WO2015133193A1 - 細胞画像評価装置および方法並びにプログラム - Google Patents

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WO2015133193A1
WO2015133193A1 PCT/JP2015/051394 JP2015051394W WO2015133193A1 WO 2015133193 A1 WO2015133193 A1 WO 2015133193A1 JP 2015051394 W JP2015051394 W JP 2015051394W WO 2015133193 A1 WO2015133193 A1 WO 2015133193A1
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cell image
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PCT/JP2015/051394
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松本　剛
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富士フイルム株式会社
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    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • the present invention relates to a cell image evaluation apparatus, method, and program for evaluating a cell obtained by imaging a cell.
  • pluripotent stem cells such as ES cells, iPS cells, and STAP cells and differentiation-induced cells are imaged with a microscope and the like, and the culture state of the cells is determined by capturing the characteristics of the images. Yes.
  • Patent Literature 1 and Patent Literature 2 propose a method of acquiring a morphological feature amount of a cell from a cell image obtained by imaging a cell and evaluating a mixture ratio of cancer cells in the cell image based on the feature amount. Has been.
  • Patent Document 3 proposes that a cell image analysis program is set in advance for each cell type, and that the cell image is analyzed according to the cell type using the analysis program.
  • Patent Document 4 a method for automatically specifying a cell colony region from a cell image is proposed.
  • the morphology of the stem cell colonies changes according to the culture period. Specifically, for example, in the initial stage of culture, undifferentiated cells are uniformly distributed in the colony region, but as the culture progresses, differentiation begins at the periphery of the colony region and differentiated cells are distributed. Become.
  • stem cell colony In response to such locally different morphological changes in stem cell colonies, for example, if the same evaluation method is used for the entire stem cell colony, the state of the stem cell colony is evaluated appropriately. There are cases where it is not possible. For example, a stem cell colony is laminated at the center when the culture proceeds to some extent. In such a case, if the whole stem cell colony is evaluated using the morphology of individual cells, it is very difficult to recognize individual cells by stacking at the center. It cannot be evaluated properly.
  • Patent Document 1 to Patent Document 4 nothing has been proposed about considering different morphological changes for each local region of the stem cell colony as described above.
  • the present invention provides a cell image evaluation apparatus, method, and program capable of appropriately evaluating the state of a stem cell colony according to different morphological changes for each local region of the cell colony. Objective.
  • the cell image evaluation apparatus of the present invention includes an image acquisition unit that acquires a cell image obtained by photographing a cell, a cell evaluation unit that evaluates a cell image, and local region specific information in a cell colony region in the cell image.
  • a local region information acquisition unit to acquire, and the cell evaluation unit determines, for each local region in the colony region, an evaluation method for the cell image in the region based on the local region identification information. Then, the cell image of the region is evaluated using the determined evaluation method.
  • the cell evaluation unit may determine an evaluation method based on the luminance distribution of the cell image of the region. it can.
  • the cell evaluation unit can determine the evaluation method based on the state of each cell included in the cell image of the region.
  • the cell evaluation unit can determine the evaluation method based on the halo image included in the cell image of the region.
  • the cell evaluation unit can determine the evaluation method based on the contrast of the edge of the colony region included in the cell image of the region.
  • a maturity level information acquisition unit that acquires information related to the maturity level of the cell
  • the cell evaluation unit is configured to determine the local region-specific information based on the local region specific information and the information related to the maturity level. The evaluation method can be determined.
  • information on a cell culture period can be used.
  • the maturity level information acquisition unit can acquire information related to the maturity level by analyzing the image information of the colony region.
  • information relating to the shape or size of the colony region can be used as information relating to maturity.
  • the cell evaluation unit can determine an evaluation method for each local region based on the local region specific information, information related to maturity, and cell culture conditions.
  • a pre-evaluation unit that performs a pre-evaluation of the cell image is provided before the evaluation of the cell image in the local region, and the cell evaluation unit applies the cell image in the local region based on the result of the pre-evaluation.
  • An evaluation method can be determined.
  • the local area information acquisition unit can acquire local area specific information based on the cell image of the colony area.
  • the cell evaluation unit can determine an evaluation method for each local region based on the local region specific information and the cell type.
  • the cell evaluation unit can specify the type of cell based on the cell image of the colony region.
  • the cell image evaluation method of the present invention acquires a cell image obtained by photographing a cell, acquires local area specifying information in a colony area of the cell in the cell image, and acquires the acquired local area specifying information. Based on each local region in the colony region, an evaluation method for the cell image in the region is determined, and the cell image in the region is evaluated using the determined evaluation method. .
  • the cell image evaluation program of the present invention includes a computer, an image acquisition unit that acquires a cell image obtained by photographing a cell, a cell evaluation unit that evaluates a cell image, and a local region in a cell colony region in the cell image.
  • a cell image evaluation program that functions as a local region information acquisition unit that acquires specific information, in which the cell evaluation unit determines the region for each local region in the colony region based on the local region specific information. An evaluation method for each cell image is determined, and a cell image in the region is evaluated using the determined evaluation method.
  • local region specific information in a cell colony region in a cell image is acquired, and the local region is determined based on the local region specific information.
  • the evaluation method for the cell image in the area was determined, and the cell image of the area was evaluated using the determined evaluation method. Therefore, different morphological changes for each local area of the cell colony Accordingly, the state of the cell colony can be appropriately evaluated.
  • the block diagram which shows schematic structure of the stem cell culture observation system using one Embodiment of the cell image evaluation apparatus of this invention.
  • Diagram showing schematic configuration of phase contrast microscope The figure which shows an example of the form of the stem cell colony in the initial stage of culture, the middle stage of culture, and the latter stage.
  • the figure which shows an example of the table which matched the culture condition, the culture
  • the block diagram which shows the modification of the stem cell culture observation system using one Embodiment of the cell image evaluation apparatus of this invention
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a cell culture observation system.
  • the cell culture observation system of this embodiment includes a cell culture device 1, a cell image evaluation device 2, a photographing device 3, a display 4, and an input device 5, as shown in FIG.
  • the cell culture device 1 is a device for culturing cells.
  • Examples of cells to be cultured include pluripotent stem cells such as iPS cells, ES cells, and STAP cells, cells such as nerves, skin, heart muscle, and liver that are induced to differentiate from stem cells, and cancer cells.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells, ES cells, and STAP cells
  • cells such as nerves, skin, heart muscle, and liver that are induced to differentiate from stem cells, and cancer cells.
  • the cell culture device 1 includes a stage 10, a transport unit 11, and a control unit 12.
  • the stage 10 is provided with a culture vessel to be imaged by the imaging device 3.
  • the transport unit 11 selects a culture container to be imaged from among a plurality of culture containers accommodated at a predetermined position in the cell culture apparatus 1 and transports the selected culture container to the stage 10.
  • the control unit 12 controls the entire cell culture device 1 and controls environmental conditions such as temperature, humidity, and CO 2 concentration in the cell culture device 1 in addition to the operations of the stage 10 and the transport unit 11 described above.
  • the temperature, the configuration for adjusting the humidity and CO 2 concentration can be a known configuration.
  • the imaging device 3 captures a cell image of a cell in a culture vessel installed on the stage 10.
  • the imaging device 3 includes a phase contrast microscope 30 that captures cells and outputs a cell image, and a control unit 39 that controls the phase contrast microscope 30.
  • the phase contrast microscope 30 captures a phase image of the cells in the culture vessel installed on the stage 10.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a schematic configuration of the phase-contrast microscope 30.
  • the phase-contrast microscope 30 has a white light source 31 that emits white light and a ring-shaped slit, and the white light emitted from the white light source 31 is incident to emit ring-shaped illumination light.
  • an objective lens that irradiates the cells in the culture vessel 15 installed on the stage 10 with the ring-shaped illumination light emitted from the slit plate 32. 33.
  • a phase difference lens 34, an imaging lens 37, and an image sensor 38 are provided on the opposite side of the stage 10 from the white light source 31.
  • the phase difference lens 34 includes an objective lens 35 and a phase plate 36.
  • the phase plate 36 is configured by forming a phase ring on a transparent plate that is transparent to the wavelength of the ring-shaped illumination light.
  • the size of the slit of the slit plate 32 described above is in a conjugate relationship with this phase ring.
  • the phase ring includes a phase film that shifts the phase of incident light by a quarter wavelength and a neutral density filter that attenuates the incident light in a ring shape.
  • the direct light incident on the phase difference lens 34 is collected by the objective lens 35 and passes through the phase ring, so that the phase is shifted by 1 ⁇ 4 wavelength and the brightness is weakened.
  • most of the diffracted light diffracted by the cells in the culture vessel 15 passes through the transparent plate of the phase plate, and its phase and brightness do not change.
  • the phase difference lens 34 is moved in the direction of arrow A shown in FIG. 2 by a driving mechanism (not shown). As the phase difference lens 34 moves in this way, the focus position is changed and focus control is performed.
  • the drive mechanism moves the phase difference lens 34 based on the focus control signal output from the imaging control unit 25 of the cell image evaluation apparatus 2.
  • phase contrast microscope 30 of the present embodiment is configured such that a plurality of phase difference lenses 34 having different magnifications can be exchanged.
  • the phase difference lens 34 may be replaced automatically according to an instruction input from the user, or may be replaced manually by the user.
  • low-magnification imaging for macro observation and high-magnification imaging for detailed observation are performed.
  • a phase difference lens 34 of 1 to 4 times is used.
  • high-magnification imaging a 10 to 20 times phase difference lens 34 is used.
  • low magnification imaging and high magnification imaging only need to have relatively different magnifications, and are not limited to these magnifications.
  • the imaging lens 37 receives direct light and diffracted light that have passed through the phase difference lens 34 and forms an image of these lights on the image sensor 38.
  • the imaging element 38 captures a phase image of the cell by photoelectrically converting the image formed by the imaging lens 37.
  • a charge-coupled device (CCD) image sensor, a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) image sensor, or the like is used as the image sensor 38.
  • the phase contrast microscope 30 is used as the imaging device.
  • a microscope capable of changing other optical magnifications may be used.
  • a differential interference microscope may be used. Good.
  • the cell image evaluation apparatus 2 includes a low-magnification image acquisition unit 20 (corresponding to an image acquisition unit), a local region information acquisition unit 21, a maturity information acquisition unit 22, a cell evaluation unit 23, And a control unit 24.
  • the maturity level information acquisition unit 22 includes a feature amount acquisition unit 28, and the control unit 24 includes an imaging control unit 25 and a display control unit 26.
  • the cell image evaluation apparatus 2 is obtained by installing an embodiment of the cell image evaluation program of the present invention on a computer.
  • the cell image evaluation apparatus 2 includes a central processing unit, a semiconductor memory, a hard disk, and the like, and an embodiment of the cell image evaluation program of the present invention is installed on the hard disk.
  • this program is executed by the central processing unit, a low-magnification image acquisition unit 20, a local region information acquisition unit 21, a maturity information acquisition unit 22, a cell evaluation unit 23, a feature amount as shown in FIG.
  • the acquisition unit 28, the imaging control unit 25, and the display control unit 26 operate.
  • the low-magnification image acquisition unit 20 acquires a cell image captured by the phase-contrast microscope 30 by performing the low-magnification imaging described above.
  • the low-magnification captured image acquired by the low-magnification image acquisition unit 20 may be one image obtained by imaging one cell colony, or a plurality of image groups obtained by dividing one cell colony into a plurality of rectangular divided regions. Good. A plurality of cell colonies may be included in one image.
  • the low-magnification image acquisition unit 20 stores identification information for identifying cell colonies and low-magnification captured images in association with each other. For example, when one cell colony is captured with one low-magnification captured image, the identification information of the cell colony and the low-magnification captured image are stored in a one-to-one correspondence. When one cell colony is captured with low-magnification captured images of a plurality of divided regions, the identification information of the cell colonies and the low-magnification captured image groups of the plurality of divided regions are stored in association with each other. Further, when a plurality of cell colonies are captured with one low-magnification captured image, the identification information of each cell colony and one low-magnification captured image are stored in association with each other.
  • the identification information of the cell colony and the low-magnification captured image can be immediately read out and displayed.
  • the local region information acquisition unit 21 specifies a cell colony region in the low-magnification captured image acquired by the low-magnification image acquisition unit 20, and specifies a local region (hereinafter referred to as a local region) in the cell colony region.
  • Information (local area specific information) is acquired.
  • the location may be specified by automatically extracting the cell colony region by template matching or the like.
  • the display control unit 26 causes the display 4 to display a low-magnification captured image, the user designates a cell colony region in the low-magnification captured image using the input device 5, and the designated coordinates
  • the local area information acquisition unit 21 may acquire position information such as
  • examples of the local region include, but are not limited to, a central portion and a peripheral portion in the cell colony region.
  • the information specifying the local region may be set and input by the user using the input device 5 or may be specified based on the low-magnification captured image in the cell colony region.
  • a region where a specific type of cells is distributed is extracted based on a low-magnification captured image in the cell colony, and the extracted An area may be specified as a local area.
  • a known method can be used for extracting a specific type of cell region.
  • the local region may be specified by the density of individual cells.
  • relative position information with respect to the cell colonies such as a central part and a peripheral part in the cell colony is stored in advance in a memory or the like as information for specifying the local area, and this position information is stored in the local area information acquisition unit 21. May be acquired.
  • the maturity level information acquisition unit 22 acquires information related to the maturity level of cells. Information related to the maturity acquired by the maturity information acquisition unit 22 is used by the cell evaluation unit 23 when determining a method for evaluating the cell image of the cell colony region.
  • the cell maturity is divided into three stages, ie, the initial stage of culture, the middle stage of culture, and the late stage of culture, and information related to the maturity level of the cell is acquired by the maturity level information acquisition unit 22. Get the stage to which the maturity of the cell belongs.
  • the cell maturity is divided into the early stage of culture, the middle stage of culture and the late stage of culture.
  • the morphology of the cell colony differs depending on each stage, and it is desirable to determine the evaluation method of the cell image according to the form. Because.
  • undifferentiated cells are uniformly distributed in the colony region as shown in FIG. Then, at the middle of the culture, as shown in FIG. 3, undifferentiated cells are densely distributed in the central part of the colony region, and differentiated cells are distributed in the peripheral part. Moreover, although the center part of a colony area
  • differentiation is likely to occur in the central part of the colony region, and a so-called hole phenomenon may occur.
  • differentiated cells are distributed in the central part and the peripheral part of the colony region, and undifferentiated cells are distributed in an intermediate part between the central part and the peripheral part.
  • the shape of the cell colony region changes in the early stage of culture, the middle stage of culture, and the late stage of culture, and the change in shape varies depending on the local region in the cell colony region. Therefore, in this embodiment, the cell image evaluation method is determined for each culture period and each local area in the cell colony area. The evaluation method for each local area will be described in detail later.
  • the information related to the maturity level of the cell acquired by the maturity level information acquisition unit 22 may be any information as long as it is information indicating the stage of the maturity level of the cell.
  • the culture period measured by a timer or the like is used as the maturity level. It can be acquired as related information.
  • the image information of the cell colony region in the low magnification cell image is analyzed, and the size of the cell colony, the number of cells in the cell colony, or the number of cells per unit area smaller than the cell colony are calculated. You may measure and acquire such information as information relevant to maturity. For example, it is determined that the maturity degree is advanced as the number of measured cells is larger. As the size of the cell colony, the area, perimeter, maximum diameter, etc. of the cell colony can be obtained.
  • the brightness of the image of the cell colony region, and the texture such as uniformity and roughness may be acquired as information related to maturity.
  • the degree of maturity advances and the density of the stem cells increases, and the stem cells are further stacked to gradually increase the luminance of the image. Therefore, it can be said that the higher the brightness is, the more mature the progress is.
  • the feature quantity of the shape of the stem cell colony may be acquired.
  • the shape of the stem cell colony gradually approaches a circular shape, and then the differentiation of the peripheral portion proceeds and the complexity of the edge increases. Therefore, the feature amount of the change in the shape of the stem cell colony can be acquired as the feature amount related to the maturity.
  • the feature quantity of the thickness of the stem cell colony may be acquired. As the maturity of stem cells progresses, the stem cell colonies gradually become thicker. Therefore, such a feature quantity of the thickness of the stem cell colony can be acquired as a feature quantity related to maturity.
  • the thickness of the stem cell colony may be measured by a separately provided measuring device, or may be set and input by the user using the input device 5.
  • the user may set and input the cell passage number using the input device 5.
  • the maturity level information acquisition unit 33 acquires information related to the maturity level of the cells as described above, and acquires the stage of maturity level of the cells from this information.
  • the cell maturity is divided into three stages, but is not limited to three stages, and may be divided into two stages or four or more stages.
  • various intervals can be set for the intervals of each stage according to the culture conditions and the like.
  • the cell evaluation unit 23 Based on the information related to the maturity acquired in the maturity information acquisition unit 22 and the local region specific information acquired by the local region information acquisition unit 21, the cell evaluation unit 23 performs local detection in the colony region. A cell image evaluation method is determined for each region. In the present embodiment, an evaluation method is determined for each local region depending on whether the local region is the central part of the colony region or the peripheral region.
  • the cell evaluation unit 23 of the present embodiment has a table that associates the culture period and the position of the local region (the central portion and the peripheral portion of the colony region) as shown in FIG.
  • the cell image evaluation method is determined for each local region with reference to this table.
  • the cell evaluation unit 23 of the present embodiment also acquires culture conditions, and based on the acquired culture conditions and culture period, refer to the table shown in FIG. Decide how to evaluate the image.
  • the culture conditions include the type of scaffold and medium, and whether or not different types of heterogeneous cells (feeder cells) are used. Even in the same culture period, the morphological change of the colony region varies depending on these culture conditions.
  • the cell image evaluation method for each local region is determined in consideration of the culture conditions.
  • the culture conditions are not limited to the above-mentioned conditions, but may be any conditions as long as they affect the cell growth rate.
  • culture conditions such as temperature, humidity or CO 2 concentration are included. May be.
  • the culture condition information is set and input by the user using the input device 5, for example, but the temperature and humidity as described above may be the conditions measured with a thermometer or hygrometer.
  • the cell evaluation unit 23 is a state where the undifferentiated cells are uniformly distributed. It is a single layer, and it is possible to recognize individual cells by analyzing cell images. Therefore, the entire cell colony region is determined by an evaluation method based on the state (cell unit) of each cell.
  • the distribution state of individual cells may be acquired and the cell image may be evaluated based on the uniformity of the distribution state.
  • the cells to be evaluated are stem cells
  • the stem cells are evaluated to be in an undifferentiated state, and the stem cells are unevenly distributed in a concentrated manner. In some cases, it may be evaluated that some stem cells are differentiated.
  • the feature amount acquisition unit 28 acquires a feature amount serving as an evaluation criterion, such as the distribution state of the individual cells described above.
  • the distribution state of individual cells may be obtained by detecting, for example, a pattern of nucleolus of a cell, or a pattern of halo generated due to diffracted light passing between cells. You may make it acquire by doing. Diffraction occurs when the illumination light passes between cells. When the distance between cells (slit gap) is an integral multiple of the wavelength of the illumination light, the phase of the diffracted light ( ⁇ 1st order diffracted light) and direct light (0th order diffracted light) is synchronized, resulting in high brightness artifacts. appear. This high brightness artifact is halo.
  • the density of individual cells may be acquired by the feature amount acquisition unit 28, and the cell image may be evaluated based on the density. For example, when the cell to be evaluated is a stem cell, if the density is equal to or higher than a predetermined threshold, it is evaluated that the undifferentiated state is maintained well, and if the density is lower than the threshold, What is necessary is just to evaluate that differentiation is progressing and the undifferentiated state is not maintained.
  • the evaluation method of cell images based on the state of individual cells is not limited to the above evaluation method, and other known evaluation methods can be used.
  • the central part of the cell colony region becomes a stacked state due to the dense distribution of undifferentiated cells, and individual cells are recognized from the cell image. Is difficult.
  • the peripheral part of the cell colony region is in a state of maintaining a monolayer.
  • the cell evaluation unit 23 determines the evaluation method based on the luminance distribution of the cell image for the central part of the cell colony region, and the peripheral part of the cell colony region is the same as in the initial stage of the culture. Decide on a state-based evaluation method.
  • the feature amount acquisition unit 28 acquires the luminance distribution of the cell image at the center of the cell colony region, and evaluates the cell image based on the uniformity of the luminance distribution. You can do that.
  • the cell to be evaluated is a stem cell
  • the brightness distribution of the cell image in the center is uniform, it is evaluated that the undifferentiated state is maintained, and the brightness distribution is uneven. In other words, it may be evaluated that some stem cells are differentiated and do not maintain an undifferentiated state.
  • an evaluation method based on the state of individual cells with respect to the peripheral part of the cell colony region for example, an evaluation method similar to that in the initial stage of culture may be used.
  • both the central part of the cell colony region and the peripheral part of the cell colony region are evaluated, but only one of the local regions is evaluated, and the evaluation result For example, the degree of differentiation of the entire stem cell colony region may be evaluated.
  • the state of the entire cell colony region may be evaluated using both the evaluation result of the central part of the cell colony region and the evaluation result of the peripheral part as described above.
  • the evaluation value of the central portion and the evaluation value of the peripheral portion may be calculated, and for example, the degree of differentiation of the entire stem cell colony region may be evaluated based on the total value thereof. At this time, each evaluation value may be weighted and added.
  • the cell evaluation unit 23 determines the central part of the cell colony region by an evaluation method based on the luminance distribution of the cell image, but determines an evaluation method different from the evaluation method based on the luminance distribution in the middle period of culture.
  • holes may be formed as described above. For example, is there a closed region where the luminance is higher than a predetermined threshold and the area is not less than the predetermined threshold? It is sufficient to evaluate whether or not a hole is formed when such a region exists.
  • the periphery of the cell colony region is determined by the evaluation method based on the halo area. Specifically, the area of the halo may be calculated, and the degree of differentiation of the peripheral portion may be evaluated based on the area. For example, the greater the area of the halo, the higher the degree of differentiation may be evaluated.
  • the evaluation method is determined based on the contrast of the edge existing in the peripheral part of the cell colony region as in the case where the culture condition is the condition B in FIG. You may do it.
  • the feature amount acquisition unit 28 detects edges existing in the periphery of the cell colony region using a filter or the like, calculates the contrast of the edge, and determines the degree of differentiation of the periphery based on the contrast And so on. For example, the lower the edge contrast, the better the degree of differentiation may be evaluated.
  • the late stage of culture as in the case of the middle stage of culture, only the local area of either the central part or the peripheral part of the cell colony area is evaluated, and based on the evaluation result, the entire cell colony area is evaluated. The degree of differentiation may be evaluated. Similarly to the case of the middle stage of culture, the state of the entire cell colony region may be evaluated using both the evaluation result of the central part of the cell colony region and the evaluation result of the peripheral part.
  • the evaluation method of the cell image is determined based on the information related to the maturity of the cell, the culture condition, and the position of the local region in the cell colony region. Since the growth method and the change in form differ depending on the type of cell, the cell image evaluation method may be determined in consideration of the type of cell.
  • a table as shown in FIG. 4 is set for each cell type, and the cell evaluation unit 23 also acquires cell type information and determines a cell image evaluation method. That's fine. What is necessary is just to set suitably about the evaluation method for every local area
  • cell type information include pluripotent stem cells such as iPS cells, ES cells, and STAP cells as described above, cells such as nerves, myocardium, skin, and liver that are induced to differentiate from stem cells, and cancer cells. is there.
  • various cells constituting the myocardium such as myocardial cells, vascular endothelial cells, stromal cells,... are separately cultured and differentiated and then put into the same culture container. To self-organize by co-culture. At this time, vascular endothelial cells and stromal cells are arranged at a position where they want to become blood vessels, or myocardial cells are arranged at positions where they want to become myocardium, and various cells are arranged at predesigned positions. Is done.
  • the evaluation method is determined for each local region in the myocardial colony based on the placement information of the cells. Also good. For example, for local areas where cardiomyocytes are placed, evaluate the pulsation cycle, and for local areas where blood vessels are formed, evaluate whether there are any remaining undifferentiated cells or whether holes are formed. Or cell morphology such as blood vessel clogging may be evaluated.
  • the user may set and input the information on the cell type and the information on which cell is arranged in which position in the cell colony using the input device 5, for example.
  • the arrangement of various cells is not designed in advance, but may be completely self-organized.
  • the arrangement of blood vessels and myocardium is roughly specified, and the evaluation method according to the blood vessels and myocardium as described above is determined for the specified local region.
  • the local region information acquisition unit 21 identifies the local region to be evaluated and the types of cells included in the local region based on the low-magnification captured image of the myocardial colony, and identifies the identified cell for the identified local region. You may make it determine the evaluation method according to the kind of.
  • a blood vessel specifying method for example, a linear pattern may be extracted.
  • cardiomyocytes may be specified from the shape and movement of the cells.
  • the imaging control unit 25 outputs a control signal to the control unit 12 of the cell culture device 1 to control the movement of the stage 10 in the XY direction. Further, when the phase contrast microscope 30 is configured so that the magnification of the phase difference lens 34 can be automatically changed, the imaging control unit 25 has a low magnification phase difference lens 34 and a high magnification phase difference lens 34. And a control signal is output to the control unit 39 of the photographing apparatus 3 so that the above is changed. If the phase contrast microscope 30 is configured to manually change the magnification of the phase difference lens 34, the user can change the phase difference lens 34 to the high magnification phase difference lens 34 at the time of high magnification imaging. Good.
  • the display control unit 26 causes the display 4 to display a cell image picked up by the phase contrast microscope 30. Further, the display control unit 26 displays the evaluation result of the cell colony region by the cell evaluation unit 23 on the display 4.
  • the above-described evaluation result for each local region of the cell colony region may be displayed, or the cell colony region may be displayed based on the evaluation result for each local region.
  • the entire evaluation result may be displayed. Specifically, in the case of the present embodiment, the evaluation result of the central part of the cell colony region and the evaluation result of the peripheral part may be displayed, respectively, or the evaluation result of the central part and the peripheral evaluation result may be displayed.
  • the entire evaluation result may be displayed.
  • the culture to be photographed is selected from the plurality of accommodated culture containers by the transport unit 11, and the selected culture container 15 is placed on the stage 10 (S10).
  • the magnification of the phase difference lens 34 of the phase-contrast microscope 30 is set to a low magnification, and a low-magnification captured image is captured, and the captured low-magnification captured image is acquired by the low-magnification image acquisition unit 20 (S12). .
  • the low-magnification captured image acquired by the low-magnification image acquisition unit 20 is output to the display control unit 26 and displayed on the display 4 by the display control unit 26.
  • the low-magnification captured image acquired by the low-magnification image acquisition unit 20 is output to the local region information acquisition unit 21, and the local region information acquisition unit 21 performs the low-magnification based on the input low-magnification captured image.
  • the position of the cell colony region in the captured image is specified, and information specifying the local region in the cell colony region is acquired. (S14).
  • the maturity level information acquisition unit 22 acquires information on the culture period and information on the culture conditions as information related to the maturity level of the cells by setting input by the user (S16).
  • the information on the culture period and the culture condition acquired by the maturity information acquisition unit 22 is output to the cell evaluation unit 23, and the cell evaluation unit 23 specifies the information on the culture period and the culture condition and the local region.
  • the evaluation method of the cell image for each local region of the cell colony region is determined. That is, in this embodiment, the evaluation method of the cell image of the center part of a cell colony area
  • the display control unit 26 displays the input evaluation result of the cell colony region on the display 4 (S22).
  • the local region in the colony region of the cell in the cell image is specified, and the evaluation method for the cell image in the local region is determined for each local region in the colony region. And since the cell image of a local region was evaluated using the determined evaluation method, a stem cell colony can be appropriately evaluated according to a different morphological change for each local region of a cell colony.
  • the evaluation method for each local region is set in advance as a table.
  • the present invention is not limited to this, and as shown in FIG.
  • a pre-evaluation unit 27 that performs pre-evaluation of the cell image is further provided. Based on the result of the pre-evaluation by the pre-evaluation unit 27, the cell evaluation unit 23 determines an evaluation method for the cell image for each local region. You may make it do.
  • the pre-evaluation unit 27 evaluates in advance whether or not each cell can be identified for the cell image in the local region, and when each cell can be identified, as described above. If the evaluation method based on individual cells is determined and individual cells cannot be identified, the evaluation method based on the luminance distribution as described above may be used. Whether or not individual cells can be identified may be evaluated, for example, by contrast of the edges of the individual cells.
  • a high-magnification captured image obtained by high-magnification imaging of cells in a local region is acquired, and the display control unit 26 displays the high-magnification image on the display 4. Also good.

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Abstract

　細胞コロニーの局所的な領域毎の異なる形態変化に応じて幹細胞コロニーの状態を適切に評価する細胞画像評価装置および方法並びにプログラムを提供する。細胞を撮影した細胞画像を取得する低倍率画像取得部２０と、細胞画像を評価する細胞評価部２３と、細胞画像における細胞のコロニー領域内の局所的な領域の特定情報を取得する局所領域情報取得部２１とを備え、細胞評価部２３が、局所的な領域の特定情報に基づいて、コロニー領域内における局所的な領域毎について、その領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、その決定した評価方法を用いてその領域の細胞画像の評価を行う。

Description

細胞画像評価装置および方法並びにプログラム
　本発明は、細胞を撮像した細胞を評価する細胞画像評価装置および方法並びにプログラムに関するものである。
　従来、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＳＴＡＰ細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の培養状態を判定する方法が提案されている。
　たとえば特許文献１および特許文献２には、細胞を撮像した細胞画像から細胞の形態的な特徴量を取得し、この特徴量に基づいて細胞画像におけるがん細胞の混在率を評価する方法が提案されている。
　また、特許文献３においては、細胞の種類毎に細胞画像の解析プログラムを予め設定しておき、その解析プログラムを用いて細胞の種類に応じた細胞画像の解析を行うことが提案されている。
　また、特許文献４においては、細胞画像から細胞コロニー領域を自動的に特定する方法が提案されている。
特開２０１１－２３９７７８号公報 特開２０１１－２２９４０９号公報 特開２００６－３３３７１０号公報 特許第５３５５２７５号公報
　ここで、たとえば幹細胞を培養する場合、幹細胞コロニーの形態は培養期間に応じて変化する。具体的には、たとえば培養初期は、コロニー領域内に未分化細胞が均一に分布している状態であるが、培養が進むとコロニー領域の周辺部は分化が始まって分化細胞が分布することになる。
　このような幹細胞コロニーの局所的に異なる形態変化に応じて、たとえば幹細胞コロニー全体に対して同じ評価方法を用いて幹細胞コロニーの状態を評価するようにしたのでは、幹細胞コロニーの状態を適切に評価できない場合がある。たとえば、幹細胞コロニーは培養がある程度進むとその中心部では積層化が起こる。このような場合に、個々の細胞の形態を用いて幹細胞コロニー全体を評価するようにしたのでは、中心部は積層化によって個々の細胞を認識することが非常に困難であるため、幹細胞コロニーを適切に評価することができない。
　特許文献１から特許文献４には、上述したような幹細胞コロニーの局所的な領域毎の異なる形態変化を考慮することについては何も提案されていない。
　本発明は、上記の問題に鑑み、細胞コロニーの局所的な領域毎の異なる形態変化に応じて幹細胞コロニーの状態を適切に評価することができる細胞画像評価装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。
　本発明の細胞画像評価装置は、細胞を撮影した細胞画像を取得する画像取得部と、細胞画像を評価する細胞評価部と、細胞画像における細胞のコロニー領域内の局所的な領域の特定情報を取得する局所領域情報取得部とを備え、細胞評価部が、局所的な領域の特定情報に基づいて、コロニー領域内における局所的な領域毎について、その領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、その決定した評価方法を用いてその領域の細胞画像の評価を行うことを特徴とする。
　また、上記本発明の細胞画像評価装置において、細胞評価部は、局所的な領域がコロニー領域の中心部である場合には、その領域の細胞画像の輝度分布に基づく評価方法に決定することができる。
　また、細胞評価部は、局所的な領域がコロニー領域の周辺部である場合には、その領域の細胞画像に含まれる個々の細胞の状態に基づく評価方法に決定することができる。
　また、細胞評価部は、局所的な領域がコロニー領域の周辺部である場合には、その領域の細胞画像に含まれるハロの画像に基づく評価方法に決定することができる。
　また、細胞評価部は、局所的な領域がコロニー領域の周辺部である場合には、その領域の細胞画像に含まれるコロニー領域のエッジのコントラストに基づく評価方法に決定することができる。
　また、細胞の成熟度に関連する情報を取得する成熟度情報取得部を設け、細胞評価部は、局所的な領域の特定情報と成熟度に関連する情報とに基づいて、局所的な領域毎の評価方法を決定することができる。
　また、成熟度に関連する情報として、細胞の培養期間の情報を用いることができる。
　また、成熟度情報取得部は、コロニー領域の画像情報を解析することによって成熟度に関連する情報を取得することができる。
　また、成熟度に関連する情報として、コロニー領域の形状または大きさに関する情報を用いることができる。
　また、細胞評価部は、局所的な領域の特定情報と成熟度に関連する情報と細胞の培養条件とに基づいて、局所的な領域毎の評価方法を決定することができる。
　また、局所的な領域の細胞画像の評価の前に、細胞画像の事前評価を行う事前評価部を設け、細胞評価部は、事前評価の結果に基づいて、局所的な領域内の細胞画像に対する評価方法を決定することができる。
　また、局所領域情報取得部は、コロニー領域の細胞画像に基づいて、局所的な領域の特定情報を取得することができる。
　また、細胞評価部は、局所的な領域の特定情報と細胞の種類とに基づいて、局所的な領域毎の評価方法を決定することができる。
　また、細胞評価部は、コロニー領域の細胞画像に基づいて、細胞の種類を特定することができる。
　本発明の細胞画像評価方法は、細胞を撮影した細胞画像を取得し、細胞画像における細胞のコロニー領域内の局所的な領域の特定情報を取得し、その取得した局所的な領域の特定情報に基づいて、コロニー領域内における局所的な領域毎について、その領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、その決定した評価方法を用いてその領域の細胞画像の評価を行うことを特徴とする。
　本発明の細胞画像評価プログラムは、コンピュータを、細胞を撮影した細胞画像を取得する画像取得部と、細胞画像を評価する細胞評価部と、細胞画像における細胞のコロニー領域内の局所的な領域の特定情報を取得する局所領域情報取得部として機能させる細胞画像評価プログラムであって、細胞評価部が、局所的な領域の特定情報に基づいて、コロニー領域内における局所的な領域毎について、その領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、その決定した評価方法を用いてその領域の細胞画像の評価を行うことを特徴とする。
　本発明の細胞画像評価装置および方法並びにプログラムによれば、細胞画像における細胞コロニー領域内における局所的な領域の特定情報を取得し、その局所的な領域の特定情報に基づいて、局所的な領域毎について、その領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、その決定した評価方法を用いて領域の細胞画像の評価を行うようにしたので、細胞コロニーの局所的な領域毎の異なる形態変化に応じて細胞コロニーの状態を適切に評価することができる。
本発明の細胞画像評価装置の一実施形態を用いた幹細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図 位相差顕微鏡の概略構成を示す図 培養初期、培養中期および培養後期における幹細胞コロニーの形態の一例を示す図 培養条件、培養期間およびコロニー領域内における位置と、細胞画像の評価方法と対応づけたテーブルの一例を示す図 本発明の細胞画像評価装置の一実施形態を用いた幹細胞培養観察システムの作用を説明するためのフローチャート 本発明の細胞画像評価装置の一実施形態を用いた幹細胞培養観察システムの変形例を示すブロック図
　以下、本発明の細胞画像評価装置および方法並びにプログラムの一実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。まず、本発明の細胞画像評価装置の一実施形態を備えた細胞培養観察システムの全体構成について説明する。図１は、細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図である。
　本実施形態の細胞培養観察システムは、図１に示すように、細胞培養装置１と、細胞画像評価装置２と、撮影装置３と、ディスプレイ４と、入力装置５とを備えている。
　細胞培養装置１は、細胞の培養を行うための装置である。培養対象の細胞としては、たとえばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞やＳＴＡＰ細胞といった多能性幹細胞や、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋、肝臓などの細胞や、がん細胞などがある。細胞培養装置１内には、培養対象の細胞を培地に播種した培養容器が複数収容されている。そして、細胞培養装置１は、ステージ１０と搬送部１１と制御部１２とを備えている。
　ステージ１０は、撮影装置３による撮影対象の培養容器が設置されるものである。また、搬送部１１は、細胞培養装置１内の所定位置に収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養容器を選択し、その選択した培養容器をステージ１０まで搬送する。また、制御部１２は、細胞培養装置１全体を制御し、上述したステージ１０や搬送部１１の動作以外に、細胞培養装置１内の温度、湿度およびＣＯ２濃度などの環境条件を制御する。なお、温度、湿度およびＣＯ２濃度を調整するための構成については、公知な構成を用いることができる。
　撮影装置３は、ステージ１０に設置された培養容器内における細胞の細胞画像を撮像する。撮影装置３は、細胞を撮像して細胞画像を出力する位相差顕微鏡３０と、位相差顕微鏡３０を制御する制御部３９とを備えている。
　位相差顕微鏡３０は、ステージ１０上に設置された培養容器内の細胞の位相画像を撮像する。図２は、位相差顕微鏡３０の概略構成を示す図である。位相差顕微鏡３０は、図２に示すように、白色光を出射する白色光源３１と、リング形状のスリットを有し、白色光源３１から出射された白色光が入射されてリング状照明光を出射するスリット板３２と、スリット板３２から射出されたリング状照明光が入射され、その入射されたリング状照明光をステージ１０上に設置された培養容器１５内の細胞に対して照射する対物レンズ３３とを備えている。
　そして、ステージ１０に対して白色光源３１とは反対側に、位相差レンズ３４と、結像レンズ３７と、撮像素子３８とが設けられている。
　位相差レンズ３４は、対物レンズ３５と、位相板３６とを備える。位相板３６は、リング状照明光の波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成して構成される。なお、上述したスリット板３２のスリットの大きさは、この位相リングと共役な関係にある。
　位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されて構成される。位相差レンズ３４に入射された直接光は対物レンズ３５によって集光され、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、培養容器１５内の細胞によって回折された回折光は大部分が位相板の透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。
　位相差レンズ３４は、図示省略した駆動機構によって図２に示す矢印Ａ方向に移動する。このように位相差レンズ３４が移動することによってフォーカス位置が変更されてフォーカス制御が行われる。駆動機構は、細胞画像評価装置２の撮像制御部２５から出力されたフォーカス制御信号に基づいて位相差レンズ３４を移動させる。
　また、本実施形態の位相差顕微鏡３０は、倍率の異なる複数の位相差レンズ３４を交換可能に構成されている。位相差レンズ３４の交換については、ユーザからの指示入力に応じて自動的に行う構成としてもよいし、ユーザが手動で交換するようにしてもよい。
　本実施形態においては、マクロ観察のための低倍率撮像と詳細観察のための高倍率撮像とが行われるが、低倍率撮像の際には１倍～４倍の位相差レンズ３４が用いられ、高倍率撮像の際には１０倍～２０倍の位相差レンズ３４が用いられる。ただし、低倍率撮像と高倍率撮像とは相対的に倍率が異なっていればよく、これらの倍率に限定されない。
　結像レンズ３７は、位相差レンズ３４を通過した直接光および回折光が入射され、これらの光を撮像素子３８に結像する。撮像素子３８は、結像レンズ３７によって結像された像を光電変換することによって細胞の位相画像を撮像する。撮像素子３８としては、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。
　なお、本実施形態においては、撮像装置として位相差顕微鏡３０を用いるようにしたが、その他の光学倍率が変更可能な顕微鏡を用いるようにしてもよく、たとえば微分干渉顕微鏡などを用いるようにしてもよい。
　図１に戻り、細胞画像評価装置２は、低倍率画像取得部２０（画像取得部に相当する）と、局所領域情報取得部２１と、成熟度情報取得部２２と、細胞評価部２３と、制御部２４とを備えている。成熟度情報取得部２２は、特徴量取得部２８を備えており、制御部２４は、撮像制御部２５と表示制御部２６とを備えている。
　細胞画像評価装置２は、コンピュータに対して本発明の細胞画像評価プログラムの一実施形態がインストールされたものである。 
　細胞画像評価装置２は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに本発明の細胞画像評価プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図１に示すような、低倍率画像取得部２０、局所領域情報取得部２１、成熟度情報取得部２２、細胞評価部２３、特徴量取得部２８、撮像制御部２５および表示制御部２６が動作する。 
　低倍率画像取得部２０は、位相差顕微鏡３０が、上述した低倍率撮像を行って撮像した細胞画像を取得する。低倍率画像取得部２０によって取得される低倍率撮像画像は、１つの細胞コロニーを撮像した１枚の画像でもよいし、１つの細胞コロニーを矩形の複数の分割領域で分割した複数の画像群でもよい。また、１枚の画像内に複数の細胞コロニーが含まれていてもよい。
　低倍率画像取得部２０は、細胞コロニーを識別するための識別情報と低倍率撮像画像とを対応づけて記憶する。たとえば、１つの細胞コロニーを１枚の低倍率撮像画像で撮像した場合には、その細胞コロニーの識別情報と低倍率撮像画像とが１対１で対応づけられて記憶される。また、１つの細胞コロニーを複数の分割領域の低倍率撮像画像で撮像した場合には、その細胞コロニーの識別情報と複数の分割領域の低倍率撮像画像群とが対応づけられて記憶される。また、複数の細胞コロニーを１枚の低倍率撮像画像で撮像した場合には、その各細胞コロニーの識別情報と１枚の低倍率撮像画像とが対応づけられて記憶される。
　このように細胞コロニーの識別情報と低倍率撮像画像とを対応づけて記憶して管理することによって、たとえばユーザが入力装置５から細胞コロニーの識別情報を入力した際、その識別情報に対応づけられた低倍率撮像画像を即座に読み出して表示等することができる。
　局所領域情報取得部２１は、低倍率画像取得部２０によって取得された低倍率撮像画像内における細胞コロニー領域を特定し、その細胞コロニー領域内における局所的な領域（以下、局所領域という）を特定する情報（局所的な領域の特定情報）を取得する。細胞コロニー領域を特定する方法としては、たとえば低倍率撮像画像を２値化画像に変換した後、テンプレートマッチングなどによって細胞コロニー領域を自動的に抽出することによって位置を特定するようにすればよい。また、細胞コロニー領域の自動抽出については、上述した方法に限らず、その他の公知な方法を用いるようにしてもよい。
　また、自動抽出に限らず、表示制御部２６によってディスプレイ４に低倍率撮像画像を表示させ、ユーザが入力装置５を用いて低倍率撮像画像内における細胞コロニー領域を指定し、その指定された座標などの位置情報を局所領域情報取得部２１が取得するようにしてもよい。
　また、局所領域としては、たとえば細胞コロニー領域内の中央部や周辺部などがあるが、これに限られない。局所領域を特定する情報は、ユーザが入力装置５を用いて設定入力してもよいし、細胞コロニー領域内の低倍率撮像画像に基づいて特定するようにしてもよい。具体的には、たとえば細胞コロニー領域内に複数種類の細胞が含まれている場合、細胞コロニー内の低倍率撮像画像に基づいて、特定の種類の細胞が分布する領域を抽出し、その抽出した領域を局所領域として特定するようにしてもよい。なお、特定種類の細胞領域の抽出については、公知な方法を用いることができる。または、個々の細胞の密集度などによって局所領域を特定するようにしてもよい。
　また、たとえば細胞コロニー内における中央部や周辺部などといった細胞コロニーに対する相対的な位置情報を、局所領域を特定する情報として予めメモリなどに記憶しておき、この位置情報を局所領域情報取得部２１が取得するようにしてもよい。
　成熟度情報取得部２２は、細胞の成熟度に関連する情報を取得する。成熟度情報取得部２２によって取得された成熟度に関連する情報は、細胞評価部２３において、細胞コロニー領域の細胞画像の評価方法を決定する際に用いられる。
　本実施形態においては、細胞の成熟度を培養初期、培養中期および培養後期の３段階に区分し、成熟度情報取得部２２によって細胞の成熟度に関連する情報を取得することによって、撮像対象の細胞の成熟度が属する段階を取得する。
　細胞の成熟度を培養初期、培養中期および培養後期と区分するのは、これらのそれぞれの段階によって細胞コロニーの形態が異なっており、その形態に応じて細胞画像の評価方法を決定することが望ましいからである。
　具体的には、たとえば幹細胞コロニーの場合、培養初期は、図３に示すようにコロニー領域内に未分化細胞が均一に分布している。そして、培養中期になると、図３に示すようにコロニー領域の中心部は未分化細胞が密集して分布し、周辺部は分化が始まって分化細胞が分布する。また、コロニー領域の中心部は未分化細胞が密集することによって積層化されるが、周辺部は単層のままで維持される。
　さらに、培養後期になると、図３に示すようにコロニー領域の中心部において分化が起こり易くなり、いわゆるホールと呼ばれる現象が起こることがある。これによりコロニー領域の中心部と周辺部には分化細胞が分布し、中心部と周辺部との間の中間部に未分化細胞が分布する。
　上述したように、培養初期と培養中期と培養後期とで細胞コロニー領域の形態が変化し、その形態変化は、細胞コロニー領域内の局所領域毎に異なる。したがって、本実施形態においては、培養期間および細胞コロニー領域内の局所的な領域毎について、細胞画像の評価方法をそれぞれ決定する。局所的な領域毎の評価方法については、後で詳述する。
　成熟度情報取得部２２によって取得される細胞の成熟度に関連する情報は、細胞の成熟度の段階を示す情報であれば如何なる情報でもよく、たとえばタイマなどによって計測された培養期間を成熟度に関連する情報として取得することができる。また、培養期間に限らず、たとえば低倍率細胞画像内の細胞コロニー領域の画像情報を解析し、細胞コロニーの大きさや、細胞コロニー内の細胞数または細胞コロニーよりも小さい単位面積当たりの細胞数を計測し、これらの情報を成熟度に関連する情報として取得するようにしてもよい。たとえば、計測した細胞数が多いほど成熟度が進んでいると判断する。細胞コロニーの大きさとしては、細胞コロニーの面積、周囲長、最大径などを取得することができる。
　また、たとえば細胞コロニー領域の画像の輝度や、均一性や粗さなどのテクスチャを成熟度に関連する情報として取得するようにしてもよい。たとえば撮像対象の細胞が幹細胞である場合には、その成熟度が進行すると幹細胞の密集度が高くなり、さらに幹細胞が積層されて、画像の輝度が次第に高くなる。したがって、輝度が高いほど成熟度が進行しているといえる。
　また、成熟度が進行して上述したように幹細胞が増殖して積層された状態となった場合、画像の均一性が高くなり、また凹凸の少ない滑らかな画像となる。したがって、画像の均一性が高い、または画像が滑らかであるほど成熟度が進行しているといえる。画像の均一性や滑らかさの特徴量の取得方法については、既に公知な手法を用いることができる。
　また、成熟度に関連する情報として、幹細胞コロニーの形状の特徴量を取得するようにしてもよい。幹細胞の成熟度が進行すると幹細胞コロニーの形状は次第に円形に近づいた後、周辺部分の分化が進行してエッジの複雑度が大きくなる。したがって、このような幹細胞コロニーの形状の変化の特徴量を成熟度に関連する特徴量として取得することができる。
　また、成熟度に関連する情報として、幹細胞コロニーの厚さの特徴量を取得するようにしてもよい。幹細胞の成熟度が進行すると幹細胞コロニーは次第に厚くなっていく。したがって、このような幹細胞コロニーの厚さの特徴量を成熟度に関連する特徴量として取得することができる。幹細胞コロニーの厚さについては、別途設けられた計測装置によって計測するようにしてもよいし、ユーザが入力装置５を用いて設定入力するようにしてもよい。
　また、上述した成熟度に関連する情報として、細胞の継代数をユーザが入力装置５を用いて設定入力するようにしてもよい。
　成熟度情報取得部３３は、上述したような細胞の成熟度に関連する情報を取得し、この情報から細胞の成熟度の段階を取得する。
　なお、本実施形態においては、細胞の成熟度を３段階に区分するようにしたが、３段階に限らず、２段階や４段階以上に区分してもよい。また、各段階の間隔についても、培養条件などに応じて種々の間隔を設定することができる。
　細胞評価部２３は、成熟度情報取得部２２において取得された成熟度に関連する情報と局所領域情報取得部２１によって取得された局所領域の特定情報とに基づいて、コロニー領域内における局所的な領域毎について、細胞画像の評価方法を決定する。本実施形態においては、局所領域がコロニー領域の中心部である場合と周辺部である場合とで、それぞれの局所領域に対して評価方法を決定する。
　本実施形態の細胞評価部２３は、具体的には、図４に示すような培養期間と局所領域の位置（コロニー領域の中心部および周辺部）とを対応づけたテーブルを有しており、このテーブルを参照して局所領域毎について細胞画像の評価方法を決定する。また、本実施形態の細胞評価部２３は、培養期間の他に培養条件も取得し、その取得した培養条件と培養期間とに基づいて、図４に示すテーブルを参照して局所領域毎の細胞画像の評価方法を決定する。
　培養条件としては、足場や培地の種類や、培養対象の細胞とは異なる種類の異種細胞（フィーダー細胞）を使用しているか否かの条件などがある。同じ培養期間であっても、これらの培養条件によってコロニー領域の形態変化が異なることになるので、本実施形態では、培養条件も考慮して局所領域毎の細胞画像の評価方法を決定する。
　また、培養条件は、上記に挙げた条件に限らず、細胞の成長速度に影響する条件であれば如何なる条件でもよく、たとえば温度、湿度またはＣＯ２濃度などの培養の環境条件なども含めるようにしてもよい。なお、培養条件の情報は、たとえばユーザによって入力装置５を用いて設定入力されるが、上述したような温度や湿度などは温度計や湿度計で計測した条件を用いるようにしてもよい。
　細胞評価部２３は、具体的には、たとえば培養条件が条件Ａであり、培養期間が培養初期である場合には、細胞コロニー領域は、未分化細胞が均一に分布している状態であって単層であり、細胞画像を解析することによって個々の細胞を認識することが可能である。そのため、細胞コロニー領域全体について、個々の細胞の状態（細胞単位）に基づく評価方法に決定する。
　個々の細胞の状態に基づく細胞画像の評価方法としては、たとえば、個々の細胞の分布状態を取得し、その分布状態の均一性に基づいて細胞画像を評価するようすればよい。たとえば評価対象の細胞が幹細胞である場合には、幹細胞が均一に分布している場合には未分化状態であると評価し、幹細胞が一部に集中して分布したりして不均一である場合には、一部の幹細胞の分化が生じていると評価するようにすればよい。
　特徴量取得部２８は、上述した個々の細胞の分布状態のような、評価基準となる特徴量を取得する。なお、個々の細胞の分布状態については、たとえば細胞の核小体のパターンを検出して取得するようにしてもよいし、細胞間を通過した回折光に起因して発生するハロのパターンを検出することによって取得するようにしてもよい。照明光が細胞間を通過する際、回折が起こる。そして、細胞間の距離（スリットギャップ）が照明光の波長の整数倍となった場合、回折光（±１次回折光）と直接光（０次回折光）の位相が同調し、高輝度のアーチファクトが発生する。この高輝度のアーチファクトがハロである。
　また、個々の細胞の分布の均一性に限らず、特徴量取得部２８によって個々の細胞の密集度を取得し、この密集度に基づいて細胞画像を評価するようにしてもよい。たとえば評価対象の細胞が幹細胞である場合には、密集度が所定の閾値以上である場合には、未分化状態を良好に維持していると評価し、密集度が閾値よりも小さい場合には、分化が進んでおり、未分化状態を維持していないと評価するようにすればよい。
　また、個々の細胞の状態に基づく細胞画像の評価方法としては、上記の評価方法に限らず、その他の公知な評価方法を用いることができる。
　次に、培養期間が進んで培養中期である場合には、細胞コロニー領域の中心部は未分化細胞が密集して分布することによって積層された状態となり、個々の細胞を細胞画像から認識することが困難である。一方、細胞コロニー領域の周辺部は単層を維持した状態となる。
　したがって、細胞評価部２３は、細胞コロニー領域の中心部については、その細胞画像の輝度分布に基づく評価方法に決定し、細胞コロニー領域の周辺部については、培養初期と同様に、個々の細胞の状態に基づく評価方法に決定する。
　細胞画像の輝度分布に基づく評価方法としては、たとえば、特徴量取得部２８によって細胞コロニー領域の中心部の細胞画像の輝度分布を取得し、その輝度分布の均一性に基づいて細胞画像を評価するようすればよい。たとえば評価対象の細胞が幹細胞である場合には、中心部の細胞画像の輝度分布が均一である場合には、未分化状態を維持していると評価し、輝度分布が不均一である場合には、一部の幹細胞が分化し、未分化状態を維持していないと評価するようにすればよい。
　また、細胞コロニー領域の周辺部に対する個々の細胞の状態に基づく評価方法としては、たとえば培養初期と同様の評価方法を用いるようにすればよい。
　また、上記説明では、培養中期の場合、細胞コロニー領域の中心部と、細胞コロニー領域の周辺部との両方を評価するようにしたが、いずれか一方の局所領域のみを評価し、その評価結果にもとづいて、たとえば幹細胞コロニー領域全体の分化度を評価するようにしてもよい。
　また、上述したような細胞コロニー領域の中心部の評価結果と、周辺部の評価結果との両方を用いて、細胞コロニー領域全体の状態を評価するようにしてもよい。たとえば、中心部の評価値と周辺部の評価値を算出し、これらの合計値に基づいて、たとえば幹細胞コロニー領域全体の分化度などを評価するようにすればよい。また、この際、それぞれの評価値を重み付け加算するようにしてもよい。
　次に、培養期間がさらに進んで培養後期である場合には、細胞コロニー領域の中心部はホールが形成された状態となり、一方、細胞コロニー領域の周辺部は分化した細胞が分布した状態となる。
　したがって、細胞評価部２３は、細胞コロニー領域の中心部については、細胞画像の輝度分布に基づく評価方法に決定するが、培養中期における輝度分布に基づく評価方法とは異なる評価方法に決定する。具体的には、培養後期では、上述したようにホールが形成されている可能性があるので、たとえば輝度が所定の閾値よりも高く、かつ面積が所定の閾値以上である閉領域が存在するか否かを評価し、そのような領域が存在する場合には、ホールが形成されていると評価するようにすればよい。
　そして、細胞コロニー領域の周辺部については、培養が進行すると、細胞が分化・遊走し始めることによって、上述したハロが多く発生する。したがって、細胞コロニー領域の周辺部については、このハロの面積に基づく評価方法に決定するようにする。具体的には、ハロの面積を算出し、その面積に基づいて周辺部の分化度などを評価するようにすればよい。たとえばハロの面積が大きいほど分化度が進んでいると評価するようにすればよい。
　また、上述したようにハロの面積に基づく評価方法ではなく、たとえば図４において培養条件が条件Ｂの場合のように、細胞コロニー領域の周辺部に存在するエッジのコントラストに基づく評価方法に決定するようにしてもよい。具体的には、特徴量取得部２８によって、細胞コロニー領域の周辺部に存在するエッジを、フィルタなどを用いて検出し、そのエッジのコントラストを算出し、そのコントラストに基づいて周辺部の分化度などを評価するようにすればよい。たとえば、エッジのコントラストが低いほど分化度が進んでいると評価するようにすればよい。
　なお、培養後期についても、培養中期の場合と同様に、細胞コロニー領域の中心部および周辺部のうちのいずれか一方の局所領域のみを評価し、その評価結果にもとづいて、細胞コロニー領域全体の分化度を評価するようにしてもよい。また、培養中期の場合と同様に、細胞コロニー領域の中心部の評価結果と、周辺部の評価結果との両方を用いて、細胞コロニー領域全体の状態を評価するようにしてもよい。
　なお、各培養段階における細胞コロニー領域の中心部と周辺部との評価方法については、上記の方法に限らず、その他の公知な評価方法を用いることができる。
　また、本実施形態においては、上述したように細胞の成熟度に関連する情報と培養条件と細胞コロニー領域における局所領域の位置とに基づいて、細胞画像の評価方法を決定するようにしたが、細胞の種類によってもその成長の仕方や形態の変化は異なるため、さらに細胞の種類も考慮して細胞画像の評価方法を決定するようにしてもよい。
　具体的には、たとえば図４に示すようなテーブルを細胞の種類毎に設定しておき、細胞評価部２３が、細胞の種類の情報も取得して細胞画像の評価方法を決定するようにすればよい。各培養段階における局所領域毎の評価方法については、細胞の形態変化の特徴に応じて適宜設定するようにすればよい。細胞の種類の情報としては、上述したようなｉＰＳ細胞やＥＳ細胞やＳＴＡＰ細胞といった多能性幹細胞や、幹細胞から分化誘導された神経、心筋、皮膚や肝臓などの細胞や、がん細胞などがある。
　また、たとえば、心筋シートを作成する場合、心筋細胞、血管内皮細胞、間質細胞、・・・のように心筋を構成する各種細胞を別々に培養・分化させた後、同じ培養容器に投入して共培養させて自己組織化させる手法がとられる。この際、血管となって欲しい位置に血管内皮細胞と間質細胞とを配置したり、心筋になって欲しい位置に心筋細胞を配置したりして、各種細胞を予め設計された位置に配置することが行われる。
　この場合、心筋コロニー内のどこの場所にどの細胞が配置されているかが事前に把握できるため、その細胞の配置情報に基づいて、心筋コロニー内の局所領域毎に評価方法を決定するようにしてもよい。たとえば、心筋細胞が配置される局所領域については、拍動周期を評価し、血管が形成される局所領域については、未分化細胞が残っていないかを評価したり、穴が形成されていないかを評価したり、血管の詰まりがないかなどの細胞形態を評価するようにしてもよい。
　なお、この場合、細胞の種類の情報や、細胞コロニー内のどの位置にどの細胞が配置されるかの情報については、たとえばユーザが入力装置５を用いて設定入力するようにすればよい。
　また、上述したように各種細胞の配置を予め設計するのではなく、完全に自己組織化させる場合もある。この場合には、たとえば心筋コロニーの低倍率撮像画像に基づいて、血管や心筋の配置を大まかに特定し、その特定した局所領域について、上述したような血管や心筋に応じた評価方法を決定するようにすればよい。すなわち、局所領域情報取得部２１が、心筋コロニーの低倍率撮像画像に基づいて、評価対象の局所領域とその局所領域に含まれる細胞の種類を特定し、その特定した局所領域について、特定した細胞の種類に応じた評価方法を決定するようにしてもよい。なお、血管の特定方法としては、たとえば線状のパターンを抽出するようにすればよい。また、心筋細胞の特定方法としては、細胞の形状や動きなどから心筋細胞を特定するようにすればよい。
　なお、上記説明では、心筋シートを作成する場合について説明したが、心筋に限らず、その他の組織を培養する際にも、同様に、局所領域毎のその細胞の種類に応じた評価方法を決定することができる。
　図１に戻り、撮像制御部２５は、細胞培養装置１の制御部１２に制御信号を出力し、ステージ１０のＸ－Ｙ方向の移動を制御する。また、撮像制御部２５は、位相差顕微鏡３０が、位相差レンズ３４の倍率を自動的に変更可能に構成されている場合には、低倍率の位相差レンズ３４と高倍率の位相差レンズ３４とが変更されるように撮影装置３の制御部３９に対して制御信号を出力する。なお、位相差顕微鏡３０が、位相差レンズ３４の倍率を手動で変更する構成である場合には、高倍率撮像の際には、ユーザが高倍率の位相差レンズ３４に変更するようにすればよい。
　表示制御部２６は、位相差顕微鏡３０によって撮像された細胞画像をディスプレイ４に表示させる。また、表示制御部２６は、細胞評価部２３による細胞コロニー領域の評価結果をディスプレイ４に表示させる。表示制御部２６によってディスプレイ４に評価結果を表示する際、上述した細胞コロニー領域の局所領域毎の評価結果をそれぞれ表示するようにしてもよいし、局所領域毎の評価結果に基づいて細胞コロニー領域全体の評価をするようにした場合には、その全体の評価結果を表示するようにすればよい。具体的には、本実施形態の場合、細胞コロニー領域の中心部の評価結果と周辺部の評価結果とをそれぞれ表示するようにしてもよいし、中心部の評価結果と周辺の評価結果とに基づいて細胞コロニー領域全体を評価するようにした場合には、その全体の評価結果を表示するようにすればよい。
　次に、上述した細胞培養観察システムの作用について、図５に示すフローチャートを参照しながら説明する。
　まず、細胞培養装置１において、搬送部１１によって、収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養が選択され、その選択された培養容器１５がステージ１０に設置される（Ｓ１０）。
　そして、位相差顕微鏡３０の位相差レンズ３４の倍率が低倍率に設定されて低倍率撮像画像が撮像され、その撮像された低倍率撮像画像が低倍率画像取得部２０によって取得される（Ｓ１２）。低倍率画像取得部２０によって取得された低倍率撮像画像は表示制御部２６に出力され、表示制御部２６によってディスプレイ４に表示される。
　また、低倍率画像取得部２０によって取得された低倍率撮像画像は、局所領域情報取得部２１に出力され、局所領域情報取得部２１は、入力された低倍率撮像画像に基づいて、その低倍率撮像画像内における細胞コロニー領域の位置を特定し、その細胞コロニー領域内における局所領域を特定する情報を取得する。（Ｓ１４）。
　一方、ユーザによる設定入力などによって成熟度情報取得部２２は、細胞の成熟度に関連する情報としての培養期間の情報と、培養条件の情報とを取得する（Ｓ１６）。
　そして、成熟度情報取得部２２によって取得された培養期間および培養条件の情報は、細胞評価部２３に出力され、細胞評価部２３は、培養期間および培養条件の情報と、局所領域を特定する情報とに基づいて、細胞コロニー領域の局所領域毎の細胞画像の評価方法を決定する。すなわち、本実施形態においては、細胞コロニー領域の中心部と周辺部の細胞画像の評価方法をそれぞれ決定する（Ｓ１８）。そして、細胞評価部２３は、その決定した評価方法に基づいて、細胞コロニー領域内の細胞画像を評価し、その評価結果を表示制御部２６に出力する（Ｓ２０）。
　表示制御部２６は、入力された細胞コロニー領域の評価結果をディスプレイ４に表示させる（Ｓ２２）。
　上記実施形態の細胞培養観察システムによれば、細胞画像における細胞のコロニー領域内の局所領域を特定し、そのコロニー領域内における局所領域毎について、その局所領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、その決定した評価方法を用いて局所領域の細胞画像の評価を行うようにしたので、細胞コロニーの局所領域毎の異なる形態変化に応じて幹細胞コロニーを適切に評価することができる。
　なお、上記実施形態の細胞培養観察システムにおいては、局所領域毎の評価方法をテーブルとして予め設定するようにしたが、これに限らず、図６に示すように、局所領域の細胞画像の評価の前に、その細胞画像の事前評価を行う事前評価部２７をさらに設け、この事前評価部２７による事前評価の結果に基づいて、細胞評価部２３が、局所領域毎の細胞画像に対する評価方法を決定するようにしてもよい。
　具体的には、たとえば、事前評価部２７が、局所領域の細胞画像について個々の細胞が識別可能であるか否かを事前評価し、個々の細胞が識別可能である場合には、上述したような個々の細胞に基づく評価方法に決定し、個々の細胞が識別不可能である場合には、上述したような輝度分布に基づく評価方法に決定するようにしてもよい。個々の細胞の識別可能であるか否かについては、たとえば個々の細胞のエッジのコントラストなどを評価するようにすればよい。
　また、上記実施形態の細胞培養観察システムにおいて、局所領域の細胞を高倍率撮像した高倍率撮像画像を取得し、表示制御部２６が、その高倍率際像画像をディスプレイ４に表示させるようにしてもよい。
１　　 細胞培養装置
２　　 細胞画像評価装置
３　　 撮影装置
４　　 ディスプレイ
５　　 入力装置
１０　 ステージ
１１　 搬送部
１２　 制御部
２０　 低倍率画像取得部
２１　 局所領域情報取得部
２２　 成熟度情報取得部
２３　 細胞評価部
２４　 制御部
２５　 撮像制御部
２６　 表示制御部
２７　 事前評価部
２８　 特徴量取得部
３０　 位相差顕微鏡
３１　 白色光源
３２　 スリット板
３３　 対物レンズ
３４　 位相差レンズ
３５　 対物レンズ
３６　 位相板
３７　 結像レンズ
３８　 撮像素子

Claims (16)

  1. 　細胞を撮像した細胞画像を取得する画像取得部と、
    　前記細胞画像を評価する細胞評価部と、
    　前記細胞画像における前記細胞のコロニー領域内の局所的な領域の特定情報を取得する局所領域情報取得部とを備え、
    　前記細胞評価部が、前記局所的な領域の特定情報に基づいて、前記コロニー領域内における局所的な領域毎について、該領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、該決定した評価方法を用いて前記領域の細胞画像の評価を行うことを特徴とする細胞画像評価装置。
  2. 　前記細胞評価部が、前記局所的な領域が前記コロニー領域の中心部である場合には、前記領域の細胞画像の輝度分布に基づく評価方法に決定する請求項１記載の細胞画像評価装置。
  3. 　前記細胞評価部が、前記局所的な領域が前記コロニー領域の周辺部である場合には、前記領域の細胞画像に含まれる個々の細胞の状態に基づく評価方法に決定する請求項１または２項記載の細胞画像評価装置。
  4. 　前記細胞評価部が、前記局所的な領域が前記コロニー領域の周辺部である場合には、前記領域の細胞画像に含まれるハロの画像に基づく評価方法に決定する請求項１または２記載の細胞画像評価装置。
  5. 　前記細胞評価部が、前記局所的な領域が前記コロニー領域の周辺部である場合には、前記領域の細胞画像に含まれる前記コロニー領域のエッジのコントラストに基づく評価方法に決定する請求項１または２記載の細胞画像評価装置。
  6. 　前記細胞の成熟度に関連する情報を取得する成熟度情報取得部を備え、
    　前記細胞評価部が、前記局所的な領域の特定情報と前記成熟度に関連する情報とに基づいて、前記局所的な領域毎の評価方法を決定する請求項１から５いずれか１項記載の細胞画像評価装置。
  7. 　前記成熟度に関連する情報が、前記細胞の培養期間の情報である請求項６記載の細胞画像評価装置。
  8. 　前記成熟度情報取得部が、前記コロニー領域の画像情報を解析することによって前記成熟度に関連する情報を取得する請求項６記載の細胞画像評価装置。
  9. 　前記成熟度に関連する情報が、前記コロニー領域の形状または大きさに関する情報である請求項８記載の細胞画像評価装置。
  10. 　前記細胞評価部が、前記局所的な領域の特定情報と前記成熟度に関連する情報と前記細胞の培養条件とに基づいて、前記局所的な領域毎の評価方法を決定する請求項６から９いずれか１項記載の細胞画像評価装置。
  11. 　前記局所的な領域の細胞画像の評価の前に、前記細胞画像の事前評価を行う事前評価部を備え、
    　前記細胞評価部が、前記事前評価の結果に基づいて、前記局所的な領域内の細胞画像に対する評価方法を決定する請求項１記載の細胞画像評価装置。
  12. 　前記局所領域情報取得部が、前記コロニー領域の細胞画像に基づいて、前記局所的な領域の特定情報を取得する請求項１記載の細胞画像評価装置。
  13. 　前記細胞評価部が、前記局所的な領域の特定情報と前記細胞の種類とに基づいて、前記局所的な領域毎の評価方法を決定する請求項１記載の細胞画像評価装置。
  14. 　前記細胞評価部が、前記コロニー領域の細胞画像に基づいて、前記細胞の種類を特定する請求項１３記載の細胞画像評価装置。
  15. 　細胞を撮影した細胞画像を取得し、
    　前記細胞画像における前記細胞のコロニー領域内の局所的な領域の特定情報を取得し、
    　前記局所的な領域の特定情報に基づいて、前記コロニー領域内における局所的な領域毎について、該領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、該決定した評価方法を用いて前記領域の細胞画像の評価を行うことを特徴とする細胞画像評価方法。
  16. 　コンピュータを、細胞を撮影した細胞画像を取得する画像取得部と、前記細胞画像を評価する細胞評価部と、前記細胞画像における前記細胞のコロニー領域内の局所的な領域の特定情報を取得する局所領域情報取得部として機能させる細胞画像評価プログラムであって、
    　前記細胞評価部が、前記局所的な領域の特定情報に基づいて、前記コロニー領域内における局所的な領域毎について、該領域内の細胞画像に対する評価方法をそれぞれ決定し、該決定した評価方法を用いて前記領域の細胞画像の評価を行うことを特徴とする細胞画像評価プログラム。
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