JP2007535957A - Es細胞からの神経細胞分化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、インビトロにおける、多能性細胞、特にES細胞からのニューロンの前駆もしくは祖先細胞、またはニューロンの生成に関する。
ES細胞を培養すること;
EB形成させること;
EBをレチノイン酸(RA)と接触させること;
EBを分離させること;および、
分離したEB細胞をプレートに播き、培養すること、
の段階を含む。
我々は、ES細胞の神経細胞への分化を最適化して、定義された神経細胞系譜の生成および神経細胞集団の均一性に関して驚くべき利点をもたらすことができる手段を見出した。従って、本発明は、ES細胞から神経細胞をインビトロで生成させるための、ES細胞のニューロンまたはニューロン前駆もしくは祖先細胞への発生および/または分化を誘導および/または促進する改良された方法を提供する。
本発明は、神経細胞、例えばニューロンおよび/またはニューロン前駆/祖先細胞の作成または生成方法、ES細胞のニューロン前駆または祖先細胞への分化の促進または誘導方法、および前駆または祖先細胞のニューロンへの分化または成熟化の促進または誘導方法に関する。
ES細胞を培養すること;
胚様体(EB)を形成させること;
EBをレチノイン酸(RA)と接触させること;および、
EBを分離させること;
を、以後に記載する1またはそれ以上のさらなる特徴または段階と組み合わせて含む。
分離したEB細胞をプレートに播き、それによりニューロン前駆または祖先細胞のプレート上の培養物を得ること、
を含む。
好ましくは、本方法は、フィーダー細胞(典型的には、不活性化された線維芽細胞)の非存在下でES細胞を培養することを含む。方法は、ES細胞をフィーダー細胞と共に最初に培養し、続いてフィーダー細胞なしで培養することを含み得る。フィーダー細胞は、ES細胞を繰り返し植え継ぐことにより、希釈して除去し得る。フィーダー細胞なしで、少なくとも1回、より好ましくは少なくとも2回の植え継ぎを胚様体形成の前に実施することが好ましい。従って、フィーダー細胞は、好ましくは、EB形成に使用するES細胞培養には存在しない。「植え継ぎ」は、細胞を分離し、多数の細胞を再びプレートに播くことを含む。例えば、植え継ぎは、培養ディッシュから細胞を剥離/分離すること(通常、トリプシンを使用する)、細胞の集合体の分離および数々の分離したES細胞を再びプレートに播くこと(接着培養)、およびES細胞を培養することを含み得る。
我々は、ES細胞の増殖状態がそれらの多能性に影響を与え、本方法でプレートに播いた細胞の密度が、それらの分化の能力および傾向に影響力を有することを認識した。我々は、増殖しているES細胞を制御された細胞密度で選択し、プレートに播くことにより、より多数の定義された細胞系譜を有するニューロン前駆体を入手し得、より不均一な細胞は殆ど作成されないことを見出した。
ES細胞の増殖状態(倍加時間、細胞数の増加、または任意の他の適切な尺度の決定により測定または評価し得る);
ES細胞の形態;および/または
EB形成のためにプレートに播くES細胞の数または密度、
を測定、評価、観察または決定することを含む。
これらの点の各々は、下記でより詳細に論ずる。
増殖性の高い細胞は、本明細書に記載する通り、特定の培養方法により作成される細胞であり得る。我々は、ES細胞の増殖状態は、ES細胞の培養方法により変動し得ることを見出した。
ES細胞を、細胞約0.3x105ないし4x105個/cm2、例えば、細胞約0.5ないし2x105個、好ましくは約1x105個/cm2の密度でプレートに播く;そして、
プレートに播いた2日後にES細胞を回収/分離し、場合により再びプレートに播く。
EB形成に使用するES細胞は、好ましくは、形態学的に均一であり、全てまたは実質的に全てのES細胞が同じまたは類似の形態学的特徴を有する。
EB形成のために、かくして生成された増殖性の高い細胞および/または形態学的に均一な細胞を、通常、細胞約0.5x106ないし5x106個/EB形成用培養培地15ml、好ましくは培地15ml中に細胞2.5−2.5x106個、例えば細胞3x106個を使用して、プレートに播くべきである。通常、細胞約0.3ないし3.5x105個ml−1、好ましくは細胞1.6−2.5x105個ml−1、最も好ましくは細胞2x105個ml−1をプレートに播くべきである。通常、10cmのプレートで、15mlの培地が好ましい体積であるが、10mlまたは10ないし15mlを使用できる。
本発明の方法では、一般的に、細胞の分離は、好ましくは細胞(ES細胞またはEB)を分離して、実質的に2個または3個の細胞の集合体を欠く、単一の細胞の懸濁液を形成することを含む。好ましくは、懸濁液は、完全に単一に分離された細胞からなるものである(即ち、懸濁液は細胞の集合体を有さない)。好ましくは、90%、95%、98%または99%より多い懸濁液中の細胞が、単一に分離されている。好ましくは、懸濁液中の5%より少ない細胞が、4個またはそれ以上の細胞の集合体を形成している。
EBは、懸濁培養で培養し、次いで、EB細胞を分離し、分離したEB細胞の懸濁液を作成する。通常、EBを8日後に、即ち、EB形成用に細胞をプレートに播いてから8日目に、または、RA添加の4日後に、分離する。分離は、これより早くても遅くてもよいが、通常、RA添加の3ないし5日後である。当業者は、分離に最適な時期を実験により決定できる。
本発明の方法は、分離したEB細胞を保存すること、例えば、細胞を液体窒素中で凍結することを含み得る。例えば、保存は、細胞を遠心分離し、遠心分離後の細胞をEB培地+10%DMSOに再懸濁し、細胞を液体窒素中で凍結することを含み得る。従って、いくつかの実施態様では、本方法は、EBを分離し、分離したEB細胞を保存することを含む。かくして、神経前駆体の便利で容易な供給を達成し得る。
EB細胞をプレートに播く態様において、我々は、EB細胞をプレートに播く密度が、細胞の生存および分化に重要であることを見出した。プレートに薄く播きすぎると細胞の生存率を低下させ、一方、プレートに濃く播きすぎると分化速度に悪影響を与える。プレートに播く密度は、培養の純度、即ち、非ニューロン細胞の量対ニューロン細胞の量にも影響を与える。好ましくは、分離したEB細胞約0.5x105個ないし2.5x105個/cm2、例えば細胞約1ないし2x105個、最も好ましくは約1ないし1.5x105個/cm2を、プレートに播くべきである。
我々は、分離したEB細胞をプレートに播いた約2時間後に培養培地を交換すると、細胞生存率の顕著な、大幅な上昇を達成できることを観察した。この知見は、当分野で今まで稀であった、長期のニューロンの培養をもたらす可能性を開く。
分離したEB細胞は、好ましくはN2培地中でプレートに播く。
2日後、好ましくは、「完全培地」(実施例参照)などのニューロンの分化に適する培地に、培地を交換する。培地の選択および組成は、所望のニューロンの系譜に依存し得る。例えば、ここで使用する完全培地は、ブリューワー(Brewer)の培地を基礎とし、錐体ニューロンの発生を促進するように設計された。他の培地または因子、例えばコリン作動性運動ニューロンをもたらすShh(ソニックヘッジホッグ)を選択して、異なるニューロンの系譜を支持し得る。
胚性幹細胞は、哺乳動物の胚盤胞の内側細胞塊から単離される多能性幹細胞である。本発明で使用する胚性幹細胞は、ヒトまたは非ヒト、例えばモルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウマまたは霊長類、例えばサル由来であり得る、任意の哺乳動物に由来し得る。典型的には、マウスのES細胞を使用する。
選択手順、例えばSox2選択を可能にするように設計されたES細胞を使用し得る。
本明細書で使用するとき、神経細胞は、神経系の細胞であり、文脈で断りのない限り、神経幹細胞、ニューロン前駆または祖先細胞、およびニューロン(ニューロン細胞)を含む。用語「ニューロン」および「ニューロン細胞」は、互換的に使用する。
本発明の方法は、好ましくは、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%の細胞が、ニューロン前駆/祖先細胞、例えば放射状膠細胞、またはニューロン、例えば錐体ニューロンである、細胞集団を作成する。方法は、好ましくは、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の細胞を、ニューロン前駆/祖先細胞、例えば放射状膠細胞、またはニューロン、例えば錐体ニューロンと同定することを含む。本発明のニューロン細胞の培養方法は、好ましくは、5%より少ない星状細胞、例えば4%、3%、2%または1%を有する細胞集団を作成する。
本発明の方法では、一般的に、EBを形成させ、培養培地中で培養する。EB形成および培養の間、培養培地は、典型的には2日毎に交換する。
本発明のさらなる態様は、ニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロン細胞で実施される細胞アッセイ方法を提供する。それは、通常、インビトロで生成された細胞(初代ニューロンではない)であり、好ましくは、本発明の方法により作成される細胞である。そのアッセイ方法は、ニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロンを作成するために、本明細書に記載の本発明の方法を含み得る。本発明の方法は、神経分化(ニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロンの作成)のために本明細書に記載の本発明の方法を実施することを含み得、さらに、本明細書に記載の細胞アッセイ方法の段階を含む。
従って、上記の神経分化方法を、アッセイに関して使用し得る。
従って、アッセイ方法は、関心のある特徴を増大または低減させる化合物または条件を同定し得る。
比較は、典型的には、例えば分離したEB細胞をプレートに播いた1週間後に、ニューロン細胞と実施する。
試験物質の存在下、そして、ニューロンの特徴を増加させると知られているか、またはその増加と関連する条件下で、ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞を培養すること;
試験物質の非存在下、そして、ニューロンの特徴を増加させると知られている条件下で、ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞を培養すること;
ニューロンの特徴のレベルを定量または決定すること;および、
試験物質の存在下のニューロンの特徴のレベルを、試験物質の非存在下のニューロンの特徴のレベルと比較すること;
ここで、試験物質の非存在下と比較して、試験物質の存在下で低いニューロンの特徴のレベルは、その物質が、その条件によりもたらされるか、またはそれに関連するニューロンの特徴の増加を、阻害または低減することを示す。
本発明の方法は、神経突起の増殖、神経突起の伸長または神経突起の縮退を定量することを含み得る。定量は、神経突起特異的タンパク質の発現レベルの決定を含み得る。ここで、高い発現レベルは、高いレベルの神経突起の増殖および/または神経突起の伸長、および/または低いレベルの神経突起の縮退を示し、低い発現レベルは、低いレベルの神経突起の増殖および/または神経突起の伸長、および/または高いレベルの神経突起の縮退を示す。定量は、ニューロン特異的レポーター遺伝子の発現を引き起こすか、または可能にし、レポーター遺伝子の発現レベルを測定し、それにより神経突起の増殖、神経突起の伸長または神経突起の縮退を定量することを含み得る。例えば、レポーター遺伝子がGFPなどの蛍光タンパク質をコードするとき、発現レベルの測定は、蛍光の測定を含む。本発明の方法は、ニューロンを神経突起マーカー(例えば、チューブリン、ニューロフィラメント、シナプトフィジン)に対する抗体と接触させ、マーカーへの抗体の結合を決定または定量し、それにより神経突起の伸延または伸長を検出または定量することにより、神経突起の増殖、神経突起の伸長または神経突起の縮退を定量することを含み得る。
試験物質の存在下、そして、神経突起の縮退を増加させると知られている条件下で、ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞を培養すること;
試験物質の非存在下、そして、神経突起の縮退を増加させると知られている条件下で、ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞を培養すること;
試験物質の存在下および非存在下の神経突起の縮退のレベルを定量または決定すること;および、
試験物質の存在下の神経突起の縮退のレベルを、試験物質の非存在下の神経突起の縮退のレベルと比較すること;
ここで、試験物質の非存在下と比較して、試験物質の存在下で低い神経突起の縮退のレベルは、その物質が、その条件によりもたらされるか、またはそれに関連する神経突起の縮退の増加を、阻害または低減することを示す。
ニューロンの細胞死のアッセイの必要性が当分野に存在し、かかるアッセイが本発明により提供される。
ニューロンの細胞死のアッセイは、ニューロンまたはニューロン細胞集団の、所定の条件、例えば1種またはそれ以上の化合物の存在への感受性を試験または決定するのに、例えば、ニューロンの細胞死を増加または低減させる条件(例えば化合物)を同定するのに、使用し得る。
ニューロンを第1の条件下で培養すること(「試験培養」);
ニューロンを第2の条件下で培養すること(「対照培養」);
第1および第2の条件下で、ニューロンの細胞死を定量または決定すること;および、
第1の条件下のニューロンの細胞死のレベルを、第2の条件下のニューロンの細胞死のレベルと比較すること;
ここで、第2の条件下と比較して第1の条件下で高いニューロンの細胞死のレベルは、第1の条件が細胞死を増加させることを示し;かつ/または、
ここで、第2の条件下と比較して第1の条件下で低いニューロンの細胞死のレベルは、第1の条件がニューロンの細胞死を低減させることを示す。
試験物質の存在下、そして、ニューロンの細胞死を増加させると知られている条件下で、ニューロンを培養すること;
試験物質の非存在下、そして、ニューロンの細胞死を増加させると知られている条件下で、ニューロンを培養すること;
試験物質の存在下および非存在下のニューロンの細胞死のレベルを定量または決定すること;および、
試験物質の存在下のニューロンの細胞死のレベルを、試験物質の非存在下のニューロンの細胞死のレベルと比較すること;
ここで、試験物質の非存在下と比較して、試験物質の存在下で低いニューロンの細胞死のレベルは、その物質が、その条件によりもたらされるニューロンの細胞死の増加を、阻害または低減することを示す。
本発明の方法は、神経形成またはニューロンの分化のアッセイを含み得る。このアッセイでは、ニューロンの作成もしくは生成、またはES細胞並びに/またはニューロン前駆および/もしくは祖先細胞の分化を、検出および/または定量する。本方法は、1種またはそれ以上のニューロン特異的マーカーの検出および/または定量を含み得る。本発明の方法は、選択したマーカーに応じて、1種またはそれ以上の特定のニューロンのサブタイプまたは系譜の神経形成のレベル、または、一般的なニューロンのレベルをモニターすることを含み得る。定義された系譜のニューロンの生成は、系譜特異的マーカーの検出および/または定量によりアッセイし得る。方法は、細胞を細胞マーカーに対する抗体と接触させ、結合を決定することを含み得る。ここで、マーカーの存在(そして、故に抗体の結合)は、その細胞が特定の細胞タイプ、サブタイプ、系譜またはサブリネージであることを示す。方法は、抗体結合のレベルを決定または定量し、それにより分化のレベル、その細胞の分化段階、および/または特定のタイプ、サブタイプ、系譜またはサブリネージの、または特定の分化段階での%細胞を、決定または定量することを含み得る。マーカーの検出および細胞タイプの同定の詳細は、本明細書の他の箇所に含まれ、適するマーカーは、当業者に知られている。
ニューロンの電気的活性のレベル、例えば特定のチャネル(例えばイオンチャネル)の開口を示す電気的活性を、観察、検出、決定または定量し得る。
アッセイ方法は、ニューロン細胞におけるシナプス形成を検出または定量することを含み得る。検出または定量は、細胞の電気生理学的活性の測定、および/または、シナプス形成の指標である1種またはそれ以上のマーカー、例えばシナプトフィジンの発現の検出または測定を含み得る。
本発明は、参照(通常野生型)ニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロンを、変異型ニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロンと比較する方法を提供する。これらのニューロンは、様々な遺伝子型を有する。本方法は、上記の神経細胞を生成するための方法を含み得る。
第1および第2のニューロン細胞またはニューロン前駆もしくは祖先細胞の培養を提供すること、ここで、第1の培養の細胞は、第2の培養の細胞と異なる遺伝子型を有する;および、
第1の培養のニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロンを、第2の培養のニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロンと比較すること。
本明細書で使用するとき、「抗体」は、必要な特異性のある結合ドメインを有する特異的結合物質を包含する。従って、この用語は、抗体フラグメント、誘導体、機能的均等物および抗体のホモログを包含し、天然または合成のいずれでもよい免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。従って、他のポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメインまたは均等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP−A−0120694およびEP−A−0125023に記載されている。
本明細書で言及した全文献は、出典明示により全体を本明細書の一部とする。
ES細胞の培養
ES細胞からのニューロンの生成を導く操作は、以下の通りにまとめられる次の段階を含んだ:
1.フィーダー層上で培養した細胞は、コロニーとして増殖するが、フィーダー排除後、それらは平坦な単層として増殖する。
2.非接着性細菌用ディッシュ上のES細胞は、懸濁状態で増殖する細胞集合体(EB)を形成する。
3.EB形成の4日後、RAをさらに4日間にわたり添加した。
5.全部で8日後に、EBを分離し、N2培地中、PDL/ラミニン被覆ディッシュのプレートに播いた。
6.2時間後、そして12−24時間後に再度、N2培地を交換した。この段階で、殆どの前駆細胞は、紡錘形の形態である。ニューロン分化培地を30−48時間後に添加する。
ES細胞は、均一な放射状膠細胞の集団に分化した。
EBから分離した細胞は、放射状膠細胞の形を思わせる、明確な伸びた紡錘形の形態をとる(参考文献16参照)。位相差像は、分化の2時間で二極性紡錘形態を示した。
表1
ニューロンの形態を有する細胞は、EB分離の2日後より早く現れ始めた。全ての分化細胞はGFPを発現した。このことは、それらがニューロンであることを示し、結論は、チューブリンのニューロン特異的形態を認識する抗体を使用する染色実験により支持された。
本発明のニューロン前駆細胞を、その中でそれらが運動ニューロンを含む異なる特定のニューロンの系譜に分化し得るニワトリ胚に移植することにより、それらの発生的潜在能力を試験した。
電気生理学的実験は、ニューロンがシナプスを形成し、APを示し、そして電気生理学的特徴において非常に均一であることを示した。ニューロンは主にグルタミン作動性であり(NBQXによるシナプス電流の遮断、vGAT染色により示される)、いくらかのGABA作動性入力(ビククリンによる遮断、そうでなければ培養は生存できないであろう)を伴う。電気生理学は、使用した条件下で他のニューロン細胞のタイプが存在しないことを明確に示した。
マウスのES細胞を使用して、放射状膠細胞と定義される事実上純粋なニューロン前駆体の集団の生成を導く条件を見出した。次いで、これらの細胞は、錐体細胞の特徴を有する均一なニューロンの集団の生成に至る。
材料
ES細胞培養培地の成分は Gibco から、LIFは Chemicon から、PDL並びにN2および完全培地の原液は Sigma から入手した。BSA粉末画分Vは、Gibco からであった。ラミニンは、Engelbreth-Holm-Swarm 肉腫 (Roche) から単離した。RAは、Sigma から入手し、異なるバッチを使用しても、結果に差異は観察されなかった。
免疫組織化学の一次抗体は、マウスモノクローナル抗体抗ネスチン(rat401、IgG1;1:10;Developmental Studies Hybridoma Bank, DSHB)、マウスモノクローナル抗体RC2(IgM;1:4;DSHB)、ウサギポリクローナル抗体抗−BLBP(1:2000;M. Goetz に N. Heintz, Rockefeller University, New York より親切にも提供された)、マウスモノクローナル抗体抗−Pax6(IgG1;1:100;DSHB)、マウスモノクローナル抗体抗−βチューブリンIII(IgG2b;1:100;Sigma)およびウサギポリクローナル抗体抗−vGlut1(1:5000;SYSY)であった。サブクラス特異的Cy2−またはCy−3−結合抗血清を二次抗体として使用した。ウエスタンブロット用に、我々はマウスモノクローナル抗体抗−シナプトフィジン(IgG1;1:1000;Sigma)、ウサギポリクローナル抗体抗−GluR1(1:1000;Upstate)、ウサギポリクローナル抗体抗−Trk(C−14、sc−11;1:1000;Santa Cruz)、ウサギポリクローナル抗体抗−APP(1:3000;P. Paganetti, Novartis, Basel より親切にも提供された)およびウサギポリクローナル抗体抗−p75(1:2000;Promega)を使用した。
BSA Gibco #A-9418 Powder Fraction V 100 g
10mg/mlのアリコートを−20℃で保存
最終濃度50μg/ml
原液はH2O中、5mg/ml(濃HCl1滴でpH2に酸性化し、インシュリンを溶解する)
−80℃で保存
原液は、H2O中、2mg/ml
−80℃で保存
原液は、EtOH中2mM、−80℃で保存
作業溶液は、H2O中の原液の20μM希釈、−80℃で保存
原液は、H2O中100μM、−80℃で保存
原液は、H2O中300μM、4℃で保存
最初に、ES細胞を、マイトマイシン−非活性化マウス胚線維芽細胞からなるフィーダー細胞上で、融解後少なくとも2回の植え継ぎの間培養した。続く植え継ぎでは、ES細胞をフィーダー細胞なしで培養し、フィーダー細胞なしで少なくとも2回植え継いだ直後に、または、フィーダー不含ES細胞の凍結保存物から、分化を開始させ得る。分化に使用する保存物は、手順を開始する前に少なくとも2回植え継いだ。ES細胞をフィーダー細胞上で培養した後、フィーダーなしでの最初の植え継ぎが重要であった。分化の成功は、この最初の植え継ぎに使用するES細胞の密度に依存する。ES細胞は、分割の1日後に、プレートの少なくとも3分の1を占めるべきである。ES培地は、15%FCS(ES細胞培養と続くニューロンの分化のために特別に試験したもの)、LIF(1000U/ml)、非必須アミノ酸およびβ−メルカプトエタノールを含有するDMEMを基礎とした。細胞培養プレートは、常に、0.2%ゼラチン溶液で少なくとも10分間被覆した。インキュベーションの温度は、ニューロンの分化が37℃より高くては成功しなかったので、重要な要因であることが判明した。最高温度37℃で、7%CO2/空気雰囲気中、ES細胞を維持した。全ての培地は、37℃で予熱した。
EB形成用に、ES細胞3x106個を非接着性細菌用ディッシュ(Greiner)に、EB培地(LIFなし、および10%のみのFCSのES培地)15ml中で播き、8日間インキュベートした。
ニューロンの分化は続き、ニューロンの培養を数週間維持できる。
ガラスのカバースリップを、水中で洗浄し、65%硝酸中で1ないし2日間インキュベートすることにより調製した。その後、それをH2O中で数時間浮動させ、エタノールですすぎ、空気乾燥し、UV光源下で滅菌した。細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で10分間固定し、PBS中で洗浄し、ブロッキングバッファー(0.03%カラゲナン、10%NGS、0.3% Triton X-100)中で1時間ブロックした。マウントは、AquaPoly/Mount (Polysciences) 中であった。
分離したEBを上記の通りにプレートに播き、ウエスタンブロット用のサンプルを示した時点で回収した。回収前に、氷冷PBSでプレートを2回洗浄した。6cmプレート用に、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を添加した溶解バッファー(50mM TrispH7.4、150mM NaCl、10%グリセロール、1% Triton X-100)750μl中で、細胞全体の抽出物を調製した。Eppendorf 遠心機中、30分間4200rpmで遠心分離した後、上清を取り出し、タンパク質含有量をDCタンパク質アッセイ(BioRad)で決定した。サンプルを Laemmli バッファー中で煮沸し、5μgをポリアクリルアミドゲルに載せた。ブロットを5%ミルク溶液でブロックし、インキュベーションは、一次抗体で終夜、そして二次抗体で2時間であった。検出は、ECL Plus (Amersham)で実施した。
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Claims (54)
- 胚性幹(ES)細胞のニューロン前駆または祖先細胞への分化を誘導する方法であって、
ES細胞を培養すること;
胚様体(EB)を形成させること;
EBをレチノイン酸(RA)と接触させること;および
EBを分離させてニューロン前駆細胞の培養物を作成すること;
を含み、ここで、EBを形成させることが、増殖性の高いES細胞を選択し、それらの細胞を定められた密度でプレートに播き、EBを形成させることを含むものである、方法。 - 細胞を約0.5x105個ないし5x105個/mlの密度でプレートに播く、請求項1に記載の方法。
- EBを形成させることが、ES細胞を細胞約2.5x105個ないし3.5x105個/mlの密度でプレートに播くことを含む、請求項2に記載の方法。
- EB細胞の分離まで、EBを非接着培養で維持する、請求項1、請求項2または請求項3に記載の方法。
- 該方法が、ES細胞の形態を観察し、形態学的に均一なES細胞をEB形成のために選択することを含む、請求項1ないし請求項4のいずれかに記載の方法。
- 該方法が、以下の形態学的特徴:平坦な単層での増殖;相互に直接接触せずに隣り合う細胞;大きい核;多くの仁;相互の上に増殖しない、または、コロニー様形態ではない細胞の1つまたはそれ以上を有するES細胞を選択することを含む、請求項5に記載の方法。
- 該方法が、ES細胞の増殖状態を決定し、増殖性の高い細胞をEB形成のために選択することを含む、請求項1ないし請求項6のいずれかに記載の方法。
- ES細胞を培養することが、ES細胞をフィーダー細胞の非存在下で植え継ぐことを含む、請求項1ないし請求項7のいずれかに記載の方法。
- ES細胞を培養することが、ES細胞を細胞約0.5ないし2x105個/cm2の密度でプレートに播き、プレートに播いた2日後にES細胞を分離させることにより植え継ぐことを含む、請求項1ないし請求項8のいずれかに記載の方法。
- フィーダー細胞の非存在下で少なくとも2回植え継ぎを繰り返す、請求項9に記載の方法。
- 該方法が、ES細胞を分離させて単一の細胞の懸濁液を形成させること(ここで、該懸濁液中の約5%未満の細胞が4個またはそれ以上の細胞の集合体を形成している)、および、該細胞をプレートに播いてEBを形成させることを含む、請求項1ないし請求項10のいずれかに記載の方法。
- EBを分離することが、EB細胞をトリプシンで分離させて分離したEB細胞の懸濁液を形成させ、次いで、懸濁液を濾過して細胞の塊を除去することを含む、請求項1ないし請求項11のいずれかに記載の方法。
- 分離したEB細胞を約40μmのメッシュを通して濾過する、請求項12に記載の方法。
- 分離したEB細胞を、該細胞を凍結させることにより保存することを含む、請求項1ないし請求項13のいずれかに記載の方法。
- 分離したEB細胞をプレートに播き、培養して、ニューロンを作成し、場合によりニューロンを培養することをさらに含む、請求項1ないし請求項14のいずれかに記載の方法。
- 分離したEB細胞を細胞約0.5x105ないし2.5x105個/cm2の密度でプレートに播く、請求項15に記載の方法。
- 分離したEB細胞を細胞約1x105ないし1.5x105個/cm2の密度でプレートに播く、請求項16に記載の方法。
- 分離したEB細胞の培養培地を、分離したEB細胞をプレートに播いてから約1ないし6時間後に交換することを含む、請求項15ないし請求項17のいずれかに記載の方法。
- プレートに播いてから約1ないし3時間後に培養培地を交換することを含む、請求項18に記載の方法。
- 分離したEB細胞またはニューロンを血清の存在下で培養しない、請求項15ないし請求項19のいずれかに記載の方法。
- ニューロン前駆、祖先またはニューロン細胞を増殖因子の存在下で培養しない、請求項15ないし請求項20のいずれかに記載の方法。
- ニューロン前駆、祖先またはニューロン細胞を、Neurobasal 培地中で培養しない、請求項15ないし請求項21のいずれかに記載の方法。
- 該方法が負の選択段階を含まない、請求項1ないし請求項22のいずれかに記載の方法。
- ES細胞が非ヒトES細胞である、請求項1ないし請求項23のいずれかに記載の方法。
- 分離したEB細胞の少なくとも80%をニューロン前駆または祖先細胞と同定することを含む、請求項1ないし請求項24のいずれかに記載の方法。
- 分離したEB細胞の少なくとも99%をニューロン前駆または祖先細胞と同定することを含む、請求項1ないし請求項25のいずれかに記載の方法。
- 細胞の少なくとも80%をニューロンと同定することを含む、請求項15ないし請求項22のいずれかに記載の方法。
- 細胞の少なくとも90%をニューロンと同定することを含む、請求項27に記載の方法。
- ニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロン細胞の1つまたはそれ以上の特徴を決定することを含むアッセイ方法。
- 特徴が、神経突起の増殖または神経突起の伸長/縮退、ニューロンの形、ニューロンの細胞死、神経形成、ニューロンの分化、電気的活性、シナプス形成および/またはニューロン細胞マーカーの1つまたはそれ以上である、請求項29に記載のアッセイ方法。
- 該細胞が、請求項1ないし請求項28のいずれかに記載の方法により作成されるものである、請求項29または請求項30に記載のアッセイ方法。
- 請求項1ないし請求項28のいずれかに従い、ES細胞のニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロン細胞への分化を誘導すること;および、
試験条件下でニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロン細胞の1つまたはそれ以上の特徴を決定すること、
を含む、請求項31に記載のアッセイ方法。 - ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞を第1の条件下で培養すること;
ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞を、第2の第2の条件下で培養すること;
該細胞の1つまたはそれ以上のニューロンの特徴を、決定または定量すること;および、
第1の条件下で培養した細胞の1つまたはそれ以上のニューロンの特徴を、第2の条件下で培養した細胞の同じニューロンの特徴と各々比較すること、
を含む、請求項29ないし請求項32のいずれかに記載のアッセイ方法。 - ニューロンの特徴が神経突起の伸長であり、該方法が、
神経突起特異的タンパク質の発現レベルを定量すること;および、
神経突起特異的タンパク質の発現レベルを比較すること;
を含み、第1の条件下でより高い発現レベルは、第1の条件が神経突起の伸長を増加させることを示す、
請求項33に記載のアッセイ方法。 - ニューロンの特徴が神経突起の縮退であり、該方法が、
神経突起特異的タンパク質の発現レベルを定量すること;および、
神経突起特異的タンパク質の発現レベルを比較すること;
を含み、第1の条件下でより低い発現レベルは、第1の条件が神経突起の縮退を増加させることを示す、
請求項33に記載のアッセイ方法。 - 神経突起の縮退を増加させると知られている化合物によりもたらされる神経突起の縮退の増加を阻害または低減する物質の同定方法であって、
試験物質の存在下、そして、神経突起の縮退を増加させると知られている条件下で、ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞を培養すること;
試験物質の非存在下、そして、神経突起の縮退を増加させると知られている条件下で、ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞を培養すること;
試験物質の存在下および非存在下の神経突起の縮退のレベルを定量または決定すること;および、
試験物質の存在下の神経突起の縮退のレベルを、試験物質の非存在下の神経突起の縮退のレベルと比較すること;
を含み、
ここで、試験物質の非存在下と比較して、試験物質の存在下で低い神経突起の縮退のレベルは、その物質が、その条件によりもたらされるか、またはそれに関連する神経突起の縮退の増加を、阻害または低減することを示す、
方法。 - 神経突起特異的タンパク質の発現レベルの定量により神経突起の縮退のレベルを定量し、ここで、試験物質の非存在下と比較して、試験物質の存在下で神経突起特異的タンパク質の発現レベルが高いことは、試験物質が、その条件によりもたらされるか、またはそれに関連する神経突起の縮退の増加を阻害または低減することを示す、請求項36に記載の方法。
- ニューロンの特徴がニューロンの細胞死であり、該方法が、
ニューロンを第1の条件下で培養すること;
ニューロンを第2の条件下で培養すること;
第1および第2の条件下で培養した細胞の、ニューロンの細胞死を定量または決定すること;および、
第1の条件下のニューロンの細胞死のレベルを、第2の条件下のニューロンの細胞死のレベルと比較すること;
を含み、
ここで、第2の条件下と比較して第1の条件下で高いニューロンの細胞死のレベルは、その化合物が細胞死を増加させることを示し;かつ/または、
ここで、第2の条件下と比較して第1の条件下で低いニューロンの細胞死のレベルは、その条件がニューロンの細胞死を低減させることを示す、
請求項33に記載の方法。 - ニューロンがp75ニューロトロフィンおよび/またはアポトーシスのタンパク質を発現する、請求項38に記載のアッセイ方法。
- ニューロンの細胞死を増加させると知られている条件によりもたらされるニューロンの細胞死の増加を阻害または低減する物質の同定方法であって、
試験物質の存在下、そして、ニューロンの細胞死を増加させると知られている条件下で、ニューロンを培養すること;
試験物質の非存在下、そして、ニューロンの細胞死を増加させると知られている条件下で、ニューロンを培養すること;
試験物質の存在下および非存在下のニューロンの細胞死のレベルを定量または決定すること;および、
試験物質の存在下のニューロンの細胞死のレベルを、試験物質の非存在下のニューロンの細胞死のレベルと比較すること;
を含み、
ここで、試験物質の非存在下と比較して、試験物質の存在下で低いニューロンの細胞死のレベルは、その物質が、その条件によりもたらされるニューロンの細胞死の増加を、阻害または低減することを示す、
方法。 - 第1の条件下で培養することが、試験化合物の存在下で培養するか、または細胞を試験化合物にさらすことを含み、第2の条件下で培養することが、該試験化合物の非存在下で培養するか、または、細胞を試験化合物にさらさないことを含む、請求項33ないし請求項35、請求項38および請求項39のいずれかに記載のアッセイ方法。
- 細胞の分化状態を示すマーカーを同定するための、請求項29ないし請求項31のいずれかに記載のアッセイ方法であって、
ES細胞の分化を誘導し、ニューロン前駆または祖先細胞を作成すること;および/または、
ニューロン前駆または祖先細胞を培養してニューロンを作成すること;
ある分化段階の細胞におけるタンパク質の発現レベルを、第2の分化段階の細胞におけるタンパク質の発現レベルと比較すること;および
発現レベルが第1および第2の分化段階の細胞で異なるタンパク質を同定すること、
を含み、
ここで、発現レベルの差異は、該タンパク質を、細胞の分化状態を示すマーカーとして使用し得ることを示す、
方法。 - ニューロンの特徴がシナプス形成であり、該方法が、細胞の電気生理学的活性の測定、および/または、シナプス形成の指標である1種またはそれ以上のマーカーの発現の検出または測定を含む、請求項29ないし請求項32のいずれかに記載のアッセイ方法。
- 第1および第2のニューロン細胞またはニューロン前駆もしくは祖先細胞の培養を提供すること、ここで、第1の培養の細胞は、第2の培養の細胞と異なる遺伝子型を有する;および、
第1の培養のニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロンを、第2の培養のニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロンと比較すること、
を含む方法。 - 第1の培養の細胞が、関心のある遺伝子に突然変異を有し、第2の培養の細胞がその突然変異を含有しない、請求項44に記載の方法。
- 第1の培養の細胞が、導入された遺伝子を含有し、第2の培養の細胞がその導入された遺伝子を含有しない、請求項44に記載の方法。
- 第1の培養の細胞が、内在性遺伝子を過剰発現し、第2の培養の細胞がその内在性遺伝子を過剰発現しない、請求項44に記載の方法。
- 請求項1ないし請求項28のいずれかに記載の方法に従い、ES細胞のニューロン前駆もしくは祖先細胞またはニューロン細胞への分化を誘導することを含む、請求項44ないし請求項47のいずれかに記載の方法。
- 第1の培養では、ES細胞が、関心のある遺伝子に突然変異を有し、第2の培養では、細胞がその突然変異を含有しない、請求項48に記載の方法。
- 分離したEBの第1の培養物に核酸コンストラクトで形質移入し、それにより第1の培養の細胞の遺伝子型を第2の培養の細胞と比較して変更する、請求項48に記載の方法。
- ニューロン前駆もしくは祖先またはニューロン細胞の第1および第2の培養物を、試験条件下で培養すること;
それらの細胞の1つまたはそれ以上のニューロンの特徴を、検出、定量、観察または決定すること;そして、
第1の培養の細胞のニューロンの特徴を、第2の培養の細胞のニューロンの特徴と比較すること、
をさらに含む、請求項44ないし請求項50のいずれかに記載の方法。 - 第1の条件下で培養することが、細胞をAβペプチドの存在下で培養することを含み、第2の条件下で細胞を培養することが、細胞をAβペプチドの非存在下で培養することを含む、請求項51に記載の方法。
- ニューロンの特徴が神経突起の分解である、請求項52に記載の方法。
- 本明細書に実質的に記載されている方法。
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