos 5 mililitros. no esenciales. ß-MeOH 5 microlitros. Medio de N2: DMEM 5 mililitros. Glutamina 1.25 mililitros. F-12 125 mililitros. (Gibco #21765029). Insulina 1.25 mililitros 25 microgramos/mililitro. Transferrina 6.25 mililitros 50 microgramos/mililitro. Progesterona 0.25 mililitros 6 nanogramos/mililitro. Putrescina 0.25 mililitros 16 microgramos/mililitro. Selenita de 25 microlitros 30 nM. sodio. Albúmina de suero 1.25 mililitros 50 microgramos/mililitro bovino. P/S 2.5 mililitros 1 por ciento. P/S representa el antibiótico, por ejemplo penicilina/estreptomicina. Se puede excluir opcionalmente del medio de la presente, y puede ser reemplazado por un volumen equivalente de DMEM.

Soluciones de suministro para el medio de N2: BSA Gibco #A-9418, Fracción en Polvo V 100 gramos. Alícuotas de 10 miligramos/mililitro almacenadas a -20°C. Concentración final: 50 microgramos/mililitro. Insulina Sigma I-6634, 100 miligramos. Solución de suministro de 5 miligramos/mililitro en H20 (acidificada con 1 gota de HCI concentrado hasta un pH de 2, para disolver la insulina). Almacenada a -80°C. Transferrina Sigma #T-1147, apo-transferrina humana, 100 miligramos. Solución de suministro de 2 miligramos/mililitro en H20. Almacenada a -80°C. Progesterona Sigma #P-8783, 5 gramos. Solución de suministro de 2 mM en EtOH almacenada a -80°C. Solución de procesamiento en una dilución de 20 µ? de solución de suministro en H20 almacenada a -80°C. Putrescina Sigma #P-5780. Solución de suministro de 100 µ? en H20 almacenada a -80°C. Selenita de sodio Sigma #S-5261, 25 gramos. Solución de suministro de 300 µ? en H20 almacenada a 4°C.

Medio Completo: Soluciones acuosas: L-alanina (Sigma #A-7627) [Solución de suministro 2 Mg/ml de 2 miligramos/mililitro] Biotina (Sigma #B-4501) [Solución de suministro 0.1 pg/ml de 0.1 miligramos/mililitro] L-carnitina (Sigma #C-0283= [2 miligramos/ 2 Mg/ml mililitro] Etanolamina (Sigma #E-9508) [1 miligramo/ 1 pg/ml mililitro) D+-galactosa (Sigma #G-0625) [15 miligramos/ 15 pg/ml mililitro] L-prolina (Sigma 3P-0380) [7.76 miligramos/ 7.76 Mg/ml mililitro) Putrescina (Sigma P-7505) [16.1 miligramos/ 16.1 MQ/ml mililitro] Piruvato de Na (Sigma #P-5280) [25 miligramos/ 25 Mg/ml mililitro] Selenita de Na (Sigma #V-2876) [0.34 miligramos/ 0.016 Mg ml mililitro] Vitamina B12 (Sigma #V-2876) [0.34 miligramos/ 0.34 Mg/ml mililitro] Sulfato de zinc (Sigma #Z-4750) [0.194 0.194 g/ml miligramos/mililitro] Catalasa (Sigma #C-40) [16 miligramos/mililitro] 16 Mg/ml Glutationa (Sigma #G-6013) [1 miligramo/mililitro] 1 pg/ml SOD (Sigma #S-2515) [2.5 miligramos/mililitro] 2.5 Mg/ml Soluciones etanólicas: Ácido linoleico (Sigma #L-1376) [100 miligramos/ 1 g/mi mililitro] Ácido linolénico (Sigma #L-2376) [100 miligramos/ 1 pg/ml mililitro] Progesterona (Sigma #P-8783) [0.63 mg/ml] 6.3 ng/ml Retinol todo trans (Sigma #R-7632) [10 100 ng/ml miligramos/mililitro] Acetato de retinilo (Sigma #R-7882) [10 100 ng/ml miligramos/mililitro] Tocoferol (Sigma #T-3251) [100 miligramos/ 1 g/ml mililitro] Acetato de tocoferol (Sigma #T-3001) [100 1 9/rnl miligramos/mililitro] Disolver: Albúmina de suero bovino 1 gramo. Transferrina miligramos Insulina 1.6 miligramos. Glutamina 2 mM. P/S (opcional) 1 por ciento. en 400 mililitros de DMEM, y agregar las soluciones anteriores. Cultivo de células de tallo embrionario Inicialmente se cultivan las células de tallo embrionario sobre células alimentadoras consistentes en fibroblastos de embrión de ratón inactivados por mitomicina durante cuando menos dos pasos después de la descongelación. Para los siguientes pasos, las células de tallo embrionario se cultivaron sin células alimentadoras, y la diferenciación se pudo iniciar ya sea inmediatamente después de cuando menos dos pasos sin células alimentadoras, o a partir de los suministros congelados de células de tallo embrionario sin alimentador. Los suministros utilizados para la diferenciación se pasaron cuando menos dos veces antes de iniciar el procedimiento. Después del cultivo de las células de tallo embrionario sobre las células alimentadoras, fue importante el primer paso sin alimentadoras. La diferenciación de éxito dependió de la densidad de las células de tallo embrionario utilizadas para este primer paso. Las células de tallo embrionario deben ocupar cuando menos una tercera parte del plato un día después de la división. El medio de tallo embrionario se basó en DMEM conteniendo suero fetal de becerro al 15 por ciento (específicamente probado para el cultivo de células de tallo embrionario, seguido por la diferenciación neuronal), LIF (1,000 Unidades/mililitro), aminoácidos no esenciales, y ß-mercaptoetanol. Los platos de cultivo celular siempre se recubrieron con una solución de gelatina al 0.2 por ciento durante cuando menos 10 minutos. Se encontró que la temperatura de incubación es un factor importante, debido a que la diferenciación neuronal no tenía éxito arriba de 37°C. Las células de tallo embrionario se mantuvieron a una temperatura máxima de 37°C en una atmósfera de C02 al 7 por ciento/aire. Todos los medios se calentaron previamente a 37°C. Las células de tallo embrionario se dividieron cada dos días con densidades de aplicación de entre 1.5 x 106 y 4 x 106 células sobre platos de cultivo celular de 10 centímetros (Corning). Después de 2 días, se pueden recuperar entre 10 y 25 x 106 células, y el alto índice de proliferación es una condición necesaria para el éxito del experimento. Las células tienen que estar en una fase de rápido crecimiento, y tienen que formar una monocapa plana. La división de las células se hace mediante dos lavados con suero regulado con fosfato e incubación de las células con una película delgada de solución de tripsina (1 x solución de tripsina Gibco - al 0.05 por ciento en EDTA al 0.02 por ciento) a 37°C, con C02 al 7 por ciento durante 3 minutos; los platos se pueden agitar manualmente, y las células se desprenderán y volverán a suspenderse en un medio de tallo embrionario fresco pasándolas por pipeta hacia arriba y hacia abajo (inactivación de tripsina). Sigue la centrifugación durante 5 minutos a 1,000 revoluciones por minuto, y a temperatura ambiente. El gránulo se vuelve a suspender nuevamente en el medio de tallo embrionario fresco pasándolo por pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces. Las células deben disociarse hasta un cultivo de una sola célula, aunque puede haber agregados de 2 a 3 células presentes; no se deben presentar grumos más grandes. La cantidad deseada de células se vuelve a aplicar sobre los platos recubiertos de gelatina. Con el fin de privar a las células de tallo embrionario de las alimentadoras, se pueden cultivar después de descongelarse aproximadamente dos veces sobre las alimentadoras, y luego se llevarán a cabo cuando menos dos pasos sin células alimentadoras, de tal manera que lleguen a diluirse los fibroblastos. De esta manera, la célula de tallo embrionario cambia desde una forma de tipo colonia hasta una morfología plana. La descongelación de las células de tallo embrionario involucra descongelar un frasco de suministro de aproximadamente 3 x 106 células de tallo embrionario rápidamente, volver a suspender las células en 10 mililitros del medio de tallo embrionario, y centrifugar durante 5 minutos a 1,000 revoluciones por minuto, y a temperatura ambiente. El gránulo celular se vuelve a suspender en el medio de tallo embrionario nuevamente, y se aplica la cantidad de células a un plato de cultivo celular de 6 centímetros. La congelación de las células de tallo embrionario se hace volviendo a suspender las células cuando se dividen después de la tripsinación y centrifugación en el medio de tallo embrionario + sulfóxido de dimetilo al 10 por ciento. Protocolo de diferenciación neuronal Para la formación de los cuerpos embrioides, se aplicaron 3 x 106 células de tallo embrionario sobre platos bacterianos no adherentes (Greiner) en 15 mililitros del medio de cuerpos embrioides (el medio de tallo embrionario sin LIF y solamente suero fetal de becerro al 10 por ciento), y se incubaron durante 8 días. El medio de cambió cada dos días mediante la remoción del cultivo celular total del plato bacteriano (en un tubo Falcon de 50 mililitros), y dejando que se asentaran los cuerpos embrioides (de aproximadamente 3 a 5 minutos). Luego se succionó cuidadosamente el sobrenadante, y se recuperaron los cuerpos embrioides en 15 mililitros del medio de cuerpos embrioides nuevamente. Los cuerpos embrioides deben volverse a suspender cuidadosamente en el medio pasándolos por pipeta, utilizando una pipeta con una abertura suficientemente ancha para evitar dañar o disociar los cuerpos embrioides (por ejemplo, pipeta de plástico de 10 mililitros). Se agregó ácido retinoico (Sigma), 5 µ?, después de 4 días, directamente al plato, y se dispersó agitando el plato suavemente. El ácido retinoico no debe dejarse demasiado tiempo bajo la luz, debido a que es sensible a la luz. Los cuerpos embrioides se disociaron entonces, y las células se aplicaron sobre los platos recubiertos con PDL/Laminina, como sigue. Los platos de cultivo celular se recubrieron con una solución de 10 microgramos/mililitro de solución PDL en regulador de borato (150 mM, pH de 8.4), y se colocaron durante la noche (37°C, C02 al 7 por ciento) en la incubadora. También se utilizó poli-ornitina en 100 microgramos/mililitro con resultados similares. Después del lavado de los platos tres veces con suero regulado con fosfato (H20 en el caso de la poli-ornitina), se agregó directamente la laminina (aproximadamente 0.5 microgramos/centímetro cuadrado) a la solución de suero regulado con fosfato, y los platos se regresaron a las incubadoras durante cuando menos 2 horas. Después de 8 días de formación de cuerpos embrioides, los cuerpos embrioides se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato, y se tripsinizaron incubándolos durante 3 minutos en un baño de agua a 37°C, en una solución de tripsina al 0.05 por ciento, en EDTA al 0.04 por ciento/suero regulado con fosfato (recién preparado con polvo de tripsina, tratado con TPCK, Sigma). Durante el tiempo de incubación, el tubo Falcon se debe agitar con cuidado manualmente un par de veces, y se puede ver fácilmente la desintegración de los cuerpos embrioides. Entonces los cuerpos embrioides disociados se volvieron a suspender suave pero completamente en 10 mililitros de medio de cuerpos embrioides conteniendo al suero para la inactivación de tripsina. La disociación se puede hacer pasando por pipeta hacia arriba y hacia abajo aproximadamente cinco veces. La mejor trituración fue mediante una pipeta Pasteur de orilla lisa/en flama con un pequeño volumen (aproximadamente 1.5 mililitros) dos veces, y luego con una pipeta de plástico de 5 mililitros. La trituración fue seguida por 5 minutos de centrifugación a 1,000 revoluciones por minuto y a temperatura ambiente. Entonces se removió enteramente el sobrenadante, se volvió a suspender el gránulo en el medio de N2, y la suspensión celular se filtró a través de un cernidor de células de nylon de 40 mieras (Falcon). La laminina se removió de los platos recubiertos, e inmediatamente se agregó la suspensión celular, sin permitir que se secaran los platos. Las células disociadas se colocaron a una densidad de 1.5 x 105 células/centímetro cuadrado. El medio de N2 se cambió después de 2 horas, y nuevamente después de 1 día. Después de 2 días, el medio fue reemplazado por el medio sin suero enriquecido descrito por Brewer y Cotman (referencia 12), con la modificación de que se omitieron el glutamato, el HEPES, la corticosterona, el ácido lipoico y el T3. Continúa la diferenciación neuronal, y los cultivos neuronales se pueden mantener durante varias semanas. Inmunocitoquímica Se prepararon portaobjetos de vidrio lavándolos en agua e incubándolos en ácido nítrico al 65 por ciento durante 1 a 2 días. Subsecuentemente, se pusieron a flotar en H20 durante varias horas, se enjuagaron en etanol, se secaron al aire, y se esterilizaron bajo luz ultravioleta. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 por ciento (PFA) durante 10 minutos, se lavaron en suero regulado con fosfato, y se bloquearon durante hora en regulador de bloqueo (carragenano al 0.03 por ciento, NGS al 10 por ciento, Tritón X-100 al 0.3 por ciento). El montaje se hizo en AquaPoly/Mount (Polysciences). Western Blot Los cuerpos embrioides disociados se aplicaron como se indica anteriormente, y se recolectaron las muestras para los Western Blots en los puntos del tiempo indicados. Los platos se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato helado antes de cosecharse. Se prepararon extractos de células enteras en 750 microlitros de regulador de lisis para un plato de 6 centímetros (Tris 50 mM, pH de 7.4, NaCI 150 mM, glicerol al 10 por ciento, Tritón X-100 al 1 por ciento) complementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche). Después de la centrifugación durante 30 minutos a 4,200 revoluciones por minuto en un centrífugo Eppendorf, se removió el sobrenadante, y se determinó el contenido de proteína mediante el Ensayo de Proteína DC (BioRad). Las muestras se hirvieron en regulador de Laemmli, y se cargaron 5 microgramos sobre geles de poliacrilamida. Las manchas se bloquearon con una solución de leche al 5 por ciento, y la incubación fue durante la noche con el anticuerpo primario y 2 horas con el anticuerpo secundario. La detección se llevó a cabo con ECL Plus (Amersham). Referencias 1. Evans, M. J. y Kaufman, M. H. Nature 292, 154-156 (1981). 2. Martin, G. R. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78, 7634-7638 (1981). 3. Stavridis, M. P. y Smith, A. G. Biochem. Soc. Trans. 31, 45-49 (2003). 4. Rathjen, J. y Rathjen, P. D. , Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 587-594 (2001). 5. Chung, S. y colaboradores, Eur. J. Neurosci. 16, 1829-1838 (2002). 6. Kawasaki, H. y colaboradores, Neuron. 28, 31-40 (2000). 7. Wichterle, H. y colaboradores, Cell 110, 385-397 (2002). 8. Kondo M. y colaboradores, Annu. Rev. Immunol. 21, 759-806 (2003). 9. Lendahl, U., Zimmerman, L. B. y McKay, R. D. Cell 60, 585-595 (1990). 10. Li, M. y colaboradores, Curr. Biol. 8, 971-974 (1998). 11. Malatesta, P. y colaboradores, Neuron 37, 751-764 (2003). 12. Brewer, G. 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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para inducir la diferenciación de las células de tallo embrionario (ES) en células precursoras o progenitoras neuronales, el cual comprende: cultivar células de tallo embrionario; formar cuerpos embrioides (EBs); poner en contacto los cuerpos embrioides con ácido retinoico (RA); y disociar los cuerpos embrioides, para producir un cultivo de células precursoras neuronales, en donde la formación de los cuerpos embrioides comprende seleccionar las células de tallo embrionario altamente proliferativas, y aplicar estas células en una densidad medida para formar los cuerpos embrioides.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las células se aplican en una densidad de entre aproximadamente 0.5 x 105 y 5 x 105 por mililitro.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la formación de los cuerpos embrioides comprende aplicar las células de tallo embrionario en una densidad de entre aproximadamenté 2.5 x 105 y 3.5 x 105 células por mililitro.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, la reivindicación 2, o la reivindicación 3, en donde los cuerpos embrioides se mantienen en un cultivo no adherente hasta la disociación de las células de cuerpos embrioides.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende observar la morfología de las células de tallo embrionario, y seleccionar las células de tallo embrionario morfológicamente homogéneas para la formación de los cuerpos embrioides.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el método comprende seleccionar las células de tallo embrionario que tengan una o más de las siguientes características morfológicas: crecimiento en una monocapa plana; las células vecinas no están en contacto directo unas con otras; núcleos grandes; muchos nucléolos; las células no crecen unas encima de otras o en forma de tipo colonia.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende determinar el estado de proliferación de las células de tallo embrionario, y seleccionar las células altamente proliferativas para la formación de los cuerpos embrioides.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cultivo de las células de tallo embrionario comprende el paso de las células de tallo embrionario en ausencia de células alimentadoras.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el cultivo de las células de tallo embrionario comprende el paso mediante la aplicación de las células de tallo embrionario en una densidad de entre aproximadamente 0.5 y 2 x 105 células por centímetro cuadrado, y disociar las células de tallo embrionario dos días después de la aplicación.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el paso se repite cuando menos dos veces en ausencia de células alimentadoras.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende disociar las células de tallo embrionario para formar una suspensión de células individuales, en donde menos de aproximadamente el 5 por ciento de las células en la suspensión forman agregados de cuatro o más células, y se aplican las células para formar cuerpos embrioides.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la disociación de los cuerpos embrioides comprende disociar las células de cuerpos embrioides con tripsina para formar una suspensión de células de cuerpos embrioides disociadas, y luego filtrar la suspensión para remover los grumos de células.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde las células de cuerpos embrioides disociadas se filtran a través de una malla de aproximadamente 40 mieras.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende almacenar las células de cuerpos embrioides disociadas, mediante la congelación de las células.

15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende además aplicar y cultivar las células de cuerpos embrioides disociadas para producir neuronas, y opcionalmente cultivas las neuronas.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde las células de cuerpos embrioides disociadas se aplican en una densidad de entre aproximadamente 0.5 x 105 y 2.5 x 105 células por centímetro cuadrado.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde las células de cuerpos embrioides disociadas se aplican en una densidad de entre aproximadamente 1 x 105 y 1.5 x 105 células por centímetro cuadrado.

18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, el cual comprende cambiar el medio de cultivo de las células de cuerpos embrioides disociadas, entre aproximadamente 1 y 6 horas después de aplicar las células de cuerpos embrioides disociadas.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, el cual comprende cambiar el medio de cultivo entre aproximadamente 1 y 3 horas después de la aplicación.

20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en donde las células de cuerpos embrioides disociadas o neuronas, no se cultivan en la presencia de suero.

21. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde las células precursoras o progenitoras neuronales, o las células neuronales, no se cultivan en la presencia de factores de crecimiento.

22. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en donde las células precursoras o progenitoras neuronales, o las células neuronales, no se cultivan en un medio neurobasal.

23. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método no incluye un paso de selección negativa.

24. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células de tallo embrionario son células de tallo embrionario no humanas.

25. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende identificar cuando menos el 80 por ciento de las células de cuerpos embrioides disociadas como células precursoras o progenitoras neuronales.

26. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, el cual comprende identificar cuando menos el 99 por ciento de las células de cuerpos embrioides disociadas como células precursoras o progenitoras neuronales.

27. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, el cual comprende identificar cuando menos el 80 por ciento de las células como neuronas.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 27, el cual comprende identificar cuando menos el 90 por ciento de las células como neuronas.

29. Un método de ensayo, el cual comprende determinar una o más características de células precursoras o progenitoras neuronales o de células neuronales.

30. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la característica o las características son una o más de crecimiento neurítico o elongación/degeneración de neuritas, forma neuronal, muerte celular neuronal, neurogénesis, diferenciación neuronal, actividad eléctrica, sinaptogénesis, y/o marcadores de células neuronales.

31. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 29 ó con la reivindicación 30, en donde las células se producen mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

32. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 31, el cual comprende: inducir la diferenciación de las células de tallo embrionario en células precursoras o progenitoras neuronales o células neuronales, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28; y determinar una o más características de las células precursoras o progenitoras neuronales o células neuronales, bajo una condición de prueba.

33. Un método de ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, el cual comprende: cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales, bajo una primera condición; cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales, bajo una segunda condición; determinar o cuantificar una o más características neuronales de las células; y comparar una o más características neuronales de las células cultivadas bajo la primera condición, con la misma característica o características neuronales de las células cultivadas bajo la segunda condición, respectivamente.

34. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la característica neuronal es la elongación de las neuritas, y en donde el método comprende: cuantificar los niveles de expresión de una proteína específica de neuritas; y comparar los niveles de expresión de la proteína específica de neuritas; en donde un nivel más alto de expresión bajo la primera condición indica que la primera condición aumenta la elongación de las neuritas.

35. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la característica neuronal es la degeneración de las neuritas, y en donde el método comprende: cuantificar los niveles de expresión de una proteína específica de neuritas; y comparar los niveles de expresión de la proteína específica de neuritas; en donde un nivel más bajo de expresión bajo la primera condición indica que la primera condición aumenta la degeneración de las neuritas.

36. Un método para identificar un agente que inhiba o reduzca el aumento en la degeneración de las neuritas producidas mediante un compuesto que se sepa que aumenta la degeneración de las neuritas, el cual comprende: cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales o las células neuronales en la presencia de un agente de prueba y bajo una condición que se sepa que aumenta la degeneración de neuritas; cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales, o las células neuronales, en ausencia del agente de prueba, y bajo una condición que se sepa que aumenta la degeneración de neuritas; cuantificar o determinar los niveles de degeneración de neuritas en la presencia y en ausencia del agente de prueba; y comparar los niveles de degeneración de neuritas en la presencia del agente de prueba, con los niveles de degeneración de neuritas en ausencia del agente de prueba; en donde un nivel más bajo de degeneración de neuritas en la presencia del agente de prueba, comparándose con la ausencia del agente de prueba, indica que el agente inhibe o reduce el aumento en la degeneración de neuritas producido por, o asociado con, la condición.

37. Un método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde se cuantifican los niveles de degeneración de neuritas mediante la cuantificación de los niveles de expresión de una proteína específica de neuritas, en donde un nivel más alto de expresión de una proteína específica de neuritas en la presencia del agente de prueba, comparándose con la ausencia del agente de prueba, indica que el agente de prueba inhibe o reduce el aumento en la degeneración de las neuritas, producido por, o asociado con, la condición.

38. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la característica neuronal es la muerte celular neuronal, y en donde el método comprende: cultivar las neuronas bajo una primera condición; cultivar las neuronas bajo una segunda condición; cuantificar o determinar la muerte celular neuronal de las células cultivadas bajo la primera y bajo la segunda condición; y comparar los niveles de muerte celular neuronal bajo la primera condición, con los niveles de muerte celular neuronal bajo la segunda condición; en donde un nivel más alto de muerte celular neuronal bajo la primera condición, comparándose con aquél bajo la segunda condición, indica que el compuesto aumenta la muerte celular; y/o en donde un nivel más bajo de muerte celular neuronal bajo la primera condición, comparándose con aquél bajo la segunda condición, indica que la condición reduce la muerte celular neuronal.

39. Un método de ensayo de acuerdo con la reivindicación 38, en donde las neuronas expresan la neurotrofina p75 y/o una proteína apoptótica.

40. Un método para identificar un agente que inhiba o reduzca el aumento en la muerte celular neuronal producido por una condición que se sepa que aumenta la muerte celular neuronal, el cual comprende: cultivar neuronas en la presencia de un agente de prueba y bajo una condición que se sepa que aumenta la muerte celular neuronal; cultivar neuronas en la ausencia del agente de prueba y bajo la condición que se sepa que aumenta la muerte celular neuronal; cuantificar o determinar los niveles de muerte celular neuronal en la presencia y en ausencia del agente de prueba; y comparar los niveles de muerte celular neuronal en la presencia del agente de prueba, con los niveles de muerte celular neuronal en ausencia del agente de prueba; en donde un nivel más bajo de muerte celular neuronal en la presencia del agente de prueba, comparándose con aquél en ausencia del agente de prueba, indica que el agente inhibe o reduce el aumento en la muerte celular neuronal producido por la condición.

41. Un método de ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, 38 y 39, en donde el cultivo bajo la primera condición comprende cultivar en la presencia de un compuesto de prueba, o exponer a las células a un compuesto de prueba, y en donde el cultivo bajo la segunda condición comprende cultivar en ausencia del compuesto de prueba, o no exponer a las células a un compuesto de prueba.

42. Un método de ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 á 31, para identificar un marcador que indique el estado de diferenciación de una célula, el cual comprende: inducir la diferenciación de las células de tallo embrionario para producir células precursoras o progenitoras neuronales; y/o cultivar las células precursoras o progenitoras neuronales para producir neuronas; comparar los niveles de expresión de las proteínas en las células en una etapa de diferenciación, con los niveles de expresión de las proteínas en las células en una segunda etapa de diferenciación; e identificar las proteínas cuyo nivel de expresión difiera en las células en las primera y segunda etapas de diferenciación; en donde una diferencia en los niveles de expresión indica que la proteína se puede utilizar como un marcador para indicar el estado de diferenciación de la célula.

43. Un método de ensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en donde la característica neuronal es la sinaptogénesis, y en donde el método comprende medir la actividad electrofisiológica de las células, y/o detectar o medir la expresión de uno o más marcadores que indique la sinaptogénesis.

44. Un método que comprende: proporcionar un primero y un segundo cultivo de células neuronales o de células precursoras o progenitoras neuronales, en donde las células del primer cultivo tienen un genotipo diferente de las células del segundo cultivo; y comparar las células precursoras o progenitoras neuronales o neuronas del primer cultivo, con las células precursoras o progenitoras neuronales o neuronas del segundo cultivo.

45. Un método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde las células del primer cultivo contienen una mutación en un gen de interés, y las células del segundo cultivo no tienen la mutación.

46. Un método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde las células del primer cultivo contienen un gen introducido, y las células del segundo cultivo no contiene al gen introducido.

47. Un método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde las células del primer cultivo sobre-expresan un gen endógeno, y las células del segundo cultivo no sobre-expresan al gen endógeno.

48. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 47, el cual comprende inducir la diferenciación de las células de tallo embrionario en las células precursoras o progenitoras neuronales o en las células neuronales, de acuerdo con un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

49. Un método de acuerdo con la reivindicación 48, en donde, en el primer cultivo, las células de tallo embrionario contienen una mutación en un gen de interés, y en el segundo cultivo, las células no contienen la mutación.

50. Un método de acuerdo con la reivindicación 48, el cual comprende transfectar un primer cultivo de cuerpos embrioides disociados con una construcción de ácido nucleico, y de esta manera cambiar el genotipo de las células del primer cultivo, comparándose con las células del segundo cultivo.

51. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50, el cual comprende además: cultivar los primero y segundo cultivos de células precursoras o progenitoras neuronales o de células neuronales, bajo una condición de prueba; detectar, cuantificar, observar, o determinar una o más características neuronales de las células; y comparar las características neuronales de las células en el primer cultivo, con las características neuronales de las células en el segundo cultivo.

52. Un método de acuerdo con la reivindicación 51, en donde el cultivo bajo la primera condición comprende cultivar las células en la presencia del péptido ?ß, y en donde el cultivo de las células bajo la segunda condición comprende cultivar las células en ausencia del péptido ?ß.

53. Un método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde la característica neuronal es la degradación de las neuritas.

54. Un método sustancialmente como se describe en la presente.