JP2001511456A - 神経学的欠損を治療する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は神経学的欠損をもつ患者を治療する方法および組成物を特徴とする。本方法は、例えば、患者の中枢神経系（ＣＮＳ）の神経原始細胞を上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターと結合するポリペプチドと（in vivo または培養で）接触させ、この増殖した神経原始細胞の子孫を誘導して、それらが停留し当該神経学的欠損を減少させるために十分な態様で機能する場であるＣＮＳの領域に集団で移動させることによって実施することができる。本方法はさらに、当該神経原始細胞の子孫と分化を刺激する化合物とを接触させる工程を含むことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、仮出願第６０／０５５３８３号（１９９７年８月４日出願）の利益
を申請する（前記仮出願は参照により本明細書に含まれる）。

【０００２】 本発明の分野は、中枢神経系に影響を与える損傷、疾患または発育障害によっ
て惹起される神経学的欠損の治療である。

【０００３】 神経栄養因子は、神経細胞の生存、増殖、分化、大きさおよび機能を様々に支
援するペプチドである（概説として、Loughlin & Fallon, Neurotrophic Factor
s, Academic Press, San Diego, CA, 1993）。特定された栄養因子（または増殖
因子）の数は増加し続けているが、ほとんどは、それらの構造または結合親和性
をもとにしてすでに確立された１つまたはもう１つのファミリーに分類される。
種々のファミリーに由来する増殖因子（表皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーを含
む）が、黒質線状体系（本発明の方法にしたがって治療することができる領域）
のドーパミン作動性ニューロンを支援することが示された（概説として、Hefti,
J. Neurobiol. 25:1418-1435, 1994; Unsicker, Prog. Growth Factor Res. 5:7
3-87, 1994)。

【０００４】 ＥＧＦ（ＥＧＦファミリーの最初のもの）の性状は２５年以上前に明らかにさ
れた（Savage & Cohen, J. Biol. Chem. 247:7609-7611, 1972; Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621, 1972)。その時以来、新たな因子が特定されて
きたが、それらにはワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ；Ventatesan et al., J. Virol. 44:637-646, 1982)、ミクソーマウイルス増殖因子（ＭＧＦ；Upton
et al., J. Virol. 61:1271-1275, 1987）、ショープ線維腫ウイルス増殖因子（
ＳＦＧＦ；Chang et al., Mol. Cell. Biol. 7:535-540, 1987）、アンフィレギ
ュリン（ＡＲ；Kimura et al., Nature 348:257-260, 1990)、およびヘパリン結
合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ；Higashiyama et al., Science 251:936-9
39, 1991)が含まれる。これら因子の共通の特徴は、３つのジスルフィド架橋を 形成し、ＥＧＦレセプターに結合するそれらの共通の能力の基礎となる保存され
た構造を維持する、６つのシステインを含むアミノ酸配列である。

【０００５】 ＥＧＦは、このファミリーのうちで最も研究が進んだ因子で、脳組織に存在す
ることがつきとめられた最初のものである。すなわち、ＥＧＦ様免疫反応（ＩＲ
）が、淡蒼球、腹側淡蒼球、内側脚の核、黒質およびカエハ島を含む発育中の成
人の前脳および中脳領域で認められた（Fallon et al., Science 224:1107-110
9, 1984）。

【０００６】 ＥＧＦファミリーのまた別のメンバーであるＴＧＦαもまた脳組織に存在する
ことが分かった。それはＥＧＦレセプターと結合し（Todaro et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 77:5258-5262, 1980）、レセプターのチロシンキナーゼ活性
を刺激して極めて多様な細胞タイプにおいて同様なミトゲン性反応を誘発する（
概説として、Derynck, Adv. Cancer Res. 58:27-52, 1992）。ＴＧＦαもまた、
新たな別の未特定レセプターと結合するのかもしれない（このことは、いくつか
の細胞におけるＴＧＦαの作用の差異を説明するであろう）。ＴＧＦα−ＩＲは
、成獣ラットのＣＮＳ全体のニューロン神経細胞形質に、さらに前脳星状細胞の
下位集団に不均一に分布することが以前に示された（Code et al., Brain Res.
421:401-405, 1987; Fallon et al., Growth Factors 2:241-250, 1990）。ＴＧ
ＦαのｍＲＮＡはゲッ歯類の脳全体（Lee et al., Mol. Cell. Biol. 5:3655-36
46, 1985; Kudlow et al., J. Biol. Chem. 264:3880-3883, 1989)並びに線条お
よび他の脳領域でヌクレアーゼ保護アッセイによって(Weickert & Blum, Devel. Brain Res. 86:203-216, 1995）、さらにin situ 核酸ハイブリダイゼーション
によって（Seroogy et al., Neuroreport 6:105-108, 1994)検出された。

【０００７】 ＴＧＦαおよびEＧＦｍＲＮＡは出生後初期にその相対的最高量（全ＲＮＡと 比較して）に達しその後減少するが、このことは発育における役割を示唆してい
る（Lee et al., 1985, 上掲書；Lazar & Blum, J. Neurosci. 12:1688-1697, 1
992)。脳全体ではこの減少は５０％を越え（Lazar & Blum, 1992, 上掲書）、一
方、線条では相対的ＴＧＦαのｍＲＮＡはピークレベルの２／３に低下する(Wei
ckert & Blum, 1995, 上掲書）。調査された全ての発育段階で、脳全体のＴＧＦ
αｍＲＮＡは、ＥＧＦｍＲＮＡのレベルよりも１次数以上高い（Lazar & Blum,
1992, 上掲書）。

【０００８】 免疫化学的手法によりＥＧＦレセプターは、ラット脳の星状細胞並びに皮質お
よび小脳ニューロンの下位集団、並びにヒト脳の剖検標本のニューロンに存在す
ることが示された（Gomez-Pinilla et al., Brain Res. 438:385-390, 1988; We
rner et al., J. Histochem. Cytochem. 36:81-86, 1988)。放射能標識ＥＧＦを
用いたオートラジオグラフィー実験で、ＥＧＦ結合部位が線条を含むラットの皮
質領域および皮質下領域内にあることが明示された（Quirion et al.,Synapse 2
:212-218, 1988)。in situ ハイブリダイゼーション実験では、ＥＧＦレセプタ ーｍＲＮＡが、線条および中脳腹側の細胞（Seroogy et al., 1994, 上掲書）並
びにラットの発育脳および成熟脳（Seroogy et al., Brain Res. 670:157-164,
1995）に存在することが示された。相対的ＥＧＦおよびＴＧＦαｍＲＮＡに関し
ては、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡは発育初期の線条および中脳腹側で最も豊富で
、動物が成熟するにつれて徐々に減少する（Seroogy et al., 1994, 上掲書）。

【０００９】 生理学的には、ＴＧＦαは、多くの神経起源を含む身体全体の多数の細胞タイ
プで機能する(Derynck, 1992, 上掲書）。ＴＧＦαは、中枢ニューロン培養の生
存を助け（Morrison et al., Science 238:72-75, 1987; Zhang et al., Cell.
Regul. 1:511-521, 1990）、さらにＥＧＦと異なり、脊髄神経節感覚ニューロン
の生存および軸索の成長を強化する（Chalazonitis et al., J. Neurosci. 12:5
83-594, 1992)。それはまた、発育脳および成熟脳でニューロンおよびグリア原 始細胞の増殖および分化を促進する（Anchan et al., Neuron 6:923-936, 1991)
。

【００１０】 培養中の中脳ドーパミン作動性ニューロンに対するＥＧＦファミリーペプチド
の栄養作用もまたここ数年調べられてきた。ＥＧＦは、混合中脳培養でＥ１６ド
ーパミンニューロンの生存能を強化するが（Casper et al., J. Neurosci. Res. 30:372-381, 1991)、ドーパミン取り込みを促進させる度合いはそれほど強くな
い（Knusel et al., J. Neurosci. 10:558-570, 1990）。ＴＧＦαはまた、分離
細胞培養で中脳ドーパミンニューロンの生存を支援するが、その作用はＥＧＦの
それよりもさらに選択的である（Ferrari et al., J. Neurosci. Res. 30:493-4
97, 1991; Alexi & Hefti, Neurosci. 55:903-918, 1993)。

【００１１】 ＥＧＦファミリー増殖因子のもう１つの重要な特徴は、中脳ドーパミン細胞を
神経毒性攻撃から保護する能力である。ＥＧＦは、分離細胞培養でグルタメート
またはキスクォレートの興奮性毒性からドーパミンニューロンを保護することが
示された（Casper & Blum, J. Neurochem. 65:1016-1026, 1995)。それはまた、
培養ドーパミン細胞を選択的ドーパミン神経毒、１−メチル−４−フェニルピリ
ジニウム（ＭＰＰ；Park et al., Brain Res. 599:83-97, 1992)から保護し、さ
らにＭＰＰ処理細胞のドーパミン取り込みを高めることが示された（Hadjiconst
antinou et al., J. Neurochem. 57:479-482, 1991）。

【００１２】 in vivo でのＥＧＦに関する実験の結果は培養で得られたものと一致した。す
なわち、ＥＧＦは両事例で神経保護作用を示した。例えば、ＰＤのラットモデル
の黒質線条体経路の離断後、ＥＧＦの大脳内脳室（ＩＣＶ）輸液はアンフェタミ
ン誘発回旋を減少させ、ＳＮのチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性（ＴＨ−Ｉ
Ｒ）細胞の生存数を増加させ、さらに線条体のＴＨ−ＩＲ繊維を増加させた（Pe
zzoli et al., Movement Disord. 6:281-287, 1993; Ventrella, J. Neurosurg. Sci. 37:1-8, 1993）。１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒ
ドロピリジン（ＭＰＴＰ）による障害をもつマウス脳にＥＧＦをＩＣＶ輸液した
場合、線条のドーパミンおよび３，４−ジヒドロ−ジフェニル酢酸（DOPAC）の 含有量並びにチロシンヒドロキシラーゼ活性が増加した（Hadjiconstantinou et al., 1991, 上掲書；Schneider et al., Brain Res. 674:260-264, 1995）。

【００１３】 ＥＧＦと比較してより強力なそのin vitro活性にもかかわらず、in vivo 、特
に神経学的欠損をもつ動物（ヒトを含む）における、ＴＧＦαの栄養作用は、不
明である。本発明は、正常および異常な（損傷をもつ）中枢神経系の細胞に対す
るＴＧＦα輸液の新規に見出された効果に基づくもので、本明細書ではこれを開
示する。

【００１４】 本発明の特徴は神経学的欠損をもつ患者を治療する方法および組成物である。
本方法は、例えば患者の中枢神経系（ＣＮＳ）の神経原始細胞を、in vivoもし くは培養条件下で表皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターと結合するポリペプチドと
接触させて増殖性原始細胞の子孫を誘導し、ＣＮＳの一領域に一団となって移動
させ、その場所で留まり前記神経学的欠損を減少させるために十分な態様で機能
させることによって実施できる。本方法は、分化を促進する化合物と前記神経原
始細胞の子孫を接触させる工程をさらに含むことができる。

【００１５】 本発明の他の目的、利点および新規な特徴は、下記の図面の簡単な説明、発明
の詳細な説明および実施例から明らかになろう。

【００１６】 Ｉ．線条および黒質線条体系 Ａ．その解剖学、連結性、および神経化学 脳、線条、淡蒼球、黒質、腹側被蓋領域（ＶＴＡ）、視床下核、および扁桃は まとめて脳幹神経節と称される。線条は背側成分および腹側成分を含み、各々は
さらに別の解剖学的構造に分類される。ヒトでは、背側線条は尾状核および被殻
から成る。Ｃ形の尾状核は側脳室の湾曲に続く。その尾部は下角端を越えて伸長
し、各側頭葉の扁桃と合流する。尾状核の頭部は、前角の前部から腹側に彎曲し
被殻と融合する。ヒトの脳とは解剖学的に大きく異なるが、ゲッ歯類ではそれら
は共有の構造、尾状核被殻または尾被殻として合体する。

【００１７】 腹側線条は、側坐核、嗅結節および付随する線条細胞橋で構成される。淡蒼球
は、淡蒼球、内脚核、黒質網状部（ＳＮｒ）および腹側淡蒼球を含む。内脚核お
よびＳＮｒは非常に類似した求心性および遠心性連結を有する。腹側淡蒼球は、
淡蒼球と内脚核の両方に類似する連結の混合をもつ領域を含む。黒質の他の部分
（緻密部、ＳＮｃ）は、黒質−被蓋領域（ＳＮ−ＶＴＡ）に広がるドーパミンニ
ューロンをＳＮｒ中のドーパミン細胞集団とともに含んでいる。脳幹神経節の回
路網は複雑であるが、ラットとヒトとでは非常に類似し（Fallon & Loughlin, "
Cerebral Cortex", E.G. Jones & A. Peters, Eds., Vol.6, pp.41-127, Plenum Press, New York, 1987; Alheid & Heimer, Progr. Brain Res. 107:461-484,
1996）、これによってラットは、哺乳類の脳におけるこの系の連結、神経化学、
薬理学、機能および臨床的相関関係を研究する有用なモデルとされる。

【００１８】 線条は、脳幹神経節の他の核と一緒になって運動と情緒の調節に寄与する。こ
の系またはその神経支配に影響を与える多くの疾患が、重篤な消耗性の運動障害
を伴い、しばしば情動障害が随伴する。

【００１９】 尾状核および被殻は脳幹神経節の第一次入力核であり、大脳皮質並びに視床の
正中核および内層核から主要な興奮性投射を受けとる。皮質線条体からの求心性
神経はグルタメート作動性である。視床からの求心性神経もまたグルタメート作
動性である。黒質緻密部（ＳＮｃ）は、高密度のドーパミン作動性入力を、黒質
線条経路を介して線条に提供する（ラットにおけるこの系の概説のために以下を
参照されたい、Fallon & Loughlin, "The Rat Nervous System", G. Paxions, E
d., pp.215-237, Academic Press, San Diego, 1995)。腹側線条および側坐核は
、腹側正中中脳のＶＴＡのドーパミン細胞からそれらのドーパミン作動性神経刺
激伝播の大半を受けとる。扁桃からの辺縁求心性神経および中脳または縫線から
のセロトニン作動性繊維もまた腹側線条で終わる。

【００２０】 線条体の求心性神経およびそれらの終末点の分布は、それらの起始点領域を単
純に規則正しく表現したものではない。線条は、機能的および化学的に異なる周
辺マトリックスに埋め込まれた斑または線条小体（striosome)に組織化される。
この組織化は、初めアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）に関する組織化学
的手法を用いて明らかにされた（ＡＣｈＥは選択的にマトリックスを染色する(G
raybiel & Ragsdale, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5723-5726，1978))。そ
の時以来、酵素組織化学、免疫細胞化学、in situ ハイブリダイゼーション、放
射能標識リガンドとのレセプターの結合、前進性変性および他の方法を用いて、
この２つの区画内に別々に分布するさらなる多くのマーカーが特定された。マト
リックスのためのマーカーには、カルビンジン、ソマトスタチン、およびドーパ
ミン取り込み（〔³Ｈ〕マチンドール結合）部位が含まれる（Gerfen, J. Comp.
Neurol. 236:454-476, 1985; Voorn et al., J. Comp. Neurol. 289:189-201, 1
989）。線条小体は、エンケファリン、黒質線条体の損傷に伴う５’−ヌクレオ チダーゼ活性、チロシンヒドロキシラーゼ、ミューオポイドレセプター結合およ
びＰ物質が相対的により豊富であることによって特定できる（Graybiel et al., Neurosci. 6:377-397, 1981; Schoen & Graybiel, J. Comp. Neurol. 322:566-
576, 1992)。しかしながら予想されるように、これらマーカーの多くで種間変型
および発生期変型が存在し、いくつかは線条の一定領域でのみ有用である。

【００２１】 化学的マーカーの不均一性は、斑またはマトリックス内の多くの線条経路の選
択的起始点および終末点により、いっそう複雑になる。例えば、皮質の運動領域
、帯状束領域、体性感覚領域および視覚領域からの求心性神経は、マトリックス
内で終わる（Gerfen, Nature 311:461-464, 1984; Donoghue & Herkenham, Brai
n Res. 365:397-403, 1986）。辺縁皮質の深層Ｖおよび深層ＶＩからの皮質線条
体の求心性神経の大半は斑の中で終わるが、一方、より表面に近い層Ｖ並びに層
ＩＩおよびＩＩＩから発する皮質線条体の求心性神経のほとんどはマトリックス
へ入力を提供する（Gerfen, Science 246:385-388, 1989)。ＶＴＡおよびＳＮｃ
の背側層からの求心性神経は、ドーパミン作動性入力をマトリックスに提供する
。斑は、ＳＮｃの腹側層およびＳＮｒのドーパミン細胞集団からドーパミンの神
経興奮伝播を受けとる（Schoen & Graybiel, J. Comp. Neurol. 322:566-576, 1
992)。背側線条では、視床の中央分割内の核からの入力は斑内で終わるが、一方
、外側分割（前方および後方内層並びに吻側腹側層核を含む）からの求心性神経
はもっぱらマトリックス組織を神経支配する（Ragsdale & Graybiel, J. Comp.
Neurol. 311:134-167, 1991)。さらに、扁桃の基底外側核から始まる扁桃線条繊
維は斑区画を選択的に神経支配する（Ragsdale & Graybiel, J. Comp. Neurol.
269:506-522, 1988)。

【００２２】 線条体の遠心性神経もまた斑マトリックス機構に関しては別々に分布する。線
条体で始まる２つの主要な経路の一つである線条黒質経路は、２つの異なる投射
路で構成されることが示された。斑区画内のニューロンから生じる繊維は、腹側
ＳＮｃ内のドーパミンニューロン周辺およびＳＮｒ内のドーパミン細胞集団内で
終わる。マトリックスのニューロンは、ＳＮｒ（ドーパミン非作動性領域および
その樹状突起がＳＮｒ内に位置するドーパミンニューロンを含む）に向かう局所
解剖学的に編成された投射路を生じる（Gerfen, 1984, 上掲書; Jiminez-Castal
lanos & Graybiel, Neurosci. 32:297-321, 1989）。

【００２３】 その他の主要な遠心性投射路（線条体淡蒼球経路）は淡蒼球へ神経刺激を発射
する。斑マトリックス機構については分布は示されなかったが、神経化学的には
それは線条体黒質系とは異なっている。線条体淡蒼球繊維の大半はエンケファリ
ンを発現するが、ダイノルフィンまたはＰ物質は発現しない。対照的に、線条体
黒質投射路はほとんどエンケファリンを含まないが、そのほとんどはダイノルフ
ィンおよびＰ物質を発現する（Gerfen & Young, Brain Res. 460:161-167, 1988
）。霊長類では、この２つの系はまたその解剖学的発生領域が異なっている。す
なわち線条体淡蒼球の遠心性神経は主に被殻から生じ、線条体黒質の遠心性神経
は主に尾状核内に起点をもつ（Parent et al., Brain Res. 303:385-390, 1984)
。

【００２４】 線条体連結のこの不均一な分布に加えて、形態学的および化学的に異なるいく
つかのニューロンタイプが線条に見出されている（Albin et al., Trends Neuro
sci. 12:366-375, 1989; Groves, Brain Res. Rev. 5:234-238, 1983）。それら
はその樹状突起の形態を基準にして慣習的に有棘または無棘として分類されてい
る。線条には２つの一般的に認識された有棘ニューロンが存在する。それは種々
のＧＡＢＡ、Ｐ物質、エンケファリンおよびダイノルフィンの組み合わせを含む
が、もっぱらＧＡＢＡ作動性である。中間有棘ニューロン（有棘タイプＩ）は断
然もっとも豊富で、全線条体ニューロンの９０−９５％を構成する。それらは平
滑な細胞体およびその樹状突起の離れた部分に棘の密度の高い蓄積を有する。そ
れらの樹状突起の樹枝状部は体幹から約２００μｍに及ぶ。中間有棘ニューロン
はＳＮｃ内のドーパミン作動性ニューロンの末端標的で、その樹状突起の棘の頸
部上にもっぱらシナプスを形成する。有棘タイプＩＩ型ニューロンははるかに大
型で、体幹から約６００μｍまで伸長する種々の枝をもつ。

【００２５】 有棘ニューロンは線条の投射ニューロンである。ＧＡＢＡおよびＰ物質を含む
マトリックスのニューロンは、もっぱら淡蒼球の内部セグメント（ＧＰ_i）およ びＳＮｒに神経刺激を発射する。他方、エンケファリンを含む有棘ＧＡＢＡ作動
性マトリックスニューロンは、淡蒼球の外部セグメント（ＧＰ_e）を神経支配す る。斑区画内の有棘ニューロンはそれらの遠心性神経の大半をＳＮｃに送る（Al
bin et al., 1989, 上掲書）。

【００２６】 この２つの主要な遠心性経路を構成する線条体の投射ニューロンはまた、それ
らのドーパミンレセプターサブタイプによって区別できる。線条体黒質に神経刺
激を発射するＰ物質／ダイノルフィンニューロンはもっぱらＤ₁ドーパミンレセ プターを発現するが、エンケファリン作動性線条体淡蒼球ニューロンは主にＤ₂ レセプターを発現する。しかしながら、どちらの投射路においてもどちらかのレ
セプタータイプが排他的に発現されることはない（Besson et al., Neurosci. 2
6:101-119, 1989; Gerfen et al., Science 250:1429-1423, 1990)。

【００２７】 ３つの認識されている無棘ニューロンタイプは線条体の介在ニューロン集団を
構成する（Groves, 1983, 上掲書；Carpenter, "Core Text of Neurosviences", pp.325-360, Williams & Wilkins, Baltimore, 1991）。さらにまた、それらは
線条体ニューロンの総数の１０％またはそれ以下を構成する。無棘Ｉ型ニューロ
ンは３つのうちで最も一般的で、中間有棘ニューロンよりわずかに小さい分枝物
の中に平滑な樹状突起を有する。それらは主としてＧＡＢＡ作動性であるが、多
くはソマトスタチンおよび神経ペプチドＹを含む。無棘ＩＩ型ニューロンはその
大型の細胞体並びにＡＣｈＥおよびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡ
Ｔ）染色によって識別される。この細胞タイプは中間有棘ニューロンと対称的シ
ナプスを形成する。中間無棘ＩＩＩ型ニューロンは性状が最も明らかでないが、
ＧＡＢＡを含んでいると考えられている。すでに特定されたニューロンの他に、
これらニューロンの種類の中でおそらく新たな化学的に限定され、さらに連結に
よって限定されるサブセットが存在するであろう。

【００２８】 Ｂ．局所解剖学と発生 中脳のドーパミン系の線条体投射路における前進性および逆行性トレーサーを用
いた実験によって、成獣ゲッ歯類における正確な局所解剖学的知見が明らかにさ
れた（Fallon & Moore, J. Comp. Neurol. 180:545-580, 1978）。背側線条体は
、腹側および中間ＳＮ並びにＶＴＡのニューロンからドーパミン作動性神経刺激
伝播を受けとる。腹側線条体および側坐核は、背側ＶＴＡおよび中間ＳＮからド
ーパミン作動性入力刺激を受けとる（Fallon, Ann. NY Acad. Sci. 537:1-9, 19
88)。

【００２９】 成長しつつある系における神経組織の発生の流れは、成熟している系の神経刺
激伝播の局所解剖学的編成と一致する。ＳＮの側背部分は胚の最も初期、ラット
では１５日胚（Ｅ１５）以前に形成される（Altman & Bayer, J. Comp. Neurol. 198:677-716, 1981）。この領域からの神経刺激の発射は、線条体の外側領域お
よび腹側領域を神経支配するが（Carter & Fibiger, Neurosci. 2:569-576, 197
7; Veening et al., Neurosci. 5:1253-1268, 1980）、この領域はまた最も初期
に形成される線条体領域である（Bayer, Neurosci. 4:251-271, 1984）。線条体
には腹側外側から背側内側の勾配でより若いニューロンが存在するので、求心性
神経は、ＳＮ（Ｅ１５以降に形成される）のより腹側内側（より後で生じる）部
分から到達し、これらより後で生じる線条体領域を神経支配する。したがって、
最も若い（腹側内側の）黒質ドーパミンニューロンは最も若い（背側内側の）線
条体ニューロンを神経支配し、より齢の進んだ（背側外側の）黒質ドーパミンニ
ューロンはより齢の進んだ（腹側外側の）線条体ニューロンを神経支配する。こ
のパターンは、ＧＡＢＡ作動性の線条体黒質投射路で同様に繰り返される（Bunn
ey & Aghajanian, Brain Res. 117:423-435, 1976)。

【００３０】 線条のニューロンは、出生前および出生後初期の脳の側脳室周辺の感覚上皮に
由来する。脳室ゾーンは最初脳室を裏打ちし、後にそれより深いところにある脳
室下（または上衣下）ゾーンが加わる。脳が成長するにつれ、脳室ゾーンは消失
するが、上衣下ゾーンは細胞の薄い層として存続する。このゾーンは、神経幹細
胞および原始細胞を含み、これらの細胞は限定され制限された経路に沿って移動
し、嗅球の不安定な介在ニューロン細胞集団を補充する（Luskin, Neuron 11:17
3-189, 1993; Lois & Alvarez-buylla, Science 264:1145-1148, 1994)。

【００３１】 Ｃ．病理学 線条およびそのドーパミン作動性神経支配は、いくつかの神経変性疾患（例えば
ハンチントン病（ＨＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ））を含む多くの症状の攻
撃を受けやすい（Albin et al., 1989, 上掲書）。ＨＤは、常染色体（４番染色
体）の優性遺伝性疾患で、線条の進行性変性を特徴とする。ＨＤは、四肢と顔面
の不随意性の舞踏病性不定位運動および随意運動崩壊を伴う（概説として、Purd
on et al., J. Psychiatr. Neurosci. 16:359-367, 1994)。マトリックス区画内
の中間有棘ＧＡＢＡ作動性ニューロン、特にＧＰ_eに刺激を伝播するＧＡＢＡ／ エンケファリン作動性ニューロンが最も影響を受ける（Albin et al., 1989, 上
掲書）。大型の無棘コリン作動性介在ニューロン並びにソマトスタチン、ニュー
ロペプチドＹおよびＮＡＤＰＨ−ジアフォラーゼを含む小型の無棘介在ニューロ
ン（これらもまたマトリックス区画内に見出される）は比較的障害を受けない（
Ferrante et al., Science 230:561-563, 1985; Reiner et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 85:5733-5737 、 1988)。しかしながらＨＤのさらに進行した段
階では、ニューロンの変性は線条の全てのタイプのニューロンを含み、脳幹神経
節、大脳皮質、視床下部および小脳の他の核に及ぶ。

【００３２】 パーキンソン病（ＰＤ）は、安静時振せん、硬直、動作開始不能（失動症）お
よび動作の緩慢（運動緩徐）を特徴とする（Marsden, Lancet 335:948-952, 199
0)。運動性欠如は、ドーパミン作動性黒質線条経路の進行性変性、及び様々な程
度の、側坐核へのドーパミン作動性神経支配の喪失、青斑のノルアドレナリン作
動性細胞の変性、および縫線のセロトニン作動性ニューロンの変性に付随する（
Javoy-Agid et al., Adv. Neurol. 40:189-198, 1984; Agid, Lancet 337:1321-
1327, 1991）。８０％もの黒質ドーパミンニューロンが顕著な運動性欠如が出現
する前に失われる。

【００３３】 神経栄養因子として知られるペプチドを神経変性疾患の治療薬として使用する
主要な方策の１つは、変性の進行を停止させ、残存する細胞の機能を強化するこ
とである。下記の実施例で提示する実験は、本発明がいかにして従来提唱された
用途を越えて神経栄養因子を使用するかを実例で説明する。

【００３４】 ＩＩ．神経学的欠損の治療 下記実施例で示すように、成熟前脳の上衣下ゾーンの神経原始細胞は、ＥＧＦ レセプターと結合するポリペプチド（例えばＴＧＦα；本明細書で用いられる“
ポリペプチド”という用語は、長さまたは翻訳後修飾にかかわらず任意のアミノ
酸残基鎖を指す）の輸液によって、刺激され増殖して中枢神経系（ＣＮＳ）（例
えば線条）に集団として移動させることができる。さらにまた、この増殖細胞を
密度の高い隆線として移動させることができる。下記に述べるように、誘導移動
は多様な方法で達成できる。例えば、標的領域の脱神経（これは神経化学的また
は機械的な力によって達成できる）によって、ポリペプチド増殖因子（例えばＴ
ＧＦβ、これはフィブロネクチンおよびラミニンのような細胞粘着分子の局部的
発現を増加させる）の適用によって、および所望の移動経路沿いの細胞を天然に
存在するシグナルを抑制する化合物と接触させる（そうしなければ移動を抑制す
るであろう、すなわち抑制物質を抑制することによって受動的なミクロの環境を
出現させる）ことによって誘導移動は促進される。

【００３５】 さらに、移動隆線の形状は、輸液の位置を変えることによって（例えば輸液カ
ニューレの配置または活性化合物を含む生物分解性カプセルの位置を変えること
によって）制御することができる。同様に、隆線内の細胞数は、活性化合物の投
与量（例えばＴＧＦαの投与量）を変動させることによって、または活性化合物
が上衣下領域の神経原始細胞集団に対して放出される距離を変えることによって
制御できる。下記で述べるように（および図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂお
よび１１Ｃで図示するように）、動物が線条中央または内側線条輸液を受ける場
合、移動細胞は輸液カニューレにそれら細胞が到達する前に停止し、Ｓ字型また
はＬ字型隆線を生じる。したがって、細胞の移動を促進するのみならず、移動が
終了する場所を制御することも可能である。増殖因子（及び他の化合物）の投与
量および放出場所を調節することによって、影響を受ける面積を比較的限定され
た標的領域に制限することが可能であろう。

【００３６】 成熟哺乳類の脳の神経原始細胞の増殖および移動は、別々に制御することがで
きる異なった事象である。求心路遮断のないＴＧＦαまたはＥＧＦの大脳脳室内
（ＩＣＶ）輸液または線条体内輸液は増殖を誘発することができるが、しかし変
性した細胞、損傷を受けた細胞（例えば求心路遮断または他の損傷によって）、
またはそうでなければ異常な（すなわち機能不全の）細胞が存在し、関連する神
経学的損傷からの回復に少なくとも影響を与えるに十分な規模で移動を促進させ
るであろう。さらに下記で述べるように、変性、損傷または異常細胞のこの促進
作用を薬理物質を用いて模倣することができる。例えば、誘発化合物を投与する
ことにより線条内に細胞粘着分子の一過性発現を刺激することができる。例えば
、フィブロネクチンは、小脳星状細胞培養で増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）を形質
転換させることによって強力にアップレギュレートされる（Baghdassarian et a
l., Glia 7:193-202, 1993）。ＴＧＦβを過剰発現しているトランスジェニック
（遺伝子導入）マウスでは、フィブロネクチンおよびラミニンもまたＣＮＳで正
常レベルを越えて顕著に増加する（Wyss-Coray et al., Am. J. Pathol. 147:53
-67, 1995)。したがって、細胞外マトリックス分子または細胞粘着分子の発現を
刺激する任意の化合物により、特に所望の経路にしたがって移動を誘導すること
は、本発明の範囲内と考えられる。

【００３７】 前脳の神経幹細胞（これは移動子孫細胞を生じる）は、脳室の壁沿いの位置に
残留すると考えられる（Morshead et al., Neuron 13:1071-1082, 1994）。下記
に述べる実験では、濃厚なＥＧＦレセプターハイブリダイゼーション領域は、移
動隆線が線条内に移動した後も側脳室に沿って残存した。さらに、伸長した細胞
が常に隆線と側脳室との間に見出された。したがって、上衣下ゾーンから集団で
細胞が移動するにもかかわらず、幹細胞自体はおそらく移動隆線の一部分ではな
いであろう。これらの神経幹細胞は、新しいニューロンおよびグリアの再生可能
な供給源を提供するであろう。したがって、神経の子孫細胞の多数の集団を刺激
して、損傷脳もしくは変性脳の領域または神経損傷の回復を助ける領域に移動さ
せることができる。これらの細胞の存続はまた、成熟前脳の幹細胞の正常な機能
（現時点では嗅球のための新しいニューロンを提供すると考えられている）は不
可逆的にこの処置によって破壊されることはないということを示唆している。

【００３８】 線条でのＴＧＦα（およびそのｍＲＮＡ）の豊富な発現およびドーパミン作動
性神経支配の欠如はまた発達初期の線条の特徴である（Weickert & Blum, Devel
.Brain Res. 86:203-216, 1995; Bayer, Intl. J. Devel. Neurosci. 2:163-175 , 1984）。同様に、ＴＧＦα輸液動物の上衣下領域におけるＥＧＦレセプター ｍＲＮＡ発現の増加は、発達中の脳の脳室周囲の感覚上皮で認められる豊富なＥ
ＧＦレセプターｍＲＮＡのハイブリダイゼーションと類似する（Seroogy et al.
, Neuroreport 6:105-108, 1994; Seroogy et al., Brain Res. 670:157-164, 1
995)。フィブロネクチンのｍＲＮＡコード形、およびそのレセプター、並びに他
の細胞粘着分子（これらは神経原始細胞の移動を促進する）はまた発育にしたが
って調節される（Pesheva et al., J. Neurosci. Res. 20:420-430, 1988; Prie
to et al., J. Cell Biol. 111:685-698, 1980; Pagani et al., J. Cell Biol. 113:1223-1229, 1991; Linnemann et al., Int. J. Devel. Neurosci. 11:71-8
1, 1993)。したがって、本実験のＴＧＦαを輸液され、さらに６−ＯＨＤＡで損
傷を受けた動物で観察された作用を概念化する１つの方法は、胚の神経発生の選
択的発生反復として考えることである。すなわち、成熟哺乳類の脳における神経
幹細胞は増殖シグナルに反応し、それらの子孫細胞は、発達中の動物で反応した
ように移動シグナルに反応することができるであろう。

【００３９】 最近になって神経幹細胞が、成獣ゲッ歯類のＣＮＳ全体の上衣下（Weiss, Soc
. Neurosci. Abstr. 25:101, 1995; Ray et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22:39
4.5, 1996)、および成人の前脳の上衣下（Kirschenbaum et al., Cerebral Cort
ex 4:576-589, 1994）で見出された。本明細書に開示した方法にしたがって、脳
および脊椎の多様な領域の病的もしくは損傷を受けた、または機能不全のＣＮＳ
ニューロンに代わる新しいニューロンの供給源を提供するためにこれらの細胞を
操作することができる。

【００４０】 Ａ．本発明の利点 下記でさらに述べるように、神経学的欠損を治療するために提唱される技術の １つは、そのような欠損をもつ患者から神経原始細胞を取りだし、さらにこれら
の細胞を培養で増殖させ、多数の神経子孫細胞を増殖させることを含む。続いて
、これらの細胞を当業者に既知の技術を用いて再度同じ患者に移植することがで
きる（例えば以下を参照；Stein et al., "Brain Repair", pp.87-103, Oxford University Press, New York, 1995; Leavitt et al., Soc. Neurosci. Abstr.
22:505, 1996）。明らかに、この技術は、流産胎児由来の胚細胞を必要とする現
在使用されている技術より有利である。要するに、それは、組織のドナーとして
中絶胎児を使用することが必要なために生じる倫理的問題を回避する。さらにこ
の技術は、移植拒絶の高発生の原因となる免疫反応を刺激しないので成功の蓋然
性が高い。

【００４１】 神経原始細胞の増殖および移動のin vivo での刺激はまた別の利点を有する。
すなわち、in vivo 刺激は侵襲的神経外科手術の程度およびおそらくはその数を
減少させる。幹細胞切り出し手術は実施されないであろうし、胚細胞または培養
細胞の移植では典型的に必要とされる多数の移植細胞栓子は不要であろう。さら
に、移植操作による未分化神経原始細胞の大量死はないであろう。典型的には、
ヒトの胎児のドーパミン作動性細胞移動においては、移植細胞の９０％から９９
％を越える細胞が定着する前にホストの脳で死滅する（Freed et al., Soc. Neu
rosci. Abstr. 22:481.3, 1966）。

【００４２】 本発明によって提供されるもう１つの利点は、神経原始細胞は瘢痕組織によっ
てホストの脳から隔離されないであろうということである。移植細胞栓子は、神
経膠瘢痕組織および反応性星状細胞の外皮の中に被包化される。厚い神経膠組織
の物理的バリアーに加えて、瘢痕組織内の反応性星状細胞は、軸索の成長を抑制
する因子を放出する（McKeon et al., 1995)。in vivo で生じた神経原始細胞は
脳の残りの部分から瘢痕組織によって隔離されない。したがって、それらの軸索
の成長は反応性星状細胞の大量増殖によって抑制されないであろう。したがって
、本明細書で提供される誘導移動は、障害を受けていない領域に影響を与えるこ
となく、大量の新細胞によるＣＮＳの特定の損傷領域の選択的リポピュレーショ
ン（程度には変化があるかもしれない）を可能にする。

【００４３】 本明細書で提示する技術は、in vivo で刺激された前脳神経幹細胞に関する以
前のただ１つの実験より進歩している。以前の実験では、成獣ラットは６日間Ｅ
ＧＦのＩＣＶ輸液を受け、輸液後７週間まで追跡調査された（Craig et al., J. Neurosci. 16:2649-2658, 1996)。本実験では、ＴＧＦαを１４日間輸液し、輸
液終了後３ヵ月間追跡調査した。この違いは、本実験でのみ脳室周囲の拡張部の
細胞が重層線条内に集団で移動したという点で極めて重要である。選択した標的
領域内への神経原始細胞のこの誘導集団移動は、新規なニューロンによる変性脳
領域のリポピュレーションのためにはるかに好ましい方法を提示する。

【００４４】 神経幹細胞の分化の操作は最近強い関心がもたれている分野のひとつである。
細胞の分化がいったん終了するや、それら細胞の最終的な配置および神経化学的
表現型は極めて重要であり、下記でさらに考察する。

【００４５】 神経原始細胞を成獣ゲッ歯類の脳から取りだしin vitroで分化させたとき、細
胞は免疫化学的に星状細胞、稀突起神経膠細胞およびニューロンとして特定され
る細胞が認められる（Reynolds & Weiss, Science 255:1707-1710, 1992; Reyno
lds et al., J. Neurosci. 12:4565-4574, 1992; Lois & Alvarez-Buylla, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2074-2077, 1993）。ニューロンとして特定される
細胞の多くはまた、ＧＡＢＡおよびＰ物質（これらは線条で通常見出される２種
の細胞型の神経化学的マーカーである）に対して免疫反応性を有する。成人の脳
から体外移植された原始細胞もまた神経マーカーを発現し、ニューロンに付随す
る電気生理学的特性を示す（Kirschenbaum et al., Cerebral Cortex 4:576-589
, 1994）。

【００４６】 これらの実験は、線条体隆線の細胞がin vivo で偶発的に分化する場合、それ
らの多くは線条体ニューロンに典型的な表現型をもつ細胞になることを示唆して
いる。最近のいくつかのデータは、それらの表現型は種々のニューロトロフィン
の組み合わせに暴露することによって変化させることができることを示唆してい
る（Lachyankar et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22:394.7, 1996)。種々の処置
を受けた原始細胞は、いったん分化すると種々の神経化学的免疫マーカーを発現
する。これらにはアセチルコリンエステラーゼ、ＧＡＢＡ、チロシンヒドロキシ
ラーゼ（ＴＨ）およびカルビンジンが含まれる。ＴＨの発現は特に興味深い。な
ぜならば、一体化された増殖、移動およびドーパミン細胞への誘導分化は、パー
キンソン病（ＰＤ）で失われた線条体ドーパミンを再置する新規な方法を提供す
るからである。

【００４７】 ＰＤの患者では、機能的に顕著な数の新しいドーパミン産生線条体細胞が、流
産胎児の中脳組織の移植と同様な態様で、運動性欠損の回復を助けるであろう。
ハンチントン病（ＨＤ）の患者では、新しい中間有棘ＧＡＢＡ作動性ニューロン
およびその疾患で失われる他のニューロンの新しいもので線条体をリポピュレー
ションさせるために、神経原始細胞が刺激されるであろう。異なる研究系統から
得られた最近のいくつかの証拠によれば、線条淡蒼球経路の再構成自体は可能で
あろうということが示唆された。条件を整えて不死化させて線条に移植した神経
原始細胞は分化し、突起が線条から淡蒼球へ送られた（Lundberg et al., 1996)
。

【００４８】 Ｂ．治療に適した神経学的欠損 本発明は、多能性原始細胞を刺激して分裂させ脳全体に移動させることができ るという発見を基にしているので、多様な疾患、異常および損傷によって引き起
こされた神経学的欠損を治療するために用いることができる。これらの障害には
以下のものが含まれるが、ただしこれらに限定されるものではない（当業者の他
のものは下記に挙げた疾患および異常を異なる態様で分類するかもしれないが、
それら疾患に付随する神経学的欠損は本発明の方法にしたがって治療するために
適している）。

【００４９】 １．変性性疾患 本発明にしたがって治療できる変性性疾患には以下が含まれる：アルツハイマ ー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、ピック病、
進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、線条黒質変性、皮質基底変性、小児崩壊性障害、
オリーブ橋小脳萎縮（ＯＰＣＡ；遺伝型を含む）、リー病、乳児壊死性脳脊髄障
害、ハンター病、ムコ多糖体症、種々の白質萎縮症（例えばクラッベ病、ペリツ
ェーウス＝メルツバッヒャー病など）、黒内障性（家ファミリー性）精神遅滞、
クッフス病、シュピールマイアー＝フォークト病、テイ＝サックス病、バッテン
病、ヤンスキー＝ビールショースキー病、レイエー病、大脳性運動失調、慢性ア
ルコール中毒、脚気、ハレルフォルデン＝シュパッツ症候群、小脳変性など。

【００５０】 ２．中枢神経系に対する外傷性および神経毒性損傷 本発明の方法にしたがって治療できる外傷性および神経毒性損傷には以下が含 まれる：銃創、鈍器によって生じる外傷、貫通外傷によって生じる外傷（例えば
刺し傷）、外科手術時に生じる外傷（例えばＣＮＳから腫瘍または膿瘍を除去す
るため、または癲癇治療のため）、中毒（例えばＭＰＴＰまたは一酸化炭素）、
シェークンベビー症候群（Shaken-baby syndrome）、薬物の副作用（特異体質反
応を含む）、薬物過剰投与（例えばアンフェタミン）、外傷後脳障害など。

【００５１】 ３．虚血 神経系への血流または酸素供給の阻害はいずれも細胞（その中のニューロンお よび神経膠細胞を含む）を損傷し死滅させる。これらの損傷は本発明の方法にし
たがって治療でき、以下の損傷を含む：脳血液供給関連発作によって生じる損傷
（全体的発作（心停止、不整脈または心筋梗塞から生じるもの）または病巣性発
作（血栓、塞栓、出血、または他の動脈閉鎖から生じるもの）を含む）、酸素欠
乏症、低酸素症、部分的水溺、筋クロヌス、重篤な煙の吸入、失調症（遺伝性失
調症を含む）、後天的水頭症など。

【００５２】 ４．発達異常 本発明の方法にしたがって治療できる発達異常には以下が含まれる：精神分裂 病、重篤な知的発育遅延のある種の形態、脳性麻痺（原因が感染、酸素欠乏、早
産、血液型不適合などのいずれであれ、さらに盲目、聾唖、発育遅延、運動技能
欠失などを示しているか否かにかかわらない）、先天性水頭症、ＣＮＳに影響を
与える代謝異常、重篤な自閉症、ダウン症候群、ＬＨＲＨ／視床下部異常、二分
脊椎など。

【００５３】 ５．視力に影響を与える異常 視力に影響を与える異常、特に網膜細胞の消失または障害によって生じるもの は本発明の方法によって治療することができる。これらの異常には、糖尿病性網
膜症、重篤な網膜剥離、緑内障に付随する網膜損傷、網膜の外傷、網膜血管閉塞
、黄斑の変性、遺伝性網膜ジストロフィー、視神経萎縮、および他の網膜変性疾
患が含まれる。

【００５４】 ６．脊椎の損傷および疾患 脊椎の損傷または脊椎に影響を与える疾患もまた本発明の方法にしたがって治 療できる。そのような損傷または疾患には以下が含まれる：ポリオ後遺症症候群
、筋萎縮性側索硬化症、不特定脊椎変性、外傷性損傷（例えば交通事故またはス
ポーツ事故によって発生したもので、脊椎の細胞の機能を粉砕するか、部分的、
完全もしくは不可逆的に影響を与える一切の損傷を含む）、脊椎の手術によって
生じた損傷（例えば腫瘍摘出）、前角細胞疾患、麻痺性疾患など。

【００５５】 ７．脱髄または自己免疫疾患 脱髄または自己免疫反応によって生じる神経学的欠損は本発明の方法にしたが って治療できる。そのような欠損は、多発性硬化症、おそらく狼瘡、および他の
疾患によって生じる。

【００５６】 ８．感染性または炎症性疾患 感染性または炎症性疾患によって生じる神経学的欠損は本発明の方法にしたが って治療できる。治療可能な欠損を生じる感染性または炎症性疾患には、クロイ
ツフェルト＝ヤコブ病および他のスローウイルス感染症、ＡＩＤＳ脳症、脳炎後
振せん麻痺、ウイルス性脳炎、細菌性髄膜炎および他の微生物によって生じる髄
膜炎、頭蓋内静脈洞の静脈炎および血栓性静脈炎、梅毒性振せん麻痺、ＣＮＳの
結核などが含まれる。

【００５７】 ９．その他 当業者には、それらの原因にかかわらず神経学的欠損を理解し、そのような欠 損をもつ患者を治療するために本発明の方法を適用することが可能であろう。上
記に挙げた症状の他に、本明細書に開示した方法を用いて治療することができる
神経学的欠損には、レッシュ＝ナイハン症候群、重症筋無力症、種々の痴呆、多
数の寄生性疾患、癲癇などが含まれる。本発明の方法は、これらおよび他の疾患
、異常または外傷によって生じる神経学的欠損の軽減に容易に適用できる。

【００５８】 Ｃ．ＥＧＦレセプターに結合するポリペプチド １．ＥＧＦファミリー ＥＧＦファミリーのポリペプチド群はある意味で無関係に見える。例えば、ＴＧ
ＦαとＥＧＦはわずか３０％の構造的相同性しかもたない（Marquardt et al.,
Science 223:1079-1082, 1984)。しかしながら、それらはＭr１８００００ＥＧ Ｆ膜レセプターに対して同様な結合動態を示し、さらに当該レセプターのチロシ
ン特異的燐酸化を刺激する（Cohen et al., Nature 292:259-262, 1981）。この
２つの増殖因子の機能的同等性は、部分的には６つのシステイン残基（コンセン
サス配列中で“Ｃ”で表される：ＣＸ₇ＣＸ_4,5ＣＸ₁₀ＣＸＣＸ₈Ｃ）が同じ相対 的配置にあるということによる。これらの保存残基は、同様なジスルフィド結合
によって仲介される構造的拘束を与え、したがって関連のある三次元構造を与え
る（Twardzik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5300-5304, 1985)。当
業者には、任意のアミノ酸配列をＥＧＦファミリーのコンセンサス配列と比較し
て、あるポリペプチドが機能的にＥＧＦと同等でありそうか否かを決定すること
は容易であろう（同等である場合、本発明の方法を実施するのは有用であろう）
。（ＥＧＦ、ＴＧＦα、およびワクシニアウイルスの１９ｋＤａ初期タンパク質
配列におけるシステイン並びにグリシン残基の同様なパターンを明らかにするコ
ンピューター検索の記載について例えば以下を参照された：Blomquist et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7363-7367, 1984）。

【００５９】 ＥＧＦ、ＴＧＦαおよびワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）の他に、ＥＧＦファミ
リーにはアンフィレギュリン（ＡＲ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、エピレギュリ
ン（ＥＲ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、神経線維腫由来
増殖因子（ＳＤＧＦ）、ＨＵＳ１９８７８、ミクソーマウイルス増殖因子、ショ
ープ線維腫ウイルス増殖因子および奇形癌由来増殖因子−１（ＴＤＧＦ−１、ま
たクリプト−１（ＣＲ−１）としても知られている）が含まれることが知られて
いる。

【００６０】 ２．ＥＧＦレセプター結合を決定する方法 当業者にはいずれのポリペプチドもＥＧＦレセプターに結合するか否かは容易 に決定できよう。本明細書で用いられるように、“結合”という用語は、生物学
的反応（好ましくは神経学的欠損の減少に寄与する反応）を誘発するために十分
なシグナルトランスダクションを生じるポリペプチドとＥＧＦレセプターとの間
の一切の特異的相互反応を指す。好ましくは、本発明の方法で有用ないずれのポ
リペプチドもＥＧＦレセプターと、ＥＧＦそれ自体の結合親和性の少なくとも５
０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％に匹
敵する親和性で結合するであろう（ＥＧＦレセプター結合におけるＶＧＦ、ＴＧ
Ｆα、およびＥＧＦの生物学的活性の比較については上掲書（Twardzik et al）
を参照されたい）。

【００６１】 ＥＧＦレセプター結合アッセイを実施する場合に手引が必要な場合、適切な方
法を記載している多数の文献のいずれも当業者は参照することができる。この事
項に関する以下の５つの文献が参照により本明細書に含まれる：Cohen & Carpen
ter(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:1317-1321, 1975）またその改変としてTw
ardzik et al.(上掲書）、同様に特異的結合および配列情報、シグナル発生、並
びにレセプターの局所解剖に関する内容を含む概説として、例えば、McInnes & Sykes(Biopolymers(43:339-366, 1997）、Boonstra et al.(Cell Biol. Intl. 1
9:413-430, 1995)、または、Gill(Mol. Reprod. Dev. 27:46-53, 1990)。

【００６２】 Ｄ．誘導移動 下記の実施例でもまた、特に成獣ゲッ歯類の前脳における神経原始細胞の誘導 移動の成功の証拠を提供する。下記実施例で使用される（さらにそこで完全に開
示される）免疫組織化学的および他の技術を、当業者が日常的に実施している同
様な技術と同様に用いて、細胞の移動を誘導するために用いられる任意の増殖因
子または任意の他の刺激物質による輸液の効果を調べることができる。実際、あ
る程度詳細に細胞の移動を追跡することが可能である（すなわち、細胞数、細胞
の大きさ、形状および神経系内のその配置を決定することができる）。

【００６３】 細胞にin vivo で多様な刺激を施し、集団での細胞の移動を誘導することがで
きる（細胞の移動を指すために本明細書で用いられる“集団で”という用語は、
実質的に同じ方向に集団として認識されるために十分な時間（例えば図９、１０
および１１で明らかなように）細胞集団が移動することを意味する）。大雑把に
言えば、２つの方法のどちらかで移動を誘導することができる：（１）指令的誘
導態様、すなわち積極的に移動細胞を誘因する刺激（例えば化学誘引物質、神経
向性因子、または細胞粘着分子もしくは細胞外マトリックス分子（例えばフィブ
ロネクチン、ラミニン、または神経細胞粘着分子）の発現を増加させる化合物（
例えばＴＧＦα））を適用することによるか、または（２）受動的態様、すなわ
ち移動細胞を抑制するシグナルを抑制する刺激を適用することによる。

【００６４】 移動を誘導する刺激としては、標的領域の組織の破壊が含まれる。この標的領
域は細胞が損傷を受けた部位、または発達異常のために細胞が異常な連結を生じ
た任意の部位であろう。細胞が損傷を受けた部位は、例えば線条または黒質（こ
こでは多数の消耗性神経変性疾患に伴ってドーパミン作動性細胞が失われること
が分かっている）；大脳皮質（ここでは、例えば血栓または塞栓によって生じた
虚血性事象に続いてニューロンおよびグリアが失われる）；または脊椎（ここで
は、例えば外傷性損傷によって運動ニューロンが失われる）である。また別には
、神経原始細胞からそれら細胞の所望の移動終点へ向かってのびている経路の中
または経路に沿って組織を破壊することができる。

【００６５】 組織は、物理的な力（例えばニューロンを除去または切断するか、またはニュ
ーロン細胞体から伸びる突起の１つもしくは２つ以上を切断する）、毒物または
神経毒（例えばリシンまたは６‐OHDA）、腐食性化学物質（例えば酸性または塩
基性溶液）、アポプトシスを誘発する化合物（Leavitt et al.（Soc. Neurosci. Abstr. 22:505, 1966）を参照されたい）、脱髄を誘発する化合物(Lachapelle
et al. (Soc. Neurosci. Abstr. 22:505, 1966）を参照されたい）、または細胞
活性を抑制することができる化合物（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（
例えば細胞の主要な神経伝達物質をコードする遺伝子の転写を抑制するオリゴヌ
クレオチド）、抗体またはポリペプチド）によって破壊することができる。当業
者には多くのそのような化合物は既知で、それらには、細胞表面のレセプターに
結合することができるが活性化させることができない化合物、例えば通常はグル
タメートが結合する代謝向性レセプターが含まれる。例えば、下記で述べる実験
では、６−ＯＨＤＡによるドーパミン脱神経（ＴＧＦαの輸液を伴う）の細胞移
動に対する効果は明瞭である。

【００６６】 神経系の標的領域、特に患者の脳および脊椎の明瞭で正確な画像（現在では例
えば磁気共鳴画像化またはコンピュータ支援断層撮影スキャンで作製することが
できる）が得られる領域に、上記の化学物質のいずれかを適用することによって
、細胞の移動を誘導することは、当業者には容易であろう。

【００６７】 さらにまた、下記に述べる実験から、細胞がたどる移動経路をより正確に誘導
し、細胞が停留する場所をより正確に限定するために、移動を誘導する化合物の
適用に付随する１つまたは２つ以上の変数（適用の性質、位置、濃度および期間
を含む変数）を変更することができることは明瞭であろう。

【００６８】 Ｅ．分化因子 いくつかの神経原始細胞は偶発的に分化することができるが、十分な時間が許 されるならば、分化が生じる時および場所を制御することによってはるかに大き
な利点が認識されることであろう。すなわち、そのような制御を実施することに
よって、神経の“リポピュレーション”（神経学的欠損を減少させるために十分
であるかぎり部分的でも完全でもよい）を、その必要があるＣＮＳの領域に限定
することができる。したがって、神経原始細胞をＥＧＦレセプターと結合するポ
リペプチドと接触させる前、その間、またはその後で種々の刺激を与えることが
できる。

【００６９】 大雑把に言えば、分化を誘発する刺激は“普遍的”でも“誘導的”でもよい。
普遍的分化刺激は、細胞を刺激して自然の状態で認められるように分化させるも
ので、細胞を刺激してその天然の表現型を発現させることによって神経学的欠損
を減少させることができる場合はいつでも適用される。例えば、線条の上衣下ゾ
ーンの細胞は普遍的な分化シグナルに暴露されたときＧＡＢＡ作動性ニューロン
に分化することは当技術分野で知られている。したがって、普遍的分化因子の適
用によりこれらの細胞を刺激して分化させることによって、ハンチントン病の患
者（このような患者ではＧＡＢＡ作動性中間有棘ニューロンが選択的に失われて
いる）に付随する神経学的欠損を減少させることができるであろう。

【００７０】 本発明の増殖性および移動性細胞の分化を促進するために、普遍的分化を刺激
する既知の手段を当業者は容易に適用できるであろう。例えば、細胞を網膜芽腫
タンパク質と接触させることによって細胞サイクルから脱出させる（これは分化
のために必要である）ことができることが知られている（最近の研究について以
下を参照されたい：Slack et al., J. Cell Biol. 140:1497-1509, 1998)。さら
に、細胞を細胞サイクル関連キナーゼ抑制物質（ｐ２１）と接触させることによ
って、細胞を有糸分裂後の状態（すなわち分化状態）に維持できる（Berger et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22:505, 1996)。本発明で分化を促進するために適
用できるもう１つの刺激はサイクリンＤ細胞サイクル調節物質である（Ouaghi e
t al., Soc. neurosci. Abstr. 22:1706, 1996）。稀突起神経膠細胞の前駆細胞
の分化を刺激したい場合は、インテグリンを適用できる（例えば以下を参照され
たい：Buttery et al., Soc. Neurosci. Abstr. 22:1723, 1996)。脳由来神経栄
養因子（ＢＤＮＦ）およびレチン酸（ＲＡ）は細胞の分化を刺激するそれらの能
力についてよく知られている（例えば、Ahmed et al., J. Neurosci. 15:5765-5
778, 1995)。

【００７１】 当該事例では、神経前駆細胞を移動誘導の前に培養し、それらの分化に影響を
与えることができる脳の領域にそれら細胞を移植することができる。例えば、移
植した神経前駆細胞は、脳室下ゾーン近くに移植（３５％まで）したときの方が
より外側部位に移植したものより（この場合わずか０〜８％の細胞が分化した）
高い百分率でニューロンに分化した（Catapano & Macklis, Soc. Neurosci. Abs
tr. 23:345, 1997）。同様に、移植された小脳前駆細胞は、海馬に移植されたと
き海馬のニューロンのマーカーを発現する（Vicario-Abejon et al., J. Neuros
ci. 15:6351-6363, 1995）。したがって、増殖性神経前駆細胞の子孫細胞をそれ
らの分化を刺激する化合物と接触させる代わりに、細胞の分化を誘導することが
できる脳の領域内またはその十分近くに細胞を移植することによって本発明を実
施できることは当業者には理解されよう。

【００７２】 誘導分化刺激は、細胞を刺激して誘導させるものであるが、その細胞が天然に
発現する表現型とは異なる表現型を有するものである。誘導分化因子は、細胞を
刺激して非天然の表現型を発現させることによって、神経学的欠損を減少させる
ことができる場合はいつでも適用できるであろう。そのような例の１つはパーキ
ンソン病の場合で、この場合は線条体細胞をドーパミン産生細胞に分化させるこ
とによって、黒質からのドーパミン作動性神経支配の損失を代替することができ
るであろう。同様に、アルツハイマー病で細胞が選択的に失われた場合、筋萎縮
性側索硬化症で脊椎の運動ニューロンが失われた場合、外傷性脊椎損傷の後で脊
椎の運動ニューロンが失われた場合、および脱髄疾患（例えば多発性硬化症）で
稀突起神経膠細胞が失われた場合、中隔領域のコリン作動性表現型の発現を刺激
することを目的とすることができる。

【００７３】 ＧＤＮＦ／ニューツリン（neurturin)（ＴＧＦβ）ファミリーの因子（これら
はグリア細胞株に由来する）は神経細胞の分化を誘発するかもしれない（さらに
これはＲＡによって強化される）（Hishiki et al., Cancer Res. 58:2158-2165
）。さらに、ＧＤＮＦは、ラットの腹側中脳培養で運動ニューロンの分化を刺激
する。ＢＤＮＦおよび毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）もまた運動ニューロンの
分化を促進する（それらの作用はＧＤＮＦの作用に対して付加的または相乗的で
あるようである）（Zurn et al., J. Neurosci. Res. 44:133-141, 1996)。さら
に、運動ニューロンの分化は、ビトロネクチン（これは神経管の腹側領域で発現
される（Martinez-Morales et al., Development 124:5139-5147))の適用によっ
て、および音性ヘッジホッグによってコードされるタンパク質によって誘発する
ことができる（Tanabe et al., Curr. Biol. 5:651-658, 1995）。音性ヘッジホ
ッグファミリーの１つであるインディアンヘッジホッグは発育中および成熟網膜
で発現され、網膜原始細胞の増殖および光受容体の発達を促進する（Levine et al., J. Neurosci. 17:6277-6288, 1997）。

【００７４】 皮質の神経原始細胞は、ＥＧＦ、ＴＧＦαおよび前記細胞が増殖する基質タイ
プに影響されて領域特異的表現型を表す。ＥＧＦまたはＴＧＦαによって、非辺
縁系領域の原始細胞に由来する辺縁ニューロンの百分率はそれらが増殖因子欠如
マトリゲル（Matrigel（登録商標））またはＩＶ型コラーゲン上に静置された 場合２倍になる（Ferri et al., Development 121:1151-1160, 1995)。

【００７５】 インシュリンは、胎児の神経細胞培養の分化にＩＧＦ−１以上に影響を与える
ことが知られている（Abboud et al., Soc. Neurosci. Abstr. 23:1425, 1997）
。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびニューロトロフィンは、海馬細
胞の分化を誘導するために用いることができる（Vicario-Abejon et al., Neuro
n 15:105-114, 1995）。

【００７６】 ある実施態様では、本発明の方法は、変性性疾患で失われた神経経路を修復す
るために用いられる。例えば、分化した線条体ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、そ
の分化に際して線条淡蒼球投射路を修復することができる。本発明の方法によっ
て再構築することができる多数の神経経路を当業者は容易に理解しえよう。

【００７７】 Ｆ．医薬組成物 本発明での使用に適したポリペプチド（すなわちＥＧＦレセプターに結合する か、または分化を刺激するもので、また本明細書では“活性化合物”と称される
もの）は、投与に適した医薬組成物に包含させることができる。典型的には、そ
のような組成物は１つまたは２つ以上のポリペプチドおよび“医薬的に許容でき
る担体”を含む。前記担体は、任意の全ての溶媒、分散媒体、被覆物質、抗菌剤
、抗黴剤、等張剤および吸収遅延剤などの医薬用投与に適合するものを含む。そ
のような媒体および薬剤を使用することは当技術分野では周知である。いずれか
の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物にそれを使
用することは意図されている。

【００７８】 意図された投与ルート（非経口投与（例えば静脈内、皮内または筋肉内注射；
経口投与；または対象領域への直接適用を含む）用に医薬組成物を製剤化する必
要性は当業者には理解されるところである。本方法は、脳から採集し、培養基に
静置した神経前駆細胞にポリペプチドを適用するか、またはin vivo で前駆細胞
に直接適用する（例えば注射カニューレもしくはシャントによる輸液、または担
体（例えば生物分解性カプセル）内での移植によって）ことによって実施される
ことが意図せられているが、他の投与ルート、特に非経口（好ましくは静脈内）
投与もまた本発明の範囲内である。

【００７９】 本発明の医薬組成物で有用な溶液または懸濁液（例えばＥＧＦレセプターと結
合するポリペプチドおよび神経前駆細胞の分化を刺激する化合物を含有する組成
物として）には以下が含まれる：滅菌希釈液、例えば水、通常の食塩水、固定油
、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合
成溶媒；抗菌または抗黴剤、例えばベンジルアルコール、パラベン（例えばメチ
ルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、シメロサール
など；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤
、例えばＥＤＴＡ；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩；およ
び張度調節用薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸また
は塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節できる。

【００８０】 注射に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（活性化合物が水溶性の場合）、また
は滅菌注射溶液もしくは懸濁液の即席調製物を目的とした分散剤および滅菌粉末
を含む。静脈内投与用の適切な担体には生理学的食塩水、制菌水、クレモフォア
ＥＬ（Cremophor EL（登録商標）)(BASF;Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝食 塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての事例で、組成物は滅菌されていなければなら
ず、さらに注射筒で容易に吸引できるような程度に流動的であるべきである（適
切な流動性は、例えばレシチンのような被覆剤を用いるか、懸濁液の場合は一定
の粒子サイズを維持するか、および界面活性剤を包含させることによって維持で
きる）。組成物は製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、さらに上記に
記載したように、細菌および黴のような微生物の汚染作用から保護されなければ
ならない。多くの場合に、好ましくは等張剤（例えば糖類、ポリアルコール（例
えばマンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）が組成物に包含される。
注射用組成物の吸収延長は、吸収を遅らせる薬剤（例えばモノステアリン酸アル
ミニウムおよびゼラチン）を組成物に加えることによってもたらされる。

【００８１】 滅菌注射用溶液は、活性化合物（例えばＥＧＦレセプターと結合するポリペプ
チド）を必要な量で適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙した成分の１つま
たはその組み合わせとともに加え、続いて濾過滅菌を実施することによって調製
できる。一般に、懸濁液は、活性化合物および他の必要な上記に列挙したものか
ら選ばれる成分を基礎懸濁媒体を含む滅菌賦形剤に包含させることによって調製
される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法
は真空乾燥および凍結乾燥で、これによって活性化合物および先に濾過滅菌され
た溶液に由来する任意の所望の成分の粉末が得られる。

【００８２】 ある実施態様では、身体から急速に排除されることを防ぐ１つまたは２つ以上
の担体と合わせて活性化合物が調製される。それは例えば放出制御製剤で、移植
物および微小被包化薬剤供給系が含まれる。生物分解性であり、生物適合性であ
るポリマー、例えば酢酸ビニルエチレン、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コ
ラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を用いることができる。そのよう
な製剤を調製する方法は当業者には明白である。それらの材料は市販ルート、例
えばアルザ社（Alza Corp.）およびノバ・ファーマシューティカル社（Nova Pha
rmaceuticals, Inc.）から入手できる。リポソーム調製物もまた医薬的に許容で
きる担体として用いることができる。これらは、当業者に既知の方法にしたがっ
て、例えば米国特許第４５２２８１１号に記載されたように調製できる。

【００８３】 投薬の容易さおよび投薬の均質さのために、本発明の組成物をユニット製剤と
して製剤化するのが極めて有利である。本明細書で用いられるユニット製剤とは
、処置される患者のための単位投与量に合わせた物理的に別個のユニットを指す
。各ユニットには、所望の治療効果を得るために計算された予め定めた量の活性
化合物が必要な医薬担体と合わせて含まれている。本発明のユニット製剤の細目
は、活性化合物の固有の性状、達成されるべき個々の治療効果、および個々人の
治療のためにそのような活性化合物を調合する技術に固有の制限によって指定お
よび左右される。

【００８４】 ＥＧＦレセプターと結合するか、または細胞分化を刺激するポリペプチドを直
接適用する代わりに、これらのポリペプチドをコードする核酸分子をベクターに
挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは
、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５３２８４７０号）によって、また
は定位注射（例えば以下を参照：Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9
1:3054-3057, 1994)によって対象者に薬剤供給することができる。遺伝子治療ベ
クターの医薬調製物は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含有するも
のでもよく、また、遺伝子供給用担体が埋め込まれた例えば脳内もしくは脊椎内
の徐放性マトリックスであってもよい。また別には、完全遺伝子供給ベクターが
組換え細胞から無傷の状態で産生される場合（例えばレトロウイルスベクター）
、この医薬調製物は、遺伝子供給系を産生する１つまたは２つ以上の細胞を含む
ことができる。

【００８５】 医薬組成物は、容器、パック、または分配用具を投薬指示書とともに含むこと
ができる。

【００８６】 Ｇ．治療実施方法 実施例として（当業者は、ヒトの患者の最適投与量について１つのモデル(in vivoモデルであれ、in vitroモデルであれ）から別のモデルを容易に推定できよ
うが）、ゲッ歯類の脳について、神経前駆細胞の増殖を刺激するために輸液を少
なくとも２週間継続させた。その結果、隣接する脳室に沿って多数の未分化原始
細胞が劇的に増加した。下記の実施例で適用した持続的ＴＧＦα輸液もまた放射
状の細胞移動を支援するが、それだけではある種の動物で観察された大量の放射
状移動を刺激するには十分ではない。本明細書で開示した方法にしたがって実施
されるどの処置も処置期間を所望の結果にしたがって変更することができる。例
えば、下記の実施例では、細胞は脳室から集団移動する１週間以上前にその数を
大きく増加させた。さらにまた、移動の遅延は、標的領域の神経化学的または機
械的な脱神経によって促進され、さらに別の神経栄養因子、ＴＧＦβのような因
子（これは放射状移動を引き起こすと考えられている細胞粘着分子の局部的発現
を増加させる）の同時輸液によって薬理学的に促進できるかもしれない。移動パ
ターンおよび移動細胞の隆線の最終配置は、輸液場所を変えることによって制御
できる。

【００８７】 当業者には本発明で投与される化合物の必要な投与量は容易に決定できる。好
ましくは投与量は、輸液であれ経時的放出小胞からの放出であれ、活性化合物ま
たは成分（例えばＴＧＦαまたは上記の因子のいずれか）の１から１００ｎｇ／
ｋｇ／日、より好ましくは１から５０ｎｇ／ｋｇ／日の範囲であり、最も好まし
くは１から１０ｎｇ／ｋｇ／日が投与されるであろう。

【００８８】 実施例 実施例１：正常な発育中および成熟黒質線条体系におけるＴＧＦαおよびＥＧＦ
レセプターｍＲＮＡの発現 詳細な説明で概略したように、ＥＧＦファミリーの神経栄養因子をコードするｍ
ＲＮＡは黒質線状体系では発達にしたがって調節される。下記に述べる実験では
、ＴＧＦαおよびＥＧＦレセプターｍＲＮＡの発現が正常な発育時および成獣ゲ
ッ歯類系で調べられる。

【００８９】 Ａ．動物と組織の調製 スプラーグ＝ドーリ系ラット（２５０〜３５０ｇ）の成獣雄および調節妊娠中の
雌をシモンセン（Simonsen, Gilroy, CA）から入手した。当該実験および本明細
書で開示する他の全ての実験用動物は、温度および湿度が制御された動物飼育場
で維持した。これらの動物の使用は、用いた実験手順の全てについてカリフォル
ニア大学アーヴァイン校、動物管理委員会がアメリカ国立衛生研究所のガイドラ
インにしたがって承認したものである。

【００９０】 新生児（Ｐ０）、出生後１日（Ｐ１）、およびＰ４の動物を低体温によって麻
酔し断頭によって死亡させた。Ｐ１０、Ｐ２１および成獣動物は断頭によって死
亡させた。それらの脳を迅速に取りだし、イソペンタン中で−２０℃で凍結し、
−７０℃で保存した。冠状部クリオスタット切片を２０μｍで切り出し、ベクタ
ボンド (Vectabond（登録商標）, Vector Labs, Inc.)被覆スライドに前方から 後方の順に融解接着させた。切片を１時間０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
中の４％パラホルムアルデヒドで後固定し、リン酸緩衝液で洗浄し風乾した。切
片は乾燥剤を加えて処理まで−２０℃で保存した。

【００９１】 Ｂ．ハイブリダイゼーションプローブ ＴＧＦαｍＲＮＡプローブは、ラットのＴＧＦαの５’末端の５５０ヌクレオ チド長のＸｂａＩ／ＢａｍＨＩｃＤＮＡフラグメントから生成し、ｐＧＥＭ７Ｚ
ｆ（Promega, Inc.)でサブクローニングした。アンチセンスおよびセンスプロー
ブはＳＰ６およびＴ７ポリメラーゼでそれぞれ転写した。ラットＥＧＦレセプタ
ーｍＲＮＡプローブは、ｐＧＥＭ７Ｚｆ中のこの遺伝子の５’末端の７１８塩基
対ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ挿入物から生成した。ラットＴＨのプローブは、ｐＧＥ
Ｍ７Ｚｆでサブクローニングした１．２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメ
ントを用いて作製した。ＥＧＦレセプターおよびＴＨに対するアンチセンスサブ
クローンはＴ７ポリメラーゼで転写した。ＥＧＦレセプターおよびＴＨのセンス
サブクローンはＳＰ６ポリメラーゼで転写した。全てのプローブは、〔³⁵Ｓ〕Ｕ
ＴＰ（NEN Research Products, Inc.)の存在下で転写することによって放射能標
識した。

【００９２】 Ｃ．in situ ハイブリダイゼーションおよび分析 in situ 核酸ハイブリダイゼーションは文献（Simmons et al., J. Histotech . 12:1169-181, 1989)に記載された方法にしたがって実施したが、ただし発育中
の脳は０．０００１％プロテアーゼＫ溶液および０．０５ＭＥＤＴＡで処理した
点を除く。１０⁷ｃｐｍ／ｍｌの濃度でセンスおよびアンチセンスプローブと切 片を一晩６５℃でハイブリダイズさせた。それらの解剖学的分布の直接比較がで
きるように、同じ動物の隣接切片をプローブの各々に対してハイブリダイズさせ
た。

【００９３】 発育中および成熟動物のスライドをまとめ、¹⁴Ｃ−標識脳ペースト標準物とと
もに６から７日間オートラジオグラフ用ベータマックスハイパーフィルム（Beta
Max Hyperfilm, Amersham, Inc.)に重ねた。オートラジオグラフフィルムの現像
成功後、スライドをコダックＮＴＢ−２乳液に浸漬して４週間感光させた。オー
トラジオグラフのシートフィルムおよびＮＴＢ−２乳液はＤ−１９現像液および
ラピッドフィックス（Rapid Fix, Kodak, Inc.）で現像した。続いて脳切片をチ
オニンで対比染色しカバースリップを載せた。浸漬して染色した切片を半定量的
に調べ、明視野および暗視野で顕微鏡写真を撮影した。

【００９４】 黒質線状体系におけるＴＧＦαおよびＥＧＦレセプターｍＲＮＡの発現は、出
生後の初期発達から成熟時まで選択した時点で追跡した。ＴＧＦαｍＲＮＡのハ
イブリダイゼーションは出生後初期の線条に豊富に認められたが、Ｐ２１までに
成獣レベル近くまで徐々に減少した。脳梁での発現は、線条での発現に匹敵する
レベルまで出生後の発達を通して増加した。ＴＧＦαｍＲＮＡは、発育時または
成熟黒質では顕著には検出されなかった。

【００９５】 線条のＥＧＦレセプターｍＲＮＡは出生後初期の発達時に最高となり、Ｐ２１
までに再び減少した。ＥＧＦレセプターは側脳室周辺の神経上皮で最高であった
が、線条体でも中等度のレベルで見出された。発達中の腹側中脳では、ＥＧＦレ
セプターｍＲＮＡは出生後初期の脳ではほとんど検出されないが、Ｐ２１までに
徐々に中等度のレベルまで増加した。

【００９６】 成獣では、ＴＧＦαｍＲＮＡの発現は、線条では中等度で、腹側線条および側
坐核では軽度から中等度であった。ＥＧＦレセプターｍＲＮＡのハイブリダイゼ
ーションは、線条体および側坐核では全体に分散したより多くの斑点状発現を伴
い低レベルで認められた。側脳室の直ぐ境界の線条領域では、ＥＧＦレセプター
ｍＲＮＡハイブリダイゼーションは中等度のレベルで維持された。

【００９７】 成獣の腹側中脳では、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイゼーションは黒
質（ＳＮ）（特に内側緻密部）、並びに腹側被蓋領域（ＶＴＡ）の傍黒質核およ
び傍小脳脚核で認められた。

【００９８】 先の実験では、ＴＧＦαおよびＥＧＦレセプターｍＲＮＡは黒質線条系の個体
発生中に強力に調節されること、さらに成獣でのそれらの発現は発育時のパター
ンを継続することを主として示していることが指摘された（Lazar & Blum, J. N
eurosci. 12:1688-1697, 1992; Weickert & Blum, Devel. Brain Res. 86:203-2
16, 1995）。発育時および成熟動物でのＴＧＦαおよびＥＧＦレセプターｍＲＮ
Ａハイブリダイゼーションは、これら初期の報告の発見と一致している。成獣の
線条および中脳でのそれらの発現の持続は、成熟黒質線条系における支持的役割
と一致する。

【００９９】 成獣の前脳側脳室沿いの上衣下領域における中等度のＥＧＦレセプターｍＲＮ
Ａ発現は、同様にこの領域のおける細胞の維持における役割またはその機能を示
唆している(Seroogy et al., Brain Res. 670:157-164, 1995; Weickert & Blum
, 1995, 上掲書）。ＴＧＦα（またはＥＧＦ）は、この領域の“ＥＧＦ反応性”
細胞を体外移植しin vitroで増殖させたとき、それらの生存および分化を支援す
ることが示された（Reynolds & Weiss, Science 255:1707-1710, 1992; Reynold
s et al., J. Neurosci. 12:4565-4574, 1992)。それは、発育時にin vivo で類
似の機能を演じるかもしれない。

【０１００】 実施例２：６−ヒドロキシドーパミン損傷および線条体ＴＧＦα輸液によるＴ
ＧＦαおよびＥＧＦレセプターｍＲＮＡ発現の調節 in situ ハイブリダイゼーションを用いて、黒質線条体ＴＧＦαまたはＥＧＦ レセプターｍＲＮＡがＴＧＦαの線条内輸液によって変化するか否かを調べた。
さらに、輸液および非輸液動物でのレセプター発現に対する一側性６−ＯＨＤＡ
損傷の影響を調べた。

【０１０１】 Ａ．処置群 ２５０〜３００グラムの成獣雄スプラーグ＝ドーリー系ラットをシモンセン（ Simonsen, Gilroy, CA）から入手し、下記５つの処置群の１つに割り当てた： （１）線条体ＴＧＦα輸液、黒質６−ＯＨＤＡ損傷（以下“損傷”）；（２）Ｔ
ＧＦα輸液、損傷無し；（３）人工脳脊椎液（ａＣＳＦ）輸液、損傷；（４）ａ
ＣＳＦ輸液、損傷無し；（５）輸液無し、損傷無し。各実験群について４匹から
８匹の動物を用いた。各々の外科手術後に動物が完全に回復するまでモニターし
、その他の時間はいつでも温度および湿度が制御されている飼育場で維持した。

【０１０２】 Ｂ．６−ヒドロキシドーパミン損傷 ラットの体重１ｋｇ当たり８ｍｇのキシラジンおよび１００ｍｇのケタミンで 麻酔した。０．０１％アスコルビン酸含有０．９％食塩水中の４．８ｍｇ／ｍｌ
の６−ヒドロキシドーパミンＨＣｌ（６−ＯＨＤＡ；Sigma Chemical Co.）の冷
却溶液を注射の直前に調製した。滅菌技術によって８μｌ容積を、耳間０を参照
として用いて１μｌ／分の速度で左の黒質（＋３．７Ａ／Ｐ；＋２．１Ｍ／Ｌ；
＋２．０Ｄ／Ｖ）に定位注射した（Paxinos & Watson, "The Rat Brain in Ster
eotaxic Coordinates", Academic Press, San Diego, 1986)。６−ＯＨＤＡ損傷
の成功および程度は、中脳のチロシンヒドロキナーゼ（ＴＨ）ｍＲＮＡのin sit
u ハイブリダイゼーションによってモニターした。ＴＨはドーパミン合成経路の
速度限定酵素で、ドーパミン産生ニューロンの一般的マーカーである。不完全な
損傷をもつ１匹の動物（顕著な数の黒質ＴＨ−ＩＲ細胞を保持する）をこの実験
から排除し、動物の総数に加えなかった。

【０１０３】 Ｃ．輸液 損傷後４〜５週間で浸透圧ミニポンプ（モデル２００２、Alzet, Inc.)を移植 した。ミニポンプには約２００μｌの人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中のＴＧＦα（
０．０５μｇ／ｍｌ）（試験動物用）またはａＣＳＦのみ（コントロール用）の
どちらかを満たし、移植前に３７℃で一晩保温した。上記のように麻酔した後、
滅菌条件下でミニポンプに結合させた５ｍｍのカニューレ（Brain Infusion kit
, Alzet, Inc.)を左の尾状核被殻（＋１．２Ａ／Ｐ；＋２．７Ｍ／Ｌ）に参照と
してブレグマを用い定位移植し（Paxinos & Watson, 1986, 上掲書）、カルボキ
シレートセメントで頭蓋骨に固定した（図１）。ミニポンプ自体は肩甲骨間領域
の皮下に設置した。輸液物は、０．５μｌ／時間の速度で２週間にわたって線条
に直接供給した。

【０１０４】 Ｄ．組織の調製 輸液期間の終了時に動物を断頭して死亡させた。それらの脳を迅速に取りだし 、−２０℃のイソペンタンで凍結し−７０℃で保存した。冠状クリオスタット切
片を２０μｍで切り出し、ベクタボンド (Vectabond（登録商標）, Vector Lab s, Inc.)被覆スライドに前方から後方の順に融解接着させた。切片を１時間０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで後固定し、リ
ン酸緩衝液で洗浄し風乾した。切片は乾燥剤を加えて処理まで−２０℃で保存し
た。

【０１０５】 Ｅ．ハイブリダイゼーションプローブ ＴＧＦαｍＲＮＡプローブは、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（Promega, Inc.)でサブクロー ニングしたラットのＴＧＦαの５’末端の５５０ヌクレオチド長のＸｂａＩ／Ｂ
ａｍＨＩｃＤＮＡフラグメントから生成した。アンチセンスおよびセンスプロー
ブはＳＰ６およびＴ７ポリメラーゼでそれぞれ転写した。ラットＥＧＦレセプタ
ーｍＲＮＡプローブは、ｐＧＥＭ７Ｚｆ中のこの遺伝子の５’末端の７１８塩基
対ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ挿入物から生成した。ラットＴＨのプローブは、ｐＧＥ
Ｍ７Ｚｆでサブクローニングした１．２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメ
ントを用いて作製した。ＥＧＦレセプターおよびＴＨに対するアンチセンスサブ
クローンはＴ７ポリメラーゼで転写した。ＥＧＦレセプターおよびＴＨのセンス
サブクローンはＳＰ６ポリメラーゼで転写した。全てのプローブは、〔³⁵Ｓ〕Ｕ
ＴＰ（NEN Research Products, Inc.)の存在下で転写することによって放射能標
識した。

【０１０６】 Ｆ．in situ ハイブリダイゼーションおよび分析 in situ 核酸ハイブリダイゼーションは文献（Simmons et al., 1989, 上掲書 ）に記載された方法にしたがって実施した。試験動物およびコントロール動物の
対応する切片を１０⁷ｃｐｍ／ｍｌの濃度でセンスおよびアンチセンスプローブ と一晩６５℃でハイブリダイズさせた。それらの解剖学的分布の直接比較ができ
るように、同じ動物の隣接切片をプローブの各々とハイブリダイズさせた。

【０１０７】 試験動物およびコントロール動物のスライドをまとめ、¹⁴Ｃ−標識脳ペースト
標準物とともに３から７日間オートラジオグラフ用ベータマックスハイパーフィ
ルム（BetaMax Hyperfilm, Amersham, Inc.)に重ねた。オートラジオグラフフィ
ルムの現像が成功した後、スライドをコダックＮＴＢ−２乳液に浸漬して４週間
感光させた。オートラジオグラフのシートフィルムおよびＮＴＢ−２乳液はＤ−
１９現像液およびラピッドフィックス（Rapid Fix, Kodak, Inc.）で現像した。
続いて脳切片をチオニンで対比染色しカバースリップを適用した。

【０１０８】 Ｇ．分析と定量 浸漬し染色した切片を精査し、明視野および暗視野で顕微鏡写真を撮影した。 オートラジオグラフィー写真をＭＣＩＤシステム（Microcomputer Imaging Devi
ce, Imaging Research, Inc.）を用いて定量分析した。問題の解剖上領域の各々
の中の多数の部位でデンシトメトリーの読みを取り平均値を得た。続いて、¹⁴Ｃ
脳ペースト標準物質から構築したコンピュータ作製第三階級ポリノミアル標準曲
線を用いてＴＧＦαおよびＥＧＦレセプターハイブリダイゼーションの相対的濃
度を概算した。続いて、各処置群の各領域についてのこの概算値を平均し、それ
らの標準誤差を算出した。実験の処置と同側の脳領域を同じ切片の対応する反対
側の領域、またはほぼ同じ部位のコントロール脳内の対応する領域と比較した。
この比較の有意はスチューデントのｔ検定を用いて決定した。

【０１０９】 Ｈ．正常な発現およびコントロール輸液 ａＣＳＦの線条輸液を受けたコントロール動物の線条、線条上衣下領域および ＳＮにおけるＴＨ、ＴＧＦαおよびＥＧＦレセプターｍＲＮＡの発現は、正常な
動物のそれと区別できない（正常な発育時および成獣の発現については実施例１
を参照されたい）。ｍＲＮＡハイブリダイゼーションはＳＮ−ＶＴＡを通して顕
著であった。ＴＧＦαｍＲＮＡはＳＮでは検出されなかった。しかしながら、Ｅ
ＧＦレセプターｍＲＮＡは、内側黒質緻密部（ＳＮｃ）、ＶＴＡの傍黒質核、傍
小脳脚核および脚間核には顕著であった（図２）。

【０１１０】 ＴＧＦαｍＲＮＡハイブリダイゼーションは、尾状核−被殻および側坐核（Ｎ
Ａ）で示されたが、ＮＡでわずかに薄かった。ＥＧＦレセプターハイブリダイゼ
ーションは、線条体全体にわたって低レベルで認められ、ＮＡでは、低レベルの
背景全体に分散されたより強い斑点状発現として、さらに側脳室と接する線条の
増殖領域では中等度のレベルで認められた。

【０１１１】 Ｉ．６−ＯＨＤＡ損傷の影響 一側性黒質６−ＯＨＤＡ損傷は、同側の線条でのＴＧＦαｍＲＮＡハイブリダ イゼーションを２５％減少させたが、反対側のＴＧＦαｍＲＮＡハイブリダイゼ
ーションには影響はなかった（図５）。線条および上衣下ＥＧＦレセプターハイ
ブリダイゼーションは、正常動物と較べて損傷をもつ動物で変化はなかった（図
６）。中脳では、６−ＯＨＤＡ損傷は、同側のＳＮ−ＶＴＡにおけるＥＧＦレセ
プターハイブリダイゼーションを消失させた。

【０１１２】 Ｊ．ＴＧＦα輸液の影響 ＴＧＦα輸液を受けた損傷をもたない動物では、輸液された線条でのＴＧＦα ｍＲＮＡハイブリダイゼーションは、反対側の線条または正常動物の線条と較べ
て変化を認めなかった（図５）。ＴＧＦαまたはａＣＳＦのどちらかの輸液を受
けた数匹の動物は、輸液カニューレの瘢痕の直ぐ周囲でＴＧＦαｍＲＮＡハイブ
リダイゼーションのわずかな増加を示した。黒質のＴＧＦαｍＲＮＡハイブリダ
イゼーションでは輸液は検出可能レベルの増加をもたらさなかった。

【０１１３】 ＴＧＦα輸液を受けた全動物で、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡに対するハイブリ
ダイゼーションは、同側上衣下領域で劇的に増加したが、線条の残りの部分では
増加しなかった（図６）。ＴＧＦα輸液単独ではＥＧＦレセプターハイブリダイ
ゼーションについて正常と異なる変化は認められなかった。

【０１１４】 Ｋ．ＴＧＦα輸液と６−ＯＨＤＡ損傷との併用 線条ＴＧＦα輸液およびそれに続く黒質６−ＯＨＤＡ損傷の両方を受けた動物 の線条ＴＧＦαｍＲＮＡハイブリダイゼーションは、損傷のみを受けた動物のそ
れと区別できなかった（図５）。同様に、ＴＧＦα輸液／６−ＯＨＤＡ損傷動物
の中脳におけるＥＧＦレセプターハイブリダイゼーションは損傷のみの動物のそ
れと区別できなかった。

【０１１５】 前脳におけるＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイゼーションは、上衣下領
域におけるハイブリダイゼーションの増加に加えて、同側の線条体で濃いハイブ
リダイゼーションの異常な隆線を示した（図４、６および７）。この隆線はＴＧ
Ｆα輸液／損傷併用群の６匹のラットのうち５匹で認められたが、ＴＧＦα輸液
／無損傷群では６匹のラットのうち１匹のみに認められた。周辺の線条における
ＥＧＦレセプターハイブリダイゼーションには変化はなかった。

【０１１６】 Ｌ．考察 上記の結果は、成獣ゲッ歯類の黒質線条体系におけるＴＧＦαおよびＥＧＦレ セプターコードｍＲＮＡ発現に対する、黒質６−ＯＨＤＡ損傷またはＴＧＦαの
線条輸液、またはその両方の調節性作用の分析を可能にする。これらの結果は、
各処置に付随する発現における変化およびこれら２つの処置が併用されたときの
線条での固有の発現パターンを明瞭に示している。

【０１１７】 １．６−ＯＨＤＡ損傷の影響 ６−ＯＨＤＡによる中脳の損傷は、損傷後数週間で線条のＴＧＦαｍＲＮＡハ イブリダイゼーションを２５％減少させた。この系でＴＧＦαペプチドレベルが
ＴＧＦαｍＲＮＡの発現と一致する場合、ＴＧＦαｍＲＮＡの減少は、ヒトの特
発性ＰＤと類似しないゲッ歯類の損傷モデルの１つの特徴かもしれない。すなわ
ちＴＧＦαはＰＤ患者の線条で大きく増加する（Mogi et al., Neurosci. Lett. 180:147-150, 1994）。ＴＧＦαはドーパミンニューロン機能のin vitro測定の
多数を強化することが示された（Alexi & Hefti, Neurosci. 55:903-918, 1993)
。ＴＧＦα（およびＥＧＦ並びに他の栄養因子）の増加は、したがってドーパミ
ンニューロンおよびそれらの線条遠心性神経の持続的変性に対する反応を反映し
、さらに残存する中脳ドーパミン細胞がこの失われた線条のドーパミン作動性神
経支配を代償する能力に貢献しているのかもしれない(Mogi et al., 1994, 上掲
書）。したがって、部分的またはおそらくは慢性の損傷モデルは、ヒトのＰＤの
この特徴をよりよく反映することができるかもしれない。

【０１１８】 ドーパミン細胞の損失の時間経過における相違はまた、６−ＯＨＤＡゲッ歯類
モデルとヒトＰＤとの間のこの明瞭な矛盾の説明に役立つかもしれない。ラット
モデルでは、中脳のドーパミンニューロンは、神経毒のただ１回の注射によって
比較的迅速に殺される。ヒトのＰＤでは中脳ドーパミンニューロンの慢性進行性
変性は何年もかけて生じる。本実験では、動物は中脳のドーパミン細胞が変性し
た後で死亡させられている。これらの動物では、我々の実験では明らかではない
、線条ＴＧＦαｍＲＮＡ発現における初期の変化があったのかもしれない。ラッ
トモデルで、ドーパミンニューロンが変性過程にあるとき、損傷後より短時間で
どのようなＴＧＦαｍＲＮＡ発現が変化するかを決定するのは興味深いであろう
。

【０１１９】 尾状核−被殻における中等度のＴＧＦαｍＲＮＡ発現は、中脳ドーパミンニュ
ーロンのための標的由来増殖因子としてのその仮説的役割と一致する。中脳神経
毒損傷後の同側線条におけるその減少を引き起こす原因は不明である。ドーパミ
ンレセプター結合は、視床下部におけるＴＧＦαｍＲＮＡ発現に影響を及ぼすこ
とが示された（Borgundvaag et al., Endocrinol. 130:3453-3458, 1992)、しか
しながら、そのような相互作用は線条ではこれまで示されていない。ＴＧＦｍＲ
ＮＡは、正常なゲッ歯類成獣の線条ニューロンおよびグリアの亜集団で発現され
る（Seroogy et al., J. Neurochem. 60:1777-1782, 1993）。線条のドーパミン
脱神経は、シナプス後ニューロン、星状細胞またはその両方におけるＴＧＦαｍ
ＲＮＡ発現に潜在的に影響を与えることができたかもしれない。

【０１２０】 反対側の線条のＴＧＦαｍＲＮＡ発現は６−ＯＨＤＡ損傷によって顕著には変
化しなかった。この発見はまた、ドーパミン脱神経仲介ＴＧＦαｍＲＮＡ発現減
少と一致する。わずかに数％の線条中央のドーパミン作動性投射路が対側性であ
り（Loughlin & Fallon, Neurosci. Lett. 32:11-16, 1982)、したがって、この
損傷から生じるいずれの対側性調節作用も同側性作用と比較して小さいと予想さ
れるであろう。

【０１２１】 ＤＡ脱神経化線条のＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイゼーションは、対
側のＣＰまたは損傷をもたないコントロール線条におけるそれと顕著には異なら
なかった。再び繰り返すが、中脳損傷または輸液カニューレの移植によって生じ
る発現の初期変化があったかもしれない（これらは損傷後数週間または移植後２
週間では明らかではなかった）。損傷を受けたＳＮｃにおけるＥＧＦレセプター
ｍＲＮＡハイブリダイゼーションの停止によって、内側中脳束の６−ＯＨＤＡ損
傷後の類似の観察が確認された（Seroogy et al., Neuroreport 6:105-108, 199
4)。この損傷誘発減少は、黒質ドーパミンニューロンによるＥＧＦレセプター発
現の証拠として以前に記載された（Seroogy et al., 1994, 上掲書）が、近傍の
黒質ドーパミンニューロンの損傷または死滅によって調節を受けるＥＧＦレセプ
ターｍＲＮＡの黒質グリアの産生の可能性が残る。興味深いことには、死後のＰ
Ｄ患者の中脳におけるＥＧＦレセプター結合は、正常人と変わらない。（Villar
es et al., Brain Res. 628:72-76, 1993)。したがって、損傷後のＥＧＦレセプ
ターｍＲＮＡ発現の損失は、ゲッ歯類の損傷モデルとヒトＰＤとの間のまた別の
相違を示している。線条のＴＧＦα発現に関しては、部分的損傷モデルは、パー
キンソウ病のヒトの脳で認められる変化をラットの脳でより良好な類似を示すか
もしれない。

【０１２２】 ２．ＴＧＦα輸液の効果 損傷をもたない動物では、ＴＧＦαまたはａＣＳＦの輸液は、中脳または線条 におけるＴＧＦαｍＲＮＡハイブリダイゼーションを正常レベルと較べて変化さ
せない。他の組織または細胞タイプにおけるＴＧＦα発現の自己刺激の報告（Co
ffey et al., Nature 328:817-820, 1987; Barnard et al., J. Biol. Chem. 26
9:22817-22822, 1994)にもかからず、本実験の結果はこの系におけるそのような
活性に対する証拠を提供しなかった。初期の実験における自己刺激作用は数時間
の規模で生じた。本実験の脳組織は、２週間に及ぶ増殖因子への連続暴露の後で
得られた。したがって、輸液開始近くの初期のアップレギュレーション（後に正
常に戻る）は明らかではないであろう。

【０１２３】 損傷のみを受けた動物におけるＴＧＦαおよびＥＧＦレセプター転写に関して
は、実験処置の開始後より早い時点で調節の時間的変化を調べることは興味深い
であろう。輸液瘢痕の直ぐ周辺で数匹の動物に認められたＴＧＦαｍＲＮＡのわ
ずかな増加がＴＧＦαおよびａＣＳＦ輸液線条で観察された。したがって、それ
はおそらく、カニューレ自体によってもたらされた持続的な機械的損傷およびグ
リオーシスに起因するものであって、輸液物に起因するものではないであろう。

【０１２４】 ＴＧＦα輸液は、同側上衣下ゾーンのＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイ
ゼーションを劇的に増加させたが、線条の残りの部分では増加させなかった。他
の組織では、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡはいくつかの化学的および機械的手段に
よって調節できる。ＥＧＦペプチドは、in vitroでＥＧＦレセプターｍＲＮＡを
多くの哺乳類の細胞タイプで増加させた（Earp et al., J. Biol. Chem. 261:47
77-4780, 1986; Kesavan et al., Oncogene 5:483-488, 1990)。レチン酸は正常
なゲッ歯類の線維芽細胞（Thompson & Rosner, J. Biol. Chem. 264:3230-3234, 1989)で、さらに形質転換ラット肝細胞株(Raymond et al., Cell. Growth Diff
. 1:393-399, 1990)で同様な増加をもたらす。単独またはＥＧＦとともにシクロ
ヘキシミドに暴露することによって培養ヒト栄養膜細胞で増加が刺激され、さら
にＥＧＦレセプターの転写が安定化され、したがってＥＧＦレセプターｍＲＮＡ
の総量を増加させるために転写の強化以外の機構が提供される（Kesavan et al.
, 1990, 上掲書）。

【０１２５】 ラットの坐骨神経の離断は、切断端のＥＧＦレセプターｍＲＮＡの徐々に勾配
が平坦になる増加をもたらす（Toma et al., J. Neurosci. 12:2504-2515, 1992
）。プロタミンによる処置は、in vitroでマウスおよびヒトの細胞株で125Ｉ− ＥＧＦ結合および細胞表面レセプター数を増加させた（Lokesshwar et al., J.
Biol. Chem. 264:19318-19326, 1989)。ＴＧＦαはこれらの作用に類似し、残存
する上衣下細胞中のＥＧＦレセプター転写物の産生および／またはその寿命を増
加させるかもしれない。それはまた、通常は相当量のＥＧＦレセプターｍＲＮＡ
を発現しない細胞で転写を刺激するかもしれない。これらの作用のどちらも当業
者に既知の日常的技術を用いてin vivo でさらに容易に調べることができるであ
ろう。

【０１２６】 また別の可能性としては、ＴＧＦαは上衣下細胞の増殖を刺激し、ＥＧＦレセ
プターｍＲＮＡ発現細胞の総数を増加させているという場合もある。ＥＧＦおよ
びＴＧＦαは、上衣下領域から体外移植された“ＥＧＦ反応性”培養細胞に対し
て強力な有糸分裂促進剤である（Reynolds & Weiss, 1992, Science 255:1707-1
710)。線条ＴＧＦα輸液が上衣下ＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョンに対して有するこの強力な誘発作用は、無傷の脳の増殖性細胞はin vivo で
これらの細胞に対して同様に反応することを示しているのかもしれない。

【０１２７】 ３．ＴＧＦα輸液と６−ＯＨＤＡ損傷の併用 損傷とＴＧＦα輸液とを合わせて受けた動物では、線条のＴＧＦαｍＲＮＡハ イブリダイゼーションは、損傷とａＣＳＦ輸液とを合わせて受けた動物のそれと
区別できなかった。ＴＧＦαは他の組織で強力な自己刺激作用を有するが、本実
験ではそれは線条ＴＧＦαのｍＲＮＡハイブリダイゼーションの減少を顕著には
変化させなかった。６−ＯＨＤＡ仲介中脳ＥＧＦレセプターｍＲＮＡの損失は同
様にＴＧＦα輸液によって影響を受けなかった。後者の事例では、中脳の損傷は
輸液の開始の数週間前に実施され、同側のドーパミン細胞は破壊された。したが
って、増殖因子はそれらの排除を防止する機会をもたなかった。

【０１２８】 ドーパミン細胞自体がＥＧＦレセプターｍＲＮＡを発現するという証拠（Sero
ogy et al., 1994, 上掲書）、および神経毒とともに同時に投与される場合には
、ＴＧＦαは線条のドーパミン作動性神経支配のためのマーカーの損失を和らげ
るというある種の証拠が存在する。したがって、神経毒損傷とＴＧＦαの投与と
の間の時間的間隙は、ＴＧＦα輸液が中脳のＥＧＦレセプターｍＲＮＡの停止に
対する影響をもたない理由を説明できるかもしれない。

【０１２９】 ヒトのパーキンソン病の脳では、中脳のＥＧＦレセプター結合は正常な脳で認
められるものと変わらない(Villares et al., 1993, 上掲書）。ＰＤに関する線
条ＴＧＦα（および他の神経栄養因子）の大きな増加(Mogi et al., 1994, 上掲
書）は、残存ニューロンでの発現レベルの増加によってＥＧＦレセプター発現ド
パミン細胞の数の減少を覆い隠すかもしれない。他方、in vitro実験は、中脳ド
パミンニューロンに対するＴＧＦαの栄養作用の多くは（少なくとも部分的に）
グリアを介して仲介されることを提唱している(Alexi & Hefti, 1993, 上掲書）
。したがってＴＧＦαは、ドーパミンニューロンに影響を及ぼすためにパラクリ
ン（直接的）および続発的（間接的）態様の輸送を介して作用するかもしれない
。

【０１３０】 ＴＧＦα−損傷有りの動物の上衣下ゾーンにおけるＥＧＦレセプターｍＲＮＡ
ハイブリダイゼーションのパターンは、ＴＧＦα−損傷無しの動物で認められる
ハイブリダイゼーションパターンと同様であった。これらの動物の同側線条にお
ける極めて驚くべき特徴は、線条体から外の濃い、上衣下ゾーンにおける強化さ
れたハイブリダイゼーションの隆線よりも一層濃い隆線であった。この隆線は既
知の解剖学的特徴のいずれとも一致せず、ＴＧＦαまたはＴＨプローブでは明瞭
ではなかった。非隆線線条におけるＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイゼー
ションは、他の全ての群の線条におけるハイブリダイゼーションと同じであった
。

【０１３１】 ６−ＯＨＤＡ損傷に由来する神経毒性障害および輸液カニューレの移植に由来
する機械的損傷は、グリア細胞の増殖および活性化を刺激したかもしれない。以
前の実験は、損傷の結果としてグリオーシスおよび星状細胞のＥＧＦレセプター
発現の増加を示した（Nieto-Sampedro et al., Neurosci. Lett. 91:276-282, 1
988; Fernaud-Espinoza et al., Glia 8:277-291, 1993）。さらに、ＴＧＦαは
星状細胞の反応性で役割を演じるかもしれない（Junier et al., J. Neurosci.
14:4206-4216, 1994）。もう１つの可能性は、増殖因子輸液と中脳損傷の併用に
よって、上衣下領域の増殖性細胞は脳室から引き離され、その上に重なる線条に
引き込まれたということである。ＴＧＦαは多様な細胞タイプに対して強力な化
学誘引剤（Reneker et al., Development 121:1669-1680, 1995)であるが、単独
ではほとんどの動物において隆線形成を刺激するには十分ではなかった。細胞性
隆線の形成は中脳の損傷によって促進されたのかもしれない。これらの細胞の由
来および正体は以下の実施例で調べられるであろう。

【０１３２】 実施例３：線条隆線の性状 上記で述べたように、ＴＧＦαの線条輸液は、黒質の６−ＯＨＤＡ損傷と併用 されたとき、線条体に濃厚な細胞隆線の形成を誘発する。この細胞隆線はＥＧＦ
レセプターｍＲＮＡを大量に発現するが、ＴＧＦαは周辺組織よりも少ない。隆
線は密に詰め込まれた細胞集団で構成され、単純なチオニン染色を用いてその明
瞭な検出が可能である。この異常な線条隆線の正体は明らかではないが、３つの
可能性が考えられた。

【０１３３】 損傷に反応するグリオーシスは、脳組織に対する外傷性および神経毒性障害の
両方の特徴である。典型的には、両タイプの脳損傷が星状細胞増加症および損傷
組織の星状細胞とミクログリアによる浸潤を促進する（Fernaud-Espinoza et al
., Glia 8:277-291, 1993)。星状細胞は、ＥＧＦレセプターの免疫反応性を、特
に脳の損傷に反応して発現することが示された（Gomez-Pinilla et al., Brain Res. 438:385-390, 1988; Nieto-Sampedro et al., Neurosci. Lett. 91:276-28
2, 1988)。さらに、ＴＧＦ自体は星状細胞の増殖を刺激する（Alexi & Hefti, N
eurosci. 55:903-918, 1993)。したがって、線条の隆線は、神経毒性および機械
的障害並びに増殖因子の輸液を合わせたものに対して反応したグリア細胞の集合
であるという可能性が考えられた。

【０１３４】 ゲッ歯類の線条に固有の解剖学と関係を有する隆線の第二の可能な供給源を詳
細に調査した。この隆線はこれまでに特定されたいずれの解剖学的特徴とも一致
しなかった。ゲッ歯類では、尾状核および被殻は解剖学的に別個の構造物ではな
い。したがってこれまでのところ、ゲッ歯類の基底グリアのこれら２つの核を区
別する解剖学的マーカーも神経化学的マーカーも特定されていない。しかしなが
ら出生前および出生後初期の発達時には、発達中の線条の種々の領域内の神経組
織発生勾配は、尾状核および被殻のこれら２つの核が解剖学的に別個である動物
の尾状核および被殻の特徴的な勾配と一致する（Bayer, Intl. J. Devel. Neuro
sci. 2:163-175, 1984）。ゲッ歯類では、前交連の交叉に対して吻となる新しい
線条体ニューロンは、最も新しく生じたニューロンが側脳室に最も近いニューロ
ンであるように、外側から内側への勾配で付加される。同じパターンが尾状核の
発生で観察され、このことはゲッ歯類の前線条は“尾状核様”領域以上のもので
あることを提唱している。前交連の交叉に対して尾となるニューロンは内側から
外側への勾配で付加され、被殻が解剖的に明瞭な動物の発達中の被殻と類似する
。したがって、ゲッ歯類の後線条はより“被殻様”であろう。したがって、線条
体隆線は、ラット線条のこれら２つの領域間の、おそらく何らかの神経化学的相
違のために以前には認識されなかった境界（これは細胞の分厚い集合を可能にす
る）を表しているのかもしれないという可能性が考えられた。

【０１３５】 線条体隆線の供給源としての第三の可能性もまた調査した。成熟哺乳類の前脳
側脳室の上衣下ゾーンから体外移植した細胞は、特にＥＧＦファミリー神経栄養
因子（ＴＧＦαを含む）の存在下で培養したとき増殖して新しいニューロンおよ
びグリアに分化することができることが分かった（Reynolds et al., J. Neuros
ci. 12:4565-4574, 1992; Morshead et al., Neuron 13:1071-1082, 1994）。最
近、側脳室に輸液されたＥＧＦまたはＴＧＦαは、成熟マウス脳で“ＥＧＦ反応
性”幹細胞および神経原始細胞の増殖を刺激した（Craig et al., J. Neurosci. 16:2649-2658, 1996)。本実験の線条隆線の供給源の可能性は、ＴＧＦα輸液は
、ラットの脳で同様な増殖活性を刺激するということであった。さらに、線条隆
線は、上衣下領域に由来する増殖神経原始細胞の集団移動であるという可能性が
考えられた。

【０１３６】 下記で述べる実験は、この異常な線条隆線の性状を多様な組織化学的および免
疫組織化学的技術を用いて決定することを可能にするために役立った。隆線の起
源およびその出現に影響を与える因子もまた、線条におけるその形成の時間的経
過を調べることにより、さらに外科的および化学的処置の組み合わせを変更する
ことによって調査した。

【０１３７】 Ａ．実験プロトコル 実験を通して体重２５０−３００グラムの成獣雄スプラーグ＝ドーリー系ラッ トを用いた。２４匹の動物にラットＴＧＦα（０．５μｇ／日；Sigma Chemical Co.）に標準的な線条中央輸液を施した。別の２６匹のラットには人工脳脊髄液
（ａＣＳＦ）を輸液するか、または全く輸液しなかった。標準的ＴＧＦα輸液群
およびコントロール群のサブセットに、輸液開始４８時間後に黒質に定位６−Ｏ
ＨＤＡ注射を施した。本実験のこの部分で用いた動物は、それらの輸液損傷の組
み合わせにしたがって以下のように６群に分類した：ＴＧＦα輸液、損傷有り（
ｎ＝１３）；ＴＧＦα輸液、損傷無し（ｎ＝１１）；ａＣＳＦ輸液、損傷有り（
ｎ＝１２）；ａＣＳＦ輸液、損傷無し（ｎ＝９）；輸液無し、損傷有り（ｎ＝１
）；輸液無し、損傷無し（ｎ＝４）。

【０１３８】 新たな別の動物は、線条の他の領域、側脳室、大脳皮質または中隔にＴＧＦα
輸液を受けた。さらに４匹の動物（各群に２匹）は、標準的投与量の１／２また
は１／１０の線条中央ＴＧＦα輸液を受けた。また、２匹の動物にはＴＧＦαの
代わりに上皮増殖因子（ＥＧＦ）の線条中央輸液を施した。これらのラットに投
与したＥＧＦは標準的な０．５μｇ／日の用量であった。これらの臨時群の動物
の全てに損傷を与えた。典型的には、全実験でラットに損傷後１から１６日間灌
流を施した（３〜１８日の輸液）。輸液を停止した後で隆線が存続するか否かを
決定するために、ＴＧＦα輸液を受けている４匹の動物から２週間の最後にミニ
ポンプを除去したが、これらの動物は数日後まで灌流を施さなかった。脳切片を
調製し種々の免疫化学的および組織化学的技術を用いて染色した。

【０１３９】 Ｂ．ＴＧＦα輸液 ラットをキシラジン８ｍｇ／ｋｇおよびケタミン１００ｍｇ／ｋｇで麻酔した。
ＴＧＦαの輸液はアルゼット浸透圧ミニポンプ（Alzet osmotic minipump 2002)
で１８日間まで実施した。ミニポンプには、コントロール動物用にａＣＳＦまた
は試験動物用にａＣＳＦ４００μｌ中に２０μｇのＴＧＦα（５０μｇ／ｍｌ）
約２００μｌを充填した。滅菌条件下で輸液カニューレをブレグマを基準に定位
座標に配置し（＋１．２Ａ／Ｐ；＋２．７Ｍ／Ｌ；−６．０Ｄ／Ｖ）（Paxisons & Watson, "The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates", Academic Press, S
an Diego, 1986）、歯科用セメントで頭蓋骨の最上部に接着した。輸液物は約０
．５μｌ／時間でカニューレから供給した。さらに数匹のコントロール動物に側
脳室、その上の皮質または他の領域に輸液した。

【０１４０】 Ｃ．神経毒性損傷 ミニポンプ移植後４８時間してから上記のようにラットを麻酔した。６−ＯＨ ＤＡＨＣｌの冷却４．８ｍｇ／ｍｌ溶液を注射の直前に調製した。滅菌的技術に
よって、参照として耳間０を用いて神経毒を一側の黒質に定位注射した（＋３．
７Ａ／Ｐ；＋２．１Ｍ／Ｌ；＋２．０Ｄ／Ｖ）（Paxinos & Watson, 1986, 上掲
書）。６−８μｌの容積を１μｌ／分の速度で注射した。

【０１４１】 Ｄ．組織の調製 損傷後１から１６日、動物を０．１Ｍの燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４ ）中の４％パラホルムアルデヒド５００ｍｌで灌流し、その脳を２０％蔗糖に入
れた。次の日、この脳をイソペンタン中で−２０℃で凍結した。続いて、４０ミ
クロンの冠状切片を０．１ＭＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド中に凍結ミク
ロトームで切り出した。線条および黒質−ＶＴＡを通して連続切片を得た。脳の
残りの部分から代表的な切片を得た。

【０１４２】 Ｅ．ニッスル染色 ニッスル染色用の脳のミクロトーム切片をゼラチン被覆スライドにマウントし 一晩乾燥させた。続いてこれらを脱水し、エタノール浴により再度水和させ、チ
オニン溶液中に約４分放置した。切片を一連のエタノール浴で脱水し、連続的ヒ
ストクリア（Histoclear）洗浄で透明にしてカバースリップで覆った。切片を明
視野顕微鏡下で観察し、ＩＳＯ１００でテクニカルパンフィルム（Technical Pa
n Film; Kodak, Inc.)で撮影した（６分間ＨＣ−１１０プロセッシング）。

【０１４３】 Ｆ．銀染色 隆線の変性線維および細胞をナウタ（Nauta)染色法の変法を用いて標識した。 この方法はフィンク＝ハイマー（Fink-Heimer)の工程Ｉと類似する（Giolli & K
aramanlidis, "Neuroanatomical Research Techniques", R.T. Robertson, Ed., pp.211-240, Academic Press, New York, 1978)。簡単に記せば、浮遊切片を新
しい１％ヒドロキノリン−１％シュウ酸で処理する前に０．０５％の過マンガン
酸カリウム中に入れた。これらを濃度が増加する硝酸ウラニル／硝酸銀の連続溶
液で処理した。もう一度洗浄した後、これら切片を銀アンモニア液中で、続いて
エタノール／クエン酸／パラホルムアルデヒド還元剤中で、最後にチオ硫酸ナト
リウム中で反応させた。染色後、切片をガラススライドにマウントし、スライド
ドライヤー上で１５分乾燥させた。続いて切片を濃度が増加する連続エタノール
洗浄で脱水し、３回の連続ヒストクリアー洗浄で脱脂してカバースリップで覆っ
た。

【０１４４】 Ｇ．免疫組織化学 黒質損傷の質と程度は同側の腹側中脳のＴＨ−ＩＲの損失によって決定した。 グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（星状細胞のマーカー）、ネスチン（
神経原始細胞のマーカー）、およびビメンチン（放射状グリア細胞のマーカー）
に対する抗体を隆線の神経化学的性状決定に用いた。免疫組織化学を浮遊切片で
実施した。簡単に記せば、脳切片を０．１ＭのＰＢＳまたはトリス緩衝食塩水（
ＴＢＳ；３ｘ１０分）中で洗浄し、続いて０．１ＭのＰＢＳまたはＴＢＳ中の３
％正常ヤギ血清から成る封鎖溶液で１５０μｌのトリトンＸ−１００とともに１
時間保温した。次に、それらを封鎖溶液で希釈した抗体溶液とともに回転盤上で
室温で一晩保温した。抗体溶液は、ウサギ抗ＴＨ抗血清（１：５００；Eugene T
ech Intl., Inc.)、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：６４００；Dako Corp.）、マウスモ
ノクローナル抗ビメンチン（１：１５０；Sigma Chemical Co.）、またはマウス
抗ネスチン上清（１：２０；University of Iowa Hybridoma Bank)。

【０１４５】 続いて、切片を洗浄し、ＴＨまたはＧＦＡＰ免疫染色にはビオチン付加ヤギ抗
ウサギ抗血清（１：２００；Vector Labs, Inc.)で、ネスチンまたはビメンチン
免疫染色にはビオチン付加ウマ抗マウス抗血清（Vector Labs, Inc.)で１時間保
温し、続いて洗浄し、さらにアビジン−ビオチン複合体（ABC Elite kit, Vecto
r Labs, Inc.）中で１時間保温した。一次抗体結合場所はジアミノベンジジン（
ＤＡＢ）ペルオキシダーゼ法を用いて明示した。切片を十分に洗浄し、ゼラチン
被覆スライドにマウントし、一晩乾燥させた。最後に、上記のように切片を脱水
し透明化してカバースリップで覆った。

【０１４６】 実験に用いたいずれの動物もミニポンプ移植または損傷手術による副作用を示
さなかった。全ての動物は実験中餌と水をとり続けた。損傷、輸液またはその両
方が不成功の場合、それらの動物（ｎ＝６）は最初の実験群から除外し、別個に
調べた。損傷の成功は、同側の黒質ＴＨ−ＩＲの完全またはほぼ完全な排除をも
たらすものと規定した。線条輸液の成功は、輸液カニューレの先端が線条体中に
上手く固定された場合と規定した。

【０１４７】 in situ ハイブリダイゼーション実験に関しては、６日またはそれ以上の線条
内ＴＧＦα輸液を受けた全動物が、輸液と同側の脳室沿いに細胞の劇的な集合（
チオニン染色で可視化できる）を示した。比較により対側の線条はそのような増
加を示さず、ａＣＳＦ輸液動物のそれと区別できなかった。損傷をもつ動物のＥ
ＧＦ輸液は脳室沿いに細胞の増大を誘発したが、線条の隆線形成は誘発しなかっ
た。より低い用量のＴＧＦαは細胞の増大および隆線形成の両方を誘発したが各
々における細胞数は減少した。

【０１４８】 １．６−ＯＨＤＡ損傷の影響 ａＣＳＦを受けた損傷をもつ動物のいずれも、同側の脳室沿いの細胞増大また は線条の隆線の証拠を全く示さなかった。ＴＧＦαを輸液された損傷をもつ動物
は一様に脳室に沿って細胞の集合を示し、典型的には線条隆線を示した。黒質損
傷は、損傷のない動物と比較して隆線形成率を劇的に増加させた（表１）。

【０１４９】 ２．隆線の形態と持続性 線条中央の輸液は、背内側尾状核−被殻から発し線条内を流れ、その腹側端の 中央線に向かってわずかに輪を描いてもどる特徴的なＳ字形隆線を生じる。隆線
の最も背側部分は上衣下領域の細胞集合と連続していた。典型的には、チオニン
染色は、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイゼーションと一致して隆線の背
側部分で最も濃密であった。一般に細胞性隆線は線条の吻−尾領域の大半にわた
って見出された。隆線はＴＧＦα輸液ポンプを除去した３ヵ月後にもなお顕著で
あった。

【０１５０】

【表１】 輸液物 損傷 数 増大 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ａＣＳＦ 無し ９ ０％ ０％ ａＣＳＦ 有り １２ ０％ ０％ ＴＧＦα 無し １１ １００％ ２７％ ＴＧＦα 有り １３ １００％ ９２％ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ３．ＧＦＡＰ免疫組織化学 グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（星状細胞に対するマーカー）に対 する抗血清は、線条隆線の細胞も脳室沿いの細胞の増大も染色できなかった。正
常なＧＦＡＰ−ＩＲ星状細胞染色は、隆線に対して内側および外側で認められた
が、隆線それ自体はほとんど除外された。

【０１５１】 ４．銀染色 ナウタ法の変法で非特異的に細胞を標識することによって、脳室の細胞増大お よび線条隆線を構成する細胞に関する更なる情報が提供された。最も驚くべき特
徴の１つは、上衣下の細胞集合および隆線を構成する極めて多数の細胞であった
（図８）。これらの細胞は密に詰め込まれ、形状はもっぱら紡錘形であった（図
８）。隆線の腹側部分では、細長い細胞は内包の線維束周囲を流れるように見え
、これらの細胞が線条を通って移動していることを示唆している。

【０１５２】 ５．隆線形成のタイムコース 隆線の細胞密度は単純なチオニン染色を用いて隆線形成を追跡することを可能 にした（図９）。タイムコース実験に用いた全ての動物は６−ＯＨＤＡ損傷およ
び線条中央ＴＧＦα輸液を受けた。輸液６日前の時点で、上衣下領域に非常にわ
ずかの細胞の集合が存在したが、線条隆線の証拠は認められなかった。輸液の６
日までに、脳室に沿って細胞の明瞭な増大があった。９日輸液で、隆線の腹側部
分は脳室からわずかに移動して出現し始めた。輸液１２日までに、隆線の腹側部
分は脳室壁から４００μｍの位置にあった。輸液１６日で、隆線は線条中央に出
現し、その腹側部分は脳室から２ｍｍにあった。したがって、隆線は脳室領域か
ら発生し、より長い輸液期間で重なっている線条に放射状に徐々に移動した。輸
液１６日での隆線の外側限界と脳室壁との間の距離の概算は約１．６ｍｍであっ
た。

【０１５３】 ６．ネスチン免疫組織化学 ネスチン（神経上皮原始細胞のためのマーカー）に対するモノクローナル抗体 は、隆線全体に線維の密な集合を濃く染色した（図１０）。ネスチン−ＩＲ線維
は隆線の外側には認められなかったが、隆線の内側にはたまたま線維が認められ
た。線維は隆線に対して主に直角方向に向いていた。

【０１５４】 ７．隆線の形態の変化 線条中央にＴＧＦαを輸液された損傷をもつ動物は、冠状切片に特徴的なＳ字形
線条隆線を一様に示した。この形態は、尾状核−被殻の他の領域に輸液されたラ
ットでは劇的に変化した（図１１）。線条中央の輸液は、カニューレ輸液部位近
くにＬ字形隆線を生じた。このＬ字形隆線は脳室に沿って“Ｌ”の垂直部分を有
し、水平部分は脳室から線条に直角に伸びる。線条の極外側への輸液は側脳室の
壁に平行な直線状隆線の形成を刺激した。

【０１５５】 ８．ビメンチン免疫組織化学 ビメンチン（放射状グリア細胞に対するマーカー）を認識する抗血清は、輸液 ２週間の線条、上衣下ゾーン、または線条隆線のいずれの細胞も染色しなかった
。しかしながらこの結果は、コントロールが、誤った陰性結果の排除が確信でき
ない条件の下で胎児で実施されたのでさらに調査している。

【０１５６】 ９．隆線の位置の制御 in situ ハイブリダイゼーション実験のために用いたラットの隆線の細胞と比 較して、本実験シリーズの隆線細胞は最大では脳室からはるかに遠く移された（
図１２）。これら２つの動物群の間の違いは輸液と損傷の時刻の違いであった。

【０１５７】 in situ ハイブリダイゼーション実験で調製した動物は損傷を受け、続いて損
傷後ほぼ２週間で一連の行動検査を施し一側性の損傷を確認した。典型的には、
これらの動物は、損傷後５週間まで輸液を受けなかった。したがって、ドーパミ
ン変性過程およびＴＧＦαの線条輸液は一時的に別個の事象であった。

【０１５８】 本実験シリーズでは、輸液が最初に開始し、輸液ポンプ移植後４９時間まで損
傷は実施されなかった。これらの動物では、黒質ドーパミンニューロンの変性、
その結果の線条ドーパミン作動性神経支配の損失、および増殖因子の線条投与は
一時的に同時に発生する事象であった。

【０１５９】 １０．線条以外の脳領域への輸液 線条以外の脳領域に輸液を受けた全てのラットは２週間のＴＧＦα輸液および 黒質６−ＯＨＤＡ損傷を受けた。損傷と同側の大脳脳室内（ＩＣＶ）増殖因子輸
液は脳室壁に隣接して細胞の集合を刺激したが、いずれの動物においても線条隆
線の形成を誘発しなかった。

【０１６０】 中隔およびいくつかの線条輸液は、側脳室の内側壁に結合した中隔隆線の形成
を刺激した。線条隆線と同様に中隔隆線は、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡin situ
ハイブリダイゼーションまたはチオニン染色で容易に検出されたが、密度および
細胞数に関して定性的に旺盛さは少ない傾向があった。

【０１６１】 背側皮質輸液、すなわち脳梁に浸透しないような浅い輸液は側脳室沿いの細胞
密度に関して識別可能な影響をもたなかった。これらの背側輸液はいずれも隆線
の形成を誘発しなかった。脳梁に微かに浸透する皮質輸液は同側脳室に沿って細
胞の増大を刺激したが、線条隆線の形成は誘発しなかった。これらの動物は、脳
梁隆線と考えられる脳梁における細胞の密集状態を示さなかった。

【０１６２】 Ｈ．ＴＧＦαは細胞増殖を刺激する 本実験は上記で述べたものと合わせて、ＴＧＦα投与が細胞の集合形成および 線条隆線形成に必要であることを示している。輸液と反対側の上衣下領域または
正常な動物と比較したとき、線条ａＣＳＦ輸液を受けたただ１匹の動物も（損傷
が有るか否かにかかわらず）、明瞭な脳室周辺の細胞増大を全く示さなかった。
明らかに、前脳の細胞は、側脳室に沿って増殖することによってＴＧＦαの線条
輸液に反応している。ＥＧＦまたはＴＧＦαの６日間のマウスＩＣＶ輸液に関す
る最近の実験は、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）または〔3 Ｈ〕チミジン（細胞増殖のマーカー）で免疫標識される脳室周辺の細胞数の大き
な増加を示した（Craig et al., J. Neurosci. 16:2649-2658, 1996)。これらの
細胞の９５％以上がＥＧＦレセプターに対する免疫反応性もまた陽性であった。
クレシルバイオレットニッスル染色もまた、これらの動物で増殖因子の投与に反
応する脳室周囲の細胞数の増加を示した。

【０１６３】 側脳室沿いの増大細胞集団は、前脳の神経毒性損傷および機械的損傷の結合並
びに輸液ＴＧＦαによって刺激されたグリア細胞であるという可能性が最初考え
られた。星状細胞は、増殖しさらにそれらの形態および機能的特性を変化させる
ことによって脳損傷に反応することが知られている（例えば概説として以下を参
照されたい：Norenberg, J. Neuropath. Exper. Neurol. 53:213-220, 1994）。
さらに、線条星状細胞はＥＧＦレセプターをもち（Gomez-Pinilla et al., 1988
, 上掲書;Nieto-Sampedro et al., 1988, 上掲書）、さらにＴＧＦαによって刺
激され増殖する(Alexi & Hefti, 1993, 上掲書）。本実験では、グリア原線維酸
性タンパク質（ＧＦＡＰ、星状細胞のためのマーカー）に対する抗血清は、２週
間の輸液で脳室領域または隆線の星状細胞の増加を示すことができなかった。実
際、ＧＦＡＰ−ＩＲはこれらの領域からほとんど排除された。正常な星状細胞染
色は例えば隆線の内側および外側に認められたが、ほとんどのＧＦＡＰ−ＩＲ線
維は隆線自体の中では認められなかった。これらの発見は、ＥＧＦまたはＴＧＦ
αの６日間のＩＣＶ輸液実験の発見と一致した。すなわち、ＧＦＡＰおよびまた
別の星状細胞マーカー（Ｓ１００β）は、側脳室周辺で顕著な増加を示さなかっ
た（Craig et al., 1996, 上掲書）。ビメンチンもまた反応性星状細胞によって
発現される（Federoff et al., J. Neurosci. Res. 12:14-27, 1984)が、ビメン
チン−ＩＲは調べたいずれの切片でも観察されなかった。ミクログリアのための
マーカー（ＭＡＣ−１）および稀突起神経膠細胞ためのマーカー（ＭＡＧ、ＣＮ
Ｐ、Ｏ４およびＲｉｐ）もまた顕著には変化しなかった（Craig et al., 1996,
上掲書）。したがって、免疫組織化学的証拠は、脳室沿いおよび線条隆線内のＴ
ＧＦα誘発細胞増大はグリオーシスの結果ではないことを明示した。

【０１６４】 １．細胞の形態および方向性 銀染色およびチオニン染色は、脳室沿いの細胞凝集内の極めて多数の細胞を明 瞭に示した。細胞は、上衣下ゾーンおよび隆線の背側部分で極めて密で数も多か
った。細胞は主に紡錘形で、発達中の脳内の移動中の神経原始細胞と類似してお
り、脳室壁に対して（または背側線条の境界の上衣下ゾーンの背外側増大部に対
して）直角に向く長い軸を有していた。隆線の腹側セグメント内の銀で染色され
た細胞は、内包の線維束周囲を流れているように見え、それらが線条を通過して
移動していることを示唆した。

【０１６５】 これらの細胞が実際に移動していたのか否かを決定するために、タイムコース
実験を実施し、増殖因子輸液の開始後に時間の関数として隆線の発達およびその
場所を調べた。

【０１６６】 ２．線条隆線の細胞の移動 側脳室沿いの進行する細胞増大およびそれに続くこれら細胞の濃い隆線として の放射状移動は、実際これらの細胞が集団で線条を通って移動していることを証
明した。したがって、この隆線は、ゲッ歯類線条の推定的な“尾状核様”および
“被殻様”領域間の解剖的な線引きではなかったであろう。

【０１６７】 ３．神経原始細胞の刺激 成熟星状細胞、ニューロン、ミクログリア、または稀突起神経膠細胞に対する 免疫マーカーのいずれも脳室周囲の増大細胞または線条隆線の細胞を標識しなか
ったが、ネスチン（神経上皮前駆細胞によって発現される中間体フィラメント）
を認識するモノクローナル抗体は、隆線および脳室沿いの細胞の突起を強く染色
した。反応性星状細胞もまたネスチン−ＩＲを発現することができるが、隆線の
細胞ではＧＦＡＰ−ＩＲが陰性であるということで、星状細胞が隆線細胞の大き
な部分を構成するという可能性が排除された。ネスチン−ＩＲは、in vitroおよ
びin vivo で神経前駆細胞を特定し標識するために近年用いられてきた（Lendah
l et al., Cell, 60:585-595, 1990; Craig et al., 1996, 上掲書）。線条隆線
の強いネスチン−ＩＲ、およびグリアマーカーによる免疫染色の欠如は、隆線の
細胞はもっぱら神経前駆細胞であるという結論を支持する。

【０１６８】 これまでのところ、２つの異なる細胞集団が、新しいニューロンおよびグリア
を生じることができる成獣哺乳類の脳で特定された(Morshead et al., 1994, 上
掲書）。一つ（比較的不活性な細胞集団である）は、本物の多能性神経幹細胞で
あると考えられている。他方（構成要素として増殖する集団）は、幹細胞から派
生した神経原始細胞であると考えられている。幹細胞集団は、上位または上衣下
ゾーンに残存し、それらが死滅したときまたは移動したときに原始細胞を補充す
ると思われる。“神経前駆細胞”という用語は、これらの細胞が神経幹細胞であ
るか、または神経原始細胞であるかにかかわらず、成獣哺乳類の脳でニューロン
およびグリアを生じることができる未分化の増殖性細胞をいうために本明細書で
用いられる。

【０１６９】 以前の実験では、多くの神経原始細胞が、上衣下ゾーンからそれらが移動する
前に当該領域で死滅することが示された（Morshead & Van der Kooy, J. Neuros
ci. 12:249-256, 1992）。しかしながら最近、他の多くが確かに生存し、厳しく
限定された経路に沿って嗅球に移動し、そこで嗅覚介在ニューロンに分化するこ
とが発見された（Luskin, Neuron 11:173-189, 1993; Lois & Alvarez-Buylla,
Science 264:1145-1148, 1994)。それらの細胞は、移動する細胞の鎖が特殊化さ
れたＧＦＡＰ−ＩＲ星状細胞によって包まれる“鎖状移動（chain migration)”
と称される過程で側脳室の壁に沿って接線方向に移動する（Rousselot et al.,
1994; Lois et al., Science 271:978-981, 1996）。

【０１７０】 したがって、前脳側脳室沿いの上衣下ゾーンは、胎児の神経上皮の休眠中残存
物以上のものである。手を加えられていない正常な脳では、それは吻に向かって
移動し、ニューロンに分化する新しい神経芽細胞を産生し続ける。ＥＦＧファミ
リーの神経栄養因子（ＴＧＦαを含む）の影響下では、上衣下神経前駆細胞はin vitroで刺激され、大量の新しいニューロン、星状細胞、および稀突起神経膠細
胞を産生することができる（Reymonds & Weiss, Science 255:1707-1710, 1992)
。これらの体外移植実験から、最も高濃度の神経前駆細胞は、尾状核−被殻の背
側境界に沿って上衣下ゾーンの背側部分で見出されるということが明瞭になった
。

【０１７１】 さらに、神経前駆細胞は刺激されてその数を増加させ、新しいニューロンおよ
びグリアをin vivo で産生することができるという証拠さえも最近得られている
（Craig et al., 1996, 上掲書）。ＢｒｄＵおよび成熟ニューロンとグリアに対
するマーカーとで二重に標識された細胞が、ＥＧＦのＩＣＶ輸液の６日後および
輸液後６週までの生存動物で、線条、中隔および皮質全体に分散して分布するの
が見つけられた。しかしながら、上衣下細胞の隣接する線条への集団移動は当該
実験では認められず（本方法で得られた結果とは極めて対照的である）、本明細
書で述べた線条隆線で認められた密に詰め込まれた細胞集団と比較してその細胞
数は極めて控えめであった。さらにまた、前記文献（Craig et al.）の動物のい
ずれも本実験で観察された集団移動を刺激するために十分な輸液を受けておらず
、さらに前記実験の動物のいずれも黒質６−ＯＨＤＡ損傷（本明細書で初めて移
動の発生率を劇期に増加させることが示された）を受けていなかった。

【０１７２】 ４．ニューロン表現型の証拠 残る疑問は、脳室沿いの塊状増大物内の細胞および移動してきた線条隆線内の 細胞が本当に神経原始細胞であるか否かということである。表２は、これらの細
胞は確かに神経原始細胞であるという結論を支持するデータの要約である。神経
化学的証拠は、それらが成熟ニューロン、星状細胞、稀突起神経膠細胞またはミ
クログリアに対するマーカーを発現していないことを示した。しかしながら、そ
れらは未成熟の神経原始細胞のマーカーを強く発現した。それらは、細胞増殖マ
ーカーを発現した。それらは、側脳室の壁から発生し、成獣ゲッ歯類の脳ではこ
こに神経前駆細胞が位置し、外側に広がり脳室から放射状に移動する。さらにま
た、それらの細胞形態は紡錘状で、それらの突起は脳室および隆線に対して直角
に向き、胎児の脳での移動中の神経前駆細胞と同様で、上衣下領域からのそれら
の移動と一致する。以下の表（表２）にまとめたデータは、脳室周囲の増大細胞
および線条隆線の細胞は、上衣下神経幹細胞から生じた神経原始細胞であること
を指摘している。

【０１７３】

【表２】 増大部および隆線の細胞が原始細胞表現型をもつ証拠 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 神経化学的証拠 豊富なＥＧＦレセプターｍＲＮＡ^*および免疫反応性を発現 ＧＦＡＰ^*または星状細胞マーカー、Ｓ−１００βは免疫反応陰性 成熟ニューロンマーカー、ＮｅｕＮは免疫反応陰性 稀突起神経膠細胞マーカー、ＭＡＧ、ＣＮＰ、０４またはＲｉｐは免疫反応陰性
放射状グリアマーカー、ビメンチン^*は免疫反応陰性 ミクログリアマーカー、ＭＡＣ−１は免疫反応陰性 神経上皮前駆体マーカー、ネスチンは免疫反応陽性 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 形態 上衣下ゾーンに直交する隆線内の伸長した細胞体 上衣下ゾーンに垂直な隆線内でネスチン−ＩＲ突起 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 解剖 上衣下ゾーンから発生 最高密度の細胞は背側上衣下領域に存在する −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 生理 数を増すことによってＴＧＦαの投与に反応する −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ５．移動メカニズム これらの細胞の線条への集団移動は、線条のドーパミン脱神経および輸液カニュ
ーレの配置によって制御できたが、移動メカニズムは不明であった。隆線の形状
は、輸液の位置によって簡単に変更することができるという事実によって、最初
化学誘引剤的作用が提唱された。ＴＧＦαは、多様な細胞タイプで強力な化学誘
引剤であることが知られている（Ju et al., J. Invest. Dermatol. 100:628-63
2, 1993; Panagakos, Biochem. Mol. Biol. Int. 33:643-650, 1994)。周生期の
尾状核−被殻におけるその豊富な発現は、それが線条の発達において同様な役割
を演じることを示しているのかもしれない。

【０１７４】 正常な脳内の神経原始細胞は側脳室壁内の薄い領域に位置している。線条中央
への輸液は、この領域の背側端の細胞にさらに接近した。おそらく、線条内に移
動する細胞は、ＴＧＦαが放出されている輸液カニューレの先端のより高濃度と
推定される増殖因子に向かって移動するであろう。線条中央輸液を受けている動
物の隆線の特徴的なＳ字形は、輸液カニューレの先端近くの上衣下ゾーンの腹側
セグメント内の細胞のレセプター飽和から生じたのかもしれない。ＥＧＦレセプ
ターが飽和した細胞は、輸液部位に接近するやそれらの移動を中止したのかもし
れない。上衣下ゾーンの腹側端近くの細胞はより低いと推定される増殖因子と出
会い、それらのレセプターを飽和させるために十分ＴＧＦαの濃度が増加する前
に輸液部位に向かってさらに移動しなければならないであろう。このレセプター
飽和による弁別的な移動は、これらの隆線の特徴的なＳ字形を説明することがで
きるであろう。

【０１７５】 神経化学的勾配／レセプター飽和作用と再び歩調を合わせて、線条内側への輸
液はＬ字形隆線を生じた。この事例では、背側上衣下細胞はそのレセプターが飽
和され、それらが上衣下ゾーンから出てくる前にそれらは移動を中止したのかも
しれない。上衣下領域の最も腹側の部分の細胞のみが脳室から移動して離れるこ
とができるであろう。

【０１７６】 極外側輸液は、増殖領域のほぼ全長に沿って、同様な推定される濃度勾配を細
胞に本質的に提供したであろう。上衣下細胞は全て脳室から同じ距離を移動し、
ほぼ直線状の隆線を生じ、化学的誘引剤的、神経化学的勾配作用の考え方と一致
する。

【０１７７】 しかしながら、性状決定実験から得られた免疫組織化学的証拠は、単純な化学
誘引剤的作用がこの放射状集団移動を完全に説明することができるという考えに
疑問を投げかけた。移動細胞のネスチン−ＩＲ突起は、増殖因子の濃度が最も高
いと推定される領域である輸液カニューレの先端に沿って並ばなかった。その代
わりに、それらは脳室と隆線に対して垂直に向いた。この向き方は、細胞が輸液
カニューレの先端に向かって斜めに移動したのではなく、移動神経原始細胞が胎
児の線条神経上皮から移動するように尾状核−被殻内に直角に移動したことを示
唆した。

【０１７８】 この２つの新たな発見によって、隆線の移動における単純な化学誘因の役割は
割引かれた。第一に、細胞はそれらが産生されたとき移動を開始しなかった。す
なわち、それらは１週間以上脳室に沿って数を増し、続いて厚い細胞シートとし
て集団で移動した。さらに、同側黒質の損傷は移動発生率を大きく増加させた。
これらの発見の両方が細胞の移動に影響するより複雑な因子群を提唱している。
これらのデータは、隆線の移動における化学的誘因の役割を完全には排除しない
が、単純な化学的誘因作用単独では隆線の移動を説明することはできなかった。

【０１７９】 成獣の線条における神経原始細胞の放射状移動に寄与する可能性がある別のメ
カニズムは、神経毒性損傷、輸液カニューレの移植手術によって生じた機械的損
傷、またはその両方による放射状グリアの足場の再構築であった。放射状グリア
は、発達中の脳の多くの領域で神経原始細胞の移動の道案内をする。それらは脳
室に沿って固定され、上に横たわる実質内にそれらの突起を放射状に伸ばす。通
常それらは、神経芽細胞の移動が完了するや、出生後初期にＧＦＡＰ−ＩＲ星状
細胞に形質転換され、ビメンチンおよびネスチンの発現を停止する。新生児ラッ
トの皮質プレートの凍結損傷は、放射状グリアの形質転換を抑制し、成獣の脳の
損傷領域でグリアによるビメンチンおよびネスチンの発現を持続させる（rosen et al., Dev. Brain Res. 82:127-135, 1994）。成獣ラットの海馬のカイネート
損傷は、海馬の上衣下ゾーンの星状細胞に放射状グリアの形態を誘発し、ネスチ
ン−ＩＲおよびビメンチンＩＲの発現を誘発し、脳の損傷は、星状細胞表現型を
胎児の脳で認められたものに復帰させる刺激になることが提唱された（Clarke e
t al., Neuroreport 5:1885-1888, 1994）。

【０１８０】 本免疫組織化学的実験はこの現象についての支持情報を提供していない。ネス
チン−ＩＲ繊維は、輸液９日で脳室に沿って放射状に向く線維で豊富に見出され
たが、以降の時点では、それらはもはや脳室沿いに残留していなかった。隆線の
細胞が上衣下領域から移動して離れるようにネスチン−ＩＲ線維も離れていった
。さらにまた、ビメンチン（放射状グリアのマーカー）の免疫染色は、隆線でも
上衣下領域でも標識線維の染色を全く示さなかった。したがって、いずれかの星
状細胞がそれらの胎児の放射状グリア表現型に復帰したという可能性も、星状細
胞の復帰が神経原始細胞の放射状移動で役割を果たしたという可能性もありそう
にない。

【０１８１】 成獣哺乳類の脳で神経原始細胞によって特異的に利用される新しく記載された
移動態様は、前脳上衣下ゾーンから嗅球へのこれらの細胞の接線方向への移動を
排除する(Lois et al., 1996, 上掲書）。吻に向かって移動する神経芽細胞は密
に詰め込まれ、これら神経芽細胞の厳しく限定された移動経路と隣合うＧＦＡＰ
−ＩＲ星状細胞によって覆われる。移動細胞は、特殊化されたグリアガイド細胞
の管の中でしっかり詰まった移動細胞の流れを形成する。我々の実験では神経前
駆細胞は線条神経網を通って（限定された経路に沿ってではなく）シートとして
移動し、ＧＦＡＰ−ＩＲ細胞を伴わなかった。実際、増殖上衣下ゾーンおよび細
胞隆線は大規模にＧＦＡＰ−ＩＲを排除した。したがって、鎖状移動のメカニズ
ムは本実験で見られる放射状移動を説明することはできなかった。

【０１８２】 神経原始細胞集団移動をおそらく引き起こすまた別のメカニズムは、線条の細
胞が、損傷に反応して増殖因子、細胞粘着分子または他の物質の発現を変化させ
たのかもしれないということである。このシナリオでは、線条は、放射状移動を
促進するそれ自身の化学誘引剤または物質を提供するために刺激されたのかもし
れない。また別には、移動を抑制する物質の発現をダウンレギュレートさせるた
めにそれは誘発されたかもしれない。

【０１８３】 線条および上衣下領域の細胞粘着分子を調べた最近の実験は特に興味を引く識
見を提供した。高度にポリシアリル化された神経細胞粘着分子（ＰＳＡ−Ｎ−Ｃ
ＡＭ）の免疫反応性は、発達中のゲッ歯類線条で強烈に発現されるが、動物が成
熟するにつれ減少する（Aaron & Chesselet, Neurosci. 28:701-710, 1989; Sze
le et al., Neurosci. 60:133-144, 1994)。しかしながら、ＰＳＡ−Ｎ−ＣＡＭ
発現は、成獣の前脳上衣下領域に沿って存続する（Rousselot et al., 1994; Sz
ele et al., 1994, 上掲書）。部分的皮質除去によって誘発される線条求心路遮
断は、上衣下ゾーンでのＰＳＡ−Ｎ−ＣＡＭおよび他の粘着分子（Ｌ１）の発現
を劇的に増加させる（Poltorak et al., J. Neurosci. 13:2217-2229, 1993; Sz
ele & Chesselet, J. Comp. Neurol. 368:439-454, 1996)。ヒトの脳では、ＰＳ
Ａ−Ｎ−ＣＡＭ発現は正常な線条では低いが、ハンチントン病患者の線条、特に
上衣下ゾーンで増加する（Nihei & Kowall, Ann. Neurol. 31:59-63, 1992)。

【０１８４】 特に興味深いものは、部分的な一側性前頭皮質除去後に線条でのフィブロネク
チンｍＲＮＡ発現で生じる変化であった（Popa-Wagner et al., Neuroreport 3:
853-856, 1992)。フィブロネクチンは、in vitroで神経の移動を支援することが
示された多数の分子の１つである（Fishman & Hatten, J. Neurosci. 13:3485-3
495, 1993)。フィブロネクチンｍＲＮＡハイブリダイゼーションは創傷腔直下の
線条の部分で７２時間で最高レベルに増加した。この初期増加は、短期間の創傷
治癒過程の１成分として説明された。より大きな同側性線条におけるフィブロネ
クチンの発現はより長期の増加に従い、損傷後約１０日でピークに達した。この
二次増加は、求心路遮断に対する線条の反応として説明された。Ｎ−ＣＡＭおよ
びαチュブリンをコードする他の２つのｍＲＮＡの発現における増加は、初期創
傷治癒に関連する線条および一時的パターンにのみ従っていた。

【０１８５】 求心路遮断後の線条フィブロネクチンｍＲＮＡ発現の１０日目ピークは、本実
験の線条ドーパミン脱神経に続く隆線移動の遅延とよく一致する。フィブロネク
チンｍＲＮＡ発現ピークの遅延は、なぜ本発明の原始細胞が輸液９日頃まで放射
状に移動を開始しなかったのか、さらにそれらが最終的に移動したときなぜそれ
らは集団で移動したのかについて説明を助けるであろう。輸液と損傷の間が数週
間離れた動物では、輸液２週間での最大の外側移動距離は劇的に減少した。この
観察はまた、線条のフィブロネクチン発現の一時的ピークと一致する。黒質損傷
を受けなかった隆線をもつ数匹の動物では、その上に重なる皮質の機械的損傷が
線条での十分なフィブロネクチン発現を刺激して移動を促進させたのかもしれな
い。したがって、フィブロネクチンは、同側線条のドーパミン脱神経に反応して
アップレギュレートされ、続いて上衣下ゾーンから神経原始細胞の放射状移動を
促進するかもしれない。

【０１８６】 成獣の線条における神経原始細胞の放射状移動に影響を与える別の可能性は、
細胞粘着分子による二次的影響から生じるかもしれない。脳の種々の領域（線条
を含む）への刺し傷を受けた成獣ラットのＮ−ＣＡＭの脳内輸液は星状細胞の増
殖を抑制した（Krushel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4323-4327, 1
995)。星状細胞は軸索の成長を抑制する因子を放出し、したがって神経の再生反
応を抑制するかもしれない。したがって、線条の脱神経、および付随する上衣下
ＰＳＡ−Ｎ−ＣＡＭの増加は神経再生抑制物を放出するかもしれない。

【０１８７】 ドーパミン脱神経線条の移動作用の強化はまた、ドーパミン作動性神経支配の
喪失と直接関係があったかもしれない。胎児の線条の発達時に、未熟なニューロ
ンは脳室領域に発し放射状に移動する(Bayer, 1984, 上掲書；Bayer & Altman,
Prog. Neurobiol. 29:57-106, 1987）。線条ニューロンの発生時移動は、中脳か
らの求心神経によるドーパミン神経支配の前に生じる。視床下部ニューロンにお
けるＤ2ドーパミンレセプター刺激は、ＴＧＦαｍＲＮＡ発現および下垂体の成 長を劇的に減弱させる（Borgundvaag et al., Endocrinology 130:3453-3458, 1
992)。ＴＧＦα発現のドーパミンレセプター仲介抑制は上衣下ゾーンでは調べら
れていないが、非損傷動物での移動発生率の抑制と一致する。したがって、発育
時のドパミン神経支配は、前脳のドーパミン作動性神経支配が確立されるので線
条細胞の移動を抑制するかもしれない。

【０１８８】 線条ドーパミンはまた、ドーパミン作動性求心神経が確立されるので、出生後
初期の発育で線条ＴＧＦαのダウンレギュレーションに貢献するかもしれない。
成獣の線条のドーパミン脱神経は、発達中の線条でのみ通常認められる局所的化
学的環境的刺激（例えば線条ニューロンで発現されるドーパミンレセプターに対
する利用可能なリガンドの減少）のいくつかを線条細胞のために模倣することが
できる。線条ドーパミン神経支配はまた、互換的態様で星状細胞による細胞外マ
トリックス（ＥＣＭ）分子の発現と連関していた（Gates et al., J. Chem. Neu
roanat. 6:179-189, 1993)。興味深いことに、ＴＧＦαは、胎児の線条における
ＴＧＦα発現の上昇と類似してＰＤ患者の線条で選択的に上昇した（Mogi et al
., Neurosci. Lett. 180:147-150, 1994）。線条のＴＧＦαがドーパミン神経支
配によって調節されるならば、この増加は線条のドーパミンの減少およびその結
果のＴＧＦα発現抑制物質の放出に関係しているかもしれない。

【０１８９】 基本的なメカニズムが何であれ、タイムコース実験によって、成獣ラットの脳
で上衣下細胞が刺激され、その数を増し、集団となって放射状に隣接する線条に
移動することができることが証明された。ＴＧＦα輸液の位置および用量を変化
させた実験で、線条隆線の移動およびそれに含まれる細胞総数が制御できること
が示された。性状決定実験では、上衣下細胞増大および濃密な線条隆線は神経原
始細胞で構成されていることを示す豊富な証拠が提供された。これらの発見の重
要性は、ヒトの神経変性疾患および外傷性脳損傷の治療のための可能な利用と合
わせて下記で考察される。

【０１９０】 本発明は具体的な実施例および実施態様を参考にこれまで説明してきた。本明
細書によって当業者には他の実施態様を提案することができるであろう。

【０１９１】 本発明は、明瞭な理解のために比較および実施例によって詳細に開示してきた
が、添付の請求の範囲の範囲内である種の変更および改変を実施できることは明
瞭であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ラットの前脳の冠状切片の模式図である。右側に示した注入ピペットは、輸液
することができる位置の１つを示している。Ｓｔｒ＝線条；ｃｔｘ＝大脳皮質；
ｌｖ＝側脳室。

【図２】 ＥＧＦレセプターｍＲＮＡの分布を示すことが証明された成獣ラットの中脳を
通る冠状切片の顕微鏡写真である。図２Ａでは、“センス”プローブがコントロ
ールとして用いられた。図２Ｂ〜２Ｄでは、黒質（ｓｎ）を通る切片は、海馬（
ｈｉｐ）、ｓｎａの中央部、並びに腹側被蓋領域（ｖｔａ）の鰓傍核（parabran
chial nuclei）および黒質傍核（paranigral nuclei)における中等度に豊富な発
現を示している。最も尾側の中脳（図２Ｄ）では、脚間核（ｉｐ）が最も強く標
識された。縮尺表示棒は５ｍｍ長に相当する。

【図３】 ＴＧＦαを輸液され、ＥＧＦレセプターｍＲＮＡの分布を示すことが証明され
た成獣ラットの脳の線条を通る冠状切片の顕微鏡写真である。輸液側ではハイブ
リダイゼーション密度における劇的な増加が、側脳室に隣接する線条中央部で明
白である。

【図４】 ＴＧＦαを輸液され、６−ＯＨＤＡによる損傷をもつ成獣ラットの脳の前脳を
通る冠状切片の顕微鏡写真である。in situ ハイブリダイゼーションを実施して
ＥＧＦレセプターｍＲＮＡの位置を調べた。ＥＧＦレセプターｍＲＮＡは、線条
体中によく伸長した濃い隆線として出現した。

【図５】 ５つの被験動物群（正常；ａＣＳＦ輸液、損傷無し；ａＣＳＦ輸液、損傷有り
；ＴＧＦα輸液、損傷無し；ＴＧＦα輸液、損傷有り）の各々の線条におけるＴ
ＧＦαｍＲＮＡのハイブリダイゼーションの平均標準化密度を示す棒線グラフで
ある。棒線対は、処置に対する同側の線条および対側の線条におけるハイブリダ
イゼーション密度を示している。平均ハイブリダイゼーション密度は、黒質の６
−ＯＨＤＡ損傷を受けた両群で処置に対して同側で１／４顕著に減少した。ＴＧ
Ｆαペプチドの線条体輸液は減少に対して影響を与えなかった。平均±Ｓ．Ｅ．
Ｍ．（スチューデントのｔ検定、同側−対側比較のために対形成；ｐ値、＊ｐ＜
０．００５、＊＊ｐ＜０．００１）。

【図６】 図５で述べた同じ５検査群の動物の側脳室と接する線条端に沿って上衣下領域
のＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイゼーションの平均標準化密度を示す棒
線グラフである。棒線対は、処置に対して同側および対側の線条における密度を
示している。平均ハイブリダイゼーション密度は、ＴＧＦα線条体輸液を受けた
両群の同側上衣下領域で約２倍であった。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（スチューデント
のｔ検定、同側−対側比較のために対形成；ｐ値、＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０
．０００１）。

【図７】 線条体隆線を有する全動物の線条体隆線、線条体の非隆線部および上衣下領域
のＥＧＦレセプターｍＲＮＡハイブリダイゼーションの平均標準化密度を示す棒
線グラフである。棒線対は、処置に対して同側および対側の線条の密度を示して
いる。平均ハイブリダイゼーション密度は、処置に際して同側の線条体隆線で最
も高かった。対側の線条では線条体隆線は出現しなかった。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．
（スチューデントのｔ検定、同側−対側比較のために対形成；ｐ値、＊ｐ＜０．
００５、＊＊ｐ＜０．００１）。

【図８】 黒質の６−ＯＨＤＡ損傷および１４日間のＴＧＦα輸液を受けた成獣ラットの
線条を通る冠状切片の顕微鏡写真である。図８Ａでは、処置に際して同側の尾状
核被殻における銀染色が隆線の背側部分の多数の細胞で認められ、それらの細胞
の多くは細長い形態を示し上衣下領域に対して直角に向いている。側脳室に沿っ
て細胞の数もまた増加する。対側線条（図８Ｂ）では、細胞集団は、線条内でも
側脳室に沿っても拡大しない。

【図９】 ６−ＯＨＤＡで損傷を受け、さらに種々の期間ＴＧＦαを輸液された成獣ラッ
トの脳のチオニン染色冠状切片の顕微鏡写真である。図９Ａ（輸液後４日）では
、上衣下領域の細胞の増大はバックグラウンド染色以上にはほとんど検出できな
い。図９Ｂ（輸液後６日）では、側脳室近くのチオニン染色細胞の集合ははるか
に旺盛である。図９Ｃ（輸液後９日）では、濃く染色された細胞領域が、細胞が
増大した腹側端の上衣下ゾーンに対してわずかに外側に出現する。図９Ｄ（輸液
後１４日）では、密度の高い十分に形成された隆線が線条体中に明瞭である。

【図１０】 ６−ＯＨＤＡで損傷されＴＧＦαを１４日間輸液された成獣ラットの脳の冠状
切片の顕微鏡写真である。図１０Ａでは、ネスチン免疫組織化学によって濃い線
条体隆線が示されている。図１０Ｂでは、隣接する切片のチオニン染色によって
ネスチンＩＲ細胞と線条体隆線との間の合致が確認された。

【図１１】 ６−ＯＨＤＡで損傷を受け、１４日間側脳室から種々の距離でＴＧＦαを輸液
された成獣ラットの脳のチオニン染色切片の顕微鏡写真である。輸液カニューレ
が線条体の遠外側に埋め込まれた図１１Ａでは、隆線は上衣下ゾーンに平行で、
線条体中央輸液で認められる場合に較べて密度が高くない。輸液カニューレが線
条体中央に埋め込まれた図１１Ｂでは、隆線は特徴的なＳ字形で、腹側部分は線
条体腹側に深く伸長する。輸液が側脳室に隣接する図１１Ｃでは、線条体隆線は
Ｌ字形で、一般に非常に濃いチオニン染色を示す。

【図１２】 ６−ＯＨＤＡによる黒質損傷および１４日間のＴＧＦαの線条体中央輸液を受
けた後の成獣ラット脳の冠状切片における線条体隆線の最大置換（側脳室からｍ
ｍで表示）を示す棒線グラフである。“スケジュールＡ”（最も左の棒線）で処
置された動物は初めに損傷を受け、続いて４から５週間後にＴＧＦα輸液を受け
た。“スケジュールＢ”で処置された動物は、１４日間のＴＧＦα輸液が始まっ
てから２日後に損傷を受けた。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（スチューデントのｔ検定；
ｐ値、＊ｐ＜０．０１）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ファロン、 ジェイムズ、 エイチ. アメリカ合衆国 95612 カリフォルニア 州 アーヴァイン ディケンズ コート ５ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA13 AA17 AA19 AA22 AA23 BA44 CA53 DB53 DB61 DC50 MA02 MA17 MA66 NA10 ZA022 ZA152 ZA162 ZA332 ZA892 ZB012 ZB072 ZC032

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 神経学的欠損をもつ患者を治療する方法であって、 （ａ）患者の中枢神経系（ＣＮＳ）の神経原始細胞を上皮増殖因子（ＥＧＦ）レ
   セプターと結合するポリペプチドと接触させ、ここで前記ポリペプチドの投与量
   は前記神経原始細胞の増殖を刺激するために十分であって、さらに （ｂ）前記増殖させた原始細胞の子孫が停留し、前記神経学的欠損を減少させる
   ために十分な態様で前記神経原始細胞の子孫が機能する場であるＣＮＳの領域に
   集団で移動させるために、前記増殖原始細胞の子孫を誘導する工程を含む、前記
   神経学的欠損をもつ患者の治療方法。
2. 【請求項２】 前記細胞を前記増殖神経原始細胞の子孫を刺激して分化させ
   る化合物と接触させる工程をさらに含む請求の範囲第１項の方法。
3. 【請求項３】 前記神経学的欠損が神経変性疾患、外傷性損傷、神経毒によ
   る損傷、虚血、発達異常、視力に影響する異常、脊椎の損傷または疾患、脱髄性
   疾患、自己免疫疾患によって生じる請求の範囲第１項の方法。
4. 【請求項４】 前記神経変性疾患がアルツハイマー病、ハンチントン病、ま
   たはパーキンソン病である請求の範囲第３項の方法。
5. 【請求項５】 前記虚血が脳血液供給関連発作に伴うことを特徴とする請求
   の範囲第３項の方法。
6. 【請求項６】 前記ＥＧＦレセプターと結合するポリペプチドが、アンフィ
   レギュリン（ＡＲ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エピ
   レギュリン（ＥＲ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、神経線
   維腫由来増殖因子（ＳＤＧＦ）、ミクソーマウイルス増殖因子、ショープ線維腫
   ウイルス増殖因子、奇形癌由来増殖因子−１（ＴＤＧＦ−１）、形質転換増殖因
   子α（ＴＧＦα）、またはワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）である請求の範囲第１
   項の方法。
7. 【請求項７】 前記ＥＧＦレセプターと結合するポリペプチドがＴＧＦαで
   ある請求の範囲第１項の方法。
8. 【請求項８】 前記神経原始細胞が、ＥＧＦレセプターと結合するポリペプ
   チドとin vivo で接触させられる請求の範囲第１項の方法。
9. 【請求項９】 前記神経原始細胞が、ＥＧＦレセプターと結合するポリペプ
   チドと培養条件下で接触させられる請求の範囲第１項の方法。
10. 【請求項10】 所望の移動経路沿いにまたは前記経路の末端で、細胞粘着分
    子または細胞外マトリックス分子の発現を増加させる化合物と細胞とを接触させ
    ることによって移動が誘導される請求の範囲第１項の方法。
11. 【請求項11】 前記化合物がＴＧＦβである請求の範囲第１０項の方法。
12. 【請求項12】 前記細胞粘着分子がフィブロネクチンである請求の範囲第１
    ０項の方法。
13. 【請求項13】 前記細胞粘着分子がラミニンである請求の範囲第１０項の方
    法。
14. 【請求項14】 前記化合物が、前記神経前駆細胞とそれらの子孫が誘導され
    て移動する場所との間に沿って適用される請求の範囲第１０項の方法。
15. 【請求項15】 所望の移動経路に沿う細胞を、天然に存在するシグナルと、
    前記経路に沿って接触させることによって移動が誘導され、ここで前記天然に存
    在するシグナルが移動を抑制するシグナルである、請求の範囲第１項の方法。
16. 【請求項16】 移動が、ＣＮＳ内の組織を機械的に破壊することによって誘
    導される請求の範囲第１項の方法。
17. 【請求項17】 移動が、ＣＮＳ内の細胞の活性を神経化学的に遮断すること
    によって誘導される請求の範囲第１項の方法。
18. 【請求項18】 分化を刺激する前記化合物がレチン酸または脳由来神経栄養
    因子である請求の範囲第２項の方法。
19. 【請求項19】 神経学的欠損をもつ患者を治療する方法であって、 （ａ）患者の中枢神経系（ＣＮＳ）の神経原始細胞を上皮増殖因子（ＥＧＦ）レ
    セプターと結合するポリペプチドと接触させ、ここで前記ポリペプチドの投与量
    は前記神経原始細胞の増殖を刺激するために十分であって、さらに （ｂ）前記増殖させた原始細胞の子孫を誘導して前記ＣＮＳの第二の領域に集団
    で移動させ、さらに、 （ｃ）移動した細胞と分化を刺激する化合物とを接触させる工程を含む、前記神
    経学的欠損をもつ患者の治療方法。
20. 【請求項20】 神経幹細胞の増殖を刺激する化合物および分化を刺激する化
    合物が連続して投与される請求の範囲第１９項の方法。
21. 【請求項21】 上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターと結合するポリペプチド
    、および神経原始細胞の分化を刺激する化合物を含む医薬組成物。
22. 【請求項22】 前記ＥＧＦレセプターと結合するポリペプチドがＴＧＦαで
    ある請求の範囲第２１項の医薬組成物。
23. 【請求項23】 前記ＥＧＦレセプターと結合するポリペプチドがＴＧＦαで
    、神経原始細胞の分化を刺激する化合物が脳由来神経栄養因子である請求の範囲
    第２１項の医薬組成物。
24. 【請求項24】 中枢神経系への損傷が脊椎への損傷である請求の範囲第１項
    の方法。
25. 【請求項25】 中枢神経系への損傷が網膜への損傷である請求の範囲第１項
    の方法。