JP6015112B2 - 細胞評価装置、細胞評価方法およびプログラム - Google Patents

Description

本発明は、細胞評価装置、細胞評価方法およびプログラムに関する。

ＥＳ（Embryonic Stem）細胞やｉＰＳ（induced Pluripotent Stem）細胞などの幹細胞は、すべての組織に分化することが可能で、かつ、無限に増殖させることができることから、例えば再生医療などで応用されている。そして、ヒトのＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を神経細胞へ分化培養させることも行われている状況にある。

幹細胞を神経細胞へと分化培養させるにあたり、神経細胞の分化過程において外形的に固有で特徴的な構造物が細胞に出現することが知られている。したがって、神経細胞への分化状態を評価するにあたり、このような神経細胞への分化過程において固有な構造物を評価することは有効である。

上記のような構造物の状態の評価は目視により行わる。しかし、目視による評価では、人の労力を必要とするうえ、観察者の主観によるところが大きく定量化もできないために評価結果に再現性を与えにくい。また、例えば細胞をインキュベータから取り出して観察することになるために観察中における細胞の品質の劣化を招き、品質が不安定になってしまうことにもなる。

そこで、例えば神経細胞における構造物に対応するタンパク質の存在を蛍光抗体により染色して確認するという手法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。この手法であれば、染色された細胞の状態により構造物を特定することができるために、評価結果に再現性を与えることができる。

Leif Dehmelt, Gunnar Poplawski, Eric Hwang and Shelley Halpain 「NeuriteQuant: An open source toolkit for high content screens of neuronal Morphogenesis」

しかしながら、非特許文献１の手法においては細胞を染色するための作業に比較的時間や手間を要してしまうため、人的負担は大きい。また、非特許文献１の手法では細胞が染色されることにより侵襲が生じてしまうために、観察対象の細胞を引き続き分化培養に用いることができない。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、人的労力の軽減を図りながら、非侵襲かつ安定的に神経細胞への分化状態を評価できるようにすることを目的とする。

上述した課題を解決するために、本発明の一態様としての細胞評価装置は、神経細胞分化過程の細胞を撮像した第１の撮像画像を入力する画像入力部と、細胞の厚さ方向の位置において焦点の合った状態の全焦点画像を、少なくとも前記第１の撮像画像に基づく第１の原画像として生成する全焦点画像生成部と、前記第１の原画像において一定以下の輝度分布を有する領域と、前記第１の原画像において濃度差が一定以下の領域とで共通する領域を、分化過程に出現するロゼッタとして抽出するロゼッタ抽出部と、抽出された前記ロゼッタの状態を判定するロゼッタ対応判定部と、を備える。

また、本発明の一態様としての細胞評価方法は、神経細胞分化過程の細胞を撮像した撮像画像を入力する画像入力ステップと、細胞の厚さ方向の位置において焦点の合った状態の全焦点画像を、少なくとも前記撮像画像に基づく第１の原画像として生成する全焦点画像生成ステップと、前記第１の原画像において一定以下の輝度分布を有する領域と、前記第１の原画像において濃度差が一定以下の領域とで共通する領域を、分化過程に出現するロゼッタとして抽出するロゼッタ抽出ステップと、抽出された前記ロゼッタの状態を判定するロゼッタ対応判定ステップとを備える。

また、本発明の一態様としてのプログラムは、コンピュータに、神経細胞分化過程の細胞を撮像した撮像画像を入力する画像入力ステップ、細胞の厚さ方向の位置において焦点の合った状態の全焦点画像を、少なくとも前記撮像画像に基づく第１の原画像として生成する全焦点画像生成ステップ、前記第１の原画像において一定以下の輝度分布を有する領域と、前記第１の原画像において濃度差が一定以下の領域とで共通する領域を、分化過程に出現するロゼッタとして抽出するロゼッタ抽出ステップ、抽出された前記ロゼッタの状態を判定するロゼッタ対応判定ステップを実行させるためのものである。

以上説明したように、本発明によれば、人的労力の軽減を図りながら、非侵襲かつ安定的に神経細胞への分化状態を評価できるという効果が得られる。

本発明の実施形態におけるインキュベータの構造例を正面から示す図である。 本実施形態におけるインキュベータの構造例を平面から示す図である。 本実施形態のインキュベータの構成例を示す図である。 幹細胞から神経細胞への分化過程と、細胞に生じる現象との関係を示す図である。 神経細胞への分化過程において出現するロゼッタと神経突起を示す図である。 経細胞へ分化誘導される細胞の分化状態を本実施形態のインキュベータが評価するための手順例を示すフローチャートである。 本実施形態のインキュベータがロゼッタの状態を判定するためのより詳細な手順例を示す図である。 本実施形態のインキュベータが神経突起の状態を判定するためのより詳細な手順例を示す図である。 本実施形態の全焦点画像生成部による全焦点画像の生成手法を模式的に示す図である。 本実施形態のロゼッタ抽出部がロゼッタを抽出するために実行する画像処理の手順例を示す図である。 本実施形態のロゼッタ抽出部が実行するソフトマッチングについての結果例を示す図である。 本実施形態のロゼッタ抽出部が全焦点画像から濃度差が低い領域を抽出する処理を行った場合の結果例を示す図である。 本実施形態のロゼッタ抽出部による濃度差が低い領域についてのノイズ除去の結果例を示す図である。 本実施形態のソフトマッチング後の画像と濃度差が低い領域の抽出画像とを利用してロゼッタ抽出部が実行するロゼッタ抽出処理の結果例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が位相差画像から抽出する神経突起と死細胞と生細胞の例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が神経突起と死細胞と生細胞を抽出するための処理手順例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が死細胞と神経細胞の抽出に対応して実行するソフトマッチングの処理結果例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が生細胞の抽出のために実行するクロージングおよび二値化と、経突起抽出部が神経突起の抽出のために実行する差分画像生成および二値化の結果例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が生細胞の抽出のために実行する二値化と共通オブジェクト抽出処理の結果例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が神経細胞の抽出のために実行する差分画像生成に際して利用する画像例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が神経細胞の抽出のために実行する細線化から神経突起抽出までの処理の結果例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が死細胞の抽出のために実行するダイレーションと差分画像生成の処理結果例を示す図である。 本実施形態の神経突起抽出部が死細胞の抽出のために実行する共通オブジェクト抽出処理の結果例を示す図である。 神経突起抽出部が死細胞と生細胞の抽出に際して実行する領域分割の例を示す図である。

［インキュベータの構成例］
図１〜図３を参照して、本発明の実施形態における細胞評価装置が適用されるインキュベータ１１について説明する。
図１と図２は、インキュベータ１１の構造例を示している。図１はインキュベータ１１の正面図であり、図２はインキュベータ１１の平面図である。また、図３は、インキュベータ１１の構成例を示している。

これらの図に示すインキュベータ１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。インキュベータ１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置される。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。

まず、上部ケーシング１２の内部には、細胞の培養を行う恒温室１５が設けられる。この恒温室１５は温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂを有しており、恒温室１５内は細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されている（なお、図１と図２において温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、回収装置５１、播種装置５２および培地交換装置５３の図示は省略する）。

恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８は、パッキンＰ１，Ｐ２，Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。

また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培養容器１９を小扉１８から搬出入する。

ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図３の下側）からみて恒温室１５の左側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚には培養容器１９を複数収納することができる。なお、各々の培養容器１９には、培養の対象となる細胞が培地とともに収容されている。

観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置される。
ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出したスタンドアーム３２と、位相差観察用の顕微光学系および撮像装置３３ａを内蔵した本体部分３３とを有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。

試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９を載置することができる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容器１９の位置を調整できる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源３３ｂが内蔵されている。そして、撮像装置３３ａは、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過照明された培養容器１９の細胞を、顕微光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得できる。

容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置される。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。

また、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３４と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３４の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。

また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。

次に、下部ケーシング１３について説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の本体部分３３や、インキュベータ１１の制御装置４０が収納されている。

制御装置４０は、温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、回収装置５１、播種装置５２および培地交換装置５３とそれぞれ接続されている。この制御装置４０は、所定のプログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。

一例として、制御装置４０は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４０は、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、回収装置５１、播種装置５２、培地交換装置５３などを制御して、培養容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。さらに、制御装置４０は、観察シーケンスで取得した画像に基づいて、細胞の培養状態の評価を行う培養状態評価処理を実行する。

本実施形態のインキュベータ１１は、例えばヒト由来の皮膚細胞を神経細胞へ分化培養するのに使用される。図３においては、神経細胞への分化培養に対応する制御装置４０の機能構成例を示している。なお、この制御装置４０における各機能部の動作は、例えば制御装置４０を形成するＣＰＵ（Central Processing Unit）にプログラムを実行させることにより実現される。

制御装置４０は、神経細胞への分化培養に対応して、記憶部４１、画像入力部４２、全焦点画像生成部４３、ロゼッタ抽出部４４、神経突起抽出部４５、ロゼッタ対応判定部４６、神経突起対応判定部４７、総合判定部４８および装置制御部４９を備える。

記憶部４１は、制御装置４０が必要とする各種のデータを記憶する。
画像入力部４２は、撮像装置３３ａにより撮像される撮像画像を入力する。本実施形態において、撮像装置３３ａは、位相差観察用の顕微光学系により観察された顕微鏡画像、つまり、光の位相差をコントラストに変換した位相差画像を撮像する。また、撮像装置３３ａは、予め決定されたｘｙ平面上における撮像位置をＺ方向（標本の深さ方向）に添って焦点位置を変え、各焦点位置での撮像画像を行って撮像画像を出力する。このように得られる撮像画像の各々が単焦点画像である。画像入力部４２は、これらの位相差画像としての単焦点画像を入力する。

全焦点画像生成部４３は、画像入力部４２が入力した複数の単焦点画像を利用して全焦点画像を生成する。具体的に、全焦点画像生成部４３は、例えば細胞の厚さ方向の位置において焦点が合った領域を取り出し、これらの領域を合成するように全焦点画像を生成する。なお、このような全焦点画像は、例えばＥＤＦ（Extend Depth of Focus）画像ともいう。
例えば、幹細胞から神経細胞への分化過程においては、ロゼッタといわれる構造物が出現するのに応じて細胞表面の起伏に変化が生じる。このために、単焦点画像では、焦点が合ってコントラストが高い領域と焦点が合わずにコントラストが低い状態の領域とが混在する。画像における構造物の位置は不定であるから、単焦点画像を神経細胞の分化状態の評価に利用したとしても、適切な判定結果を得ることは難しい。そこで、本実施形態では、ロゼッタ１００を抽出するにあたり全焦点画像を評価に利用する。これにより、適切な評価結果を得ることができる。

ロゼッタ抽出部４４は、神経細胞への分化過程において細胞に固有に出現する構造物の１つであるロゼッタを全焦点画像（第１の原画像）から抽出する。

神経突起抽出部４５（構造物抽出部）は、神経細胞への分化過程における構造物の１つである神経突起を単焦点画像（第２の原画像）から抽出する。なお、神経突起が出現する分化過程においては、神経突起以外に、死んだ細胞（以下、「死細胞」ともいう）と生きた細胞の細胞体（以下、「生細胞」ともいう）とが混在する状態となる。そこで、神経突起抽出部４５は、神経突起と死細胞と生細胞とをそれぞれ区別して抽出する。

ロゼッタ対応判定部４６は、ロゼッタ抽出部４４により抽出されたロゼッタの状態を判定する。また、ロゼッタ対応判定部４６は、判定したロゼッタの状態に基づいて細胞の分化誘導に関連する所定事項についての判定を行う。
神経突起対応判定部（構造物対応判定部）４７は、神経突起抽出部４５により抽出されたロゼッタの状態を判定する。また、神経突起対応判定部４７は、判定した神経突起の状態に基づいて細胞の分化誘導に関連する所定事項についての判定を行う。
総合判定部４８は、ロゼッタ対応判定部４６の判定結果と神経突起対応判定部４７の判定結果に基づいて細胞の分化誘導に関連する所定事項についての判定を行う。

装置制御部４９は、撮像装置３３ａ、温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、容器搬送装置２３、回収装置５１、播種装置５２および培地交換装置５３の動作を制御する。

［ロゼッタと神経突起］
本実施形態のインキュベータ１１は、神経細胞への分化過程において出現するロゼッタと神経突起の状態に基づいて神経細胞の分化状態についての評価を行う。そこで、図４と図５を参照してロゼッタと神経突起について説明する。

図４は、幹細であるｉＰＳ（induced Pluripotent Stem）細胞が神経細胞に分化する過程を時間経過にしたがって示している。ｉＰＳ細胞を神経細胞へと分化誘導する培養を行うと、ｉＰＳ細胞は、神経上皮細胞、神経前駆細胞、成熟神経細胞の順で分化していく。
そして、神経上皮細胞から神経前駆細胞に分化しているときにロゼッタが出現する。

図５（ａ）は、ロゼッタ１００が出現している状態の細胞を位相差顕微鏡により観察した位相差画像の例を示している。
ロゼッタ１００は、例えば、円柱状の細胞が放射状に配列されるような形状を有している。このロゼッタ１００は、その形状が特徴的であるうえに、神経細胞への分化過程において固有な構造物として初期に出現する。したがって、ロゼッタ１００の出現が確認されたということは、ｉＰＳ細胞などの幹細胞の神経細胞への分化誘導が成功したことを示している。
ロゼッタ１００が上記のような性質を有することを考慮すれば、神経細胞への分化状態の評価を行うにあたり、ロゼッタ１００の状態を評価することは有効であるといえる。そこで、本実施形態では、神経細胞への分化状態を評価するにあたり、まず、ロゼッタ１００の状態を判定するものである。

また、神経前駆細胞から成熟神経細胞へと分化する過程において神経突起が出現し、この神経突起が伸長するという現象が現れる。
なお、図４においては、幹細胞であるｉＰＳ細胞を利用した例を示しているが、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞などの他の幹細胞やダイレクトリプログラミングによる他種の分化細胞などを利用して神経細胞への分化培養を行った場合にも、図４と同様の分化過程となる。

図５（ｂ）は、神経細胞２００の構造を示している。神経細胞２００は、細胞体２１０と、この細胞体２１０から伸長する神経突起３００（軸索２２０と樹状突起２３０）を有する構造である。
細胞体２１０は、核を有し、丸く盛り上がるような形状である。
軸索２２０は、信号を出力する機能を有する。また、軸索２２０は、細く、その太さが一様であり、長く、小胞体やリボゾームはほとんど無い。また、軸索２２０の伸長速度は速い。
樹状突起２３０は、信号を受ける機能を有する。また、樹状突起２３０は、比較的太いが、先端にいくほど細くなる。また、その伸長速度は、遅い。
この神経細胞２００も、神経細胞の分化過程において固有に出現する構造物の１つである。また、培養過程の神経細胞においては、多数の神経細胞２００が重なり合う状態となり、軸索２２０と樹状突起２３０とを区別することが難しくなる。そこで、本実施形態においては、軸索２２０と樹状突起２３０とを区別することなく神経突起３００として、神経細胞２００における伸長部分として抽出する。また、併せて、神経細胞２００における生きた細胞体２１０も生細胞として抽出する。

［評価手順］
図６は、神経細胞へ分化誘導される細胞の分化状態をインキュベータ１１が評価するための手順例を示している。
まず、インキュベータ１１には、神経細胞へと分化誘導培養する幹細胞として、ヒト由来のｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞が培養容器１９に収容される（ステップＳ１０１）。または、ダイレクトリプログラミングにより分化誘導する目的で、他種の分化細胞が培養容器１９に収容されてもよい（ステップＳ１０２）。

ステップＳ１０１またはＳ１０２により培養容器１９に収容された幹細胞は、神経上皮細胞への分化誘導培養が行われる（ステップＳ１０３）。そして、神経上皮細胞への分化後、前駆細胞へと分化する過程において、ロゼッタ１００が出現する（ステップＳ１０４）。なお、このようにロゼッタ１００が出現した細胞は、継代による分化培養により増殖させることができる。

制御装置４０は、撮像装置３３ａにより撮像された画像（第１の撮像画像）を利用してロゼッタ１００を抽出するための画像処理を実行する（ステップＳ１０５）。このために、制御装置４０は、分化過程の細胞において出現したロゼッタ１００を撮像装置３３ａにより撮像させる。前述のように、撮像装置３３ａが撮像する画像は、位相差顕微鏡により観察される位相差画像であり、かつ、それぞれが異なる焦点位置による複数の単焦点画像である。そのうえで、制御装置４０は、例えば所定の時間間隔による撮像時刻ごとに撮像装置３３ａが複数の単焦点画像を撮像するように制御する。

そして、制御装置４０における画像入力部４２は、撮像装置３３ａにより撮像された複数の単焦点画像を入力する。また、全焦点画像生成部４３は、同じ撮像時刻において撮像された複数の単焦点画像を利用して１つの全焦点画像を順次生成する。これにより、全焦点画像生成部４３は、撮像時刻ごとに対応する複数の全焦点画像を生成する。このように生成された複数の全焦点画像は、時系列にしたがったいわゆるタイムラプス画像である。
そして、ロゼッタ抽出部４４は、ステップＳ１０５としての画像処理によって全焦点画像からロゼッタ１００を抽出する。

次に、ロゼッタ対応判定部４６は、ステップＳ１０５により抽出されたロゼッタ１００を利用して、細胞に出現したロゼッタ１００の状態についての判定を行う（ステップＳ１０６）。ここでの判定項目は多様であり特に限定されるものではないが、例えば、ロゼッタ１００の質、量、および、その出現に要した期間などを基準として各種判定項目についての判定が行われる。

一例として、ロゼッタ対応判定部４６は、出現したロゼッタ１００の位置、分化状態、分化効率などについて判定する（ステップＳ１０７）。なお、分化状態としては、具体的には、ロゼッタ１００の個々または全体の形状、品質などを判定する。また、ここでの分化効率とは、例えば、出現したコロニーの数に対するロゼッタ１００の出現数として求めることができる。

また、ロゼッタ対応判定部４６は、判定したロゼッタ１００の状態に基づいて、ロゼッタ１００が出現した細胞についての次の工程の決定と（ステップＳ１０８）、将来予測（ステップＳ１０９）を行う。つまり、ロゼッタ対応判定部４６は、判定したロゼッタ１００の状態に基づいて、さらに、細胞の分化培養に関する所定事項についての判定を行うことができる。

ロゼッタ対応判定部４６がステップＳ１０８により決定する次の工程としては、以下のものが挙げられる。
つまり、ロゼッタ対応判定部４６は、次の工程として、ロゼッタ１００の状態の判定結果をロット管理用の情報として利用すべきと決定することができる。
また、ロゼッタ対応判定部４６は、次の工程として、ロゼッタ１００が出現した細胞を回収し、移植用サンプルとして利用すべきと決定することができる。このように回収すべきと決定された場合、制御装置４０の装置制御部４９は、回収装置５１を制御して細胞の回収を行う。
また、ロゼッタ対応判定部４６は、次の工程として、ロゼッタ１００が出現した細胞を凍結保存すべきことを決定することができる。凍結保存された細胞は、例えば移植、大量生産目的による貯蔵、または、ロット管理などに利用される。
また、ロゼッタ対応判定部４６は、次の工程として、ロゼッタ１００が出現した細胞を分取して検査すべきことを決定することができる。なお、このように検査すべきと決定された場合には、各種検査や分析が行われる（ステップＳ１１０）。この検査、分析に際しては、細胞を回収して行ってもよいし、回収せずに、撮像画像を利用して行ってもよい。
また、ロゼッタ対応判定部４６は、次の工程として、ロゼッタ１００が出現した細胞の培養を続行すべきことを決定することができる。

また、ロゼッタ対応判定部４６は、ステップＳ１０９としての将来予測を以下のように行うことができる。つまり、ロゼッタ対応判定部４６は、ニューロンへの分化の収率を予測することができる。また、ロゼッタ対応判定部４６は、例えばドパミン作動性やグルタミン酸作動性など、どのような種類のニューロンへの分化傾向であるのかについて予測することができる。

また、ステップＳ１０３の神経上皮細胞への分化誘導培養を継続させた場合には、さらに神経前駆細胞への分化へと進行する（ステップＳ１１１）。この神経前駆細胞に分化している段階においては、ニューロスフェロイドが出現する（ステップＳ１１２）。このニューロスフェロイドも、継代により増殖可能である。
また、ニューロスフェロイドの出現後においては、神経細胞への分化誘導培養が行われる（ステップＳ１１３）。このステップＳ１１３による分化誘導培養の過程において、神経突起２００が出現する(ステップＳ１１４)。そして、このように神経突起２００が出現すると、神経突起２００における突起（軸索２２０および樹状突起２３０）が伸長するという現象が生じる。

制御装置４０は、上記のように神経突起３００が伸長している状態の神経細胞を撮像装置３３ａにより撮像させ、その撮像画像（第２の撮像画像）を利用して神経突起３００を抽出する（ステップＳ１１５）。この神経突起抽出のための画像処理においては、画像入力部４２が撮像時刻ごとに単焦点画像を入力する。そして、神経突起抽出部４５が、生成された単焦点画像としての位相差画像から神経突起３００を抽出する。

次に、神経突起対応判定部４７は、ステップＳ１１５により抽出された神経突起３００を利用して、細胞に出現した神経突起３００の状態についての判定を行う（ステップＳ１１６）。この判定に際して基準となる項目は、例えば、突起伸長速度、生細胞数、死細胞数、また、死細胞の増加量、神経突起３００や生細胞の増殖速度などである。神経突起対応判定部４７は、例えばこれらの項目を基準に所定の判定項目についての判定を行う。なお、この神経突起３００に関する判定項目についても多様であり特に限定されるものではない。

一例として、神経突起対応判定部４７は、神経突起３００の分化状態や品質を判定する（ステップＳ１１７）。

また、神経突起対応判定部４７は、神経突起３００が出現した神経細胞についての次の工程の決定を行う（ステップＳ１１８）。
神経突起対応判定部４７がステップＳ１１８により決定する次の工程としては、以下のものが挙げられる。
例えば、神経突起対応判定部４７は、次の工程として、今回の神経突起３００の状態の判定結果をロット管理用の情報として利用すべきと決定することができる。
また、神経突起対応判定部４７は、次の工程として、神経突起３００が出現した神経細胞を回収し、移植用サンプルとして利用すべきと決定することができる。
また、神経突起対応判定部４７は、次の工程として、神経突起３００が出現した神経細胞を分取して検査すべきことを決定することができる。
また、神経突起対応判定部４７は、次の工程として、神経突起３００が出現した神経細胞をスクリーニング、アッセイなどに使用すべきことを決定することができる。

また、総合判定部４８は、ステップＳ１０７およびＳ１０９におけるロゼッタ対応判定部４６の判定結果と、ステップＳ１１７における神経突起対応判定部４７の判定結果を利用して総合判定を行う（ステップＳ１１９）。

総合判定部４８は、例えば総合判定の結果として、ロゼッタ１００と神経突起３００の出現を含むこれまでの分化工程における分化状態や分化効率を出力することができる（ステップＳ１２０）。
また、総合判定部４８は、総合判定結果として、神経突起３００が出現した段階の神経細胞についての次の工程を決定することができる（ステップＳ１１８）。

また、総合判定部４８は、総合判定結果を反映した品質データベースを作成することができる（ステップＳ１２１）。品質データベースには、例えばロゼッタ１００の分化状態、神経突起３００の分化状態、ロゼッタ１００から神経突起３００が出現する段階にまで分化させるまでの培養条件、期間などを格納する。また、遺伝子、蛋白マーカのプロファイルなどを格納する。また、最終分化後の検査結果なども格納させることができる。この品質データベースは、記憶部４１に記憶される。
そして、品質データベースの内容は、例えば次の培養工程にフィードバックさせることができる（ステップＳ１２２）。具体的に、総合判定部４８は、記憶部４１に記憶される品質データベースの内容に基づいて次の培養工程における各種項目を設定する。そして、装置制御部４９が、ユーザへの設定項目の通知、または、設定された項目にしたがった温度、湿度調整、播種、培地交換などを自動で実行する。これにより、次の培養工程への総合判定結果のフィードバックが実現される。

また、神経突起３００が出現した後においては、成熟神経細胞への分化誘導培養が行われる（ステップＳ１２３）。そして、この成熟神経細胞は、例えば検査などのために分取される（ステップＳ１２４）。また、この成熟神経細胞にまで分化した細胞を医療等に利用することができる（ステップＳ１２５）。

図７のフローチャートは、インキュベータ１１がロゼッタ１００の状態を判定するためのより詳細な手順例を示している。この図に示す手順は、図６との対応では、例えば、ステップＳ１０４〜Ｓ１０９から成る手順に相当する。

ロゼッタ１００の状態判定にあたっては、神経上皮細胞にまで分化が進行した段階の細胞を培養する（ステップＳ２０１）。そして、制御装置４０は、培養容器１９に照射する照明について、例えばロゼッタの出現に適したものに切り替えを行う（ステップＳ２０２）。また、制御装置４０における装置制御部４９は、回収と播種を行う（ステップＳ２０３）。
そして、制御装置４０における画像入力部４２は、播種直後の段階における細胞の撮像画像を入力する（ステップＳ２０４）。ロゼッタ抽出部４４は、この撮像画像（複数の単焦点画像）を利用して全焦点画像生成部４３が生成した全焦点画像（原画像）からコロニーを抽出するための画像処理を行う（ステップＳ２０５）。コロニーは、ロゼッタ１００の最も初期の状態に対応する。
なお、ステップＳ２０５において、ロゼッタ抽出部４４は、タイムラプス画像としての複数の全焦点画像の各々を対象として処理する。この点については、同図において以降説明する画像処理のステップにおいても同様である。

次に、ロゼッタ対応判定部４６は、抽出したコロニーの品質、大きさ、テクスチャなどの状態に基づいて、分化効率を予測する（ステップＳ２０６）。具体的に、ロゼッタ対応判定部４６は、例えば、抽出されたコロニーの総数のうちでロゼッタに分化成功するものの数を予測する。
そのうえで、ロゼッタ対応判定部４６は、上記の分化効率の予測結果のほかに、例えばロゼッタ１００の密度、ロゼッタ１００に分化するまでの日数なども予測し、これらの予測結果に基づいて、培養を継続すべきか廃棄すべきかの判定を行う（ステップＳ２０７）。
廃棄すべきと判定した場合には、装置制御部４９は、これまでに培養した神経細胞が廃棄されるように例えば容器搬送装置２３などを制御する（ステップＳ２０８）。一方、培養を継続すべきと判定した場合、装置制御部４９は、そのまま培養が継続されるように上部ケーシング１２内の所定の装置を制御する（ステップＳ２０９）。

ステップＳ２０９により培養を継続した場合、画像入力部４２は、培地交換直前のタイミングで出現している細胞の撮像画像を入力する（ステップＳ２１０）。ロゼッタ抽出部４４は、入力された撮像画像を利用して生成された全焦点画像からロゼッタを抽出するための画像処理を実行する（ステップＳ２１１）。

次に、装置制御部４９は、しかるべきタイミングで培地交換を行う（ステップＳ２１２）。次に、画像入力部４２は、この培地交換直後における細胞の撮像画像を入力し（ステップＳ２１３）、ロゼッタ抽出部４４は、この入力された撮像画像を利用して生成された全焦点画像からコロニーを抽出する画像処理を実行する（ステップＳ２１４）。

ステップＳ２１３の段階の細胞はさらに培養される（ステップＳ２１５）。そして、この後の地交換直前のタイミングの細胞が撮像され、画像入力部４２は、その撮像画像を入力する（ステップＳ２１６）。ロゼッタ抽出部４４は、入力された撮像画像を利用して生成された全焦点画像からロゼッタ１００を抽出するための画像処理を実行する（ステップＳ２１７）。

そして、ロゼッタ対応判定部４６は、ステップＳ２１４により抽出されたコロニーと、ステップＳ２１７により抽出されたロゼッタ１００とに基づいてロゼッタの状態を判定する（ステップＳ２１８）。具体的に、ロゼッタ対応判定部４６は、例えばロゼッタ１００が形成されたか否かについて判定する。また、ロゼッタ１００が形成された場合には、その品質について判定する。
そのうえで、ロゼッタ対応判定部４６は、ステップＳ２１８により判定されたロゼッタ１００の状態に基づいて、再び、以降の培養を継続すべきか廃棄すべきかの判定を行う（ステップＳ２１９）。
ロゼッタ対応判定部４６は、廃棄すべきと判定した場合には、これまでに判定対象とされていた細胞を廃棄し（ステップＳ２２０）、培養を継続すべきと判定した場合には、培地交換を行ったうえで培養を継続する（ステップＳ２２１）。

ステップＳ２２１により培地交換を行った場合、培地交換直後の細胞（ステップＳ２２２）はロゼッタ１００が出現過程の状態にある。そして、この細胞がさらに培養されていく過程において（ステップＳ２２３）、画像入力部４２は、回収直前のタイミングの細胞の撮像画像を入力し（ステップＳ２２４）、ロゼッタ抽出部４４は、入力された撮像画像を利用して生成されたロゼッタ１００を抽出するための画像処理を実行する（ステップＳ２２５）。

そして、ロゼッタ対応判定部４６は、ステップＳ２２５により抽出されたロゼッタ１００についての状態を判定する（ステップＳ２２６）。この段階では、ロゼッタ対応判定部４６は、例えばロゼッタ１００の状態として、その品質について判定する。

次に、ロゼッタ対応判定部４６は、ステップＳ２２６の判定結果に基づいて、以降の工程を継続すべきか廃棄すべきかの判定を行う（ステップＳ２２７）。
ロゼッタ対応判定部４６は、廃棄すべきと判定した場合には、これまでに判定対象とされていた細胞を廃棄する（ステップＳ２２８）。
また、ステップＳ２２８において培養を継続すべきとの判定した場合、その判定内容は、さらに２つに分けられる。
１つの判定内容は、例えばロゼッタ１００が十分に成長しているなどの理由で神経前駆細胞への分化のための工程に移行させるというものである。この場合、装置制御部４９は、神経前駆細胞への分化としての次の工程のために、回収装置５１により細胞を回収させる（ステップＳ２２９）。
もう１つの判定内容は、例えばロゼッタ１００が十分に成長していないなどの理由で、さらにロゼッタ１００を成長させるための工程に移行させるというものである。この場合、装置制御部４９は、ステップＳ２０３としての回収と播種の工程が行われるように、回収装置５１と播種装置５２を制御する。

図８のフローチャートは、神経突起３００の状態を判定するためのより詳細な手順例を示している。この図に示す手順は、図６との対応では、例えば、ステップＳ１１４〜Ｓ１１８から成る手順に相当する。

神経突起３００の状態判定にあたっては、神経前駆細胞にまで分化が進行した細胞を培養する（ステップＳ３０１）。そして、制御装置４０における装置制御部４９は、回収と播種を、回収装置５１と播種装置５２のそれぞれに行わせ（ステップＳ３０２）、培養を継続する（ステップＳ３０３）。

そして、ステップＳ３０３による培養を行っている過程において、画像入力部４２は、神経突起３００が出現した神経細胞の撮像画像、つまり、位相差画像としての単焦点画像を入力する（ステップＳ３０４）。また、神経突起抽出部４５は、入力された単焦点画像（原画像）から神経突起３００を抽出するための画像処理を実行する（ステップＳ３０５）。

ここで、神経突起３００が出現している状態の細胞では、前述のように、死んでしまった細胞（死細胞）と、神経突起３００以外の生きている細胞（生細胞）とが混在している。これらの死細胞と生細胞も、神経細胞の分化状態を判定する有効な材料となる。そこで、ステップＳ３０５の画像処理によっては、神経突起３００だけではなく、死細胞と生細胞も抽出する。

そして、神経突起対応判定部４７は、ステップＳ３０５により抽出された神経突起３００と死細胞と生細胞とに基づいて、例えば神経突起３００の伸長した突起の長さ、神経突起３００と生細胞と死細胞の各数、また、神経突起３００と生細胞の増殖速度などを認識する。また、この認識結果を利用して、神経細胞の生育状態、分化状態などを判定する（ステップＳ３０６）。

そのうえで、神経突起対応判定部４７は、これらの判定結果に基づき、同じステップＳ３０６において、さらに、以降の工程についても決定する。
具体的に、神経突起対応判定部４７は、これまでに培養した神経細胞を廃棄すべきと決定することができる。このように決定された場合、装置制御部４９は、これまでに培養した神経細胞を廃棄させるように例えば容器搬送装置２３などを制御する（ステップＳ３０７）。また、培地交換をしたうえで次工程へ移行すべきと決定された場合、装置制御部４９は、培地交換装置５３により培地交換を行わせたうえで（ステップＳ３０８）、次の工程に移行させる（ステップＳ３０９）。または、培地交換をせずに次工程へ移行すべきと決定された場合、装置制御部４９は、次のしかるべき工程に移行されるように、例えば上部ケーシング１２における所定の装置を制御する。

［ロゼッタ抽出のための画像処理］
次に、図９〜図１４を参照してロゼッタ１００を抽出するための画像処理の具体例について説明する。
前述のように、ロゼッタ１００を抽出するのに利用する原画像は、位相差顕微鏡を介して細胞を撮像した位相差画像であり、かつ、画面の全領域において合焦している全焦点画像である。また、全焦点画像は、例えば所定の時間間隔の撮像時刻ごとに対応して形成される。つまり、本実施形態においては、時系列における複数の全焦点画像によりタイムラプス画像が形成されている。

図９は、全焦点画像をタイムラプスにより生成する手順を模式的に示している。例えば撮像時刻ｔ０において、制御装置４０の装置制御部４９は、それぞれ異なる焦点位置により撮像したＮ枚の単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎを撮像装置３３ａに撮像させる。前述のように、各単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎは、位相差顕微鏡を介して観察される細胞を撮像した位相差画像である。制御装置４０における画像入力部４２は、これらの単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎを入力する。そして、全焦点画像生成部４３は、単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎから、例えばコントラストが高い画像領域を取り出して合成することで、撮像時刻ｔ０に対応する全焦点画像Ｐａｆ−０を生成する。

また、撮像時刻ｔ０から所定時間を経過した撮像時刻ｔ１においても、同様に、撮像装置３３ａにより、Ｎ枚の単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎを撮像させる。そして、全焦点画像生成部４３は、画像入力部４２が入力した単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎを利用して、上記と同様に、撮像時刻ｔ１に対応する全焦点画像Ｐａｆ−１を生成する。
以降、同様にして、制御装置４０は、所定時間ごとに撮像装置３３ａが撮像した単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎを利用して、全焦点画像Ｐａｆ−Ｎを生成していく。

このように本実施形態のインキュベータ１１は、所定時間ごとに位相差画像による全焦点画像Ｐａｆを生成する。このように一定時間ごとに生成される全焦点画像Ｐａｆによりタイムラプス画像が形成される。そして、ロゼッタ抽出部４４は、このように生成された全焦点画像Ｐａｆのそれぞれからロゼッタ１００を抽出する。

なお、神経突起抽出部４５が神経突起３００を抽出する際に処理対象とする原画像は、単焦点画像でよいが、図９に示すようにタイムラプス画像として形成される全焦点画像Ｐａｆであってもよい。神経突起３００はロゼッタ１００ほどの厚みはないので、単焦点画像でも十分な精度での抽出が可能であるが、全焦点画像Ｐａｆを利用すれば、抽出精度がより向上する。
ただし、神経突起３００の場合にはその伸長速度はロゼッタ１００の成長速度に対して相当に速い。このため、タイムラプス画像の時間間隔は、ロゼッタ１００を抽出するにあたっては約６時間程度が設定されるのに対して、神経突起３００を抽出するにあたっては、約３０分から１時間程度が設定される。

なお、全焦点画像生成部４３は、撮像時刻ごとに対応した単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎが入力されたタイミングで全焦点画像Ｐａｆを生成してもよい。また、撮像時刻ごとに対応して入力された単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎを記憶部４１に記憶させておいたうえで、その後における所定のタイミングで記憶部４１から読み出した単焦点画像Ｐｓｆ−１〜Ｐｓｆ−Ｎを利用して全焦点画像Ｐａｆを生成するようにしてもよい。

次に、図１０のフローチャートは、ロゼッタ１００を抽出するためにロゼッタ抽出部４４が実行する画像処理の手順例を示している。この図に示す処理は、例えば図６のステップＳ１０５や図７のステップＳ２０５、Ｓ２１１、Ｓ２１４、Ｓ２１７およびＳ２２５などに相当する。また、この図に示す処理は、図９における１つの撮像時刻において生成した全焦点画像を対象とするものとなる。

まず、制御装置４０におけるロゼッタ抽出部４４は、ロゼッタ抽出のために生成された全焦点画像を原画像として入力する（ステップＳ４０１）。なお、ロゼッタ抽出部４４は、例えば全焦点画像生成部４３が生成して記憶部４１に記憶させた全焦点画像を入力すればよい。

次に、ロゼッタ抽出部４４は、原画像からロゼッタ１００に対応する特徴を有する画像領域を抽出するためのソフトマッチングを実行する（ステップＳ４０２）。ソフトマッチングは、教師付き分類の１つである。
図１１は、ステップＳ４０３としてのソフトマッチングの結果例を示している。図１１には、原画像が示されている。位相差画像である原画像においては、細胞に出現したロゼッタ１００は暗いまとまった領域として観察される。この点に着目し、ステップＳ４０３のソフトマッチングは、暗い領域を抽出するためのテクスチャを予め定めておき、原画像からこのテクスチャに該当する領域を抽出するものである。図１１において白抜きの矢印で示す黒色となっている領域がステップＳ４０３のソフトマッチングにより抽出された領域である。このように抽出された領域はロゼッタ１００である可能性が高い領域である。

また、ロゼッタ１００が位相差画像としての原画像において一様に暗い領域の内、ロゼッタ１００に特徴的な円形構造はその周囲部分の濃度差が小さくなる。
そこで、ロゼッタ抽出部４４は、ステップＳ４０３のソフトマッチングと並行して、位相差画像としての原画像から、濃度差が一定以下の領域を抽出する（ステップＳ４０３〜Ｓ４０７）。

このために、ロゼッタ抽出部４４は、まず、原画像に対してエロージョン（Erosion）の処理を施す（ステップＳ４０３）。
図１２（ａ）は、ステップＳ４０２により生成された原画像の一例を示している。この原画像に対してステップＳ４０３によるエロージョンが施された画像を図１２（ｂ）に示す。このようにエロージョンが施された画像は、原画像において暗い部分が拡大されたような状態となる。

次に、ロゼッタ抽出部４４は、図１２（ｂ）のエロージョンが施された画像から図１２（ａ）の原画像を差し引いた差分画像を生成する（ステップＳ４０４）。図１２（ｃ）は、このステップＳ４０４により生成された差分画像である。次に、ロゼッタ抽出部４４は、ステップＳ４０４により生成された差分画像についてダイレーション（Dilation）を行う（ステップＳ４０５）。図１２（ｄ）は、ステップＳ４０５のダイレーションが施された画像を示している。このように生成された図１２（ｄ）の画像では、濃度差の絶対値が拡大されたような状態になる。

次に、ロゼッタ抽出部４４は、図１２（ｄ）のダイレーション後の画像について所定の閾値による二値化を行う（ステップＳ４０６）。図１３（ａ）の画像は、このステップＳ４０６により図１２（ｄ）の画像を二値化した結果を示している。この図において、輝度が最も低い黒色で示されている部分が、濃度差が一定以下であるとして抽出された領域（オブジェクト）である。

そのうえで、ロゼッタ抽出部４４は、さらにノイズを除去するために、図１３（ａ）の二値化した画像におけるオブジェクトのうちでそのサイズが一定以下のものを削除する（ステップＳ４０７）。具体例として、図１３（ａ）の二値化された画像においては、破線で括って示す位置に小さいサイズのオブジェクトが存在する。ステップＳ４０７によっては、例えばこのようなオブジェクトが削除される。この結果、図１３（ｂ）に示す画像が得られる。この図１３（ｂ）の画像の破線で括って示す領域においては、濃度が一定以下であるとともにサイズが一定以下のオブジェクトが削除されており、存在していない。

次に、ロゼッタ抽出部４４は、ステップＳ４０３のソフトマッチングが施された画像と、ステップＳ４０３〜Ｓ４０７による処理が施された画像とでオブジェクトが共通する部分（オブジェクトの積）を抽出する（ステップＳ４０８）。

図１４（ａ）は、ステップＳ４０２のソフトマッチングが施された画像として図１１と同じ画像を示し、図１４（ｂ）は、ステップＳ４０３〜Ｓ４０７による処理が施された画像として図１３（ｂ）と同じ画像を示している。
ロゼッタ抽出部４４は、ステップＳ４０８の処理として、図１１の画像において示されるオブジェクトと図１３（ｂ）において示されるオブジェクトとで一致する部分を抽出する。つまり、ロゼッタ抽出部４４は、図１１の画像において黒色により示される部分と、図１３（ｂ）の画像において黒色で示されている部分とでその座標が一致する領域を抽出する。図１４（ｃ）は、このようにステップＳ４０９により抽出された領域を白抜きの矢印で示すように黒色により示している。このように抽出された領域がロゼッタ１００である。
そして、ロゼッタ抽出部４４は、このようにステップＳ４０８により抽出したロゼッタ
示される画像（ロゼッタ抽出画像）を出力する（ステップＳ４０９）。

なお、この図１０のフローチャートに示す処理は、図９における１つの撮像時刻に対応して生成された１つの全焦点画像としての原画像を対象として行われる。これまでの説明から理解されるように、全焦点画像は撮像時刻ごとの集合によりタイムラプス画像を形成する。
これに伴い、ロゼッタ抽出部４４は、図１０により説明した処理を、撮像時刻ごと対応する全焦点画像ごとに行う。そして、ロゼッタ対応判定部４６は、例えば、各撮像時刻の焦点画像から抽出されたロゼッタ１００の状態を比較することにより、時間経過に応じた状態変化に基づく判定を行うことができる。

［神経突起抽出のための画像処理］
次に、神経突起３００を抽出するために神経突起抽出部４５が実行する画像処理の手順例について説明する。
前述のように、神経突起抽出部４５は、神経突起３００だけではなく死細胞と生細胞についても抽出する。そこで、図１５を参照して位相差画像である原画像において観察される神経突起３００と死細胞と生細胞の特徴について説明する。
なお、神経突起３００の抽出に利用する位相差画像は、全焦点画像ではなく単焦点画像である。ロゼッタ１００は細胞が集まった立体構造であるために高さがあるが、神経突起３００の場合にはさほどの高さは生じない。このため、神経突起３００については全焦点画像を利用しなくとも十分に高い精度で抽出が行える。

図１５（ａ）は、神経突起３００が出現している神経前駆細胞を撮像して得られた単焦点画像の一例を示している。図１５（ｂ）は、図１５（ａ）の単焦点画像において存在している神経突起３００と死細胞２４０と生細胞２５０とを区分して示したものである。なお、生細胞２５０は、神経突起３００以外の生きた細胞であり、具体的には細胞体２１０として生きている状態のものである。また、死細胞２４０は、死んでしまった状態の細胞体２１０と神経突起３００を含むものである。

単焦点画像は位相差顕微鏡を介して撮像された位相差画像である。位相差画像では、例えば起伏の大きい部分は明るく、起伏が小さい部分は暗くなるという特徴がある。
図１５（ａ）と図１５（ｂ）から理解されるように、神経突起３００は、位相差画像において、線状の暗い部分として観察される。そこで、神経突起抽出部４５は、単焦点画像（第１の原画像）において輝度が周囲よりも低く細い線状の部分を神経突起３００として抽出する。
また、死細胞２４０は、位相差画像において、明るい小さな円形が暗い線により縁取りされたような粒状の部分として観察される。そこで、神経突起抽出部４５は、単焦点画像において、輝度が一定以上で、その縁の輝度勾配が一定以上の粒状の部分を死細胞２４０として抽出する。
また、生細胞２５０は、位相差画像において、比較的大きく暗い塊であって、かつ、その周囲が明るく縁取られるような状態の部分として観察される。そこで、神経突起抽出部４５は、単焦点画像において、輝度が一定以下で、その面積が一定以上で、その縁の輝度が一定以上の部分を生細胞２５０として抽出する。

図１６のフローチャートは、神経突起抽出部４５が神経突起３００と、死細胞２４０と、生細胞２５０とを抽出するための処理手順例を示している。
まず、神経突起抽出部４５は、神経突起３００の抽出のために撮像装置３３ａにより撮像された単焦点画像を原画像として入力する（ステップＳ５０１）。なお、この際に、神経突起抽出部４５は、例えば神経突起３００の抽出のために撮像装置３３ａにより撮像させ、記憶部４１に記憶させた単焦点画像を入力すればよい。

神経突起抽出部４５は、入力した原画像としての位相差画像から死細胞２４０に対応する特徴を有する画像領域を抽出するためのソフトマッチングを実行する（ステップＳ５０２）。このステップＳ５０２におけるソフトマッチングとして、神経突起抽出部４５は、例えば明るい輪郭により周囲が縁取られた部分をオブジェクトとして抽出する処理を行う。

図１７は、ステップＳ５０２としてのソフトマッチングの処理結果例を示している。
図１７（ａ）は、ステップＳ５０１により入力した原画像の一例を示している。ステップＳ５０２のソフトマッチングにより、神経突起抽出部４５は、図１７（ａ）の原画像から、図１７（ｂ）において黒色により強調されるように囲まれる領域をオブジェクトとして抽出する。このように抽出されたオブジェクトは、死細胞２４０である可能性が高い。

また、神経突起抽出部４５は、生細胞２５０の抽出のために、ステップＳ５０１により入力した原画像についてクロージングの画像処理を行い（ステップＳ５０３）、さらに、このクロージングした画像を二値化する（ステップＳ５０４）。

図１８（ａ）〜（ｃ）は、ステップＳ５０３とＳ５０４によるクロージングと二値化の画像処理の結果を示している。
図１８（ａ）は、ステップＳ５０１により入力した原画像の一例である。神経突起抽出部４５が、図１８（ａ）の原画像に対してクロージングを行うことにより、図１８（ｂ）に示す画像が得られる。このクロージングの処理によっては細い黒い溝が埋められる。これにより、生細胞２５０に対応する黒色の塊部分は保存されるが、例えば神経突起３００に対応する細い黒色の部分や、死細胞２４０のように小さい暗い円の周囲が明るい部分は周囲の濃度で埋められる。
次に、神経突起抽出部４５は、図１８（ｂ）の画像をステップＳ５０４により二値化することにより、黒色とされた部分の領域をオブジェクトとして抽出する。このように抽出されたオブジェクトは、図１８（ｃ）において黒色により示す領域である。このように抽出されたオブジェクトは、生細胞２５０である可能性が高い。

また、神経突起抽出部４５は、神経突起３００の抽出のために、ステップＳ５０３のクロージングが行われた画像から、ステップＳ５０１により入力した原画像を差し引いた差分画像を生成する（ステップＳ５０５）。次に、神経突起抽出部４５は、この差分画像を二値化する（ステップＳ５０６）。

図１８（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）は、ステップＳ５０５とＳ５０６によるクロージングと二値化の画像処理の結果を示している。つまり、神経突起抽出部４５が、ステップＳ５０５により、ステップＳ５０３によりクロージングした図１８（ｂ）の画像に対する図１８（ａ）の原画像の差分を求めることにより、図１８（ｄ）に示す差分画像が得られる。このように生成された差分画像は、例えば原画像における生細胞２５０に対応する暗い塊部分が除去された画像である。そして、神経突起抽出部４５が、ステップＳ５０６により、この差分画像を二値化することにより、図１８（ｅ）に示す画像が得られる。この図１８（ｅ）に示す画像における白色の部分は、原画像としての原画像において暗く細い部分を示すオブジェクトであり、神経突起３００である可能性が高い。

また、神経突起抽出部４５は、生細胞２５０を抽出するにあたり、ステップＳ５０１により入力した原画像について二値化を行う（ステップＳ５０７）。そのうえで、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５０７により二値化された画像と、ステップＳ５０４により二値化された画像とでオブジェクトが共通する画像部分（オブジェクトの積）を抽出する（ステップＳ５０８）。

図１９は、ステップＳ５０７とＳ５０８の画像処理に対応する画像例を示している。図１９（ａ）は、ステップＳ５０１により入力した原画像の例である。図１９（ｂ）は、ステップＳ５０７により、図１９（ａ）の原画像を二値化した画像と、ステップＳ５０４により二値化された画像とを重ね合わせた状態を示している。

図１９（ｂ）において白抜きで示す部分は、ステップＳ５０７により二値化された画像において白の階調に分類された部分である。また、同じ図１９（ｂ）において輝度が最も低い黒色で示す部分は、ステップＳ５０４により二値化された画像において黒の階調に分類された部分に対応するオブジェクトである。この黒色で示すオブジェクトは、原画像において暗い塊の領域に該当する。

そして、神経突起抽出部４５がステップＳ５０８の処理を実行することで、図１９（ｂ）のようにステップＳ５０４により二値化された画像におけるオブジェクトのうちで、その周囲に明るい縁取りが無いものについては、除外される。このステップＳ５０８の処理結果を図１９（ｃ）に示す。具体的に、図１９（ｂ）において破線で括って示す領域において抽出されていた４つのオブジェクトは、原画像においてその周囲が明るくないものであったために、図１９（ｃ）においては、除外されている。このように、ステップＳ５０８の処理が行われる結果、原画像における暗い塊のうちその周囲が明るく縁取られたもののみがオブジェクトとして抽出される。このことは、例えばステップＳ５０４による二値化画像から、生細胞２５０に該当するオブジェクトの絞り込みを行ったこと意味している。つまり、ステップＳ５０８によっては、高い精度で生細胞２５０に該当するオブジェクトが抽出される。

また、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５０６により二値化された画像から、以下のように神経突起３００に対応するオブジェクトを抽出する。図１８（ｅ）にて説明したようにステップＳ５０６により二値化された画像において白の階調に分類された部分のオブジェクトは原画像において暗く細い部分であり、したがって神経突起３００である可能性が高い。ただし、ステップＳ５０６により二値化された画像の段階では、まだ、死細胞２４０や生細胞２５０などのノイズ成分がオブジェクトの中に比較的多く混在している可能性が高い。

そこで、神経突起抽出部４５は、神経突起３００に対応するオブジェクトの抽出のために、ステップＳ５０６により二値化された画像から、ステップＳ５０２のソフトマッチングにより処理された画像を差し引いた差分画像を生成する（ステップＳ５０９）。

ステップＳ５０２のソフトマッチングにより処理された画像では、前述のように、死細胞２４０に対応する特徴を有する画像領域がオブジェクトとして抽出されている。したがって、ステップＳ５０９により生成された差分画像は、ステップＳ５０６により二値化された画像のオブジェクトから死細胞２４０に対応するオブジェクトを除外した内容を有する画像である。

また、神経突起抽出部４５は、さらに、ステップＳ５０９により生成した差分画像から、ステップＳ５０８により抽出されたオブジェクトの画像を差し引いた差分画像を生成する（ステップＳ５１０）。ステップＳ５０８により抽出されたオブジェクトは、前述のように生細胞２５０に対応する。したがって、ステップＳ５１０により生成された差分画像においては、さらに生細胞２５０に対応するオブジェクトが除外される。つまり、ステップＳ５１０により生成された差分画像は、神経突起３００の候補であるオブジェクトのうちから、死細胞２４０と生細胞２５０である可能性が高いオブジェクトを除外した内容を有する。

図２０（ａ）は、ステップＳ５０６により二値化された画像の例を示している。また、図２０（ｂ）は、図２０（ａ）の画像の生成元となった原画像を利用してステップＳ５０２によるソフトマッチングを行った画像を示している。また、図２０（ｃ）は、ステップＳ５０８により抽出されたオブジェクトを示す画像である。
例えば、ステップＳ５０９とステップＳ５１０の処理は、図２０（ａ）に示す画像に対して、図２０（ｂ）に示す画像と図２０（ｃ）に示す画像の両者を差し引く処理に相当する。

次に、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１０により生成した差分画像から、さらに、神経突起３００に対応するオブジェクトを絞り込むための処理を以下のように実行する。
前述のように神経突起３００は、位相差画像としての原画像において細く暗い部分として観察されるのであるが、その長さが一定以下のものについては、神経突起３００ではなく、例えば生細胞２５０などである可能性が高い。したがって、ステップＳ５１０により生成された差分画像において示されるオブジェクトのうちで長さが一定以下のものについては除外すれば、より高い精度で神経突起３００を抽出できる。

そこで、つまり、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１０により生成した差分画像において示される神経突起３００の候補のオブジェクトについて細線化処理を実行する（ステップＳ５１１）。なお、この細線化処理の方式についてはここでは特に限定されない。

図２１（ａ）は、ステップＳ５１０により生成された差分画像の内容例を示している。この図において、輝度が最も低い黒色により示されている部分が神経突起３００の候補として抽出されたオブジェクトである。
神経突起抽出部４５が図２１（ａ）の画像のオブジェクトに対する細線化を施すことにより、図２１（ｂ）に示す画像が得られる。この図２１（ｂ）から分かるように、ステップＳ５１１の細線化によって、図２１（ａ）においてある程度の太さを有していたオブジェクトが線状に変換される。このようにオブジェクトが線状化されたことにより、オブジェクトを長さにより定量化できる。

そこで、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１１により細線化されたオブジェクトのうちから、その長さが一定以上のもののみを選別する（ステップＳ５１２）。具体的に、神経突起抽出部４５は、例えば細線化されたオブジェクトのうちで、その長さが予め設定した閾値未満のものについては削除し、閾値以上のもののみを残す。

次に、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１２により選別されたオブジェクトを元の太さに復元する（ステップＳ５１３）。
図２１（ｃ）は、ステップＳ５１２により復元されたオブジェクトを示す画像例を示している。ここで、図２１（ａ）において破線で括って示す領域に存在していたオブジェクトは、その長さが一定未満であったためにステップＳ５１２により削除されたため、図２１（ｃ）の復元段階においては存在していない。このようにステップＳ５１３により復元された段階の画像においては、死細胞２４０や生細胞２５０などに対応するノイズが除去され、神経突起３００に対応するオブジェクト高い精度で抽出されている。
そして、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１３により復元したオブジェクトを示す画像を、神経突起３００を抽出した結果として出力する（ステップＳ５１４）。

前述のように、ステップＳ５０２のソフトマッチングによっては、死細胞２４０に対応する部分として、明るい輪郭により周囲が縁取られた部分をオブジェクトとして抽出した画像が得られる。そのうえで、神経突起抽出部４５は、より高い精度で死細胞２４０を抽出するために、以下の処理を実行する。

つまり、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５０１により入力した原画像についてダイレーション（膨張）を行い（ステップＳ５１５）、さらに、このステップＳ５１５によりダイレーションを行った画像から、ステップＳ５０１により入力した原画像を差し引いた差分画像を生成する（ステップＳ５１６）。

次に、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１６により生成された差分画像について二値化する（ステップＳ５１７）。そして、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１７により二値化した画像におけるオブジェクトと、ステップＳ５０２のソフトマッチングにより抽出したオブジェクトとで共通となる部分をオブジェクトとして抽出する（ステップＳ５１８）。

図２２は、ステップＳ５１５とステップＳ５１６の処理に対応する画像例を示している。図２２（ａ）は、ステップＳ５０１により入力した原画像の例であり、図２２（ｂ）は、図２２（ａ）の原画像をステップＳ５１６によりダイレーションした画像である。また、図２２（ｃ）は、ステップＳ５１６により、図２２（ａ）の画像から、図２２（ａ）の画像を差し引いた画像である。この図２２（ｃ）に示す画像においては、濃度勾配の大きい部分が強調された状態となっている。

また、図２３は、ステップＳ５１７とＳ５１８の処理に対応する画像例を示している。
図２３（ａ）は、図２２（ｃ）に示した差分画像をステップＳ５１７により二値化して、白の階調に分類された部分をオブジェクトとして抽出した例を示している。
そして、図２３（ｃ）は、ステップＳ５０８により、図２３（ａ）に示されるオブジェクトと図２３（ｂ）に示されるオブジェクトとで共通となる部分として抽出したオブジェクトを示す画像である。図２３（ｂ）と図２３（ｃ）を比較して分かるように、ステップＳ５１８の段階では、ソフトマッチングにより抽出されたオブジェクトから、さらに死細胞２４０としてのオブジェクトが絞り込まれている。

これまでの説明から理解されるように、ステップＳ５０８により抽出されたオブジェクトは生細胞２５０に対応する。しかし、ステップＳ５０８の段階では、現実には個別のものであるのに係わらず、互いが近接しているために、複数の生細胞２５０に対応するオブジェクトが１つのオブジェクトとしてつながった状態で抽出されている場合がある。この点については、ステップＳ５１８によって抽出された死細胞２４０のオブジェクトについても同様のことがいえる。

例えば、神経突起３００の状態判定にあたり、生細胞２５０と死細胞２４０の数は有効な判定要素となる。このために、抽出結果における生細胞２５０と死細胞２４０のそれぞれに対応するオブジェクト数はできるだけ正確であることが好ましい。
そこで、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５０８により抽出された生細胞２５０のオブジェクトについて領域分割の画像処理を実行する（ステップＳ５１９）。つまり、神経突起抽出部４５は、複数の生細胞２５０が重複して１つとして抽出されたものとして推定されるオブジェクトを複数の生細胞２５０ごとに対応して分割する。これにより、互いに接触して１つのオブジェクトとして抽出されている生細胞２５０のオブジェクトが複数に分割される。また、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１８により抽出された死細胞２４０オブジェクトについて領域分割の画像処理を実行する（ステップＳ５２１）。これにより、互いに接触して１つのオブジェクトとして抽出されている死細胞２４０のオブジェクトが複数に分割される。

ステップＳ５１９またはＳ５２１における領域分割のためのアルゴリズムとしては特に限定されないが、有効なものの１つとして水分界分離アルゴリズムが知られている。
図２４（ａ）、（ｂ）は、水分界分離による領域分割を模式的に示している。例えば、図２４（ａ）には、円形の２つのオブジェクトＯＢＪ１とオブジェクトＯＢＪ２との一部が重なるように接触した状態が示されている。この場合において、水分界分離のアルゴリズムにより分割領域を行うことで、オブジェクトＯＢＪ１とオブジェクトＯＢＪ２は、図２４（ｂ）に示すように分離される。

そのうえで、生細胞２５０は、死細胞２４０と比較すると大きく、その形状も比較的多様である。一方、死細胞２４０は比較的小さく、また、原画像上では円形に近い状態で存在している。
そこで、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１９とステップＳ５２１で、以下のように、生細胞２５０と死細胞２４０のそれぞれに適合させた領域分割を行う。

具体的に、図２４（ｃ）、（ｄ）は、ステップＳ５１９による生細胞２５０のオブジェクトに対する領域分割の例を示している。図２４（ａ）は領域分割前の画像（つまり、ステップＳ５０８により抽出されたオブジェクトが示される画像）であり、図２４（ｂ）は、領域分割後の画像である。

図２４（ａ）において２つの生細胞２５０のオブジェクトが接触している可能性がある（分水界である）として推定される部位は、例えば破線Ａと破線Ｂで括って示す部位である。ここで、破線Ａにより示される部位において２つのオブジェクトが重なり合っているとした場合、これらのオブジェクトを分割した際の分割線（分水界）は、ある程度長いものとなる。一方、破線Ｂにより示される部位において２つのオブジェクトが重なり合っているとした場合のオブジェクト間の分水界の長さは、破線Ａにより示される部分と比較して相当に短い。

生細胞２５０には、前述のように、その形状が多様であるという特徴がある。この点からすると、破線Ａで括って示す部位を含むオブジェクトは、現実においても１つの生細胞２５０である可能性が高い。これに対して、破線Ｂで括って示す部位については、現実には２つ存在するオブジェクトが重なっている部分である可能性が高い。そこで、生細胞２５０に対応するステップＳ５１９の領域分割にあたり、神経突起抽出部４５は、重複している部分を分割した場合の分水界（分割線）の長さが一定以下となる場合にのみ分割を行うようにする。これにより、図２４（ｃ）に示される画像を対象に領域分割を行った場合には、図２４（ｄ）に示すようになる。つまり、破線Ａで示す領域は分割されず、破線Ｂで示す領域が分割される。

一方、死細胞２４０は、前述のように、比較的小さく、その形状も円形に近い粒状である。そこで、生細胞２５０に対応するステップＳ５１９の領域分割にあたり、神経突起抽出部４５は、例えば分水界であると検出された部位について、その長短に係わらずすべて分割する。
図２４（ｅ）は、ステップＳ５１８にて抽出されたオブジェクトが示される画像の一例である。この画像においては、破線Ｃで示す部分が分水界として推定されている。そこで、神経突起抽出部４５は、図２４（ｆ）に示すように、ステップＳ５２１により、破線Ｃで示す部分を分割するように領域分割を行う。

そして、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５１９により分割領域を行った後のオブジェクトの抽出結果を生細胞２５０の抽出結果として出力する（ステップＳ５２０）。また、神経突起抽出部４５は、ステップＳ５２１により分割領域を行った後のオブジェクトの抽出結果を死細胞２４０の抽出結果として出力する（ステップＳ５２２）。

なお、この図１６のフローチャートに示す処理も、図９における１つの撮像時刻に対応して生成された単焦点画像としての原画像を対象として行われるものである。したがって、神経突起抽出部４５は、タイムラプス画像を形成する単焦点画像ごとに対応して図１６の処理を実行する。

このように、本実施形態においては、画像からロゼッタ１００と神経突起３００を抽出し、この抽出結果に基づいてロゼッタ１００や神経突起３００の状態を判定する。つまり、本実施形態においては、インキュベータ１１によりロゼッタ１００と神経突起３００の抽出と、この抽出結果に基づく各種の判定とが自動で行われる。これにより、本実施形態においては、人的労力の軽減が図られる。
また、本実施形態においては、細胞を撮像した画像の内容に基づいてロゼッタの状態を判定しているので、非侵襲により安定的に神経細胞の分化状態が評価できる。本実施形態では、非侵襲によりロゼッタ１００や神経突起３００を有効に抽出可能な画像形式として、位相差画像を採用しているものである。
また、本実施形態では、インキュベータ１１内で培養されている環境の細胞を撮像するようにしているので、撮像のために培養を中断してインキュベータから取り出す必要が無い。これにより、培養過程の細胞の品質が劣化せず安定する。

なお、本実施形態においては、ロゼッタ１００とともに神経突起３００も抽出し、これらの構造物の状態に基づいて細胞の状態を総合的に判定しているが、例えばロゼッタ１００のみにより細胞の状態を判定してもよい。ただし、神経突起３００の抽出結果も併用したほうが、より信頼性の高い判定結果が期待できる。
また、ロゼッタ１００とともに抽出する構造物については、例えば神経管など、神経突起３００以外のであってもよい。また、ロゼッタ１００と神経突起３００を抽出したうえで、さらに他の構造物も抽出し、これらの抽出結果に基づいて細胞の状態判定を行うようにしてもよい。

また、図３における各部の機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより構造物の抽出および状態の判定などを行ってもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。

また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。
また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（ＲＡＭ）のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良く、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。

以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。

１１ インキュベータ
１２ 上部ケーシング
１３ 下部ケーシング
１４ ベースプレート
１５ 恒温室
１５ａ 温度調整装置
１５ｂ 湿度調整装置
１６ 大扉
１７ 中扉
１８ 小扉
１９ 培養容器
２１ ストッカー
２２ 観察ユニット
２３ 容器搬送装置
２４ 搬送台
３１ 試料台
３２ スタンドアーム
３３ 本体部分
３３ａ 撮像装置
３３ｂ ＬＥＤ光源
３４ 垂直ロボット
３５ 回転ステージ
３５ａ 回転軸
３６ ミニステージ
３７ アーム部
４０ 制御装置
４１ 記憶部
４２ 画像入力部
４３ 全焦点画像生成部
４４ ロゼッタ抽出部
４５ 神経突起抽出部
４６ ロゼッタ対応判定部
４７ 神経突起対応判定部
４８ 総合判定部
４９ 装置制御部
５１ 回収装置
５２ 播種装置
５３ 培地交換装置
１００ ロゼッタ
２００ 神経細胞
２１０ 細胞体
２２０ 軸索
２３０ 樹状突起
２４０ 死細胞
２５０ 生細胞
３００ 神経突起

Claims (9)

1. 神経細胞分化過程の細胞を撮像した第１の撮像画像を入力する画像入力部と、
   細胞の厚さ方向の位置において焦点の合った状態の全焦点画像を、少なくとも前記第１の撮像画像に基づく第１の原画像として生成する全焦点画像生成部と、
   前記第１の原画像において一定以下の輝度分布を有する領域と、前記第１の原画像において濃度差が一定以下の領域とで共通する領域を、分化過程に出現するロゼッタとして抽出するロゼッタ抽出部と、
   抽出された前記ロゼッタの状態を判定するロゼッタ対応判定部と、
   を備える細胞評価装置。
2. 前記ロゼッタ対応判定部は、
   判定したロゼッタの状態に基づいて前記細胞の分化に関連する工程又は将来予測についての判定を行う、
   請求項１に記載の細胞評価装置。
3. 前記画像入力部は、
   前記ロゼッタ以外の所定の構造物が出現する分化過程の細胞を撮像した単焦点画像である第２の撮像画像を入力し、
   前記所定の構造物を前記第２の撮像画像に基づく第２の原画像から抽出する構造物抽出部と、
   抽出された前記構造物の状態を判定する構造物対応判定部とをさらに備える、
   請求項１又は請求項２に記載の細胞評価装置。
4. 前記構造物対応判定部は、
   判定した前記構造物の状態に基づいて前記細胞の分化誘導に関連する前記構造物の分化状態又は前記構造物の品質についての判定を行う、
   請求項３に記載の細胞評価装置。
5. 前記ロゼッタ対応判定部の判定結果と前記構造物対応判定部の判定結果とに基づいて、前記細胞の分化培養に関連する分化状態又は分化効率についての判定を行う総合判定部をさらに備える、
   請求項３又は請求項４に記載の細胞評価装置。
6. 前記画像入力部は、
   位相差顕微鏡により前記細胞を観察した位相差画像を撮像した前記第１の撮像画像を入力する、
   請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の細胞評価装置。
7. 前記全焦点画像生成部は、
   前記細胞の予め決定されたｘｙ平面上における撮像位置を前記細胞の深さ方向に添って焦点位置を変更して撮像された複数の単焦点画像としての前記第１の撮像画像を取得し、前記複数の単焦点画像の各々を合成することにより、細胞の厚さ方向の位置において焦点の合った状態の全焦点画像を、少なくとも前記第１の原画像として生成する
   請求項６に記載の細胞評価装置。
8. 神経細胞分化過程の細胞を撮像した撮像画像を入力する画像入力ステップと、
   細胞の厚さ方向の位置において焦点の合った状態の全焦点画像を、少なくとも前記撮像画像に基づく第１の原画像として生成する全焦点画像生成ステップと、
   前記第１の原画像において一定以下の輝度分布を有する領域と、前記第１の原画像において濃度差が一定以下の領域とで共通する領域を、分化過程に出現するロゼッタとして抽出するロゼッタ抽出ステップと、
   抽出された前記ロゼッタの状態を判定するロゼッタ対応判定ステップと、
   を備えることを特徴とする細胞評価方法。
9. コンピュータに、
   神経細胞分化過程の細胞を撮像した撮像画像を入力する画像入力ステップ、
   細胞の厚さ方向の位置において焦点の合った状態の全焦点画像を、少なくとも前記撮像画像に基づく第１の原画像として生成する全焦点画像生成ステップ、
   前記第１の原画像において一定以下の輝度分布を有する領域と、前記第１の原画像において濃度差が一定以下の領域とで共通する領域を、分化過程に出現するロゼッタとして抽出するロゼッタ抽出ステップ、
   抽出された前記ロゼッタの状態を判定するロゼッタ対応判定ステップ、
   を実行させるためのプログラム。