JP3049091B2

JP3049091B2 - ニューロン増殖及び維持を調節する方法

Info

Publication number: JP3049091B2
Application number: JP3505616A
Authority: JP
Inventors: バートレット、ペリー; マーフィ、マーク
Original assignee: アムラド・コーポレイション・リミテッド
Priority date: 1990-03-20
Filing date: 1991-03-20
Publication date: 2000-06-05
Anticipated expiration: 2015-06-05
Also published as: US20070122381A1; CA2077763A1; EP0521914A4; EP0521914A1; FI924134A0; CA2077763C; JPH05504965A; WO1991014443A1; US6093390A; ATE138268T1; US6177402B1; DE69119759T2; DE69119759D1; HK1002697A1; FI924134A; EP0521914B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は哺乳動物の中枢及び末梢神経系におけるニュ
ーロン増殖、維持及び再生を調節する方法並びに同様に
対して有用な白血病阻害因子を含む医薬組成物に関す
る。本発明は哺乳動物、特にヒトの開発的及び脳異型及
び神経病の処置に特に有用である。

白血病阻害因子（以下「LIF」と云う）は、精製さ
れ、クローンされ、エセリキア・コリ及び酵母細胞から
精製組換え形で大量に生成された蛋白である（国際特許
出願PCT/AU88/0093）。LIFはもともとその能力を元に分
離され、ネズミ骨髄白血病細胞系、MLの分化及び抑制を
誘導する。LIFは、LIFレセプターが単球−マクロファー
ジ系統の細胞に検出されるけれども正常造血細胞に明白
な増殖効果はない。

本発明は、神経堤の細胞へのLIFの効果の研究から一
部現れた。神経堤は、胚形成の間、神経管の背側唇から
現れ、一連の複雑な通路に沿って胚を通って移動する一
群の前駆体細胞である。移動後、稜細胞は、知覚及び自
律神経神経節のニューロン及びシュワン細胞、腸神経質
系、副腎髄質、皮膚及び面間葉のメラノサイトを含む、
多くの変化の細胞型を起こす。個体群レベルで研究した
とき稜は幹細胞の多能性収集であるように見える。ウズ
ラ神経堤がニワトリ胚に移植されたドウアリン及び共同
研究者の広大な移植実験は、稜細胞の発育運がニワトリ
胚でのこの移植の位置により測定されることを示した。
これは、稜の完全発生レパートリーが移植された稜細胞
の異なるサブポピュレーションに含まれることだけでな
く、環境因子が細胞の最終分化表現型で大きな役割を演
じることを示した。

最後の10年で、神経堤は特に発育した通路に既に送ら
れる細胞のサブポピュレーションを含むことがますます
明らかになった（2,3）。しかしながら、これらの細胞
の分化が環境因子により測定されることも明らかであ
る。

多くの可溶性栄養因子はニューロンを誘導する神経堤
の生存剤として作用することを示したが、それらは、神
経堤内のニューロン前駆体細胞に直接作用することを示
さなかった。これらの因子は、神経生長因子（NGF:4）
脳誘導向神経因子（BDNF:5）、毛様体向神経因子（CNT
F:6）及び腺維芽細胞生長因子（FGF′S:5参照）を含
む。

本発明まで導く研究で、実験は、神経堤の前駆体群へ
の直接効果を有する剤を設けるよう実施された。本発明
により驚くべきことに神経堤細胞はLIFの存在で完全に
成熟したニューロンに分化することが発見された。この
効果は滴定可能であり、ニューロンの前駆体細胞の増殖
の欠如で起きる。さらに神経堤細胞のニューロンへの分
化のLIFの効果は胚の背の根神経節の前駆体細胞の成熟
知覚ニューロンへの分化の刺激に拡がる。

従って、本発明の一つの局面は、神経前駆体細胞のニ
ューロンへの分化及び／又は維持及び／又は再生を可能
にするに十分な時間及び条件下、有効量の白血病阻止因
子（LIF）を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物に
おけるニューロン増殖及び／又は維持及び／又は再生を
調節する方法を意図する。

本発明の他の局面は、中枢神経系においてニューロン
の数を増加させ及び／又は維持するに十分な時間及び条
件下に有効量のLIFを哺乳動物に投与することを含む哺
乳動物の中枢神経系におけるニューロンを増加し及び／
又は刺激し及び／又は維持し及び／又は形成を再生し及
び／又は生存する方法に関する。

一実施態様では、LIFは未成熟ニューロンを増加し、
刺激し維持し（即ち生存を促進する）及び／又は再生す
る。

本発明のさらに他の局面は、末梢神経系におけるニュ
ーロンの数を増加し及び／又は維持するに十分な時間及
び条件下に有効量のLIFを哺乳動物に投与することを含
む哺乳動物の末梢神経系の知覚ニューロン、例えば知覚
ニューオルンを増加し、刺激し及び／又は形成を維持し
及び／又は生存させる方法に関する。ここに用いられる
「LIF」は、LIFに関連していて全ての分子、例えば炭水
化物，リピド及び／又はペプチド残基への単一又は多重
置換、除去及び／又は付加を含む天然に起きるアミノ酸
配列又は全ての単一又は多重アミノ酸置換、除去及び／
又は付加を含む天然に生じた、組換え体及び合成のLIF
を含むことを意味する。従って、ここに用いられる用語
「LIF」は、LIFの変異体、誘導体、同族体及び類似体を
含む。天然に生じたLIF及びLIF様ポリペプチドを意図す
る。しかしながら用いられたLIF分子に関係なく、要求
されることは、それが哺乳動物において、ニューロン増
殖及び／又は維持及び／又は再生を援助できることであ
る。好ましい実施態様では哺乳動物はヒトでありLIFは
ヒト起源又は異なる哺乳動物からであるが、またヒトに
活性を有するものである。従って、LIFの起源及び処理
されるべき哺乳動物は同族、即ち、同一哺乳動物であり
うるか異型の即ち異なる哺乳動物からでありうる。ある
場合には処理されるべき哺乳動物は本発明の方法におい
て用いるためLIFを分離するのに用いられうる。

ここに用いられる「ニューロン増殖、維持及び再生を
調節するこ」とにより、哺乳動物の中枢及び末梢神経系
におけるニューロンを刺激し、増加し、及び／又は形成
を維持し及び／又は生存を含むことを意味する。それは
又は、疾病又は損傷により起こる障害に続く、ニューロ
ン作用に関連する性質の再生を援助する該因子の能力を
含む。それは又、ニューロン、例えば、しかしこれに限
定されない、神経伝達物質型、レセプター型及びこの表
現型と関連する他の特徴と関連するこれらの性質を刺激
し、増加し、維持し及び／又は再生することを含む。特
にLIFは、神経堤細胞の完全成熟ニューロンへの分化を
含み、刺激し、増加し、維持し及び／又は再生すること
をここに示した。この効果は、滴定可能であり、ニュー
ロン前駆体細胞の増殖に欠けるときに起きる。LIFの効
果は又は、胚の背の神経節（DRG）における前駆体細胞
の成熟知覚ニューロンへの分化の刺激に拡がる。末梢神
経系の知覚ニューロンは胚神経堤における前駆体細胞か
ら誘導される。稜移動後、これらの前駆体細胞はDRGへ
と集まり、次いで成熟知覚ニューロンに分化する。知覚
ニューロンの生存は、増殖の間重要な段階で二つの特徴
づけられた生長因子、神経生長因子（NGF）及び脳誘導
向神経因子（BDNF）及び他の明らかにされていない因子
に依存することが示された。しかしながら、知覚前駆体
細胞の分化を刺激する因子の同一性については全く知ら
れていない。従って、本発明により驚くべきことにLIF
が胚のDRGにおける前駆体細胞の成熟知覚ニューロンへ
の分化を刺激したこと、並びにLIFが胚形成の間じゅう
及び生後の生命にこれらのニューロンに生存因子として
作用したことが見出された。

LIFは又、中枢神経系に影響を及ぼす。神経管の胚前
駆体細胞からの中枢神経系の増殖での早い段階は、前駆
体集団の拡大及びこれらの細胞の成熟ニューロン及び神
経膠への分化を含む。この相は正しい標的を適切に刺激
したニューロンの選択的生存に続き、そして、標的細胞
により生成される生存因子の限られた有用性に基づくと
信じられてる。

最近、腺維芽細胞生長因子が胚脳の増殖の拡大及び分
化相に含まれることが示され（９）、加えて、又、FGF
が成熟ニューロンに生存剤として作用できることが示さ
れた。バード（５）からの業績はCNSニューロンのサブ
セットの生存、網膜神経節細胞がBDNFに依存することを
示した。しかしながら、胚脳及び脊髄の増殖に作用する
他の因子についてはほとんど知られていない。

従って、LIFは脊髄ニューロンに分化／生存及び／又
は再生剤として作用し、脊髄増殖を増加し、刺激し、及
び／又は促進し、そして神経拡大を促進することが驚く
べきことに見出された。

この方法は脊髄増殖を調節し、疾病、損傷及び／又
は、神経系に対する異常を処理するのに適用できる。例
えば本発明の方法は、中枢及び／又は末梢神経系に関連
して用いることができ、脳性麻痺、麻痺に誘発される損
傷、発作に関連する血管虚血、ニューロン腫瘍、運動ニ
ューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツ
ハイマー病、多重硬化、糖尿病、重金属又はアルコール
毒性に関連する末梢ニューロパシー、腎不全及び又は感
染病例えばヘルペス、風疹、麻疹、水痘:HIV及び／又は
HTLV−１の１又はそれ以上を処置する。

本発明の他の局面は、脊髄増殖及び脊髄ニューロン数
を増強し、刺激し、維持し及び／又は再生する方法に係
り、それは脊髄ニューロン数及び脊髄増殖を増加するに
十分な時間及び条件下で有効量のLIFを該哺乳動物に投
与することを含む。

さらに他の局面は、脊髄及び他の中枢神経系ニューロ
ンからの神経伸張を増強し、刺激し、維持し及び／又は
再生する方法に係り、さらに脊髄以外の中枢神経系に係
る。

本発明のさらに他の局面は、哺乳動物における中枢及
び末梢神経系における疾病及び損傷の処理方法を意図
し、該疾病及び損傷は、脳性麻痺、麻痺に誘発される損
傷、発生に関連する血管虚血、ニューロン腫瘍、運動ニ
ューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツ
ハイマー病、糖尿病、重金属又はアルコール毒性に関連
する多重硬化及び末梢ニューロパシー、腎不全及び又は
感染病例えばヘルペス、風疹、麻疹、水痘:HIV及び／又
はHTLV−１の１又はそれ以上を含むが、これに限られ
ず、それは該哺乳動物に有効量のLIFを疾病又は損傷を
良くするのに十分な時間及び条件下に投与することを含
む。

本発明の全てのこのような方法において、ニューロン
の増強、刺激、維持及び／又は再生は、「ニューロン増
殖を調節すること」として引用される。さらに、用語
「LIF」の使用は上述したようなLIF様ポリペプチド及び
その誘導体を含む。

本発明により使用されるLIFの有効量は、ニューロン
の調節に必要とされるものであり、一般に体重キログラ
ム（kg）当り約0.01から約10,000マイクログラム（μ
ｇ）で、好ましくは0.1ないし10,000μg/kgでもっとも
好ましくは、１ないし100μg/kg体量である。しかしな
がら、処理される疾病、処置及び患者のような因子に依
存し、多かれ少なかれLIFが使用されうるが、本発明の
範囲内にある。さらに単位/ml又は単位/kgでLIFの有効
量を測定するのが便利である。LIF活性の単位の定義はP
CT/AU88/00093に見ることができる。例えば、LIFを限定
するのではなく、10から108μ/ml用いうる。投与は時間
当り、１日当り、週当り、又は月当りであり得、又は単
一投与でありうる。投与は又は、連続注入であることが
必要でありうる。

本発明に従って、LIFは単独で或いは１又はそれ以上
の他のニューロン刺激因子、例えば、これらに限定され
ないがFGF、CNTF及び／又はBDNF及び／又は他の向神経
因子と組合せて投与しうる。「組合せ」LIF及び／又は
それ以上の他の因子の同一組成物での同時添加或いはLI
F及び１又はそれ以上の他の因子の、第１因子を与え、
次いで第２因子を与える、連続的添加を意味する。添加
の間の付加及び時間の正確な順位は、実施する医師によ
り最善に決定され、患者及び／又は必要とされる処置に
依存しうる。

従って、１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子は
LIFと同時又は連続投与により与えうる。他のニューロ
ン刺激因子の有効量は、約0.01ないし約10,000μg/kg体
量、好ましくは0.1ないし10,000μg/kgそして最も好ま
しくは１ないし1,000μg/kg体量であろう。再び投与
は、時間当り、日当り、週当り、又は月当り単一用量又
は繰り返しうる。投与は又、連続的注入でありうる。

投与の経路は好ましくは筋肉内又は静脈内注射又は遺
伝子療法を用いることによるが、他の投与経路、例えば
注入、点滴、脳内注射及び／又はインプラントが可能で
ある。

本発明の他の局面は、LIFの標的組織又は実施例５に
要約されるように逆移送による取込みを促進するように
神経の正確な位置への投与に関する。

本発明は又、LIF及び１又はそれ以上のニューロン刺
激因子及び１又はそれ以上の製薬上許容しうる担体及び
／又は希釈剤を含む医薬組成物に向けられる。このよう
な組成物は、哺乳動物におけるニューロン増殖及び／又
は維持を調節する。例えば末梢神経系におけるニューロ
ンの形成及び生存を増強し、刺激し、維持し及び／又は
調節する。及び／又は、中枢神経系における知覚ニュー
ロンの形成及び生存を増強し、刺激し、維持し及び／又
は調節する。及び／又は脊髄ニューロン及び／又は脊髄
増殖の形成及び生存を増強し、刺激し、及び／又は維持
するのに有用である。

好ましくは組成物はヒトへの投与に適当である。本発
明により組成物中に用いられるLIFは既に明細書中で定
義されたものであり、例えばLIF様ポリペプチド及びLIF
の変異体、誘導体、同族体及び／又は類似体を含む。LI
F及び他のニューロン刺激分子及び／又は向神経因子は
それらの哺乳動物根源に関して同一又は異なり、それら
は自然発生、組換え体又は合成である。その方法でLIF
及び他のニューロン刺激因子の哺乳動物起源は処理され
ている哺乳動物に対し同種又は異種でありうる。本発明
の組成物は又、既に記載したように疾病、障害及び／又
は神経系の異常の処置い有用である。

医薬組成物は、この分野でよく知られ、引用は好都合
にレミントンズ・ファーマシューティクル・サイエンシ
ズ16版、1980、マック・パプリッシング・コンパニィ・
オソル等による編集になすことができる。

本発明の他の局面は、末梢神経系におけるニューロン
の形成及び／又は生存を増加し、刺激し、維持し及び／
又は再生するための及び／又は中枢神経系におけるニュ
ーロンの形成及び／又は生存を増加し、刺激し、維持し
及び／又は再生するための、及び／又は哺乳動物の脊髄
ニューロン及び／又は脊髄増殖の形成及び／又は生存を
増加し、刺激し、維持し、及び／又は再生するための医
薬を製造するためのその誘導体を含むLIFの使用に向け
られる。好ましくは哺乳動物はヒトであり、用いられる
LIFは前に定義された通りである。本発明による使用は
１又はそれ以上の他のニューロン刺激因子、例えばFG
F、CNTF及び／又はBNDFの使用を含む。

本発明は以下の非限定図面及び実施例を引用すること
によりさらに説明する。図において、図１は、神経堤培養におけるニューロン数へのLIFの
効果を示す。神経堤細胞を培地のみで、又はLIFの存在
下で６日間インキュベートし、ニスル染色（８）、ニュ
ーロンを５明分野顕微鏡を用いて数えた。「一管」実験
で、神経管は24時間後、除きLIFを培養物に加えた。ニ
ューロン数は、LIF培養でのニューロンの密集群のた
め、おそくなると正確に数を数することが出来なかっ
た。数は平均及び標準偏差であるｎ＝６、ｐ＜0.005、
ｐ＜0.05、ｔ−テスト図２は神経堤培養でのニューロンの表現型を示す写真
表現である。神経堤培養は13日間、LIFの存在下（b.a.
e.f.g）又は不存在（a.c）でインキュベートした。示さ
れる顕微鏡写真は、a.b.ニスル染色（８）培養の明分野
見解、c.d.神経細糸を染色した培地の蛍光見解、e.CGRP
を染色したLIF処理培養の明分野見解、f.チロシンヒド
ロキシラーゼを染色したLIF処理培養の明分野見解、g.
（ｆ）におけると同一分野の蛍光見解、バー＝200μｍ
（a.b）、50μｍ（c.d.e.f.g）。である。

図３は神経堤培養への³H−チミジン取込みを示す写真
表現である。³H−チミジン（0.03μc/ml）及びLIF（10³
u/ml）を培養の４日後に加えインキュベーションを続く
９日間続け、次いで培養物は神経細糸を染色し、オート
ラジオグラフにかけた（９）。a.培養の明分野顕微鏡写
真、b.同一分野の蛍光見解、バー＝50μｍ、図４は以下を示すグラフ表現を含む。A.E12−P2 DRG
の培養におけるニューロン数に対するLIFの効果、DRG細
胞はモノムド培地、10％FBS（コントロール、黒バー）
又は＋LIF（線影バー）にプレートし、実施例１に記載
したようにニューロン数を５日CE（２）又は２日（他の
培養）後測定した。ニューロン及び最初にプレートした
細胞の数は実施例１に与えられる。B.P2DRG培養におけ
るニューロン生存の限界希釈分析、細胞（70％ニューロ
ン、その75％、２時間後プレート）を10²u/mlLIFの存在
（ダイアモンド）又は不存在（四角）に指示数（120ウ
ェル／希釈）でプレートし、生のニューロンを有するウ
ェルを２日後数えた。直線関係が入力細胞数を％ネガテ
ィブウェルの対数の間に存在し（Ｒ＝0.992）、ニュー
ロン生存に対するLIFの効果は、ゼロオーダー（シング
ルビット）運動性（11）に従うことを示す。C.P2DRG培
養におけるLIF濃度に対するニューロンの用量反応関
係、P2DRG細胞（200/ウェル）はLIFの示された濃度でプ
レートし、ニューロンは２日後数えた。平均及び標準偏
差はAB及びＣに示すｎ＝６。

図５は、D7インビトロで24ウェルプレートにLIFの存
在下培養したE10脊髄の体外移植組織の顕微鏡写真を示
す写真表現であり、方法成長を表示するａ）LIFないしのｂ）LIFとの培養を示す（バー＝100
μｍ）図6a,bはLIF刺激脊髄細胞から起きる培養の形態を示
す写真表現である。懸濁液中の細胞は実施例１に記載し
たようにプレートし、96ウェルプレートに５日間インキ
ュベートした。ａ）LIFなしｂ）LIF（バー＝100μ
ｍ）とインキュベートした細胞の相対比写真を示す。

図6c,dは神経細糸抗体を染色した脊髄前駆体の培養を
示す写真表現である。細胞は実施例に記載したようにプ
レートし、固定及び染色前にHL−Ａプレートに５日間イ
ンキュベートした。ｃ）LIFなしでｄ）LIF（バー＝100
μｍ）とインキュベートした細胞の蛍光顕微鏡写真を示
す。

図７は方法成長へのLIFの効果を示す写真表現であ
る。E10脊髄前駆体（５×10⁴）は、材料及び方法に記載
したように、96ウェルプレート中５日間LIF（10⁴u/ml）
の存在又は不存在でプレートした。集るため各不連続凝
集の細胞から生じる突起の数を定量した。与えられた数
の突起を有する凝集の頻度を測定した。方法の各５増加
に対する頻度／凝集（例えば０−４、５−９）を集めて
ウェル当りの凝集の総数のａ％として表わした。これら
の頻度はLIF処理及びコントロール培養とし６ウェルの
平均で、平均及び標準偏差をグラフに表わした。

図８は脊髄神経節から知覚ニューロンへの¹²⁵I−LIF
の結合を示すグラフ表現である。結合（黒ぬりバー）
は、Ｂに示すようにニューロンにほとんど独占的に限定
され、補助細胞（Ａ）にされない。事実上全ての結合は
冷LIF（ハッチングしたバー）により阻害され、結合は
特異的であることを示す。

図９は成熟マウスの坐骨神経による¹²⁵I−LIFの逆輸
送を示すグラフ表現である。有意な蓄積が、注射をルー
トパッドにしたときL3、L4、L5脊髄神経節に見られる
（黒ぬりバー）。

図10は新生マウスにおける知覚神経節に対する¹²⁵I−
LIFの逆輸送を示すグラフ表現である。これは足及び筋
肉注射に起きるけれども標識の有意な蓄積はL4上に再び
集った。注射を筋肉内にしたときくちばし状知覚神経節
によりいくらかの取り込みがある。

図11は小さな一群のニューロン（ａ）×400を越えて
銀粒子の蓄積を示すL4脊髄神経節を通ってセクションの
オートラジオグラフを示す写真表現である。シュワン細
胞（補助細胞）（ｂ）×1000でなくニューロン標識だけ
であることに注意、ヘマトキシリン及びエオシンで染色
されたセクション。

図12は¹²⁵I−LIFの逆標識後L4脊髄神経節のセクショ
ンでの粒子計数の分布を示す写真表現である。小さな割
合（５−10％）だけが有意に標識することに注意。

図13は、超過時間LIFと共に及びなしにインビトロで
延命する脊髄細胞を示すグラフ表現である。

実施例１材料及び方法神経堤細胞の調製胚９日（E9）でCBAマウス胎児を子宮から取り１％（v
/v）ウシ胎児血清（FBS）を含むヘペス緩衝イーグルス
メディウム（HEM）を含むペトリ皿に置く。頭及び尾
を、神経質の各側８−12体節で体幹切片を除く、解剖顕
微鏡の助けをかりてゲージシリンジ針を用いて除去し
た。これらの体幹切片を新しいペトリ皿中、HEM1％（v/
v）FBS中に置き体節及び回りの組織を26ゲージ針を用い
神経管から注意して除いた。次いで１又は２つの管を、
予めヒブロネクチン（５μg/ml）で覆った24ウェルプレ
ート（リンブロ）の各ウェルに置いた。次いで10％（v/
v）FBSを伴うデゥルベコの修飾イーグルメディウム（DM
E）を各ウェルの側に注意深く流し落とし、ウェルの底
をほとんど覆う。これは神経管をフィブリネクチン基質
及び粘着を関連づけることを可能にした。特別の実験
で、管を24時間後注意して除去し、移動性神経堤細胞を
除いた。他の実験では、いずれの結合堤細胞も妨害しな
いように管をウェルに残した。10％（v/v）FBS及び特定
された成長因子を含むモノムドメディウム（コモンウエ
ルス・セルム・ラボラトリーズ，パークヴィル、ヴィク
トリア、オーストラリア）24時間後全培養物に1mlまで
加えた、培養物を５％CO₂/95％空気中37℃でインキュベ
ートした。

脊髄神経節（DRG）の除去２日令新生児マウスを無菌条件下首を切り落とし、無
菌ペトリ皿に置いた。体幹を蒸留水中70％（v/v）エタ
ノールの溶液で洗った。皮膚を通る垂直切り口を無菌の
45°角刃のはさみを用い作った。用いた金器具は、使用
前１時間、蒸留水中70％（v/v）エタノールの溶液を浸
けた。

細かい虹彩ばさみを用い、曲った時計職人鉗子を用い
脊髄帯の除去を可能にする脊髄柱の背局面を通って切口
を作った。これは脊髄神経節をさらし、それらの除去を
促進した。無菌ガーゼ片を用い、神経節の回りをスワブ
して神経節の観察を不明瞭にする血液及び組織液を吸収
した。次いで真っすぐな非常に細かい先端ついた鉗子を
用い、各神経節を注意して除き、脊髄組織の回りをきれ
いにし、ペトリ皿中、少容量のＮ−２ヒドロキシピペラ
ジン−Ｎ−20エタンスルホン酸（HEPES）及び緩衝化イ
ーグル最小必須培地（HEM）中に置いた。約20の神経節
を各マウスから除いた。

DRG培養回りの脊髄組織を除いて切断され、そしてHEM中に置
かれたDRGは次いでHEM、0.25％（w/v）トリプシン、0.0
01％（w/v）Ｄナーゼ中37℃で（E12については12分、E1
5については20分、そしてE19及びP2については30分）イ
ンキュベートした。FBSを20％（v/v）まで加え、細胞を
300gで５分間遠心し、HEM、0.01（w/v）Ｄナーゼ中２回
洗浄し、18−25ゲージ針を通して粉砕し、単一細胞懸濁
液を得る。DRG細胞をHL−Ａプレート（ナンクII）のフ
ィブロネクチン被覆（15μg/ml）ウェルに予め最適化し
た細胞数（E12で3500細胞、E15で1000そしてE19及びP2
で200）置いた。プレート後２時間、成熟ニューロンはE
12培養に見られず、110,120及び100ニューロンの平均は
それぞれE15、E19及びP2培養に存在した。E12からの培
養物を５日後固定し、神経細糸を染色し、神経細糸を蛍
光顕微鏡法を用いて数えた。後の胎児培養（大きい、相
輝き、円い細胞）を２日数えた。

免疫組織化学特別の抗体で染色するため、神経節を24ウェルプレー
ト中ガラスカバースリップ又はプラスチック顕微鏡スラ
イド（ナンＣ、２ヤンバースライド）上に置いた。神経
細糸に対する抗体で染色するため細胞をまずメタノール
中−20℃で固定し、PBS中３回洗浄し、HEM、１％（v/
v）FBS中1:10に希釈した抗神経細糸抗体（ケミコン）と
30分間インキュベートした。ウェルを次いで洗浄し、PB
S1％（v/v）FBS中に1:50に希釈した蛍光イソチオシアナ
ート接合FITCヒツジ抗ラット接体（シレナス）とインキ
ュベートし、PBS次いで水中で洗浄し、空気乾燥し、カ
バースリップはPBS/グリセロール（1:9）メルク、オー
スト、中、2.6％1.4ジアゾビシクロ（2.2.2）オクタン
中増加した・カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）
を染色するため、培養物をパラホルムアルデヒド（PF
A）中に固定し、DMSOで清浄にしPBS中で洗浄し、ウサギ
抗ラットα−CGRP抗体（ジー．オレイ博士、モナシュ・
ユニバーシティ、オースト．）から得られ、放射イムノ
アッセーによりＢ−CGRPに９％結合、カルシトニンに＜
0.01％結合、及びサイスタンスＰ、ノイロキニンＡ又は
エンケファリンに無視しうる結合を示す）とインキュベ
ートし、洗浄し、抗体結合はビオチン結合第二抗体、ビ
オチン−アビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ錯体
（ヴェクタステインABC）及びジアミノベンジジンとの
増殖を用い検出した。チロシンヒドロキシラーゼ又はコ
リンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）を染色するた
め、培養物をPFA（及びChATについてピラリン酸）中に
固定しウサギ抗チロシンヒドロキシダーゼ抗体（ユーゲ
ン・テク、USA）又はブタChAT（PNS中ChATを認識する
（12））に対して調製されたラット抗血清とそれぞれイ
ンキュベートし、結合はフルオレセインした第二抗体で
検出した。

チミジン取込み実験増殖している神経堤細胞を探すために、³H−チミジン
（アマーシャム，特異活性103Ci/mモル）を培養物に0.1
又は0.03μCi/ml加え、同時に成長因子として、又は相
当時間にコントロール培養物を加えた。13日後、幾つか
の培養物をメタノール中固定し、上述したように神経細
糸について染色、次いでコダックNT−B2乳化液中に漬
け、２週間４℃でさらし、次いで発達させた。

脊髄細胞の分離胎児は胚日10（E10）マウスから得た。頭を除去し、E
10により閉鎖管を形成している。神経管の後端部分又は
胚脊髄を胎児の残りから囲んでいる体節とともに除去し
た。全実験に用いた髄のセクションは、耳小水泡から発
達している後肢のちょうど下に伸ばした。この組織はデ
ィスパースII（ベーリンガー）中、HEPES−緩衝化イー
グルメディウム（HEM）中15分間４℃でそして６分間37
℃でインキュベートした。次いで組織を1.0（w/v）胎児
ウシ血清（FBS）及び0.001％（w/v）Ｄナーゼを含むHEM
に移し、脊髄は、神経管の中脳及び終脳部分の調製に既
に記載したように本質的にジスパーズインキュベーショ
ンにより作られた組織プレートを用い、囲んでいる外胚
葉、体節及び髄膜のないよう切断した（９）。この段階
での検査は中枢葉の汚染のないきれいな脊髄を明らかに
した。これらの髄は移植片培養用に24ウェルプレート
（リンブロ）に直接プレートした。分離細胞懸濁液の調
製のために脊髄は次いで37℃で0.02％（w/v）EDTA、10m
Mヘペス、0.025％（w/v）トリプシン及び0.001％（w/
v）Ｄナーゼを有するハンク′ス中、pH7.6で12分間イン
キュベートした。反応をFBSの添加により停止し、細胞
をCa²＋Mg²＋フリーハンク′ス中で洗浄し、懸濁液をゆ
るやかに粉砕することにより単一細胞を調製した。1.5
×10⁵細胞の平均を各胎児の解剖から得た。

分離された脊髄細胞の一次培養脊髄細胞（５×10⁴）をモノメドメディウム中フィブ
ロネクチン（50μg/ml）及び最終容量10μｌ中0.05％FB
Sで被覆した96ウェルプレート（リンブロ）中にプレー
トした。特に説明しない限り、LIF（ネズミ組換え体、
特異活性＋10⁴u/mg）を10⁴単位/mlの濃度に用いた。ア
ッセーを５日にわたり通常実施し、その後、培養が退歩
しはじめた。細胞計数は、細胞をトリプシンで集めそれ
らを細砕したのち実施した。成長方法は５日間に細胞の
各分離凝集から出てくる方法の数を数えることにより定
量した。全ての場合の数は、６決定の平均及び標準偏差
である。細胞は又、合流物上にプレートし、24ウェルプ
レート中オノムドメディウム及び0.05％（v/v）FBS中、
５×10³細胞／ウェルの密度でガラス顕微鏡スライド上B
alb/c−3T3細胞の単層を放射線照射（4000ラド）した。
特定された時間期にカバーグラスを固定し以下に記載す
るように神経細糸を染色し、スライド当りの陽性に染色
された細胞の数を定量した。

LIF及びFGFの放射性ヨー素同位体物の精製組換えLIFはグリコシン化蛋白としてイー・コリ中に
生成した。精製された種は20,000の明白な分子量と9.0
より大の等電点を有して電気泳動した。LIFのヨード化
は既に記載された（18）ようにヨードモノクロリド法に
より実施した。要するに40％（v/v）アセトニトリル0.1
％（v/v）トリフルオロ酢酸及び0.02％（v/v）ツイーン
20中LIFの1mg/ml溶液の６μｌを1mCi Na¹²⁵I（ニュー・
イングランド・ヌクレアー・ノース・ライド.NSW,オー
ストラリア）、40μｌの200mMリン酸ナトリウム、0.02
％（v/v）ツイーン20のpH7.4（PBS）の添加及び2MNaCl
中200μｌの５μｌ渦混合によりヨード化した。室温で
１分後、放射ヨード化LIF（¹²⁵I−LIF）を連続的ゲル濾
過及びカチオン交換クロマトグラフィにより未取込み
¹²⁵Iから分離した。十分に生物活性を保つこの方法で生
成した¹²⁵I−LIFは冷却20％（v/v）トリクロロ酢酸で99
％沈澱し、放射活性の90％以上がM1細胞に特異的に結合
する（17）。特異的放射活性は自己置換分析法により測
定されたように1.1×10⁶CPm/モルであった。I¹²⁵標識aF
GFはRCC（アマーシャム）からただで得た。aFGFの特異
的活性は800Ci/mMであった。

結合実験及びオートラジオグラフィー脊髄神経節細胞は出生後２日のマウスから上記したよ
うに得、８ウェル顕微鏡スライド（ナンク）中、10％
（v/v）FCSを含むが成長因子を加えないモノムドメディ
ウム中、給湿インキュベーターで39℃一夜培養した。ス
ライドを、２時間氷上で、10％（v/v）FCS、10μg/mlの
未標識LIF20μｌを加えまたは加えず、そして、20μｌ
のDME中¹²⁵I−LIFの５×10⁴cpm、10％（v/v）FCSを加え
たヘペス緩衝化ROM1−1640メディウムの200μｌ中イン
キュベートした。細胞を３回300μｌのPBSで洗い、PBS
中10％（v/v）ホルマリンで２時間固定し、次いで水で
すすいだ。スライドを暗室中、42℃でコダックNTB2写真
乳化液に漬け、乾燥した。次いでスライドをドリーライ
トを含む光を通さない箱内にシールし、２−８週間４℃
でさらした。現像前にスライドを室温まで暖めて３分間
コダック１）19現像液（40g/500mlの水）に現像させ、
１分間水中0.5％（v/v）酢酸で洗い、３分間アグファG3
33cX−線定着剤に定着させた。ミトスピン製剤を伴うス
ライドを水中５％（v/v）フィルターギームサ中で10分
間染色し、乾燥してデペックスに取りつけた。デペック
ス（BDH、メルボルン、オーストラリア）。

オートラジオグラフ×400、×650、又は×1000倍率で
試験し、必要な粒子計数を各型の100連続細胞で実施
し、バックグラウンド計数、一般に0.3粒子の間を引い
た。

反対の標識実験新生及び成熟Balb/Cマウスの坐骨神経を６−０プロレ
ンモノフィラメント（エチコン）を用い一方に結んだ。
放射活性蛋白を足の皮膚に又は胃筋肉の中央に筋肉内に
注射した。適当な時間ののち、動物をエーテル過用量に
より殺し、坐骨神経を取った。神経を結紮でカットし、
2mm片を直ちにカットしたものの基部及び端部で取り、
直接数えた。

新生及び成熟マウスを足蹠に注射し16時間保った。T1
3からS1の神経節を切断（disecting）顕微鏡の下に除去
し、放射活性をガンマカウンター中全神経節で評価し
た。選択神経節又は神経節に付着した脊髄を動物から切
断し、乳化液に埋め込む前にPBS中４％パラホルムアル
デヒドに固定した。オートラジオグラフを３−４週間後
現像し神経節及び脊髄を標識細胞につき試験した。

実施例２神経堤細胞及び知覚ニューロンへのLIFの効果神経堤細胞へのLIFの効果を試験するため、試験管をE
9CBAマウスの頸及び胸部分から切断しフィブロネクチン
被覆ウェルにプレートし、神経堤細胞24時間原質上に移
動し、その時間で神経管を除くがそこに残すかし、LIF
を培養液に加えた。２日後、知覚ニューロンに似ている
単極又は二極の突起を有する丸い細胞が培養液に現れ
た。LIF処理培養液に、６日でコントールよりも約12倍
のこれらの細胞が存在し（図１）、それらは14日まで増
加する大きな固りを形成した（図26）。これは、それら
の不存在でニューロン様細胞の絶対数は少なかったが、
培養期の間神経管の存在に依存しなかった（図１）。こ
れらのニューロン様細胞はニスル染色（８）で陽性に染
り（図2a及びｂ）150KD神経細糸（13）を染めた（図2c
及びｄ）。この染色は固りから発生する細い突起を示し
（図2d）それらのニューロン表現型を確認する。LIFの
効果は、日１に加えたとき最大であったが、日７に加え
ときもまた現れた。

これらの培養液に発生したニューロンの表現型と特徴
づけるため、それらは、知覚及び自覚ニューロンに見ら
れるマーカーの発現を染色した。LIF処理及びコントロ
ール培養液中の全てのニューロンはCGRPへの免疫反応性
を含み（図2e）。最も広く発現したペプチドが哺乳動物
の知覚ニューロン中に見られた（14,15）。限られた開
発的研究は、このペプチドが少くともニワトリできわめ
て容易に発現することを示唆する（18）。サブスタンス
Ｐ、ペプチドへの免疫反応性は、又哺乳動物知覚ニュー
ロンに見られた（14,15）が、出生後に有意レベルで、L
IF処理及びコントロール培養液中、小割合の突起中にも
検出された。これらのニューロン（LIF処理及びコント
ロール共）の小割合（１−２％）が、チロシンヒドロキ
シラーゼ活性、カテコールアミン性細胞へのマーカーを
有した（図2f）。しかしながら細胞はChATへの免疫活
性、コリン性細胞へのマーカーを示さなかった。

これらの免疫組織化学的発見及びニューロンの形態学
は、ニューロンが知覚系統であることを示唆する。鳥類
でその前の仕事は少くとも知覚ニューロンの一部は神経
堤の非分裂プレカーサーから起きることを示した（１−
２）。LIF処理培養液中のニューロンも非分裂プレカー
サーから起きることを研究するため、³H−チミジンを付
随的にLIFを含む培養液に培養の1,4及び７日に添加し
た。13日のオートラジオグラフ分析は、LIF培養液中に
起きた0.2％以下のニューロン（数えた1100ニューロン
中２）の時間の付加に関係なく³H−チミジン（図３）を
取込んだことを示した。これらの観察は、ニューロン数
の増加はプレカーサー分割の刺激の結果として起きない
ことを示す。これらの培養液中の非ニューロン細胞は³H
−チミジンで標識した（図３）が、LIFの存在は標識細
胞の全割合に対し有意差を示さなかった。LIFを１日目
に加えた場合、細胞の80＋／−18％がコントロール培養
の78＋／−12％に比べて標識され、一方、７日目では、
全細胞の70＋／−１％及び70＋／−６％がLIFの存在及
び不存在でそれぞれ標識された（ｎ＝３）。

LIFが神経堤培養液中知覚様ニューロンの増加を促進
するので、初期胚DRG培養液に同様の活性を有すること
が予期された。即ち単一細胞懸濁液をE12DRGから作り、
そしてこれは、小さな多分未成熟ニューロンのサブポピ
ュレーション及びニューロンプレカーサー（18）を含
み、LIFの存在又は不存在で、HL−Ａプレートのウェル
にプレートした。３日後ニューロン様細胞の固りがLIF
処理培養液に現れはじめたがコントロール培養には現れ
なかった。５日後、培養液は神経細糸を染色し、ニュー
ロンを数え（図4A）、LIF処理培養液中ではコントロー
ルよりも約10倍ものニューロンが存在することを示し
た。ニューロンは神経成長因子（NGF）で処理した培養
液中にも存在したが、５日後LIF処理培養液中に見られ
るものの約10％であった。現像中、後に分離されたDRG
細胞への実験（E15,E19,P2）はLIFの存在で２日後延命
された高割合（80−100％）のニューロンを示した。

限られた希釈実験は、生存割合の細胞数により影響さ
れないので、LIFがニューロンの直接作用することを示
す（図4B）。加えてP2DRGへのLIF力価測定は10²u/mlの
最大活性及び他の向神経因子（4.5.6）に見られるもの
に似ている約1.5u/mlで50％活性を示した。

これらの結果は、LIFがインビトロで胚知覚ニューロ
ン発達を通じて作用できることを示す。神経堤培養で、
それはニューロン分化及び／又は知覚プレカーサーの生
存を刺激するよう作用しうる。これと一致して、神経堤
細胞のサブポピュレーションは特に¹²⁵I−LIFに結合す
ることが見出され、それらはLIFレセプターを有するこ
とを示す。他は発達しているDRG細胞の生存及び／又は
分化において向神経因子（BDNF）を得た脳を結びつけ
た。一つの可能性は、インビトロで細胞を誘導する中枢
葉により生成されるLIFはインビボで末梢組織に生成さ
れ得、DRGの発達でBNDFを誘導する中枢神経系と協力し
て作用する。

古いDRG培養へのLIFの作用は、それがNGFのようにイ
ンビトロで知覚ニューロンへの向神経因子であるこをを
示す。LIFは出生後及び胚知覚ニューロンに生存剤とし
て作用する。結果はLIFがニューロンの標的神経支配の
臨界期の間だけでなくその後も作用することを示す。即
ちLIFは、知覚ニューロンの発達を通して盛人期に入っ
てその効果を働かせうる。

実施例３脊髄ニューロンへのLIFの効果 LIFは胚脊髄から突起成長を刺激する。

実施例２でLIFはE9マウス胚から得た神経堤の培養液
における知覚ニューロンの発達を刺激することを示し
た。これらの培養液中、堤細胞は胚脊髄からフィブロネ
クチン原質上に移動し、LIF培養液中の知覚ニューロン
は回っている固りとして脊髄体外移植組織からある距離
で現れる。LIFも、体外移植組織がそれらの明らかな生
存度と突起成長を増加する培養液中に残った脊髄の出現
に影響したことが注目される。これらの実験はE10胚か
ら脊髄体外移植組織で繰り返され、そこでほとんどの脊
髄は索から既に移動したが少しニューロン分化が起き
た。LIFがニューロン又は脊髄中それらのプレカーサー
で作用するかを見るため、血清を我々のアッセーから、
ニューロン分化を必要に影響することなく、おそい神経
膠増殖へ除いた。期待されるようにこれらの培養液では
体外移植組織かせごく少しの細胞移動があったかLIF処
理培養液中依然として大量の突起成長があった（図
５）。突起は体外移植組織から直すぐにあるものは束で
あるものは単一突起として原質へ延びた。限られた割合
の突起の分枝があった。突起成長の刺激は初め３日目に
明らかになり７日目に最大の増加した。

これらの観察はLIFが突起成長及び脊髄ニューロンの
発達に貢献しうることを示す。これをさらに試験するた
め、脊髄細胞の単一細胞懸濁液を作りLIFの存在及び不
存在にプレートし、効果が分離された培養液に観察され
るかを見た。これらの培養液の利点は正確な数の細胞を
異なる大きさの体外移植組織と対照的に各ウェルにプレ
ートでき、かくしてLIFの効果の定量がより容易とな
る。

これらの細胞をかなりの高細胞密度で96ウェル及びHL
Aプレートにプレートすると、それら不連続の固りに集
り、突起がこれの固りから出て、他の固りと橋を形成す
るように見える（図６）。これらの突起が明らかにニュ
ーロン起源であることは培養液の神経細糸を染色するこ
とにより確立された。LIF処理及びコントロール培養液
の全突起は抗神経細糸抗体で陽性に染った（図６）。LI
Fの存在で、はるかに多くのこれらの突起がコントロー
ルよりも存在した（図６）。LIF培養液におけるほとん
ど全ての固りは突起を出し、一方、コントロールのほと
んどの固りは突起を有しなかった。さらに、LIF培養液
において一般に固り当りより多くの突起があった。この
効果は２日目で観察され、５日目でもっとも明らかとな
り、このときまでにコントロール培養液の突起の数は減
少する。この時にLIF処理培養液中の突起の平均数はコ
ントロールの約10倍であった（図７）。

実施例４ LIFは脊髄培養液中のニューロンの数の増加を刺激す
る。

LIFによる突起成長の刺激を説明する一つの可能性
は、それがプレカーサーの生存及び／又は脊髄培養にお
けるニューロンの分化を刺激することである。初めにLI
Fの存在及び不存在で細胞培養液中に存在する細胞の全
数を調整した。細胞計数はインビトロで３及び５日後、
96ウェルプレートから実施した。図３に示すように、LI
Fの存在で全細胞数がわずかに増加した。これらのデー
タは又、LIF又はコントロール培養液で細胞数はわずか
に増加したことを示し少しの増殖が起きたことを示唆し
た。

LIF培養中、数の増加はわずかな生存効果であるか、
又は、培養中、細胞のサブポピュレーションへの影響、
即ちニューロンである。しかしながら、この分析方法は
集団中のニューロンの固定がなされない。ニューロン数
に有意な効果があるかを測定するため、培養系に達する
細胞の全体の集団と対照的に、E10細胞を低密度で放射
線照射されたBalb/c−3T3単層にプレートした。これら
の条件下、培養液は神経細糸を染色し、個々のニューロ
ンを数えた。４日で、LIF処理培養液中、約２倍のニュ
ーロンがあった。10,000脊髄細胞をプレートした培養液
中、LIF処理培養液中1920ニューロンが観察され、これ
に対し、コントロールでは998であった。2500脊髄細胞
をプレートした培養液中では、LIF処理培養液中625ニュ
ーロンが存在し、これに対しコントロールでは343であ
った。培養の７日目で、LIF培養液中、依然としてニュ
ーロンの良好な生存があり、一方ニューロン培養液では
ほとんど全てのニューロンが死亡していた。これらのデ
ータは、LIFが脊髄ニューロンの分化及び生存を刺激す
ることを示唆する。

これらの実験は、LIFが、未分化幹神経管から及び胚
脊髄から突起成長を刺激することを示す。即ち、LIF
は、体の末梢組織を刺激する脊髄ニューロンの分化を刺
激するのに作用するように見える。これをなす三つの大
クラスのニューロンは、脊髄の低運動性ニューロン並び
に神経節交感神経及び副交感神経系鎖である。これらの
クのどれにLIFが影響するかを区別できないので、低運
動性ニューロンがよい候補者であり管から出る突起は厚
く、神経管から長距離延びることが推測できる。低運動
性ニューロンだけが脊髄からインビボでこれをなす。加
えて、LIFは低運動性ニューロン神経支配の天然標的で
ある筋肉中に見出された。粘着性仮説はLIFからこれら
の運動性ニューロンについての標的因子を誘導した筋肉
であることである。それは標的に突起を延ばすようそれ
らを刺激し、次いで筋肉を刺激するニューロンの生存因
子として作用する。

実施例５結合及び逆標識実験実施例２は、LIFが新生脊髄神経節からの知覚ニュー
ロンの大部分の生存を支持することを示す。これは非常
に低い細胞数−単一ニューロンが支持できる一でも明ら
かで、LIFが大分ニューロンに直接作用し、補助細胞を
経てではないことを示す。知覚ニューロンが高親和性LI
Fレセプターを発現することを証明するため、分離知覚
ニューロンへの結合研究をインビトロで実施した。図８
に示すように神経細糸のそれらの発現によりニューロン
として確認された細胞の50％より多くを有意量の¹²⁵I−
LIFと結合し、その全てを冷LIFの添加により阻害した。
さらに、培養液中、¹²⁵I−LIFの、非ニューロン細胞へ
の無視しうる冷阻害可能結合がある。

これらの結果は、成熟知覚ニューロンがLIFの高親和
性レセプターを発現すること及び補助細胞、例えばシュ
ワン細胞はそうでないことを示す。これは、LIFの直接
ニューロン作用を強く立証し、そしてそれは、LIFが非
常に少ない数の知覚ニューロンの生存を支持した限定希
釈研究（実施例２）から予報された。放射、標識された
NGFとの研究は、それがインビボ定常状態で反映するの
かどうか明らかでないが、インビトロでシュワン細胞及
びニューロンがNGFと結合することを示した。LIFと別
に、他の因子ではニューロン成分に限って結合すること
を示さない。

レセプターの観察された分布は、ばく大な数の知覚ニ
ューロンがLIFの存在で生存することを示すインビトロ
生存での結果とよく合う。限られた分布もLIFレセプタ
ーが知覚神経節発達の間ニューロン系統に限られうるこ
とを示唆する。

知覚ニューロンへのインビトロでのLIFレセプターの
存在を実施し、LIFの取込みを仲介するレセプターが知
覚ニューロン体幹へ逆輸送されるかを研究した。神経結
紮を用いる実験は、坐骨神経の軸索とニューロンによる
¹²⁵I−LIFの逆輸送があるかどうかを測定することで実
施した。足または脚への¹²⁵I−LIFの注射後、神経の遠
位体節での放射活性の有意な蓄積があることが判った。
この蓄積の時間経過は、それが逆輸送によること他のメ
カニズムでないことを示唆した。さらに注射後¹²⁵I−FG
Fの遠位蓄積は明らかでなかった。

さらに詳しくどのニューロンがLIFの逆輸送に係るか
実験するため、成熟マウスを再び皮膚又は筋内に注射し
たが今回は坐骨神経無傷であった。足の皮膚に注射した
これらの動物中、16時間後、知覚神経節中の放射活性の
有意な蓄積が腰椎神経節４に集まった（L4、図９）。筋
肉に注射した動物中、放射活性の蓄積はごくわずかしか
なく、これはより吻側であることが明きらかであった
（図９）。FGFは知覚ニューロンを含むニューロンの範
囲を支持することを示したが、腰椎DRG又は脊髄中¹²⁵I
−FGFの蓄積は明らかでなかった。

坐骨神経は成熟マウス中央高部分で結紮し、１μCiの
¹²⁵I−LIFを仔ウシの足蹠に注射した。種々の時間後、
神経を除去し、結紮の各側2mm部分を取り放射活性をガ
ンマカウンターで測定した。

新生マウスでは、足及び脚注射で放射活性の大きな蓄
積があった。再び皮膚注射はL4に集中した（図４）。筋
肉注射からの輸送は、広く拡がり、これらの小動物の注
射部位から大きく拡がって、反映した（図10）。再び両
ケースでL4神経節での放射活性の蓄積は逆輸送と調和し
た時間経路に従った。

足蹠に¹²⁵I−LIFを注射した成熟及び新生動物からのL
4神経節を経る組織部分のオートラジオグラフ実験はニ
ューロンのサブポピュレーションでの放射活性物質の存
在を明らかにした（図11）。有意数の粒子を有するニュ
ーロンの数は集団の５−10％の間であり（図12）、再び
非ニューロン細胞と結合した放射活性は明らかでない
（図11）。

本発明のこの局面に従った大きな発見は、LIFが逆に
様子の類似するNGFに輸送されることである。これは、L
IFレセプターの発現がインビトロ加工品ではなく知覚ニ
ューロンへの向神経分子としてLIFをより重要に含むと
いう考察を再び守らせる。本発明者らの知る限り、これ
だけが/NGFの外に、FGFが網膜神経節細胞に前転して輸
送できる証拠があるが、このような方法で輸送されるの
を示す向神経分子である。NGFのようにLIFは、脊髄に分
子の蓄積の証拠はないので前転して輸送されたようには
見えない。LIFは坐骨神経中の運動性ニューロンにより
輸送されないし交感神経又は副交感神経系に輸送されな
いようにみえる。これは多分、LIFも細胞の表面に直接
結合することによる神経系への生物学的効果を及ぼし、
輸送を解決させたレセプターを受けないことを示す。こ
れは筋肉、血小板、胎児幹細胞及びいくつかの造血細胞
系を含む幾種類もの細胞へのLIFの作用の一次モードの
ようである。

NGFの逆輸送は、その生物作用のあるものに必要であ
るようであるが、そのような証拠はLIFには存在しな
い。発達する知覚ニューロンでの２つの因子の作用の類
似性はこの工程が十分な生物学的信号を周囲から細胞体
幹に伝えるのに必要であることを示唆する。そのような
示唆は、細胞体幹に注射されたNGFはニューロン生存に
関係しなという発見が与えられ非常に短絡的に見える。
これは、レセブター−リガンドコンプレックスが信号送
付に重要であることを示唆する。

この分野の当業者はここに記載された本発明が特に記
載されたもの以外に変更及び修飾を受入れることを認識
するであろう。本発明は、全てのかかる変更及び修飾を
含むことを理解すべきである。本発明は又は、本明細書
に個々に又はまとめて引用され、又は示された段階、特
徴、組成物及び化合物、及び二又はそれ以上の該段階又
は特徴の組合せを含む。

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ン、エッチ．、及びレ・ドーリン、エヌ．エム．エンボ
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】非ヒト哺乳動物において、ニューロン増殖
及び／又は再生及び／又は維持を調節する方法であっ
て、有効量の白血病阻害因子（LIF）を神経プレカーサ
ー細胞のニューロンへの増殖及び／又は該神経プレカー
サーの生存を促進するに十分な時間及び条件で該非ヒト
哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２】非ヒト哺乳動物において、脊髄増殖及び／
又は回復及び／又は維持及び／又は再生を調節する方法
であって、有効量のLIFを、数を増加し、脊髄ニューロ
ン及び／又は神経突起を維持又は再生するに十分な時間
及び条件で該非ヒト哺乳動物に投与することを含む方
法。
【請求項３】非ヒト哺乳動物の神経系に対する疾病及び
／又は傷害を処理する方法であって、該非ヒト哺乳動物
に有効量のLIFを疾病及び／又は傷害を回復するに十分
な時間及び条件で投与することを含む方法。
【請求項４】LIF及び１又はそれ以上の製薬的に許容し
うる担体及び／又は希釈剤を含む、哺乳動物のニューロ
ン増殖及び／又は再生及び／又は維持を調節するための
薬剤。
【請求項５】ニューロンが末梢神経系にある請求項４の
薬剤。
【請求項６】ニューロンが中枢神経系にある請求項４の
薬剤。
【請求項７】投与経路が静脈内又は筋肉内注射又は注入
により、又は遺伝子治療により、又は逆標識による請求
項４の薬剤。
【請求項８】LIFが哺乳動物LIFである請求項４の薬剤。
【請求項９】哺乳動物LIFがマウス、ラット、ヒト又は
家畜類動物LIFである請求項８の薬剤。
【請求項１０】LIFの哺乳動物起源及び処理されるべき
哺乳動物が同一種に属する請求項９の薬剤。
【請求項１１】LIFの有効量が約0.01から約10,000μg/k
g体重である請求項４から10のいずれか一つの薬剤。
【請求項１２】１又はそれ以上の他のニューロン刺激因
子を同時に又は順次に投与することをさらに含む請求項
11の薬剤。
【請求項１３】他のニューロン刺激因子がFGF、CNTF、N
GF及び／又はBNDF及び／又は１又はそれ以上の向神経因
子を含む請求項12の薬剤。
【請求項１４】それぞれの他のニューロン刺激因子が約
0.01から約10,000μg/kg体重の有効量で投与される請求
項13の薬剤。
【請求項１５】ニューロンが知覚ニューロンである請求
項４の薬剤。
【請求項１６】ニューロンが脊髄ニューロンである請求
項４又は６の薬剤。
【請求項１７】ニューロンが末梢神経系にある請求項４
の薬剤。
【請求項１８】LIF及び１又はそれ以上の製薬的に許容
しうる担体及び／又は希釈剤を含む、哺乳類の脊髄増殖
及び／又は回復及び／又は維持及び／又は再生の調節の
ための薬剤。
【請求項１９】投与経路が静脈内又は筋肉注射又は注入
により、又は遺伝子治療により、又は逆標識による請求
項18の薬剤。
【請求項２０】LIFが哺乳動物LIFである請求項19の薬
剤。
【請求項２１】哺乳動物LIFがマウス、ラット、ヒト又
は家畜類動物LIFである請求項18の薬剤。
【請求項２２】LIFの哺乳動物起源及び処理されるべき
哺乳動物が同一種に属する請求項21の薬剤。
【請求項２３】LIFの有効量が約0.01から約10,000μg/k
g体重である請求項18から22のいずれか一つの薬剤。
【請求項２４】１又はそれ以上の他のニューロン刺激因
子を同時に又は順次に投与することをさらに含む請求項
23の薬剤。
【請求項２５】他のニューロン刺激因子がFGF、CNTF、N
GF及び／又はBNDF及び／又は１又はそれ以上の向神経因
子を含む請求項25の薬剤。
【請求項２６】それぞれの他のニューロン刺激因子が約
0.01から約10,000μg/kg体重の有効量で投与される請求
項25の薬剤。
【請求項２７】LIF及び１又はそれ以上の製薬的に許容
しうる担体及び／又は希釈剤を含む、哺乳哺乳動物の神
経系に対する疾病及び／又は傷害を処理するための薬
剤。
【請求項２８】投与経路が静脈内又は筋肉内注射又は注
入により、又は遺伝子治療により、又は逆標識による請
求項27の薬剤。
【請求項２９】LIFが哺乳動物LIFである請求項28の薬
剤。
【請求項３０】哺乳動物LIFがマウス、ラット、ヒト又
は家畜類動物LIFである請求項29の薬剤。
【請求項３１】LIFの哺乳動物起源及び処理されるべき
哺乳動物が同一種に属する請求項30の薬剤。
【請求項３２】LIFの有効量が約0.01から約10,000μg/k
g体重である請求項27から31のいずれか一つの薬剤。
【請求項３３】１又はそれ以上の他のニューロン刺激因
子を同時に又は順次に投与することをさらに含む請求項
32の薬剤。
【請求項３４】他のニューロン刺激因子がFGF、CNTF、N
GF及び／又はBNDF及び／又は１又はそれ以上の向神経因
子を含む請求項32の薬剤。
【請求項３５】それぞれの他のニューロン刺激因子が約
0.01から約10,000μg/kg体重の有効量で投与される請求
項33の薬剤。