NO340914B1

NO340914B1 - In vitro fremgangsmåte for fremstilling av en populasjon av nervestamceller som er i stand til å generere nevroner i en mottakers ryggmarg.

Info

Publication number: NO340914B1
Application number: NO20073078A
Authority: NO
Inventors: Martin Marsala; Karl K Johe; Thomas G Hazel; Osamu Kakinohama; Vassilis Koliatsos; Jun Yan; Paul J Reier; Margaret J Velardo
Original assignee: Neuralstem Inc
Priority date: 2004-11-17
Filing date: 2007-06-15
Publication date: 2017-07-10
Also published as: US9220730B2; US7691629B2; US20130251686A1; NO20073078L; EP2913393B8; IL183092A; IN2014CN03629A; EP1814979B1; EP1814979A4; IL204356A; CN101084303A; US9744194B2; US10286010B2; EP2913393B1; US20060141622A1; JP5424559B2; CN104042629A; US8460651B2; RU2007122507A; KR101505347B1

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

De beskrevne fremgangsmåtene vedrører fremgangsmåter for fremstilling av nervestamceller for anvendelse ved behandling av forstyrrelser ved transplantasjon av nevnte celler som er unikt gunstige for slike behandlingsfremgangsmåter. Nærmere bestemt tilveiebringer de beskrevne fremgangsmåter for fremstilling av nervestamceller for anvendelse ved behandling av nevro-degenerative tilstander med nervestamceller (NSC).

Nevrodegenerative forstyrrelser særpreges ved tilstander som fører til svekkelse av nevroner som en følge av sykdom, arvelige tilstander eller skader, slik som traumatisk eller iskemisk skade på ryggmarg eller hjerne.

Kretssystemet i ryggmargen som styrer kontraksjonen av skjelettmuskler i lemmene omfatter eksistatoriske motonevroner og inhibitoriske, GABAerge (dvs. GABA-produserende) og glysinerge (dvs. glysinproduserende) internevroner. Et motonevron er en nerve med opphav i det fremre horn av den grå masse i ryggmargen. Aksonet til motonevronet kommer frem fra et segment i ryggmargen som en efferent motorfiber som innerverer muskelfibere. Impulser som ledes av motonevronet stimulerer muskelcellene til kontraksjon. GABA, gamma-aminosmørsyre, er en naturlig forekommende metabolitt i nervesystemet hos pattedyr som virker som en nevro-transmitter for inhibering eller demping av nervens overføring av elektrisk potensial. Tap av GABAerge internevroner fører til feilregulering av den inhiberende tonalitet av de motonevron-utløste muskel-kontraksjonene. Uten kontrollen som utøves av inhiberende internevroner på eksistatoriske nevroner opptrer en overstimulering av eksitatoriske nevroner, noe som fører til spastisk, ukontrollert kontraksjon eller ukontrollert rigiditet av musklene i lemmene. Tap av motonevroner fører til slapp paraplegi, hvor individene ikke kan kontrahere musklene og følgelig er ute av stand til å bevege seg.

Ett tilfelle hvor GABAerge-internevroner skades i ryggmargen inkluderer en komplikasjon assosiert med en forbigående kryss-klemming av den nedadgående torakale eller torakoabdominale aorta. Slik kryss-klemming er et nødvendig trinn i vaskulær kirurgi for å reparere aneurismer i den torakale eller torakoabdominale aorta. En del av ryggmargen vil ikke motta blodsirkulasjon i den tiden kryss-klemmingen vedvarer, og kan bli iskemisk. Avhengig av varigheten av det iskemiske periode, kan påfølgende nevrodegenerativ dysfunksjon uttrykkes nevrodegenerativt som paraparese eller fullt utviklet spastisk eller slapp paraplegi.

Selv om mekanismen som fører til iskemi-indusert nervedegenerasjon kun er delvis forstått og kan involvere overdreven frigjøring/aktivitet av eksitatoriske aminosyrer, prostaglandiner og/eller frie oksygenradikaler, så er nervepopulasjonen i ryggmargen som rammes av transiente iskemiske skader veldefinert. For eksempel viser histopatologisk analyse av ryggmarg tatt fra dyr med fult utviklet spastisk paraplegi et selektivt tap av små inhiberende nevroner, imidlertid vedvarer alfa-motonevroner i tidligere iskemiske spinal segmenter. Tilsvarende spinal nervepatologi hos mennesker med spinal iskemisk skade har blitt beskrevet.

I motsetning til dette observeres i dyr med slapp paraplegi pan-nekrotiske, nevro-degenerative endringer som rammer både små inhibitoriske og eksitatoriske internevroner, så vel som ventrale motonevroner. I løpet av tidsrommet med nervedegenerasjon etter spinal iskemi, observeres også en skadeavhengig aktivering av lokale mikroglia og inflammatoriske endringer, slik som infiltrasjon av makrofager, som i fokal eller global hjerneiskemi. Avhengig av omfanget av skaden så når de inflammatoriske endringene typisk en topp mellom to til syv dager etter iskemisk skade, og viser så et gradvis tap av inflammatoriske elementer over et tidsrom på to til fire uker etter perioden med iskemi.

I de siste to eller tre tiår, har en betydelig innsats blitt gjort for å vurdere i dyremodeller det terapeutiske potensialet av spinaltransplantering av en rekke materialer. Således har cellelinjer eller akutt isolert, føtalt ryggmargsvev blitt tilført til skadede områder, og direkte spinal genterapi har også blitt anvendt for å lindre nevrodegenerative dysfunksjoner i flere modeller for ryggskade, inkludert mekanisk, traumatisk skade, kjemisk skadet ryggmarg eller genetisk manipulerte dyr med progressiv a-motonevronal degenerasjon (ALS-transgene mus eller rotter).

Generelt viser studier langtidsoverlevelse og bevaring av nevronale fenotyper i transplantater fremstilt fra føtalt vev, men ikke fra nerveforløpere som har blitt ekspandert in vitro. Faktisk har bare begrenset nevronal differensiering og modning av nerveforløper-celler ekspandert in vitro og transplantert inn i mekanisk eller kjemisk skadet ryggmarg blitt vist. Cellene differensierer fortrinnsvis til ikke-nevronale celletyper. Selv om mekanismen bak denne foretrukne ikke-nevronale differensiering ikke er helt forstått, er det en hypotese om at en lokal frigjøring av pro-inflammatoriske cytokiner (for eksempel TNFa, TGFp) på stedet for en tidligere skade sannsynligvis er involvert.

Nevrodegenerasjon representerer et spesielt utfordrende biologisk miljø for celleterapi, og celledødssignaler til stede i etablert nevrodegenerativ sykdom (Rothstein et al., 1992, Howland et al., 2002, Turner et al., 2005) kan være uforenelig med transplantat overlevelse. I tillegg anses voksen ryggmarg å mangle celler og/eller signaler som tillater regenerasjon (Park et al., 2002), og størstedelen av NCS-transplantasjonsstudier har vist dårlig eller begrenset differensiering (Cao et al., 2002, Yan et al., 2003, Yan et al., 2004).

Ett av hovedproblemene ved celleterapeutiske midler er lav celleoverlevelse (mindre enn 5 %) av de transplanterte cellene. Alle de transplanterte cellene til nå gjennomgår signifikant celledød kort etter injeksjon in vivo. For tilførsel av en effektiv dose av celler må følgelig den endelige dosen injiseres minst 20 ganger. Dette krever i sin tur en mye større skala for cellefremstilling, noe som byr på ytterligere regulatoriske og økonomiske hindringer. I tillegg har overlevelsesgraden av slike celler in vivo ikke kunnet bli opprettholdt. Manglende evne til å påvise reproduserbar administrasjon av effektive doser av celleterapi forhindrer godkjenning for anvendelse fra staten og andre regulatoriske myndigheter, slik som «Food and Drug Administration».

Ytterligere utfordringer foreligger ved behandling av nevrodegenerative sykdommer og tilstander som er spredt over et stort område av en kropp, et vev eller organ, slik som hele nervesystemet, snarere enn et enkelt, lokalisert område. For eksempel i ALS involverer nevrodegenerasjonen langsom død av motonevroner langs hele ryggmargen, så vel som de samme nevroner i den motoriske korteks. I de fleste lysosomale sykdommer involverer nevronal destruksjon likeledes de fleste områder i hjernen og ryggmargen. Alzheimers sykdom involverer det meste av storhjernen. Selv i mer lokaliserte nevro-degenerative sykdommer slik som Parkinsons og Huntingtons sykdom, er det rammede området i striatum temmelig stort, mye større enn transplantasjonsområdet som kan nås kirurgisk. Celleterapeutiske midler for nevrodegenerative sykdommer forventes følgelig å kreve mer omfattende transplantasjonsfremgangsmåter.

Det foreligger følgelig et behov for forbedrede fremgangsmåter for behandling av nevrodegenerative tilstander. Det foreligger også et behov for forbedrede fremgangsmåter for dyrkning (se Rappa et al., 2004, Neuroscience 124, 823-830) og transplantasjon av humane nervestamceller og humane nerveforløperceller som etter transplantasjon over-vinner alle de tidligere observerte begrensninger og gir funksjonell nytte. Anvendelse av celler i denne fremgangsmåten for behandling av nevrodegenerative tilstander in vivo genererer robust nerve differensiering, tillater lang-tids overlevelse av nevroner under forskjellige degenerative tilstander og modning til terapeutisk relevante sup-populasjoner av nevroner i voksent vev som mangler utviklingssignaler, og tilveiebringer et mer omfattende terapeutisk område enn lokaliseringen av cellene selv.

Oppsummering av oppfinnelsen

Beskrevet her er fremgangsmåter for behandling av nevrodegenerative tilstander. Nærmere bestemt inkluderer de beskrevne fremgangsmåtene transplantasjon til et individ med behov for dette av NCS, nerve-progenitorceller eller nerveforløperceller som har blitt ekspandert in vitro, slik at cellene kan lindre den nevrodegenerative tilstanden. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter inkludert identifisering, isolering, ekspansjon og fremstilling av donorcellene for anvendelse ved behandling av den nevro-degenerative tilstanden. Donorcellene som skal transplanteres kan utvelges slik at de svarer til elementene eller manglende derav som bidrar til tilstanden, dens symptomer og/eller dens virkning.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en in vitro fremgangsmåte for fremstilling av en populasjon av nervestamceller som er i stand til å generere nevroner i en mottakers ryggmarg, omfattende: a) å ekspandere minst én nervestamcelle oppnådd direkte fra pattedyrvev i en dyrkningsflaske pre-belagt med 0,1ug/ml til 1 mg/ml av en eller flere polymerer som er i stand til å fremme adhesjon av cellene; b) å konsentrere den ekspanderte populasjonen, hvor den minst ene nervestamcellen er tilveiebragt fra andre pattedyrkiIder enn humane embryoer, hvor ekspansjon av nervestamceller inkluderer dyrking av nervestamcellen i fravær av serum, hvor ekspansjon av nerve-stamceller inkluderer å eksponere nervestamcellen for minst én vekstfaktor, og hvor celle-ekspansjonen overstiger tretti cellefordoblinger uten differensiering.

I én utførelsesform er den ekspandert populasjonen i stand til å generere GABA-produserende nevroner in vivo; eller hvor den ekspanderte populasjonen er i stand til å generere glycin-produserende nevroner in vivo; eller hvor minst 40 % av den ekspanderte populasjonen er i stand til å generere nevroner i ryggmargen; eller hvor minst 30 % av den ekspanderte populasjonen er i stand til å differensiere til nevroner in vitro; eller hvor polymeren er valgt fra gruppen bestående av poly-D-lysin, poly-L/D-lysin, poly-L-lysin, poly-D-ornitin, poly-L-ornitin, fibronektin, lamin, kollagen og kombinasjoner derav. I en foretrukket utførelsesform er vekstfaktoren valgt fra gruppen bestående av bFGF, EGF, TGF-alfa, ccFGF og kombinasjoner derav.

I en utførelsesform er nervestamcellen isolert fra en kilde valgt fra gruppen bestående av et sentralnervesystem, et perifert nervesystem, benmarg, perifert blod, navlestrengsblod og minst ett embryo. I en foretrukket utførelsesform er pattedyret et pattedyr under utvikling. I en enda mer foretrukket utførelsesform er gestasjonsalderen av pattedyret under utvikling mellom omtrent 6,5 til omtrent 20 uker.

Cellene i de beskrevne fremgangsmåtene inkluderer celler som ved transplantasjon danner en mengde av nevroner som er tilstrekkelig til å integreres i den nevronale infrastruktur til lindring av en sykdomstilstand. Beskrevet her er fremgangsmåter inkludert behandling av nevrodegenerative sykdommer eller tilstander ved transplantasjon av multipotente nerve-progenitorceller eller nervestamceller isolert fra sentralnervesystemet til et pattedyr og som har blitt ekspandert in vitro. For eksempel kan transplantasjon av de ekspanderte nervestamcellene anvendes for å forbedre bevegelsesfunksjonen host et individ som lider av forskjellige former for myelopati med symptomer på spastisitet, rigiditet, anfall, paralyse eller hvilken som helst annen hyperaktivitet av muskler.

En fremgangsmåte for behandling kan omfatte tilførsel til et skadet nerveområde ved hjelp av transplantasjon et egnet antall av NSCer som kan differensieres til et tilstrekkelig antall GABA-produserende nevroner og/eller glysinproduserende nevroner til å dempe defekte nervekretser, innbefattet hyperaktive nervekretser.

Beskrevne fremgangsmåter inkluderer gjenoppretting av motorisk funksjon i en motonevron-sykdom. Et egnet antall eller en terapeutisk effektiv mengde av NSCer eller nerve-progenitorceller som er i stand til å differensieres til motonevroner, kan tilføres til minst ett område med nevrodegenerasjon, slik som en degenerativ ryggmarg, for å utbedre motorisk funksjon. NSCene utøver sin terapeutiske virkning ved å erstatte degenererte nevromuskulære forbindelser.

I kombinasjon eller alternativt utøver NSCene sin terapeutiske virkning ved å uttrykke og frigjøre trofiske molekyler som beskytter nevronene i det degenererende vevet, slik at flere av dem overlever i lengre tidsperioder. NSC-avledede nevroner kan stimuleres til å strekke seg inn i ventrale røtter og innervere muskler, hvor NSCene deltar i omfattende gjensidige forbindelser med verts-motonevroner i individer med degenerativ motonevron-sykdom. Således kan NSCer fra human, føtal ryggmarg transplanteres inn i korsryggsmargen, hvor disse cellene kan gjennomgå differensiering til nevroner som danner synapsekontakter med vertsnevroner og uttrykker og frigjør motonevron-vekstfaktorer.

De beskrevne fremgangsmåtene inkluderer tilveiebringelse av nervestamceller eller nerve-progenitorceller som integrerer med vertsvevet og tilfører én eller flere vekstfaktorer til vertsnevronene, slik at disse beskyttes mot degenerative påvirkninger som foreligger i vevet. Fremgangsmåtene inkluderer tilførsel av et tilstrekkelig antall NSCer eller nerve-progenitorceller til et område i en ryggmarg, slik at en effektiv mengde av minst én vekstfaktor utskilles av NSCene.

De beskrevne fremgangsmåtene inkluderer tilveiebringelse av en fremgangsmåte for anvendelse av dyremodeller i den prekliniske evalueringen av stamceller for celleerstatning ved nevrodegenerative tilstander.

De beskrevne fremgangsmåtene inkluderer å øke differensieringseffektiviteten av transplanterte NSCer til nevroner. Fremgangsmåten kan inkludere ekspansjon av svært anrikede NSCer eller nerve-progenitorceller i deres udifferensierte tilstand, slik at etter transplantasjon differensieres et tilstrekkelig antall, slik som 20 % av cellene i transplantatet, i nevronal retning.

De beskrevne fremgangsmåtene inkluderer å øke antallet av differensierte celler uten å øke antallet av NSCer eller nerve-progenitorceller som skal transplanteres. Fremgangsmåten kan inkludere å klargjøre den ekspanderte donorpopulasjonen på en slik måte at etter transplantasjonen fortsetter NSCene eller nerve-progenitorcellene å dele seg in vivo så mange som ti ganger, og uten å danne en tumor, og dermed effektivt å øke det totale antallet av leverte celler.

Cellene i de beskrevne fremgangsmåtene kan isoleres eller tilveiebringes fra føtale, neonatale, juvenile eller voksne vev, eller post-mortem-vev fra et pattedyr. Cellene i de beskrevne fremgangsmåtene kan isoleres eller tilveiebringes fra sentralnervesystemet, blod eller hvilken som helst annen kilde for stamceller som differensierer til nevroner. Cellene kan også tilveiebringes fra embryonale stamceller. For eksempel i en utførelsesform inkluderer cellene nevroepiteliale celler isolert fra den utviklende føtale ryggmarg. I visse tilfeller kan de nerveforløpercellene være nerve-progenitorceller isolert fra spesifikke sub-regioner av sentralnervesystemet.

Ifølge de beskrevne fremgangsmåtene ekspanderes nervestamcellene i kultur. I en utførelsesform kan nerveforløpercellene være multipotente NSCer som er i stand til å ekspandere i kultur og til å danne både nevroner og glia-celler ved differensiering.

Cellene kan enten være udifferensierte eller pre-differensierte eller fullt differensierte in vitro ved tidspunktet for transplantasjon. I en utførelsesform blir cellene indusert til å differensiere til nevral linje. Cellene i de beskrevne fremgangsmåtene kan gjennomgå nevronal differensiering in situ i nærvær av pro-inflammatoriske cytokiner og andre miljøfaktorer som eksisterer i et skadet vev.

Ved anvendelse av de beskrevne fremgangsmåtene kan nervekretser behandles ved transplantering eller innføring av cellene i egnede områder for lindring av sykdommen, forstyrrelsen eller tilstanden. Vanligvis skjer transplantasjon inn i nervevev eller ikke-nervevev som understøtter overlevelse av de transplanterte cellene. NSC-transplantater som benyttes i de beskrevne fremgangsmåtene overlever godt i et nevrodegenerativt miljø, hvor NSCer kan utøve kraftige kliniske virkninger i form av å forsinke utbruddet og progresjonen av nevrodegenerative tilstander eller sykdommer.

I noen tilfeller kan transplantasjon skje i fjerntliggende områder av kroppen, og cellene kan migrere til det påtenkte målområdet. Følgelig kan de beskrevne fremgangsmåtene også omfatte partiell transplantasjon av humane NSCer. Som anvendt her kan uttrykket "partiell transplantasjon" vise til implantering av ekspanderte NSCer i bare en del av et område eller mindre enn et helt område med nevrodegenerasjon. Et eksempel er partiell transplantasjon av human NSCer i de lumbale segmentene av ryggmargen. Minste en del av virkningene av NSC på degenererende motonevroner inkluderer tilførsel av nevrotrofiner og trofiske cytokiner til degenererende vertsmotonevroner via klassiske cellulære mekanismer. For dette formål har NSCer som underkastes partiell transplantasjon inn i de lendesegmenter av ryggmargen ved anvendelse av de beskrevne fremgangsmåtene blitt vist i en transgen dyremodell for motonevronsykdom, å overleve, gjennomgå omfattende nevronal differensiering, fremme motonevronoverlevelse og motonevron-funksjon i det umiddelbare området for transplantasjon, så vel som i områder som ligger fjernt fra området for transplantasjon.

Følgelig tilveiebringer de beskrevne fremgangsmåtene en fremgangsmåte for behandling av spastisitet, rigiditet eller muskulære hyperaktivitetstilstander. Fremgangs-måten inkluderer isolering av minst én nervestamcelle fra et pattedyr og ekspandering av nervestamcellen in vitro til en ekspandert populasjon. Fremgangsmåten inkluderer også oppkonsentrering av den ekspanderte populasjonen og introdusering av en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen til minst ett område i en mottagende ryggmarg. Minst 20 % av den ekspanderte populasjonen er i stand til å danne nevroner i den mottakende ryggmargen.

Tilstandene som kan behandles som beskrevet her kan stamme fra traumatisk ryggmargsskade, iskemisk ryggmargsskade, traumatisk hjerneskade, slag, multiple sklerose, cerebral parese, epilepsi, Huntingtons sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, kronisk iskemi, arvelige tilstander eller hvilken som helst kombinasjon av disse.

I en utførelsesform er nervestamcellen isolert fra en kilde som er utvalgt fra gruppen som består av et sentralnervesystem, et perifert nervesystem, benmarg, perifert blod, navlesnorblod og minst ett ikke-humant embryo.

I en utførelsesform er pattedyret et pattedyr under utvikling.

I en utførelsesform er gestasjonsalderen til pattedyret under utvikling mellom omtrent 6,5 og omtrent 20 uker.

Ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer ekspansjon av nervestamcellen dyrking av nervestamcellen i fravær av serum.

Ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer ekspansjon av nervestamcellen å eksponere nervestamcellen for minst én vekstfaktor.

I en utførelsesform er vekstfaktoren utvalgt fra gruppen som består av bFGF, EGF, TGF-alfa, aFGF og kombinasjoner av disse.

I en utførelsesform er den terapeutiske effektive mengden av den ekspanderte populasjon i stand til å danne minst 1000 GABA-produserende nevroner in vivo.

I en utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden av den ekspanderte populasjon i stand til å danne minst 1000 glysinproduserende nevroner in vivo.

I en utførelsesform er minst 40 % av den ekspanderte populasjon i stand til å danne nevroner i ryggmargen.

Som beskrevet her kan tilførselen av den terapeutiske effektive mengden av den ekspanderte populasjon inkludere injeksjon av minst én del av den terapeutisk effektive mengde i flere områder i den mottagende ryggmarg.

I en utførelsesform er minst 30 % av den ekspanderte populasjonen i stand til å differensiere til nevroner in vitro.

En nervestamcelle er beskrevet her. Nervestamcellen som beskrevet her kan være i stand til å behandle spastisitet, rigiditet eller muskulære hyperaktivitetstilstander. Nervestamcellen er isolert fra et pattedyr og ekspandert in vitro til en ekspandert populasjon. Den ekspanderte populasjonen som inkluderer stamcellen er konsentrert og en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen er introdusert til minst ett område i en mottagende ryggmarg. Minst 20 % av den ekspanderende populasjonen er i stand til å danne nevroner i den mottagende ryggmarg.

En fremgangsmåte for behandling av kronisk smerte er beskrevet. Fremgangs-måten kan inkludere isolering av minst én nervestamcelle fra et pattedyr og ekspandering av nervestamcellen in vitro til en ekspandert populasjon. Fremgangsmåten kan også inkludere oppkonsentrering av den ekspanderte populasjonen og introdusering av en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen til minst ett område i en mottagende ryggmarg. Minst 20 % av den ekspanderte populasjonen er i stand til å danne nevroner i den mottagende ryggmarg.

Den kroniske smerten kan være avledet fra traumatisk ryggmargsskade, iskemisk ryggmargsskade, traumatisk hjerneskade, slag, multiple sklerose, cerebral parese, epilepsi, Huntingtons sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, kronisk iskemi, arvelige tilstander eller en hvilken som helst kombinasjon av disse.

I en utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden av den ekspanderte populasjonen i stand til å danne minst 1000 GABA-produserende nevroner.

I en utførelsesform er den terapeutisk effektive mengden av den ekspanderte populasjonen i stand til å danne minst 1000 glysinproduserende nevroner.

I en utførelsesform er minst 40 % av den ekspanderte populasjonen i stand til å danne nevroner i ryggmargen.

Som beskrevet her inkluderer introduksjon av en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen injeksjon av minste en del av den terapeutisk effektive mengde i flere områder av den mottagende ryggmarg.

Områdene kan inkludere dorsalhorn.

Områdene kan inkludere intratekal rom.

En nervestamcelle er også beskrevet. Nervestamcellen er i stand til å behandle kronisk smerte. Nervestamcellen isoleres fra et pattedyr og ekspanderes in vitro til en ekspandert populasjon. Den ekspanderte populasjonen som inkluderer stamcellen oppkonsentreres, og en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen introduseres til minst ett område i en mottagende ryggmarg. Minst 20 % av den ekspanderte populasjonen er i stand til å danne nevroner i den mottagende ryggmarg.

En fremgangsmåte for behandling av motonevron degenerasjon er også beskrevet. Fremgangsmåten omfatter isolering av minst én nervestamcelle fra et pattedyr og ekspandering in vitro av nervestamcellen til en ekspandert populasjon. Fremgangsmåten inkluderer også oppkonsentrering av den ekspanderte populasjonen og introduksjon av en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen til minst ett område i en mottagende ryggmarg. Minst 20 % av den ekspanderte populasjonen kan danne nevroner i den mottagende ryggmarg.

Motonevron degenerasjon kan skylles traumatisk ryggmargsskade, iskemisk ryggmargsskade, traumatisk hjerneskade, slag, multiple sklerose, cerebral parese, epilepsi, Huntingtons sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, kronisk iskemi, arvelige tilstander eller hvilken som helst kombinasjon av disse.

Som beskrevet her kan nevnte fremgangsmåte inkludere isolering av nervestamcellen fra et område som er rikt på minst én nerve undertype, hvor nerve undertypen danner en vekstfaktor som er effektiv til å forbedre den motoriske svikt.

Den ekspanderte populasjonen kan inkludere en mengde av nervestamceller som er i stand til å differensiere til nevroner som er tilstrekkelig til å utskille en terapeutisk effektiv mengde av minst én vekstfaktor.

Fremgangsmåten kan inkludere isolering av nervestamcellen fra et område som er rikt på motonevroner.

En nervestamcelle som er i stand til å behandle syringomyeli er også beskrevet. Nervestamcellen isoleres fra et pattedyr og ekspanderes in vitro til en ekspandert populasjon. Den ekspanderte populasjonen inkludert stamcellen oppkonsentreres og en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen introduseres til minst ett område i en mottagende ryggmarg. Minst 20 % av den ekspanderte populasjonen kan danne nevroner i den mottagende ryggmarg.

En fremgangsmåte for behandling av syringomyeli er også beskrevet. Fremgangs-måten inkluderer isolering av minst én nervestamcelle fra et pattedyr og ekspandering in vitro av nervestamcellen til en ekspandert populasjon. Fremgangsmåten inkluderer også oppkonsentrering av den ekspanderte populasjonen og introdusering av en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen til en syrinks i en mottagende ryggmarg. Minst 20 % av den ekspanderte populasjonen kan danne neuroner i syrinks i den mottagende ryggmarg.

Syringomyeli kan skylles traumatisk ryggmargsskade, iskemisk ryggmargsskade, traumatisk hjerneskade, slag, multiple sklerose, cerebral parese, epilepsi, Huntingtons sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, kronisk iskemi, arvelige tilstander eller hvilken som helst kombinasjon av disse.

Nevnte fremgangsmåte kan inkludere isolering av nervestamcellen fra et område som er rikt på minst én nerve undertype, hvor nerve undertypen danner en vekstfaktor som effektivt forbedrer syringomyeli.

Nevnte fremgangsmåte kan inkludere isolering av nervestamcellen fra et område som er rikt på motonevroner.

Den terapeutisk effektive mengden av den ekspanderte populasjonen kan være i stand til å danne minst 1000 nevroner.

Minst 100000 nervestamceller av den ekspanderte populasjonen kan introduseres til syrinks i den mottagende ryggmarg.

En nervestamcelle som er i stand til å behandle syringomyeli er også beskrevet. Nervestamcellen isoleres fra et pattedyr og ekspanderes in vitro til en ekspandert populasjon. Den ekspanderte populasjonen som inkluderer stamcellen oppkonsentreres, og en terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen introduseres i en syrinks i en mottagende ryggmarg. Minst 20 % av den ekspanderte populasjonen kan danne nevroner i syrinks i den mottagende ryggmarg.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for ekspansjon in vitro av minst én nervestamcelle til en ekspandert populasjon av nervestamceller. Hver nervestamcelle ekspansjon overskrider 30 celledoblinger uten differensiering. Fremgangs-måten inkluderer å dissosiere nervestamceller fra sentralnervesystemvev og å tilveiebringe minst ett ekstracellulært protein til et dyrknings ka r. Det ekstracellulære proteinet inkluderer minst omtrent 10 ug/ml av poly-D-lysin og omtrent 1 mg/ml fibronektin. Fremgangsmåten inkluderer også dyrking av de dissosierte nervestamcellene i dyrkningskaret i fravær av serum og ved tilsetning til dyrkningskaret av minst én vekstfaktor. Vekst-faktoren er valgt fra gruppen som består av bFGF, EGF, TGF-alfa, aFGF og kombinasjoner av disse. Fremgangsmåten inkluderer videre passasje av de dyrkede cellene før konfluens.

I en utførelsesform er de ekspanderte nervestamcellene i stand til å differensiere til nevroner.

I en utførelsesform omfatter ekspansjonen av nervestamcellene tilsetning av fibronektin til dyrkningsmediet som en løselig faktor.

I en utførelsesform omfatter dissosiasjonen av cellene og passasjen av cellene enzymatisk dissosiasjon.

I en utførelsesform omfatter den enzymatiske dissosiasjonen behandling av cellene med trypsin.

En terapeutisk effektiv mengde av den ekspanderte populasjonen kan introduseres til minst ett område i et mottagende nervesystem for å behandle en nevrodegenerativ tilstand.

Det er derfor en fordel ved de beskrevne fremgangsmåtene i forhold til eksisterende farmakologiske strategier å tilveiebringe en fremgangsmåte for å gjøre muligheten lettere for de transplanterte NSCene til å utskille trofiske molekyler som kan leveres til degenererende motonevroner under betingelser for optimal biotilgjengelighet.

Ytterligere en fordel ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for dyrking og ekspandering av NSCer for å gjøre det lettere for vellykket transplantasjon av NSCene i korsryggmargen.

En ytterligere fordel ved den beskrevne oppfinnelsen inkluderer å tilveiebringe en fremgangsmåte for å oppnå en høyere andel av nervedifferensiering i en populasjon av NSCer.

En annen fordel ved den beskrevne fremgangsmåten omfatter oppnåelse av kliniske virkninger fra partiell transplantasjon av NSC.

Ytterligere egenskaper og fordeler ved de beskrevne fremgangsmåtene er beskrevet i og vil være åpenbare fra den påfølgende, detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen og figurene.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1. Ekspansjon av humane spinale stamceller. En human spinal progenitorlinje (også betegnet NSC) ble isolert fra et 7-8 uker gammelt føtalt ryggmargsvev post morten og serielt passert i omtrent 130 dager netto dyrkningstid. Ved hver passasje ble celletallet oppnådd etter høstingen dividert med det opprinnelige celletallet ved utplating for tilveiebringelse av antall gangers økning av celletallet. Den kumulative gangers økning (venstre Y-akse) ble tilveiebragt ved å multiplisere gangers økning ved hver passasje. Doblingstiden (høyre Y-akse) for cellene ved hver passasje ble beregnet ved å dividere antall gangers økning av celletallet med dyrkningstiden (X-aksen). Denne prosessen ble gjentatt tre ganger (seriell ekspansjon 1, 2 og 3). Fig. 2. Morfologi av ekspanderte, humane, spinale stamceller. (A) Fasekontrast-bilde av en fiksert, ikke-farget, ekspanderende kultur, 20x objektiv, (B) Anti-nestin antistoff farging. Fig. 3. Karakterisering av differensierte kulturer tilveiebragt fra ekspanderte, humane, spinale stamceller. De ekspanderte cellene fra passasje 15-16 ble differensiert i omtrent 14 dager i kultur, fiksert og farget med forskjellige nevronspesifikke antistoffer.

(A) Tau og MAP2, (B) Type 3 beta-tubulin, (C) GABA, (D) Acetylcholintransferase.

Fig. 4. Ekspansjon av humane midthjerne stamceller. En human midthjerne

progenitor cellelinje (også betegnet NSC) ble isolert fra et 7-8 uker gammelt føtalt midthjernevev post morten og serielt passert i omtrent 170 dager netto dyrkningstid. Ved hver passasje ble celletallet oppnådd etter høstingen dividert med det opprinnelige celletallet ved utplating for tilveiebringelse av antall gangers økning av celletallet. Den kumulative gangers økning (Y-aksen) ble tilveiebragt ved å multiplisere antall gangers økning ved hver passasje.

Fig. 5. Dopaminopptaksaktivitet av ekspanderte, humane midthjernestamceller. Dopamintransportøraktiviteten (DAT) i levende celler ble bestemt for en human midthjerne-stamcellelinje og én av dens klonale underlinjer, som var differensiert i 22 eller 44 dager på analysetidspunktet. Cellene ble inkubert med radioaktivt merket dopamin i nærvær (+) eller fravær (-) av DAT-inhibitoren nomifensin (10 nM). Cellene ble vasket for fjerning av ikke-inkorporert dopamin og lysert i en scintillasjonsblanding. Den totale cellulære radio-aktivitet (dpm) ble så bestemt ved anvendelse av en scintillasjonsteller. Fig. 6. Virkning av eksogene faktorer på induksjon av nevronal differensiering og dopaminerg differensiering av humane midthjerne stamcellelinjer. Kryopreserverte nervestamceller fra to humane midthjerne stamcellelinjer (527RMB og 796RMB) ble tint og platet ut med en tetthet på 40 000 celler per brønn i 4-brønners kammerobjektglass i nærvær av bFGF og fikk dele seg i 6 dager. Deretter ble bFGF fjernet og cellene fikk differensiere i ytterligere 8 dager. Cellene ble delt i fire grupper basert på tidspunkt og varighet av eksponeringen ovenfor sertolicelle-kondisjonert medium (SCCM, fortynnet 1:1 i N2). Én gruppe ble eksponert for SCCM under proliferasjon og differensiering (betingelse 1), en andre ble kun eksponert under proliferasjonen (betingelse 2), en tredje ble kun eksponert under differensieringen (betingelse 3) og en fjerde ble ikke eksponert for SCCM (kontroll, Cont.). Mediet ble byttet annenhver dag og mitogen ble tilsatt daglig under den proliferative fasen. Fire brønner ble opprettholdt pr. tilstand for å tillate farging av flere markører. Etter differensiering ble cellene fiksert ved anvendelse av 4 % paraformaldehyd og immunfarget ved anvendelse av antistoffer mot MAP2ab (fig. 6A) og tyrosinhydroksylase (Fig. 6B), så vel som GFAP og GalC. Immunfargede celler ble tellet ved anvendelse av et 40x objektiv, og minst tre felt ble tellet for hver brønn. Få eller ingen GFAP+ eller GalC+ celler ble påvist ved analyse av celler opprettholdt under noen av betingelsene, så disse antigenene ble ekskludert fra analysen. Fig. 7. Reduksjon av spastisitet/rigiditet og motoriske mangler hos rotter ved transplantasjon av humane spinale stamceller. Spastiske rotter ble fremstilt ved iskemisk skade av den lumbale ryggmargen. I en gruppe (sorte sirkler) ble rottene (n=9) transplantert med humane spinale stamceller ekspandert i kultur (passasje 16), mens den andre gruppen, kontroll, (hvite sirkler, n=7) kun ble tilført medium uten celler. Det immunsupprimerende midlet FK506 ble tilført i en dose på 1 mg/kg per dag til begge grupper gjennom hele studien (8 uker). Den motoriske koordinasjon hos enkeltdyr ble vurdert ved BBB-poengsetting én gang i uken. Fig. 8. Reduksjon av spastisitet/rigiditet og motoriske mangler hos rotter ved transplantasjon av humane spinale stamceller. Spastiske rotter ble fremstilt ved iskemisk skade på den lumbale ryggmargen. I en gruppe (sorte sirkler og sorte firkanter) ble rottene (n=13) transplantert med humane spinale stamceller ekspandert i kultur (passasje 16), mens den andre gruppen, kontroll, (fylte trekanter, n=6) kun ble tilført medium uten celler. Det immunsupprimerende midlet FK506 ble tilført i en dose på 3 mg/kg per dag til begge grupper gjennom hele studien (12 uker). Den motoriske koordinasjonen hos enkeltdyr ble vurdert ved BBB-poengsetting én gang i uken. Fig. 9. Virkninger av human NSC behandling på alvorlighetsgraden av motonevron-sykdom hos G93A SODl-rotter vist med progresjon (A-B) så vel som ende-punkt analyse (C-E) av kliniske og patologiske målinger i tilfeller med levende celler (L, rød) og døde celler (kontroll, C) (blå).

A-B. Felt A er en Kaplan-Meier-fremstilling som viser en signifikant separasjon mellom forsøks- og kontrolldyr gjennom hele observasjonsforløpet (P=0,0003). Felt B viser en separasjon i de to viktigste målingene av muskelsvakhet (BBB-poeng og skråplan poeng) mellom de to gruppene (P= henholdsvis 0,00168 og 0,00125). C-E. Ende-punkt analyse av overlevelse (C), tid til sykdomsdebut (D) og motonevron-tall (E) i forsøks- og kontroll-rotter. Felt C viser en signifikant 11-dagers forskjell i levetid mellom de to gruppene (P=0,0005). Felt D viser en signifikant 7-dagers forskjell i tiden til sykdomsdebut mellom de to gruppene (P=0,0001). Felt E viser en forskjell på 3212 celler i det lumbale fremspring mellom levende og døde NSC grupper (P=0,01). Innfellingen nederst i (E) illustrerer forskjellen i motonevron overlevelse mellom en representativ forsøks- (øverst) og kontrollrotte (nederst) i en alder på 128 dager, pilene indikerer den laterale motonevron-gruppe. Størrelsesstolpe: 150 nm.

Detaljert beskrivelse

De beskrevne fremgangsmåtene vedrører å behandle nevrodegenerative tilstander. Nærmere bestemt inkluderer de beskrevne fremgangsmåtene fremgangsmåter for fremstilling av nervestamceller for anvendelse ved transplantasjon inn i et individ med behov for dette. Fremstilling av cellene for transplantasjon kan inkludere ekspansjon in vitro av en spesifikk populasjon av celler til et nivå som er tilstrekkelig for kommersiell anvendelse som en behandling for nevrodegenerative tilstander. En fremgangsmåte for behandling av et degenerert eller skadd nerveområde kan inkludere å tilføre til området et effektivt antall av nervestamceller som er tilstrekkelig til å lindre den nevrodegenerative tilstanden.

Som anvendt her kan en nevrodegenerativ tilstand inkludere hvilken som helst sykdom eller forstyrrelse, eller symptomer, årsaker eller virkninger derav, som involverer skaden eller svekkelsen av nevroner. Nevrodegenerative tilstander kan inkludere Alexanders sykdom, Alpers sykdom, Alzheimers sykdom, amyotrofisk lateralsklerose, ataksi teleangiektasi, Canavans sykdom, Cockaynes syndrom, kortikobasal degenerasjon, Creutzfeldt-Jakobs sykdom, Huntingtons sykdom, Kennedys sykdom, Krabbes sykdom, Lewy-klump demens, Machado-Josephs sykdom, multiple sklerose, Parkinsons sykdom, Pelizaeus-Merzbachers sykdom, Niemann-Picks sykdom, primær lateralsklerose, Refsums sykdom, Sandhoffs sykdom, Schilders sykdom, Steele-Richardson-Olszewskis sykdom, Tabes Dorsalis eller hvilken som helst annen tilstand som er assosiert med skadde nevroner. Andre nevrodegenerative tilstander kan inkludere eller være forårsaket av traumatisk ryggmargsskade, iskemisk ryggmargsskade, slag, traumatisk hjerneskade og arvelige tilstander.

De beskrevne fremgangsmåtene inkluderer anvendelse av NSCer for å lindre en nevrodegenerativ tilstand. Som anvendt her kan begrepet "NSCer" også vise til nerve- eller nevrale-progenitorceller eller nevroepitelial forløperceller. NSCer kan funksjonelt defineres ut fra deres evne til å differensiere til hver av de tre hoved celletypene i CNS: nevroner, astrocytter og oligodendrocytter.

I en utførelsesform er de angjeldende NSCene multipotente, slik at hver celle har evnen til å differensiere til et nevron, en astrocytt eller en oligodendrocytt. I en utførelses-form er NSCene bi-potente, slik at hver celle har evnen til å differensiere til to av de tre celletypene i CNS. I en utførelsesform inkluderer NSCene minst bi-potente celler som danner både nevroner og astrocytter in vitro og inkluderer minst uni-potente celler som danner nevroner in vivo.

Vekstbetingelser kan påvirke differensieringsretningen til cellene mot én celletype eller en annen, noe som indikerer at cellene ikke er forpliktet til en enkelt linje. Under dyrkningsbetingelser som fremmer nevrondifferensiering, er celler, fortrinnsvis fra human CNS, hovedsakelig bi-potente for nevroner og astrocytter, og differensieringen til oligodendrocytter er minimal. Følgelig kan de differensierte cellekulturene i de beskrevne fremgangsmåtene gi opphav til nevroner og astrocytter. I en utførelsesform kan forholdet mellom nevroner og astrocytter nå et 50:50 forhold.

De beskrevne fremgangsmåtene inkluderer tilveiebringelse av NSCer som oppholder seg i områder i et pattedyr CNS, slik som nevroepitelet. Andre CNS-områder fra hvilke NSCer kan isoleres inkluderer de ventrikulære og subventrikulære sonene i CNS og andre CNS-områder som inkluderer mitotiske forløperceller så vel som post-mitotiske nevroner. I en utførelsesform kan de beskrevne fremgangsmåtene benytte NSCer som oppholder seg i områder i et utviklende pattedyrs-CNS.

I en utførelsesform er NSCene tilveiebragt fra et område som er naturlig nevrogent for en ønsket populasjon av nevroner. Den ønskede populasjonen av celler kan inkludere cellene av en spesifikk nevronal fenotype som kan erstatte eller supplere en slik fenotype som har gått tapt eller er inaktiv i en nevrologisk tilstand.

En rekke forskjellige nevronale undertyper, inkludert de som er anvendelige for behandling av spesifikke nevrodegenerative sykdommer eller tilstander, kan tilveiebringes ved å isolere NSCer fra forskjellige områder eller regioner i CNS og over forskjellige gestasjonsaldere i løpet av fosterutviklingen. NSCer isolert fra forskjellige områder eller regioner i CNS og over forskjellige gestasjonsaldere anvendes for optimal ekspensjon og nevronal differensieringsevne. Ett av kjennetegnene på CNS hos pattedyr er diversiteten av nevronale undertyper. En enkelt populasjon av NSCer kan, for eksempel, spontant generere kun noen få distinkte nevronale undertyper i kultur. Videre kan cellene fra en gitt føtal gestasjonsalder etablere den fysiologiske relevansen til de dyrkede cellene.

Celler som skal transplanteres inn i individer som beskrevet her kan være avledet fra det humane, føtale motstykket til det skadde nevrale området. NSCer kan isoleres fra humane, føtale CNS-områder i en gestasjonsalder på mellom omtrent 6,5 og omtrent 20 uker. Celler fra en føtal ryggmarg kan isoleres ved en gestasjonsalder på omtrent 7 til omtrent 9 uker. Det skal bemerkes at andelen av den isolerbare nervestamcellepopulasjon kan variere med donorens alder. Ekspansjonskapasiteten til cellepopulasjonene kan også variere med donorens alder. Slik regional og temporal spesifisitet av NSCer indikerer at NSCer oppfører seg som skjebne-begrensede progenitorceller, og ikke som "blanke" celler eller som en enkelt populasjon av celler.

Andelen av populasjonen in vitro inkludert GABA-produserende nevroner er vanligvis konstant på omtrent 5-10 %.

For eksempel er NSCene fra den ventrale midthjerne forskjellige fra NSCer tilveiebragt fra ryggmargen ved samme gestasjonsalder. Nærmere bestemt gir NSCer fra den ventrale midthjerne utelukkende opphav til tyrosinhydroksylase-uttrykkende dopaminerge nevroner, mens NSC fra ryggmargen utelukkende genererer acetylcholin-produserende kolinerge nevroner. Begge celletyper genererer imidlertid samtidig de mer allestedsnærværende gluamat- og GABA-produserende nevronene. NSCer kan tilveiebringes fra den ventrale midthjernen for å behandle tilstander som lindres eller svekkes, i det minste delvis, ved implantering av tyrosinhydroksylase-uttrykkende dopaminerge nevroner. De beskrevne fremgangsmåtene inkluderer videre tilveiebringelse av NSCer fra ryggmargen for å behandle nevrodegenerative tilstander som lindres eller svekkes, i det minste delvis, ved implantering av acetylcholin-produserende kolinerge nevroner.

For behandling av bevegelsesforstyrrelser slik som Parkinsons sykdom, som særpreges ved tap av dopaminerge nevroner, kan således inkludere anvendelsen av NSCer tilveiebragt fra et område slik som den ventrale midthjerne i hvilket nevrogenese av dopaminerge nevroner er betydelig. I tillegg kan NSCer tilveiebringes ved en gestasjonsalder i den humane fosterutvikling i hvilken nevrogenesen av dopaminerge nevroner er betydelig. NSCer kan tilveiebringes fra den ventrale midthjerne ved en gestasjonsalder på omtrent 7 til omtrent 9 uker for å behandle bevegelsesforstyrrelser.

Behandling av motonevronsykdommer slik som amyotrofisk lateralsklerose eller slapp paraplegi, som skyldes tap av ventrale motonevroner, kan inkludere anvendelse av NSCer utvunnet fra et område slik som ryggmargen i hvilket nevrogenesen av ventrale motonevroner er betydelig, og kan tilveiebringes ved en gestasjonsalder i den humane fosterutvikling i hvilken nevrogenesen av ventrale motonevroner er vesentlig. NSCer kan isoleres fra ryggmargen ved en gestasjonsalder på omtrent 7 til omtrent 9 uker for å behandle motonevronsykdommer.

Det bør imidlertid forstås at grensene for slik regional spesifisitet i noen tilfeller er temmelig brede for praktiske formål. Således kan NSCer fra forskjellige områder i ryggmargen, slik som hals-, bryst-, lende- og korsryggsegmentene, anvendes om hverandre for implantering og for å behandle områder forskjellige fra det tilsvarende opprinnelsesområdet for NSCene. For eksempel kan NSC utvunnet fra hals-ryggmarg anvendes for behandling av spastisitet og/eller rigiditet ved å transplantere cellene inn i lendesegmentene hos en pasient.

NSCer kan også isoleres fra postnatalt og voksent vev. NSCer utvunnet fra postnatale og voksne vev er kvantitativt ekvivalente med hensyn til deres evne til å differensiere til nevroner og gliaceller, så vel som når det gjelder deres vekst- og differensieringsegenskaper. Effektiviteten av in wtro-isolering av NSC fra diverse post-natale og voksne CNS kan imidlertid være mye lavere enn isolering av NSCer fra føtale vev, som rommer en rikere populasjon av NSCer. Ikke desto mindre tillater de beskrevne fremgangsmåtene, som for fosterutvunnede NSCer, at minst omtrent 30 % av NSCer utvunnet fra neonatale og voksne kilder differensieres til nevroner in vitro. Således kan post-natale og voksne vev anvendes som beskrevet ovenfor når det gjelder fosterutvunnede NSCer, men anvendelse av føtale vev foretrekkes.

Forskjellige nevronale undertyper kan tilveiebringes fra manipulasjon av embryonale stamceller ekspandert i kultur. Således kan spesifikke nevronale undertyper basert på de beskrevne fremgangsmåtene isoleres og renses fra andre irrelevante eller uønskede celler for å forbedre resultatet, etter behov, og kan anvendes for behandling av de samme nevrodegenerative tilstandene.

NSCene i de beskrevne fremgangsmåtene kan være utvunnet fra ett sted og transplantert til et annet sted i det samme individ som et autotransplantat. Videre kan NSCene i de beskrevne fremgangsmåtene være tilveiebragt fra en genetisk identisk donor og transplantert som et isotransplantat. Enda ytterligere kan NSCene i de beskrevne fremgangsmåtene være utvunnet fra dets genetisk ikke-identisk medlem av den samme art og transplantert som et allotransplantat. Alternativt kan NSCer være utvunnet fra et ikke-humant opphav og transplantert som et xenotransplantat. Med utviklingen av kraftige immunsuppressive midler kan allotransplantater og xenotransplantater av ikke-humane, nerveforløperceller, slik som nerveforløperceller med griseopphav, transplanteres inn i mennesker.

Et prøvevev kan dissosieres ved hvilken som helst standardfremgangsmåte. I en utførelsesform dissosieres vev ved forsiktig mekanisk triturering ved anvendelse av en pipette og en saltbuffer fri for divalente kationer for å danne en suspensjon av dissosierte celler. Tilstrekkelig dissosiering for å oppnå hovedsakelig enkeltceller er ønskelig for å unngå stor lokal celletetthet.

For vellykket kommersiell anvendelse av NSCer er det ønskelig å opprettholde robuste og konsistente kulturer som har stabil ekspansjons- og differensieringsevne gjennom mange påfølgende passasjer. Som beskrevet ovenfor kan dyrkningsfremgangsmåtene optimeres for å oppnå langtids stabil ekspansjon av en enkelt cellelinje av NSCer fra forskjellige områder og aldere av CNS-utvikling, samtidig som deres distinkte progenitoregenskapene opprettholdes.

For dette formål har det overraskende blitt funnet at fremming av adhesjonen av NSCer (NSC) til et underlag bidrar til å akselerere den mitotiske frekvens for NSC eller progenitorceller, for derved å tilveiebringe en signifikant forøkning av en mer robust kultur av NSC eller progenitorceller. Nærmere bestemt, i tillegg til å unngå overdreven lokal celletetthet og opprettholdelse av mitogene konsentrasjoner, har det blitt funnet at konsentrasjonen av ekstracellulære matriksproteiner påvirker den langtids mitotiske- og differensieringsevnen til NSCer. De ekstracellulære matriksproteinene kan inkludere poly-D-lysin, poly-L-lysin, poly-D-ornitin, poly-L-ornitin, fibronektin og kombinasjoner av disse. Andre ekstracellulære matriksproteiner kan inkludere forskjellige isotyper, fragmenter, rekombinante former eller syntetiske etterlignere av fibronektin, lamin, kollagen og kombinasjoner av disse. Alternativt eller i tillegg bør det forstås at de beskrevne fremgangsmåtene kan inkludere hvilken som helst annen egnet substans som er i stand til å fremme effektiv celleadhesjon, slik at hver enkelt celle er festet til dyrkningsunderlaget under hele varigheten av dyrkningen, uten å være cytotoksisk eller hemme celledelingen.

Selv om ekstracellulære matriksproteiner kan være effektive til å fremme celleadhesjon, kan forskjellige aminosyre polymerer, slik som poly-L/D-ornitin eller poly-

L/D-lysin, være toksiske for cellene i visse konsentrasjoner for hver enkelt cellelinje. Varigheten av inkubasjonen kan også påvirke den endelige mengde av polymeren deponert på skåloverflaten, noe som påvirker cellenes levedyktighet. For NSCene som benyttes i de beskrevne fremgangsmåtene, kan konsentrasjonene av polymer ligge innenfor et område mellom omtrent 0,1ug/ml og omtrent 1 mg/ml. I en utførelsesform løses 100 ug/ml poly-D-lysin i 0,01 M HEPES-buffer eller vann ved nøytral pH og tilsettes til et dyrkningskar. Dyrkningskaret inkuberes i 1 time ved romtemperatur. Dyrkningskaret blir deretter grundig skyllet med vann og tørkes før anvendelse.

De beskrevne fremgangsmåtene kan også inkludere dobbelt-belegging av dyrkningskarene med et ekstracellulært matriksprotein. I en utførelsesform behandles dyrkningskaret med fibronektin eller et fibronektin-derivat etter påføringen av poly-L/D-ornitin eller poly-L/D-lysin som beskrevet ovenfor. I en utførelsesform anvendes fibronektin-protein fremstilt fra humant plasma. Det bør imidlertid forstås at hvilken som helst annen egnet form av eller kilde for fibronektin-protein kan anvendes, slik som fibronektin fra gris eller storfe, rekombinant fibronektin, fragmenter av fibronektin-proteiner, syntetiske peptider og andre kjemiske forbindelser som etterligner fibronektin. I en utførelsesform kan mellom omtrent 0,1 ug/ml og omtrent 1 mg/ml fibronektin anvendes.

I en utførelsesform som inkluderer ekspansjon av NSCer fra human ryggmarg behandles dyrkningskaret med 100 ug/ml poly-D-lysin over et tidsrom som er tilstrekkelig til at det ekstracellulære proteinet bindes til og belegger dyrkningskaret. Et slikt tidsrom kan være fra omtrent fem minutter til omtrent tre timer. Dyrkningskaret kan deretter vaskes med vann. Etter luft-tørking av dyrkningskaret kan karet behandles med omtrent 25 mg/ml fibronektin i omtrent fem minutter til flere timer ved romtemperatur, eller med omtrent 1 mg/ml fibronektin i omtrent 1 time til flere dager ved 37 °C. Deretter kan fibronektinet fjernes og dyrkningskaret vaskes minst én gang eller lagres i PBS inntil det skal anvendes.

Fibronektin kan tilsettes til dyrkningsmediet som en løselig faktor som tilføres direkte til cellene. NSCer kan ekspanderes ved tilsetning av 1ug/ml fibronektin til dyrkningsmediet i tillegg til behandling av dyrkningskarene med fibronektin. Tilførsel av feste protein et til dyrkningsmediet som en løselig faktor på det tidspunktet cellene sås ut er spesielt fordelaktig for stor, kommersiell skala dyrking av NSCer grunnet den relativt korte holdbarheten for fibronektin-belagte kar. Denne fremgangsmåten er også nyttig for fremstilling av en nervestamcellelinje som i det vesentlige krever nøyaktige betingelser og reproduserbarhet, slik som kreves i henhold til cGMP-protokoller og for fremstilling av nervestamcellelinjen for terapeutisk anvendelse.

I en utførelsesform tilsettes de isolerte NSCene til dyrkningskaret i en tetthet på omtrent 1000 til omtrent 20000 celler per kvadratcentimeter. En slik tetthet bidrar til jevn fordeling og adhesjon av individuelle celler i dyrkningskaret, slik at det unngås lokale konsentrasjoner av celler, for å anrike kulturen for NSCer.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen ekspanderes NSCer i fravær av serum. I en utførelsesform dyrkes NSCene i et definert, serumfritt medium for å unngå eksponering av NSCene for konsentrasjoner av serum som er tilstrekkelige til å destabilisere den mitotiske-og differensieringsevnen til NSC. I tillegg kan eksponering av NSCer for visse vekstfaktorer, slik som leukemi-inhiberende faktor (LIF) eller ciliær nevrotrofisk faktor (CNTF), også destabilisere NSCer, og bør unngås.

Mitogener kan tilsettes til kulturen ved hvilket som helst stadium av dyrknings-prosessen for å fremme veksten av NSCer. Mitogener kan inkludere basisk fibroblast-vekstfaktor (bFGF), sur fibroblast-vekstfaktor (aFGF), epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor-alfa (TGFa) og kombinasjoner av disse.

NSCer i de beskrevne fremgangsmåtene kan dyrkes og ekspanderes i minst to forskjellige kulturformer. Én form for kultur inkluderer en aggregert form, vanligvis betegnet som en klumpet, aggregert form, som betegnes som en suspensjonskultur. En annen form for kultur inkluderer en dispergert, ikke-aggregert form som betegnes en adhesjons-kultur.

I en dispergert, adherent kultur av NSCene i de beskrevne fremgangsmåtene danner cellene et mono-lag i hvilket de individuelle cellene i utgangspunktet er i direkte kontakt med dyrkningsunderlaget. Til slutt etter en tids inkubering kan cellene sporadisk danne klumper, hvor minst ett ekstra cellelag dannes på bunnlaget, selv om cellene i bunnlaget enkeltvis adherer til underlaget. Slik klumpdannelse oppstår spesielt når kulturen inokuleres ved høy celletetthet eller har fått lov til å nå en høy celletetthet, som i en utførelsesform minimeres for optimal ekspansjon av NSCer eller progenitorceller eller for optimal bevaring av den multipotente evnen til NSCene. I den dispergerte, adherente kulturen i en utførelsesform av de beskrevne fremgangsmåtene, er humane NSCer i stand til å dele seg på mindre enn omtrent fire dager per celledeling.

En annen distinkt egenskap ved den dispergerte, adherente kulturen er at NSCene i de beskrevne fremgangsmåtene deler seg og danner datterceller som alle bevarer sin multipotente evne. I en utførelsesform inkluderer den dispergerte, adherente kulturen av NSCer ifølge de beskrevne fremgangsmåtene en ekspansjonsevne på minst 20 celledoblinger i fravær av vesentlig differensiering. De fleste NSCer kan ekspanderes ut over minst 50 celledoblinger før de taper sitt nevrogene potensial. I en utførelsesform viser NSCer ekspandert i den dispergerte, adherente kulturen ifølge de beskrevne fremgangsmåtene forhøyet nevronal differensiering og gir i en utførelsesform opphav til minst 30 % nevronal differensiering. I mange tilfeller differensierer minst 50 % av NSC til nevroner. Selv om den dispergerte, adherente formen for kultur er en mer foretrukket form for kultur, kan de forskjellige dyrkningsfremgangsmåtene tillate isolering av cellepopulasjoner med iboende forskjeller og med forskjellig differensieringspotensialer, enten in vitro eller in vivo.

Den foreliggende fremgangsmåte tillater også klonal isolering av NSCer fra en rekke kilder uten genetisk modifisering eller inkludering av feeder-celler. Følgelig kan et svært lavt antall, fortrinnsvis mindre enn 1000 celler per kvadratcentimeter av celler, sås ut i en celledyrkningsskål klargjort som beskrevet ovenfor.

Noen få dager etter utsåing av NSCene kan cellene danne godt isolerte kolonier. Koloniene kan dyrkes til en ønsket størrelse, slik som minst omtrent 250 til omtrent 2000 celler. I en utførelsesform plukkes minst én koloni av celler manuelt og inokuleres enkeltvis til en ny celledyrkningsskål, slik som en multi-brønn plate.

Isolerte, klonale populasjoner kan ekspanderes ved seriell passasje og anvendes for etablering av flere nervestamcellelinjer. Mange slike klonale cellelinjer har blitt isolert fra forskjellige områder i det humane CNS, inkludert ryggmarg, midthjerne og bakhjerne. Klonale cellelinjer er nyttige for anrikning av en gitt cellefenotype, slik som en høyere andel av nevronale undertyper. For eksempel kan klonale cellelinjer anriket for tyrosin-hydroksylase-uttrykkende dopaminerge nevroner, GABAerge nevroner, kolinerge nevroner og nevroner med andre spesifikke fenotyper isoleres med de beskrevne fremgangsmåtene.

I en utførelsesform kan enten en polyklonal eller monoklonal nervestamcellelinje induseres til ytterligere anrikning av en gitt undertype av nevroner. En rekke vekstfaktorer, kjemikalier og naturlige substanser har blitt screenet for å identifisere effektive indusere av gitte nevroner, slik som tyrosinhydroksylase-uttrykkende dopaminerge nevroner og acetylcholin-produserende kolinerge nevroner, fra NSCer fra midthjerne eller ryggmarg. Faktoren eller kjemikalien eller kombinasjonen derav kan introduseres under den mitotiske fasen og/eller differensieringsfasen av NSCene. I en utførelsesform anrikes ytterligere en nerve-stamcellelinje for en dopaminerg fenotype som en donorpopulasjon for å behandle av Parkinsons sykdom.

Forskjellige nevronale undertyper kan tilveiebringes ved isolering av stamceller som har et ønsket differensieringsmønster in vitro. In wtro-resultater kan i det vesentlige reproduseres in vivo. Dette betyr at den potensielle virkningen av stamcellene in vivo kan forutsies ut fra differensieringsmønsteret av stamcellene in vitro. Ved injeksjon i levende, postnatale individer frembringer NSCer i enten en udifferensiert eller pre-differensiert tilstand i stor grad et in vivo differensieringsmønster som observert in vitro. Således vil NSCer som gir opphav til tyrosinhydroksylase-produserende nevroner in vitro også danne tyrosin-hydroksylase-produserende nevroner in vivo. Omvendt vil NSCer som ikke gir opphav til tyrosinhydroksylase-produserende nevroner konstitutivt in vitro ikke gi tyrosinhydroksylase-produserende nevroner/'/? vivo.

Imidlertid er differensieringssignaler som foreligger in vitro begrenset sammenlignet med dem in vivo. Således vil en vesentlig andel av de differensierte nevronene ikke uttrykke en viktig nevrotransmitter fenotype. Ytterligere signaler, slik som signaler fra afferente eller efferente nevroner, eller midler som etterligner slike naturlige signaler, kan anvendes for rekonfigurering av de differensierte fenotypene, enten under det mitotiske stadium av NSCer eller under deres differensiering. NSCer har evnen til å respondere på signaler foreliggende in vivo, så vel som in vitro. Etter transplantasjon inn i iskemi-skadet ryggmarg, danner således spinale NSCer en vesentlig høyere andel av GABA-produserende nevroner enn in vitro. NSCer er således plastiske. Slik plastisk natur av NSCer er karakteristisk for deres multi-potensialitet, og som sådan, kan denne plastisiteten anvendes for å identifisere fenotypeinduserende midler og betingelser som ytterligere kan kombineres med en NSC-populasjon for endring av dens egenskapene.

Slik reprogrammering kan inkludere behandling av NSCer fra et ryggmargsvev for å oppnå forhøyet ekspresjon av motonevron fenotyper. Behandlingsbetingelsene inkluderer dyrking av NSCer eller deres differensierte celler med forskjellige muskelceller eller celler avledet fra det perifere nervesystemet, slik som nevral listceller eller nevroner fra ganglier. NSCer kan også behandles med blandinger av molekyler som er kjente for å uttrykkes og produseres i motonevroner eller i ryggmargen for å forbedre NSC-ekspresjon av motonevron fenotyper.

For å indusere forbedret NSC-ekspresjon av den dopaminerge fenotype i human midthjerne, behandles NSCer med molekyler slik som litium, GDNF, BDNF, pleiotrofin, erytropoetin, kondisjonert medium fra celler slik som sertoli-celler, eller hvilke som helst andre egnede kjemikalier eller celler tilveiebragt ved screening, eller kombinasjoner av disse. Slik indusering kan gjøre det mulig for de transplanterte NSCer å uttrykke og opprettholde den dopaminerge fenotypen in vivo.

NSCene ifølge de beskrevne fremgangsmåtene kan inkludere pre-differensierte celler for anvendelse ved transplantasjon. For maksimalt utbytte av cellene og for å forenkle fremgangs-måten høstes en konfluent kultur for transplantasjon som omfatter primært en populasjon av udifferensierte celler. Det bør imidlertid forstås at en mindre populasjon av celler som nettopp har begynt å differensiere spontant kan også foreligge, grunnet den forhøyede celletettheten.

I en utførelsesform inkluderer passasje av NSC høsting eller løsning av cellene fra et underlag. I en utførelsesform inkluderer de beskrevne fremgangsmåtene høsting eller løsning av cellene fra et underlag ved anvendelse av minst ett enzym. Enzymatisk behandling kan unngås dersom cellesyklustiden for NSCene er kort nok til å deaktivere mitogen-reseptorene på celleoverflaten. Cellesyklustiden for humane NSCer er imidlertid mye lenger enn for gnager NSCer, slik at humane NSCer ikke er like sensitive for enzymatisk behandling. I de beskrevne fremgangsmåtene anvendes følgelig enzymatisk behandling for høsting av NSCer avledet fra et menneske. Selv om de humane NSCene kan bli midlertid refraktære ovenfor mitogen i nærvær av enzymatisk behandling, så kan gjentatt deaktivering av mitogen-reseptorene føre til en redusert andel av NSCer.

I en utførelsesform konsentreres cellene ved en kort sentrifugering ved høsting av cellene. Cellene kan videre vaskes og re-suspenderes i en endelig, klinisk anvendelig løsning, slik som saltvann eller bufret saltvann, eller alternativt re-suspenderes i en lagrings- eller dvaleløsning. Alternativt kan cellene re-suspenderes i et frysemedium, slik som medium tilsatt dimetylsulfoksid eller hvilket som helst annet egnet kryobeskyttende middel og fryses for lagring.

Dvaleløsningen er formulert for å opprettholde levedyktigheten til levende celler i et forlenget tidsrom. I en utførelsesform kan lagringsløsningen tilpasses til anvendelse for frakt av levende celler i en klar-til-bruk formulering til et transplantasjonskirurgi-sted for umiddelbar anvendelse. Egnede betingelser for frakt av levende celler til fjerntliggende steder inkluderer også en isoleringsinnretning som kan opprettholde et stabilt temperatur-område mellom omtrent 0 °C og omtrent 20 °C i minst 24 timer. Levende celler lagret ved mellom omtrent 0 °C og omtrent 8 °C i omtrent 24 timer til omtrent 48 timer er transplanterbare for behandling av en sykdom eller tilstand.

I en utførelsesform oppkonsentreres cellene i en løsning, slik som den klinisk anvendelige dvale- eller fryseløsningen som er beskrevet ovenfor. I en utførelsesform oppkonsentreres cellene til en egnet celletetthet, som kan være den samme eller ulik den celletettheten for administrering av cellene. Celletettheten for administrering kan variere fra omtrent 1000 celler per mikroliter til omtrent 1000000 per mikroliter, avhengig av faktorer slik som injeksjonsstedet, den nevrodegenerative statusen til injeksjonsstedet, minimums-dosen som er nødvendig for en gunstig virkning og toksisitetsbivirkning hensyn. I en utførelsesform inkluderer de beskrevne fremgangsmåtene injisering av celler ved en celletetthet på omtrent 5000 til omtrent 50000 celler per mikroliter.

Volumet av medium i hvilket de ekspanderte cellene suspenderes for tilførsel til et behandlingsområde kan her refereres til som injeksjonsvolumet. Injeksjonsvolumet avhenger av injeksjonsstedet og den degenerative statusen til vevet. Nærmere bestemt kan den nedre grense for injeksjonsvolumet bestemmes ut fra praktisk væskehåndtering av viskøse suspensjoner med høy celletetthet, så vel som av cellenes tendens til å klumpe. Den øvre grensen for injeksjonsvolumet kan bestemmes av grensene for kompresjons-kraften som utøves av injeksjonsvolumet som er nødvendig for å unngå å skade vertsvevet, så vel som av den praktiske operasjonstiden.

Lav celleoverlevelse av donorceller ved anvendelse av kjente fremgangsmåter har gjort det nødvendig å tilføre et stort antall celler til et relativt lite område for å forsøke på effektiv behandling. Injeksjonsvolum er imidlertid hydrostatisk trykk som utføres på vertsvevet, og den forlengede injeksjonstiden som er assosiert med høye injeksjonsvolumer forverrer kirurgisk risiko. I tillegg fører over-injeksjon av donorceller til kompresjon og påfølgende skade på vertens parenkymvev. I forsøk på å kompensere for volum-begrensninger, har kjente fremgangsmåter krevet fremstilling av suspensjoner med høy celletetthet for injeksjonene. Imidlertid fremmer en høy celletetthet tett klumping av de transplanterte cellene og inhiberer cellemigrasjon eller spredning, som forhindrer effektiv behandling utover et begrenset område og vanskeliggjør en sømløs integrasjon i vertsvevet.

I motsetning til dette, trengs det, som en følge av forbedret overlevelse in vivo av cellene fremstilt ved de beskrevne fremgangsmåtene, færre antall celler per injeksjon. Faktisk har opp til tre til fire ganger antallet av injiserte celler blitt vist å eksistere etter seks måneder fra tidspunktet for injeksjon, noe som viser en signifikant kvantitativ overlevelse ved anvendelse av de beskrevne fremgangsmåtene. Grunnet den kvantitative overlevelsen kan også reproduserbar administrering av ønskede celledoser oppnås. I en utførelsesform konsentreres følgelig cellene til en tetthet på omtrent 1000 til omtrent 200000 celler per mikroliter. Omtrent 5000 til omtrent 50000 celler per mikroliter har blitt anvendt for effektiv transplantasjon. Alternativt anvendes fra 10000 til 30000 celler per mikroliter. Cellene kan tilføres til et behandlingsområde suspendert i et injeksjonsvolum som er mindre enn omtrent 100 mikroliter per injeksjonssted. For eksempel ved behandling av nevro-degenerative tilstander i et menneske hvor flere injeksjoner kan utføres bilateralt langs ryggkanalen, kan et injeksjonsvolum på 0,1 og omtrent 100 mikroliter per injeksjonssted anvendes.

Hvilken som helst egnet innretning for injeksjon av cellene i det ønskede området kan benyttes i de beskrevne fremgangsmåtene. For eksempel kan en sprøyte som kan levere sub-mikroliter volumer over et tidsrom ved en i det vesentlige konstant strømmings-hastighet anvendes. Cellene kan fylles i innretningen gjennom en kanyle eller en fleksibel slange, eller via hvilken som helst annen egnet overføringsinnretning.

Det ønskede injeksjonsstedet for behandling av en nevrodegenerativ tilstand kan inkludere mist ett område av ryggmargen. Cellene kan implanteres i minst ett spesifikt segment eller område av ryggmargen, slik som hals-, bryst- eller lenderegionen av ryggmargen. I for eksempel lenderegionen går kun fem par av nerverøtter gjennom beinkanalen i ryggvirvelen, hvor hvert par av nerverøtter går ut fra ryggraden på hvert lendenivå fordelt over et stort område. Grunnet den lavere tettheten av nerverøtter i lendeområdet av ryggmargen, er lendeområdet spesielt velegnet for å gi et sikkert sted for injeksjon av celler. Cellene kan bli implantert i den intermediære sonen av ryggmargens parenkym.

Cellene kan injiseres på mellom omtrent 5 og omtrent 50 steder. Cellene kan injiseres på mellom omtrent 10 og omtrent 30 steder på hver side av margen. Minst to av stedene kan være separert av en avstand på fra omtrent 100 mikrometer til omtrent 5000 mikrometer. Avstanden mellom injeksjonsstedene kan være fra omtrent 400 til omtrent 600 mikrometer. Avstanden mellom injeksjonsstedene kan bestemmes basert på oppnåelse av i det vesentlige uavbrutt og kontinuerlig nærvær av donorceller gjennom spinal-segmentene og basert på det gjennomsnittlige injeksjonsvolum som viser seg å gi omtrent 2-3 måneders overlevelse i dyremodeller, slik som rotter eller griser. Cellene kan injiseres langs begge sider av midtlinjen til ryggmargen og spenner over lengden av minst flere lendesegmenter som er anvendelige for behandling av et symptom, slik som spastisitet/- rigiditet eller motonevron overlevelse. Det faktiske antall injeksjoner i mennesker kan ekstrapoleres fra resultater i dyremodeller.

Malsetet for injeksjonen kan være den grå substansen i ryggmargen. I den grå substansen kan kanylespissen plasseres for avlevering av NSCene til spesifikke nivåer av lamina. For eksempel for å tilføre GABA/glysinproduserende nevroner for å behandle spastisitet/rigiditet tilføres NSCene til området som omfatter lamina V-VII. Alternativt kan NSCene tilføres til eller nær det bakre hornet av den grå substansen til forskjellige spinalsegmenter, fra hals- til lende-, for å behandle nevropatisk smerte eller kronisk smerte. Alternativt kan NSCene tilføres i eller nær forhornet i den grå substansen i forskjellige spinalsegmenter fra hals- til lende-, for å behandle motonevron sykdommer, slik som ALS.

Cellene ifølge de beskrevne fremgangsmåtene kan danne et stort antall nevroner in vivo. Når NSCene ikke er åpenbart pre-differensiert før transplantasjonen kan NSCene proliferere opp til to til fire celledelinger in vivo før differensiering, noe som ytterligere øker antall effektive donorceller. Ved differensiering utskiller nevronene spesifikke nevrotransmittere. I tillegg utskiller nevronene til miljøet som omgir transplantatet in vivo vekstfaktorer, enzymer og andre proteiner eller substanser som er gunstige for forskjellige tilstander. Følgelig kan en rekke ulike tilstander behandles ved de beskrevne fremgangsmåtene, grunnet evnen til de implanterte cellene til å danne et stort antall nevroner in vivo og fordi de nevrodegenerative tilstandene kan skyldes eller være en følge av manglende elementer, innbefattet nevronavledede elementer. Følgelig kan individer som lider av degenerasjon av CNS-vev grunnet mangel på slike nevronavledede elementer, slik som vekstfaktorer, enzymer og andre proteiner, behandles effektivt ved de beskrevne fremgangsmåtene.

Tilstander som responderer på vekstfaktorer, enzymer og andre proteiner eller forbindelser som utskilles av de implanterte nevronene omfatter arvelige lysosomale sykdommer som Tay-Sach's sykdom, Niemann-Picks sykdom, Battens sykdom, Crabbs sykdom, ataksi og andre.

I tillegg inkluderer de beskrevne fremgangsmåtene for behandling implantering av cellene ekspandert in vitro som kan erstatte skadde eller degenererte nevroner, gi en inhiberende eller stimulerende virkning på andre nevroner og/eller frigjøre trofiske faktorer som bidrar til regenerasjon av nevroner.

Ytterligere motonevroner kan tilføres som erstatning for skadde eller degenererte nevroner. De beskrevne fremgangsmåtene inkluderer for eksempel tilveiebringelse av en tilstrekkelig nevral infrastruktur i syrinks i ryggmargen til å fylle kavitasjonen. Nevral infrastruktur er tilstrekkelig hvis den er i stand til å bremse utvidelsen av syrinks assosiert med syringomyeli som følge av traumatisk ryggmargsskade, arvelige tilstander eller hvilken som helst annen årsak. Det bør forstås at det å tilveiebringe en tilstrekkelig nevral infrastruktur også bidrar til å lindre ytterligere komplikasjoner som oppstår fra degenererende ryggmarg.

Ikke alle NSC er terapeutiske for en gitt sykdom. Typene av nevronale populasjoner som rammes i forskjellige sykdommer kan være forskjellige. Følgelig bidrar en terapeutisk effektiv donorpopulasjon av NSCer til å erstatte det tapte nevrale element. For eksempel kan behandling av spastisitet, anfall, bevegelsesforstyrrelser og andre muskulære hyperaktivitetstilstander inkludere tilveiebringelse av en terapeutisk effektiv mengde av celler som er i stand til å differensiere til inhibitoriske nevroner som danner GABA eller glysin. Distinkte populasjoner av NSCer kan vurderes in vitro ved å undersøke den differensierte nevronale fenotypen. In wtro-differensieringsmønsteret anvendes så for å forutsi effekten av cellene til å danne den egnede fenotype in vivo, ikke bare i form av en egnet nevrotransmitter fenotype, men også i form av en egnet morfologi, migrasjon og andre fenotypiske egenskaper ved nevroner.

NSCer kan implanteres som er i stand til å generere den nevronale undertypen som tilsvarer de skadde eller ødelagte nevronale undertypene som er assosiert med etiologien av symptomene. For eksempel kan hyperaktivitet av eksitatoriske kretser i individer være forårsaket av arvelige tilstander eller nerveskader grunnet spinaltraume, torakal/torako-abdominal aorta kirurgi, slag, epilepsi, hjernetraume, Huntingtons sykdom, urinblære inkontinens, hyperaktiv tarmbevegelse og hvilken som helst annen ikke-kontrollert muskelkontraksjon som følge av skade eller arvelige tilstander. Spastisitet, anfall eller annen form for hyperaktivitet opptrer i hjernen, i motsetning til ryggmargen, grunnet en rekke forskjellige etiologiske opphav. Fokal epilepsi antas for eksempel å oppstå fra en feilregulert hyperaktivitet grunnet mangel på GABA, som utøver tonal kontroll over koblingene. For dette formål inkluderer de beskrevne fremgangsmåter tilveiebringelse av inhiberende nevrotransmittere, slik som GABA eller glysin, i de rammede områdene ved transplantasjon av in wtro-ekspanderte NSCer. I tilfellet av spastisitet, anfall og annen form for hyperaktivitet, genereres for eksempel et antall NSCer som er i stand til å differensiere til inhibitoriske nevroner, slik som GABA-produserende eller glysinproduserende nevroner, in vivo for å bli transplantert for å svekke minst én hyperaktiv nevral krets assosiert med spastisitet, anfall eller annen form for nevronal hyperaktivitet. De beskrevne fremgangsmåtene kan følgelig anvendes for å behandle epilepsi og lignende tilstander med anfall.

De beskrevne fremgangsmåtene kan også anvendes for å behandle parese, paralyse, spastisitet, rigiditet eller hvilke som helst andre motoriske, tale eller kognitive symptomer som skyldes cerebral iskemi. Cerebral iskemi kan opptre som en følge av en slag-hendelse i hjernen eller fra et hjerteattakk i hvilket blod-sirkulasjonen til hjernen avbrytes i et signifikant tidsrom. Det er således analogt med ryggmargs-iskemien beskrevet ovenfor. Noen slagpasienter utvikler anfall av sentral opprinnelse, så vel som andre mangler, slik som hukommelsestap, paralyse eller parese. Disse manglene fra cerebral iskemi er også sannsynligvis på grunn av selektivt tap av inhibitoriske internevroner i hippocampus og/eller andre hjerneområder. De beskrevne fremgangsmåtene kan følgelig anvendes for å behandle slag-pasienter som lider av parese, paralyse, spastisitet eller andre motoriske, tale og kognitive symptomer.

Når det gjelder parese, slapp paraplegi og andre tilstander forbundet med tap av kontroll over muskelkontraksjon, slik som de forårsaket av ALS, traumatisk ryggmargsskade, iskemisk skade eller arvelige tilstander, så inkluderer de beskrevne fremgangsmåtene tilveiebringelse av nevronal implantering for å utøve en tilstrekkelig trofisk påvirkning til å bremse tapet av motonevroner. Nærmere bestemt letter de beskrevne fremgangsmåtene muligheten til de transplanterte NSCene til å utskille trofiske molekyler som kan avleveres til degenererende motonevroner under betingelser med optimal biotilgjengelighet. Slike trofiske molekyler omfatter eksocyterte superoksid-dismutaser, slik som superoksid-dismutase (SODI), lysosomale enzymer og ikke-proteinmolekyler, slik som celleproduserte antioksidanter. Andre trofiske faktorer som utskilles av de transplanterte cellene kan omfatte global celleavledet nevrotrofisk faktor (GDNF), hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF), vaskulær epidermal vekstfaktor (VEGF), pleiotrofin, vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), erytropoetin, midkin, insulin, insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1) og insulinlignende vekstfaktor 2 (IGF-2), eller hvilket som helst annet gunstig trofisk element.

En annen faktor som bidrar til evnen til de beskrevne fremgangsmåtene til å behandle et bredt utvalg av nevrodegenerative tilstander inkluderer de NSC-differensierte cellenes evne til omfattende å migrere langs eksisterende nervefibere. Migrasjon av de transplanterte cellene resulterer i en global fordeling og integrasjon med donornevroner og/eller gliaceller og en global eller dispergert tilførsel av det terapeutiske element som utskilles av slike celler.

Omfattende migrasjon av cellene muliggjør global og stabil tilførsel av viktige terapeutiske proteiner og forbindelser gjennom et nervesystem og kropp til et individ med behov for dette. Cellene ifølge de beskrevne fremgangsmåtene er følgelig effektive tilførselsbærere for terapeutiske proteiner og forbindelser. For slike tilførselsformål inkluderer de beskrevne fremgangsmåtene transplantasjon av cellene til forskjellige steder i nervesystemet, innbefattet CNS-parenkym, ventrikler, det subduralerommet, intratekal- og epidural-rommet, steder i det perifere nervesystem samt til områder utenfor nervesystemet, innbefattet tarm, muskel, endovaskulærsystem og subkutane seter.

Eksempel 1.

Ekspansjon av humane nervestamceller/progenitorceller fra ryggmarg

Ryggmarg fra minst én donor med en gestasjonsalder på omtrent 7-8,5 uker tilveiebringes. Et enkelt, sammenhengende vev fra ryggmargen dissosieres i Ca<++->og Mg<++->fritt fosfatbufret saltvann ved anvendelse av mekanisk triturering. Den resulterende cellesuspensjonen sås så ut i vevsdyrkningsskåler som på forhånd er belagt med både poly-L-ornitin eller poly-D-lysin og humant fibronektin eller andre proteiner fra ekstracellulær matriks. Vevsdyrkningsbehandlede skåler eller flasker ble inkubert med 100 ug/ml poly-D-lysin i 1 time ved romtemperatur. De ble så vasket tre ganger med vann og tørket. De ble så inkubert med 25 mg/ml i 5 minutter ved romtemperatur. Noen ganger ble 10 mg/ml fibronektin i 1 time ved romtemperatur anvendt. Noen ganger ble 1 mg/ml fibronektin i 18 timer ved 37°C anvendt. Dyrkningsmedium bestående av N2 (DMEM/F12 pluss insulin, tranferrin, selen, putrescin og progesteron) ble tilsatt human, rekombinant, basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF). Et konsentrasjonsområde fra 0,1 ng/ml - 100 ng/ml kan anvendes. Optimalt anvendes 10 ng/ml bFGF.

Den resulterende utgangskulturen består av postmitotiske nevroner og proliferative NSCer i et en-cellelag. Deretter, etter omtrent fem til omtrent tjue dager i kultur, dominerer de delende nestinpositive NSCene kulturen over de ikke-delende nevronene eller de sakte-delende gliacellene. Under disse dyrkningsbetingelsene favoriseres selektivt NSCer for ekspansjon. Den ekspanderende NSC-populasjonen passeres ved mild enzymatisk behandling, slik som ved anvendelse av trypsin. Cellene dyrkes i medium som er fritt for serum eller i det vesentlige er fritt for serum. Selv om lave konsentrasjoner av serum kan tolereres av cellene, er det best å unngå å eksponere cellene for serum, siden serum inneholder mange cytokiner, slik som LIF og CNTF, som fremmer glia-differensiering av NSCene. Under passasje stoppes følgelig enzymet som anvendes ved tilsetning av en spesifikk enzyminhibitor, slik som trypsininhibitor, snarere enn serum. Ved hver passasje telles antall høstede celler, og en fraksjon sås ut på nytt for videre ekspansjon. Som vist i Fig. 1 kan, ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, humane NSCer ekspanderes ut over 10<18->gangers økning av populasjonen samtidig som vekst- og differensieringsegenskapene bevares. Cellene kan ekspanderes reproduserbart. Som vist i Fig. 1 har seriell passasje av cellene blitt gjentatt tre ganger med en reproduserbar vekstkurve og doblingstid for cellene. Under ekspansjonen uttrykker nesten alle cellene nestin, in wVo-markøren for mitotiske nevroepitelial celler, og mangler antigener forbundet med differensierte nevroner og gliaceller, slik som type 3-beta-tubulin og GFAP. Cellene er også negative ved immunfarging for PSA-NCAM, en mulig markør for forpliktede nerve-progenitorceller, 04 og GaIC, markører for oligodendrocytter, og RC2, en markør for radiale gliaceller. Bestemt ut fra immunfarging, bevarer følgelig NSCene stabilt deres ekspresjon av antigenprofil gjennom den forlengede ekspansjonstiden. Et eksempel på morfologien og nestin-ekspresjonen vises i henholdsvis Fig. 2A, og B.

Eksempel 2.

Differensiering av humane nervestamceller/progenitorceller fra ryggmarg

På hvilket som helst tidspunkt under ekspansjonen av NSCene kan kulturene differensieres ved å fjerne mitogenet fra kulturen, slik som bFGF. Differensiering av NSCer følger i løpet av 1-3 dager etter fjerning av mitogenet, og distinkte, heterogene celle-morfologier er tydelige. På omtrent dag 4-7 av differensieringen kan nevronspesifikke antigener, slik som MAP2c, tau og type III beta-tubulin, synliggjøres ved immunfarging. Pa omtrent dag 12-14 er langstrakte, fascikulerte aksonale prosesser tydlige gjennom hele kulturen, sammen med en klar polarisering av den subcellulære proteintransporten. På omtrent dag 26 lokaliseres synaptiske proteiner, slik som synapsin og synaptofysin, til akson-endene og vises som punkformet farging. Ytterligere foringslag med astrocytter kan tilveiebringes for ytterligere å fremme langtidsmodning av nevronene. Som illustrert i Fig. 3, så generere differensiering av humane spinale NSCer blandede kulturer av nevroner og gliaceller, hvor nevronene på robust måte uttrykker nevronspesifikke antigener som tau, MAP2ab (A) og type3 beta-tubulin (B) og omfatter omtrent 50 % av kulturen. Som vist i Fig. 3B genererer kulturen spontant lange, buntede akson-kabler som strekker seg over flere centimeter. Som illustrert i Fig. 3C er en signifikant andel av nevronene GABAerge. Kolinerge motonevroner er også til stede i kulturen (Fig. 3D). Nærvær av en signifikant andel av GABA-nevroner i kulturen forutsier nytten av de humane, spinale NSCer for behandling av forskjellige nevrologiske tilstander som skyldes redusert GABA-produksjon i visse kretsløp. Likeledes viser nærvær av kolinerge nevroner at de humane, spinale NSCene kan gi motonevron-differensiering og forutsier nytten av dem for behandling av forskjellige motonevron-sykdommer som skyldes gradvis degenerasjon av motonevroner. For behandling ekspanderes NSCene med eller uten ytterligere fenotypefremmende betingelser, høstes og injiseres i et nevralt område med mangel.

Eksempel 3.

Ekspansjon av nervestamceller/progenitorceller fra human midthjerne

Et midthjernevev fra et foster i gestasjonsuke 7-8,5 tilveiebringes. NSC fra midthjernevevet tilveiebringes som beskrevet i Eksempel 1. Cellene passeres serielt over 160 dager med netto dyrkningstid, og den resulterende ekspansjonen er vist i Fig. 4. Gjennom ekspansjonstiden opprettholder NSC stabilt sitt multipotente og nevrogene potensial, så vel som differensieringspotensialet til å gi opphav til dopaminerge nevroner. Dopaminerge nevroner undersøkes ved nevronal ekspresjon om tyrosinhydroksylase (TH) og dopamintransportør (DAT).

DAT-ekspresjon er en markør for dopaminproduserende nevroner. DAT-ekspresjonen i nevroner kan undersøkes ved å måle dets evne til å transportere radioaktivt merket dopamin over synapsemembranen i differensierte nevroner i kultur. DAT-funksjonen i kulturer fra differensierte human midthjerne NSCer og monoklonalt avledede human midthjerne NSCer undersøkes ved analyse av opptak av radioaktivt merket dopamin (Fig. 5). Analyseresultatet viser en robust funksjonell dopaminerg aktivitet av human midthjerne NSCer. Den viser i tillegg at den dopaminerge fenotype kan anrikes ved isolering av monoklonale populasjoner av NSC som er spesielt tilbøyelig til å gi opphav til en høyere andel av dopaminerge nevroner etter differensiering (Fig. 5).

NSCer som danner anrikede dopaminerge nevroner er spesielt nyttige for behandling av Parkinsons sykdom. Pa tilsvarende måte kan NSCer som er pre-programmert på det tidspunkt de høstes fra vevet for forhøyet differensiering til en spesifikk fenotype anvendes for isolering av andre ønskede, spesifikke nevroner, slik som kolinerge nevroner fra forhjernen som er nyttige ved behandling av Alzheimers sykdom, ryggmargs kolinerge nevroner som er nyttige ved behandling av motonevronsykdommer, slik som ALS, serotonerge nevroner som er nyttige ved behandling av depresjon og GABAerge nevroner, som er nyttige ved behandling av epilepsi og Huntingtons sykdom.

Eksempel 4.

Differensiering av human midthjerne nervestamceller/progenitorceller

Human midthjerne NSCer/progenitorceller kan differensieres som beskrevet i Eksempel 2. Under den mitotiske fase til NSCene eller under deres differensiering kan andelen av den ønskede fenotype anrikes ved å behandle kulturen med forskjellige eksogene faktorer. Et eksempel på slike faktorer som er i stand til å anrike den dopaminerge fenotype fra human midthjerne NSCer, påvises ved det kondisjonerte mediet fra sertoliceller, som illustrert i Fig. 6A og 6B.

I studiene vist i Fig. 6A og 6B ble kryopreserverte nervestamceller tint og platet ut ved en tetthet på 40 000 celler per brønn i 4 brønners kammerobjektglass i nærvær av mitogen og fikk proliferere i 6 dager, hvoretter mitogen ble fjernet og cellene fikk differensiere i 8 dager. Cellene ble fordelt på fire grupper basert på tidspunkt og varighet av eksponeringen for sertolicelle-kondisjonert medium (SCCM, fortynnet 1:1 med N2a). Én gruppe ble eksponert for SCCM under proliferasjon og differensiering (betingelse 1), en andre gruppe ble eksponert kun under proliferasjon (betingelse 2), en tredje ble eksponert kun under differensiering (betingelse 3) og en fjerde gruppe ble ikke eksponert for SCCM (kontroll eller kont.). Mediet ble skiftet annenhver dag, og mitogen ble tilsatt daglig under den proliferative fasen. Fire brønner ble opprettholdt per tilstand for å muliggjøre farging for flere markører, og tre cellelinjer ble testet: 796MB, 527MB og 566SC. 566SC-celler, som var avledet fra ryggmarg, hadde ikke målbare TH-positive nevroner og ble utelatt fra figuren.

Etter differensieringen ble cellene fiksert ved anvendelse av 4 % paraformaldehyd og immunfarget ved anvendelse av antistoffer mot MAP2 (AP20-klon (Sigma), som gjenkjenner MAP2ab-undertypene), nevronspesifikt p-tubulin (TuJl (Covance)), og tyrosin-hydroksylase (Pel-Frys), så vel som GFAP (Dako) og GaIC (Chemicon). De immunfargede cellene ble tellet ved anvendelse av et 40x objektiv, og minst tre felter ble tellet for hver brønn. Få eller ingen GFAP+- eller GalC+-celler ble påvist ved analyse av celler opprettholdt under noen av disse betingelsene, så disse antigenene ble ekskludert fra analysen. I tillegg var 566SC-cellene for tette til å kunne kvantifiseres etter opprettholdelse under de beskrevne betingelsene, og ble ikke inkludert i den endelige analysen.

Analysen illustrerer at human midthjerne NSCer kan påvirkes av behandling med eksogene faktorer for søk etter nyttige proteinfaktorer eller kjemikalier for ytterligere anrikning av dopaminerge nevroner. Nye syntetiske/naturlige kjemiske- og proteinfaktorer kan således effektivt screenes ved anvendelse av humane NSC for tilveiebringelse av spesielt nyttige populasjoner for behandling av spesifikke indikasjoner, slik som Parkinsons sykdom.

Eksempel 5.

Behandling av spastisitet og rigiditet i rotter ved transplantasjon av nervestamceller/progenitorceller fra human ryggmarg

For induksjon av transient ryggmargsiskemi anvendes teknikken som tidligere er beskrevet i Taira (1996). Sprague-Dawley (SD)-rotter bedøves med halotan (1,5 %). Et 2 Fr Fogarty-kateter føres gjennom den venstre lårarterien og gjennom den nedadgående torakalaorta til nivået for venstre subklavia arterie. For å måle distalt arterietrykk (DBP) under nivået for aortaokklusjon, kanyleres halearterien med et polyetylen (PE-50) kateter.

Ryggmargiskemi induseres etter oppblåsing av det intra-aortiske ballong kateter med 0,05 ml saltvann. Systemisk hypotensjon under tidsrommet med aortaokklusjon reproduseres ved å ta ut en andel av arterielt blod (10,5-11 ml) fra en karotid arterie kanylert med et PE-50-kateter. Systemisk hypotensjon på omtrent 40 mm Hg kan induseres ved denne fremgangsmåten. Virkningen av okklusjonen er tydlig ved et umiddelbart og vedvarende fall i DBP mål i halearterien. Etter omtrent 10 minutter med indusert ryggmargsiskemi deflateres ballongen, og blodet som ble tatt ut fra halsarterien reinfuseres. Når det arterielle blodtrykket er stabilisert (i løpet av rundt 20-30 minutter etter gjenopprettet strøm), fjernes de arterielle kanylene og sårene lukkes.

Etter induksjon av ryggmargsiskemi vurderes gjenvinningen av motorisk funksjon med omtrent 2 dagers intervaller ved anvendelse av en modifisert 21-punkters lokomotorskala med åpne felt (BBB-skala)). Kun dyr med en BBB-poengsum på 0-4 velges for transplantasjonsstudie for eksperimentelle grupper).

Omtrent 7-21 dager etter den iskemiske lesjonen bedøves spastiske rotter med en BBB-poengsum på 0-4 med 1,5-2 % halotan i romluft og plasseres i et spinal-enhet apparat. En partiell laminektomi av Thll-L2 ryggvirvel utføres så. Et glasskapillær som har en tupp-diameter på 80-100 nm kobles til en trykkontrollert mikroinjektor. Rotter injiseres med 0,5 ul cellesuspensjon inneholdende 5 000, 10 000, 15 000 eller 20 000 humane nervestam-/progenitorceller per injeksjon. Hver rotte mottar i alt 6-8 injeksjoner på hver side av ryggmargen (venstre og høyre), jevnt fordelt mellom eksponerte L2-L6-segmenter. Senteret for injeksjonen målrettet til sentral grå substans (lamina V-VII)

(avstand fra framsiden av ryggmargen på L3-nivå: 1 mm). Etter implanteringen rengjøres snittet med 3 % H202og en penicillin/streptomycinblanding og lukkes i 2 lag. Rottene får så komme seg.

Immunsuppressiv behandling med FK-506 (Prograf, Fujisawa, 1 mg/kg i.p.) initieres for alle dyr rundt 3 dager før ryggmargstransplantasjon. Etter transplantasjonen mottar dyrene immunsuppressiv behandling daglig under hele overlevelsesperioden. Immunavstøtning av disse transplantatene kan effektivt forhindres med FK-506. Rottene overlever i omtrent 2 eller 7 uker (n=5 for hvert tidspunkt).

Ved slutten av overlevelsesperioden bedøves rottene med pentobarbital (40 mg/kg i.p.) og transkardialt dynkes med heparinisert saltvann i 1-2 min, fulgt av 4 % paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB). Ryggmargene dissekeres og post-fikseres i det samme fikseringsmiddelet over natten ved 4°C. Etter post-fikseringen kryobeskyttes ryggmargs-vevet i en gradert sukkroseløsning (10, 20 og 30 %) i totalt tre dager. Frosne koronale, parasagittale eller horisontale ryggmargssnitt (10-30 nm) kuttes deretter. For immunhistokjemisk analyse plasseres frittflytende snitt (30 nm) i 0,1M PBS (pH = 7,4) tilsatt 5 % normalt geiteserum (NGS) og 0,2 % Triton X100 (TX) i 2 timer ved romtemperatur for å blokkere den uspesifikke proteinaktiviteten. Dette etterfølges av over natt inkubering ved 4 °C med forskjellige primære humanspesifikke antistoffer.

Etter inkubering med primære antistoffer vaskes snittene 3X med PBS og inkuberes med sekundære geit-anti-kanin- eller -anti-muse-antistoffer konjugert med en fluorescensmarkør (Alexa 488 eller 594, 4 nl/ml, Molecular Probes). Alle blokkerings- og antistoff-preparater lages i 0,1 M PBS/0,2 % TX/5 % NGS. For dobbeltmerkings-eksperimenter tilsettes primærantistoffer fra forskjellige arter samtidig, etterfulgt av anvendelse av sekundærantistoffer konjugert til forskjellige fluorescensmarkører. I kontrolleksperimentene utelates primærantistoffene. For generell kjernefarging tilsettes DAPI (3nl/ml) til de endelige sekundær-antistoff løsningene. Etter faringen tørkes snittene ved romtemperatur og dekkes med Prolong anti-fade kit (Molecular Probes).

Objektglassene analyseres ved anvendelse av et Leica Fluorescensmikroskop. Bilder (512 x 512 piksler) fanges med et Olympus digitalkamera og prosesseres med Adobe Photoshop 5.5 (Adobe Systems, Moutain View, CA). For å bekrefte ko-lokalisering av forskjellige antistoffer i dobbeltfargede snitt, fanges bildene med et DeltaVision dekonvolvering mikroskopsystem som inkluderer en Photometrics CCD montert på et Nikon-mikroskop (Applied Precision, Inc.). Generelt tas 60 optiske snitt med en avstand på 0,1 eller 0,2 nm. Linsene som anvendes er 20x, 40x og 60x (NA 1.3). Datasettene dekonvolveres og analyseres ved anvendelse av programvaren SoftWorx (Applied Precision, Inc.) i en Silicon Graphics Octane arbeidsstasjon.

Det totale antall transplanterte nevroner som er immunreaktive for det humane nukleære NUMA-antistoff estimeres ved anvendelse av serologisk, uhildet og systematisk prøvetaking. Hvert tiende, tidligere-farget snitt tatt fra L2-L6 spinalsegmenter anvendes for stereologisk kvantifisering etter anvendelse av et fraksjonerings-prøvetakingsskjema. De optiske bildene (1 nm tykke) tilveiebringes med et Leica DMLB-mikroskop ved anvendelse av et lOOx oljeimmersjonsobjektiv med numerisk blenderåpning 1,3. De optiske bildene tas ved anvendelse av et digitalt kamera (Olympus) og ImagePro programvare (Media Cybernetics) levert med et StagePro-kontrollert, motorisert Z-objektbord (Media Cybernetics). Det totale antall transplanterte celler beregnes deretter ved å benytte fraksjoneringsformelen N = Q x 1/hsf x 1/asf x 1/ssf, hvor N er et totalt antall positive kjerner, Q er summen av celler tellet, hsf er høyden prøvetakingsfraksjonen, asf er areal prøvetakingsfraksjonen og ssf er skive prøvetakingsfraksjonen.

For tilveiebringelse av et tredimensjonalt, rekonstruert bilde av de transplanterte humane NSCene i den iskemiske ryggmargen anvendes tidligere lagrede bilder tatt fra serielt snittede ryggmarger. Gjennomsnittlig anvendes omtrent 60-100 serielle snitt for tredimensjonal rekonstruksjon. I det første trinnet åpnes en bunke av serielle bilder ved anvendelse av Ellipse programvaren og sammenstilles ved anvendelse av den spesialutviklede Allign modulen (VidiTo, SK). Sammenstillingsprosessen består av å definere to morfologiske referansepunkter i alle de serielle ryggmargsbildene (det første punkt: senter av den sentrale kanalen, det andre punkt: dorsal hornets mediale grense), etterfulgt av en datamaskinprosessert sammenstilling av alle bilder. For å identifisere grensene til dorsal- og ventralhornene trekkes deretter linjer på bunken av tidligere sammenstilte bilder ved anvendelse av Laminar map modulen (Ellipse). Endelig anvendes bunken av tidligere sammenstilte og laminar-maps-merkede bilder for den tredimensjonale rekonstruksjon ved anvendelse av 3-D constructor (Media Cybernetics).

Dyrking av humane, ryggmargs NSCer på rotteastrocytter i to til tre uker viste en tidsavhengig modning og utvikling av nevral fenotype i de fleste kulturer. Dette bekreftes ved farging med human-spesifikke antistoffer mot NSE eller MOC. Tallrike nevroner med et godt utviklet aksodendrittisk tre påvises også. Flertallet (85-90 %) av de NSE-positive nevronene er GABA-positive. Ekspresjon av synaptofysin i aksoner og dendritter observeres i noen MOC-positive nevroner.

En robust overlevelse av celler ved transplantasjon i 21 dager etter iskemisk skade observeres. Dette uttrykker seg som klart identifiserbare, bilaterale transplantater som er immunreaktive for NUMA, MOC eller NSE, alle humanspesifikke antistoffer. Analyse av horisontale snitt tatt fra transplanterte ryggmargssegmenter viser en klar migrasjon av NUMA-positive celler mellom de individuelle injeksjonsstedene. Majoriteten av de NUMA-positive cellene viser ko-lokalisering med MOC-immunreaktivitet.

Dobbeltmerking av ryggmargssnitt med NUMA- og GABA-antistoffer analysert med konfokal mikroskopi viser gjennomsnittlig 25-35 % GABA-positive celler. En konsistent ekspresjon av GABAerg fenotype observeres i alle transplanterte dyr etter syv ukers overlevelse.

På det samme tidspunkt (dvs. syv uker etter transplantasjonen) viser dobbelt-farging med synaptofysin- og NUMA-antistoff et tett synaptofysin-positivt nettverk inne i transplantatene.

Bare noen ganger vil NUMA-positive celler vise ko-lokalisering med GFAP-antistoff. Disse cellene er vanligvis lokalisert i periferien av transplantatene.

Den stereologiske estimeringen av NUMA-positive celler viser et gjennomsnitt på 75 460 +. 5 6976 vedvarende transplanterte celler i de enkelte transplantatene. Dette representerer gjennomsnittlig 3-3,6 ganger flere celler enn hva som opprinnelig ble injisert. Cellesyklusantigenet Ki67 er en markør for aktivt mitotiske celler. Farging av ryggmargssnitt to eller sju uker etter transplantasjonen viser hKi67-immunreaktivitet bare ved to uker etter transplantasjonen. Bare sporadisk (1-2 celler/10 snitt) er celler Ki67-positive etter sju ukers overlevelse. Disse resultatene indikerer at de transplanterte humane, ryggmargs NSCene og deres avkom ekspanderer i et antall tilsvarende til et gjennomsnitt på omtrent tre celledoblinger for den innledende to-ukers perioden, som deretter blir postmitotiske og stabilt integrert.

Volumrekonstruksjon av transplanterte L3-L5-segmenter utføres ved anvendelse av bilder tatt fra 40 \ im tykke serielle rygg rna rgssnitt farget med MOC-antistoff og DAPI (i alt 150-200 snitt). Tredimensjonal rekonstruksjon av transplantatet viser et lett gjenkjennelig, rostrokaudalt orientert MOC-positivt implantat fordelt inne i den grå substansen. Som illustrert i Fig. 7 og Fig. 8, undersøkes den funksjonelle effekten av de humane, ryggmargs NSCene ved å transplantere cellene og måle forbedringen av motorisk aktivitet ved BBB-poengsetting.

Når det gjelder graden av atferdsmessig forbedring observert i den foreliggende studien, har vi sett tre hovedgrupper etter transplantasjon. For det første, dyr som viser den mest robuste forbedringen og evnen til å gå (BBB<16), for det andre, dyr som viser forbedring i den aktive mobilitet av alle 3 ledd i de nedre ekstremiteter, men som ikke kunne stå (BBB omtrent 8) og den tredje gruppen med dyr som ikke viste noen forbedring (dvs. ikke-responderende). Mens årsaken til forskjellene i mottagelighet av transplantasjonen ikke er klar, spekulerer vi i at subtile forskjeller i transplantat-plasseringen med hensyn til de dysinhiberte, primære afferente cellene og/eller a-moto-nevronene kan spille en rolle. Det bør videre bemerkes at dyrene bare overlevde i 3 måneder i den foreliggende studien. Vi spekulerer i at en langsiktig post-transplantasjons-overlevelse og fortsatt fysisk rehabilitering sannsynligvis vil være forbundet med en høyere grad av funksjonell forbedring. Ikke desto mindre ble, i motsetning til behandlingsgruppen, ingen signifikant forbedring observert i noe dyr injisert med medium alene,

Eksempel 6.

Behandling av motonevronsykdommer ved transplantasjon av humane, ryggmargs NSCer (referanse eksempel)

NSCene ifølge de beskrevne fremgangsmåtene gir både kliniske og biologiske fordeler som er kraftige og signifikante. For dette formålet tillater de beskrevne fremgangsmåtene behandling av tilstander som er formidlet både gjennom sentralnervesystemet, slik som ALS, så vel som er lokalisert til et gitt område, slik som ved ryggmargsiskemi som beskrevet ovenfor. I ALS, selv om transplantasjon i den lumbale ryggmargen kan utelate andre vitale deler av det segmentale motoriske apparat, dvs. den hals-motonevron-kolonne som er ansvarlig for respiratoriske bevegelser, så fremmer de beskrevne fremgangsmåtene for implantasjon av NSCer i ryggmargen frigjøring av BDNF og GDNF og andre faktorer fra de transplanterte cellene til CSF, hvor en bredere effekt på vertsmotonevroner gjennom hele margen kan forekomme.

Det har overraskende blitt funnet at partielle transplantater av humane NSCer inn i de lumbale segmentene av det nevrodegenerative ryggmargs miljø overlever, gjennomgår omfattende nevronal differensiering og fremmer motonevronoverlevelse og funksjon, både på implanteringsstedet og på andre steder. NSCene forsinker signifikant fremkomsten av symptomer og utvider levetiden til SODI G93A-rotter, en modell for ALS (amyotrofisk lateralsklerose) hos mennesker.

SODI G93A-rotten representerer en omfattende modell for nevropatologien og de kliniske symptomene på en spesielt aggressiv form av ALS. ((Nagai et al., 2001, Howland et al., 2002)). NSCer fra human, føtal ryggmarg kan transplanteres inn i korsryggsmargen hos SODI G93A-rotter og mus, hvor en omfattende differensiering av nevronene skjer og hvor de differensierte nevronene deretter danner synaptiske kontakter med vertsnevroner og uttrykker og frigjør GDNF og BDNF. For eksempel SODI G93A-modellen i rotte, som særpreges av fulminant motonevronsykdom, kan anvendes for å undersøke og demonstrere de gunstige virkningene av NSCer i sykdommen. For dette formål overlever NSC-transplantatene som benyttes i de beskrevne fremgangsmåtene godt i et nevrodegenerativt miljø og utøver kraftige, kliniske virkninger. I det minste en del av disse virkningene er forbundet med disse transplantatenes evne til å uttrykke og frigjøre motonevron-vekstfaktorer. Følgelig vil de transplanterte NSC ifølge de beskrevne fremgangsmåtene forsinke fremkomsten og utviklingen av den fulminante motonevronsykdom og utvider levetiden for disse dyrene med mer enn 10 dager, trass i det begrensende transplantasjonsskjema som var begrenset til den lumbale protuberans.

Humane NSC (NSI-566RSC) fra ryggmargsvev fra et post-morten humant foster på 8 ukers gestasjonsalder ekspanderes i serumfritt medium tilsatt fibroblastvekstfaktor (FGF-2) i omtrent 10-12 passasjer før transplantasjonen (Johe et al., 1996). Skjebnen til disse cellenes kan på pålitelig vis spores med antistoffer mot humane nukleære antigener (HNu)

(Yan et al., 2003). Alle kirurgiske fremgangsmåter ved anvendelse av disse cellene utføres ifølge fremgangsmåter som er godkjent av «Animal Care and Use Committee of the Johns Hopkins Medical Institutions» ved anvendelse av gassbedøvelse

(enfluran:oksygen:nitrogenoksid = 1:33:66) og aseptiske fremgangsmåter.

Levende eller døde NSCer transplanteres inn i korsfremspringet (L4 & L5) hos 9 uker gamle (220-300 g) SODI G93A-rotter av begge kjønn, montert på en Kopf sipnalstereotaktisk enhet under mikroskopisk styring. Døde celler fremstilles ved gjentatt frysing og tining før transplantasjonen. Cellesuspensjonene tilføres under aseptiske betingelser, med omtrent 8 injeksjoner rettet mot ventralhornet på begge sider av ventralhornet (5 x IO<4>NSC per injeksjonssted, fire injeksjonssteder på hver side) med uttrukne og avrundede mikropipetter av glass koblet via silastik slanger til 10 \ i\ Hamilton mikrosprøyter. Alle rottene mottar FK-506 (1 mg/kg i.p.) for å forhindre immunrejeksjon basert på utprøvinger som indikerer at transplantatoverlevelsen ikke overskrider 1 måned i ubehandlede dyr eller dyr som mottar syklosporin.

Rottene testes for motorisk styrke og vekt to ganger i uken. Testene av motorisk styrke omfattet Basso, Beattie og Bresnahan (BBB)-lokomotorvurderingsskalaen (Basso et al., 1995) og skråplan skalaen (Rivlin og Tåtor, 1977). Fortest av BBB-poeng testes dyrene i omtrent 4 eller 5 minutter i et åpent område. Alle lokomotoriske ytelser registreres og vurderes i henhold til skalaen. For skråplantesting plasseres rottene på matten på skråplanet, og vinkelen justeres til det maksimale punktet hvor deres posisjon kan stabilisere i omtrent 5 sekunder. Denne vinkelen registreres så som dyrets skråplan poeng. BBB- og skråplanpoeng analyseres ved MANOVA, etterfulgt av Fisher LSD post hoc test. Sykdomsutbrudd er definert som det punkt hvor kroppsvekten begynner å avta brått. Sykdomsforløpet som en funksjon av transplantattype (transplantering av levende eller døde celler) analyseres ved å sammenligne alder ved sykdomsutbrudd og alder ved død mellom de to gruppene (med students t-test), så vel som med Kaplan-Meier overlevelses-analyse etterfulgt av long-rank-test.

Rottene avlives ved perfusjon-fiksering når deres BBB-poengsummen (se nedenfor) er lavere enn 3, et stadium hvor kun ett ledd har bevegelse eller hvor det ikke foreligger bevegelse i det hele tatt, og dyret anses som døende.

Vev fremstilles fra dyr oversprøytet med 4 % nøytralbufret paraformaldehyd. De torakolumbale ryggmargssegmentene med vedhengende røtter og lumbalnerver fikseres ytterligere ved immersjon i det samme fikseringsmiddel i ytterligere 4 timer. Blokker som inneholder hele det transplanterte området pluss 1 mm grense over og under blokken og nedfryses for videre prosessering. L3-Sl-røttene prosesseres separat som helmonterte preparater eller etter separasjon av smårøtter med varmekoagulerte spisser av glasspipetter. Blokkene snittes i transversal- eller sagitalplanet (35nm). NSC-overlevelse og -differensiering undersøkes ved immunfluorescens med dobbeltmerking, som i de fleste tilfeller kombinerer HNu, en humanspesifikk markør, med en annen cellulær markør og utføres som beskrevet i Yan et al., 2004.

En ikke-stereologisk fremgangsmåte for telling av det totale antall HNu (+)-celler, så vel som celler som er dobbeltmerket med HNu og en fenotypisk markør på tilfeldig utvalgte felter med høy forstørrelse (100x) fra våre immunfluorescenspreparater anvendes for å studere NSC-differensiering. Ett felt i hvert av seks snitt med avstand~1 mm fra hverandre gjennom det transplanterte området anvendes fra hvert dyr. Antall av HNu (+) og dobbeltmerkede profiler oppsamles fra alle de 6 feltene som telles fra hvert dyr og grupperes ut fra den eksperimentelle protokollen. Gjennomsnittlig antall enkelt- og dobbeltmerkede celler beregnes for hver behandlingsgruppe (n=6 per gruppe).

For å vurdere motonevronoverlevelse i rotter transplantert med levende eller døde celler (n=4 i hver gruppe), evalueres vev fra dyr avlivet i en alder på 128 dager. Fra hvert sjette snitt fra L3-Sl-området fra hvert dyr tas prøver som for sterologiske krav (Yan et al., 2004), og cc-motonevroner, identifisert som multipolare celler med en distinkt kjerne og en soma-diameter på >35 nm, telles med den optiske fraksjoneringsenheten som beskrevet i Yan et al., 2004. Forskjeller mellom dyrene transplantert med levende vs. døde celler analyseres med students t-test.

For ELISA-bestemmeise av motoriske nevrotrofiske faktorer tas CSF-prøver med en 25 G kanyle fra den 4. ventrikkel hos dyr under gassbedøvelse. Vevsprøver som inneholder de transplanterte stedene og områder i nabostilling til disse, dissekeres transvers fra 1 mm tykke, ferske ryggmargssnitt. CSF-prøvene eller vevsprøvene prosesseres, og totalprotein måles først som beskrevet i Sheng et al., 2003. Nivået av GDNF og BDNF måles i CSF- og ryggmargsprøver ved anvendelse av E-Max ImmunoAssay-system (Promega, Madison, WI). TMB-kromogen-absorbansen avleses ved 450 nm. Variansen i konsentrasjoner mellom prøver fra levende transplantater, områder i nabostilling til transplantater og transplantater av døde celler analyseres ved enveis ANOVA fulgt av Tukey's multiple sammenligning post hoc-test. Forskjellen i CSF-konsentrasjon mellom dyr transplantert med levende vs. døde celler analyseres med students t-test.

For western-blotting av motoriske nevrotrofiske faktorer, fraksjoneres protein-prøver fra CSF eller ryggmarg fremstilt som for ELISA med molekylvektmarkører og det overføres til nitrocellulosemembraner. Blottene blokkeres med TBS, pH 7,4 tilsatt 5 % eselserum og inkuberes så med GDNF- og BDNF-antistoff (1:500 over natten, 4 °C), og deretter med HRP-koblet esel-anti-geit-IgG (for GDNF) og -anti-kanin-IgG (for BDNF)

(1:2000, Jackson ImmunoResearch) (1 time, RT). Alle antistoffer fortynnes med TBS tilsatt 5 % eselserum. Blottene fremkalles med SuperSignal Chemiluminescent Substrate (Pierce) og eksponeres på Kodak-XAR-film (Eastman Kodak, Rochester, NY). Blottene blir deretter strippet og re-blottes med p-aktin antistoff (1:500, Sigma) og HRP-koblet esel-anti-mus-IgG (1:10 000, Jackson ImmunoResearch). Immunreaktive bånd analyseres med Bio-Rad Quantity One programvaren (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Forholdet mellom båndtettheter (GDNF eller BDNF: p-aktin) beregnes per dyr, og gjennomsnittsverdien for gruppen føres inn for statistisk analyse som i tilfellet med ELISA-eksperimentene.

Humane NSC i ryggmargen hos SODI G93A-rotter 22 uker etter transplantasjonen identifiseres ved immunfarging med humanspesifikt HNu-antistoff. HNu (+)-celler vises å overleve i det ventrale hornet (A) og det store flertallet farges med markører for nevronal avstamning, slik som den mikrotubulus-assosierte epitopen TUJ-1. Humane NSCer identifiseres ut fra deres humane kjerneprotein (HNu)-signatur, og deres fenotypiske skjebne følges ved dobbelt immuncytokjemi for HNu og epitoper som er spesifikke for nerveforløpere, nevronale- og gliaceller. Ved slutten av eksperimentene i SODI G93A-rotter, viser humane NSCer en robust implantering og utmerket langtids overlevelse. Et flertall av HNu (+)-cellene (70,4 +. 6,4 %) ble differensiert til den nevronale avstamingen, basert på ko-lokalisering med TUJ-1. Omtrent 1/5 (19,2 +. 5,6 %) av HNu (+)-cellene ko-lokaliserte med nestin, og svært få (1,3 + 0,9 %) HNu (+)-celler var positive for GFAP.

Kapasiteten til humane NSCer til å integreres inn i vertens kretssystem analyseres med perikaryale markører for transplantat/vertsceller og markører som er selektive for enten verts- eller transplantatterminaler. Snittene farges for HNu for å fastslå transplantat-opprinnelse, med TUJ-1 for å fastslå nevronal differensiering og et monoklonalt antistoff mot det pre-synaptiske protein Bassoon (BSN), som gjenkjenner rotte- og muse-epitoper, men ikke humane epitoper. Et stort antall HNu (+)-, TUJ-1 (+)-celler i parenkymale lokaliteter er funnet å bli kontaktet av synaptiske boutoner av rotteopprinnelse.

I konfokal mikroskopi blir NSC-avledede nevronale celler med HNu (+)-kjerne og TUJ-1 (+)-cytoplasma kontakt av rotteterminaler. Omvendt viser preparater farget med TUJ-1 og humanspesifikt synaptofysin tette terminale felt med små boutoner festet til vertsnevroner, særlig store og små motonevroner. Et vertsmotonevron kontaktes av et stort antall transplantatavledede boutoner. Horisontale snitt farget for HNu og human NF-70 viser et stort antall transplantatavledede aksoner som forlater transplantatet til venstre og som fortrinnsvis strekker seg langs den hvite substans i den ventrale funikkel. Celler/prosesser med ChAT-immunreaktivitet anvendes for å skille grå fra hvit substans i ventralhornet. Et stort antall aksoner merket med humanspesifikke antistoffer mot nevro-filament-epitopen NF70 finnes i assosiasjon med transplantatstedene, noe som viser at mange humane NSC differensierer til projeksjonsnevroner, disse aksonene viser en preferanse for den hvite substansen i ventralhornet.

NSC-transplantater i korsryggsmargen hos SOC1 G93A-rotter forlenger levetiden og forsinker motonevrondød og sykdomsutløsning og progresjon. En progresjonsanalyse av kliniske og patologiske mål i tilfeller med transplantasjon av levende celler (L) og døde celler (kontroll, C) er vist i Fig. 9. Dyr transplantert med levende NSCer viste en signifikant forlenget overlevelse, både ved Kaplan-Meier-analyse og sluttpunkts analyse. Et Kaplan-Meier-plott (Fig. 9A) viseren signifikant separasjon mellom forsøks- og kontrolldyrene i løpet av observasjonen (P=0,0003). Tidskurver for BBB-åpent felt og skråplan test poeng (Fig. 9B) viser en signifikant langsommere progresjon av muskelsvakhet hos dyr transplantert med levende NSCer, sammenlignet med dyr som mottok døde NSCer.

Effekten av NSCer på motonevronoverlevelse i korsfremspringet (L3-S1) og Tg-rotter undersøkes i en liten gruppe av dyr som mottar levende eller døde NSCer og avlives ved 128 dagers alder. Den gjennomsnittlige levetid for dyrene transplantert med døde NSCer er 138 dager, mens rotter transplantert med levende NSCer lever i 149 dager. Det er derfor en signifikant 11-dagers forskjell i levetid mellom forsøks- og kontroll-rottene (P=0,0005). En gjennomsnittlig tid-til-sykdomsoppstart er 115 dager for dyr som mottar døde celler og 122 dager for dyr som er transplantert med levende NSCer. En signifikant 7-dagers forskjell observeres i tid-til-sykdomsoppstart mellom de to gruppene (P=0,0001).

Det sterologisk estimerte antall a-motonevroner er 6 418 for dyr som mottar levende NSCer og 3 206 for rotter som er transplantert med døde NSCer, dvs. det er to ganger så mange nevroner i korsfremspringet hos forsøks- sammenlignet med kontrolldyrene av samme alder. En forskjell på 3 212 celler i korsfremspringet mellom levende og døde NSC-grupper observeres (P=0,01) i en representativ forsøks- og kontrollrotte ved 128 dagers alder.

Mulige mekanismer for nevro-beskyttelse som gis av humane NSCer til degenererende motonevroner inkluderer ekspresjon og frigjøring av to peptider med klassiske, trofiske virkninger på motonevroner hos pattedyr, (BDNF og GDNF) (Henderson et al., 1994, Koliatsos et al., 1993). Ekspresjon og frigjøring av GDNF og BDNF i ryggmargen hos transplanterte SODI G93A-rotter bestemmes. Margpreparater og CSF-prøvetakinger evalueres for BDNF og GDNF ved Western-blotting og ELISA. GDNF-konsentrasjonen i parenkymmet og CSF hos rotter transplantert med levende celler (LI og L2) og dyr transplantert med døde celler (C) bestemmes ved ELISA. LI viser konsentrasjoner gjennom transplantasjonsstedet, mens L2 viser konsentrasjoner i vev ett segment ovenfor eller nedenfor. Variansen mellom gruppene er signifikant og er forårsaket av en stor forskjell mellom LI- eller L2- og C-gruppene.

Forskjellen i CSF-konsentrasjoner mellom forsøks- (levende celler, L) og kontroll-gruppen (døde celler, C) er også signifikant ut fra t-testen. ELISA viste en konsentrasjon på 0,912 + 0,050 pg/ng i transplantasjonsstedet og 0,819 +_ 0,115 pg/ng et segment unna i ryggmargen hos dyr transplantert med levende NSCer. I dyr transplantert med døde NSCer var disse konsentrasjonene 0,368 +_ 0,026 pg/ng i ryggmargssegmenter som inneholdt transplantatet. I CSF var GDNF-konsentrasjonen 0,027 +_ 0,012 pg/nl i forsøksdyrene og 0,006 + 0,002 pg/nl. Disse dataene viser en tre-gangers økning i ekspresjonen og frigjøringen av GDNF i ryggmargen og en fem-gangers økning av GDNF-sekresjonen i CSF hos dyr tilført levende NSCer.

Western-blotting viser også en høyere normalisert GDNF-konsentrasjon i dyr transplantert med leverende NSCer. GDNF-Western-blotting bekrefter ELISA-mønsteret for økningen ved påvisning av et 16 kDa protein. Western-blotting viser også en normalisert GDNF-tetthet på 0,860 + 0,007 i levende-celle transplantater og 0,708 + 0,052 død-celle transplantater.

ELIsa-farging av BDNF i parenkym og CSF hos forsøksrotter og kontroller bestemmes. ELISA-analyse viser en konsentrasjon på 0,086 +_ 0,014 pg/ng i transplantasjonsstedet (LI) og 0,054 +_ 0,009 pg/ng et segment unna transplantatet i forsøksdyrene (L2). I kontroll-rottene var BDNF-konsentrasjonen 0,010 + 0,003 pg/nl i transplantatholdige segmenter. Forskjellen mellom CSF-konsentrasjonen i forsøks- og kontrolldyr er signifikant. I CSF er BDNF-konsentrasjonen 0,041 +_ 0,013 pg/nl i forsøksdyrene og 0,010 +_ 0,008 pg/nl i kontrollene. Disse funnene indikerer en åtte-gangers økning i BDNF-konsentrasjonen i ryggmargen og fire-gangers økning i CSF hos forsøksdyrene. Sett under ett, tyder ELISA-dataene på en mer utbredt sekresjon av GDNF sammenlignet med BDNF i dyr transplantert med levende NSCer, særlig i CSF.

Immuncytokjemi viser også at det store flertall av de transplanterte NHu(+)-cellene uttrykker GDNF. Kilden til GDNF i dyr med leverende transplantater er de transplanterte cellene selv. I de dobbeltfargede preparatene for HNu (rødt) og GDNF (grønt) vises overflod av GDNF-immunreaktivitet i cytoplasma hos transplanterte NSCer. I dyr som mottar levende transplantater er det en intens GDNF-immunreaktivitet i runde cytoplasmatiske strukturer som ligner sekretoriske vesikler inne i vertsmotonevroner.

Konfokal mikroskopi gjennom et verts motonevron farget med GDNF og humant synaptofysin (det siste for merking av transplantatavledede terminaler) indikerer lokaliseringen av GDNF i vesikulære strukturer, men ikke i transplantatavledede terminaler lokalisert på overflaten av det viste vertsmotonevronet. Snitt farget med antistoffer mot humant synaptofysin (for merking av alle transplantatterminaler som innerverer vertsmotonevroner) og GDNF viser mangel på enhver form for ko-lokalisering av de to proteinene i boutoner som kontakter vertsmotonevroner.

Rotter med levende transplantater viser en utforming av baner med opprinnelse i transplantatet og som innerverer strukturer i og rundt sentralkanalen. I motsetning til fraværet av GDNF-protein i terminaler som kontakter vertsmotonevroner, ko-lokaliserer det store flertall av NSC-avledede aksonterminaler som innerverer sentralkanalen med GDNF-immunreaktivitet. En utbredt ko-lokalisering av humant synaptofysin og GDNF observeres inne i transplantatavledede terminaler som innerverer ependymceller i sentralkanalen. Disse anatomiske mønstrene indikerer at GDNF trolig tas opp av vertsmotonevron-terminaler som innerverer transplantatet via retrogradtransport, og ikke tilføres til disse nevronene via trans-synaptisk overføring (Rind et al., 2005).

Den tilsynelatende resistensen av transplanterte NSCer for den pågående degenerative prosessen i ventralhornet hos SODI G93A-rotter er spesielt lovende. Overlevelsen og den omfattende differensieringen av NSCer som rapporteres her, er en sterk indikasjon på at den inflammatoriske/eksitotoksiske signaloverføring som involverer motonevroner som bærer SODI G93A (Rothstein et al., 1992, Howland et al., 2002, Turner et al., 2005) har ingen åpenbar toksisitet på celler. Denne faktoren alene gir grunn til optimisme for fremtidige cellulære strategier ved anvendelse av transplantater for gjenopprettelse av motorfunksjon i degenerativ motonevronsykdom.

Eksempel 7

Behandling av traumatisk ryggmargsskade ved transplantasjon av humane, ryggmargsnervestam-/progenitorceller, behandling av Syringomyeli. (referanse eksempel)

Ekspanderte, humane ryggmargsstamceller ble injisert i enten immunsupprimerte, voksne Sprague-Dawley-hunnrotter eller immun-defisiente, atymiske naken-rotter. C4.5-konvulsjonslesjoner ble fremstilt i begge grupper én måned før transplantasjonen. Transplantatmottakerne (n=24) overlevde fra 60-150 dager etter transplantasjonen. De humanavledede NSCene dannet store cellulære aggregater som bestod av nevroner, astrocytter og oligodendrocytter. Disse transplantatene fylte uten unntak hver lesjon. Tilsynelatende umodne, NeuN+/human kjerne+-nevroner utgjorde ofte 50 % av donorcellepopulasjonen. Disse nevronene sendte humane nevrofilament+-prosesser gjennom både grå og hvit substans over avstander på minst 2 cm fra transplantasjonsstedet. Intens humanspesifikk synaptosin immunreaktivitet ble markert i nærheten av både verts- og transplantatnevroner, og tilsynelatende ikke-reaktive GFAP+-celler lå i nabostilling til donornevronene. Disse transplantatene understøttet ytterligere vekst av TH+- og 5HT+-fibere som så ut til å oppstå fra vertskilder. Denne linjen av NSCer ser således ut til å besitte primære, føtale CNS-lignende egenskaper som er fordelaktige for reparasjon av grå substans i ryggmargen.

Claims

1. En in vitro fremgangsmåte for fremstilling av en populasjon av nervestamceller som er i stand til å generere nevroner i en mottakers ryggmarg, omfattende: a) å ekspandere minst én nervestamcelle oppnådd direkte fra pattedyrvev i en dyrkningsflaske pre-belagt med 0,1 ng/ml til 1 mg/ml av én eller flere polymerer som er i stand til å fremme adhesjon av cellene; b) å konsentrere den ekspanderte populasjonen, hvor den minst ene nervestamcellen er tilveiebragt fra andre pattedyrkilder enn humane embryoer, hvor ekspansjon av nervestamceller inkluderer dyrking av nervestamcellen i fravær av serum; hvor ekspansjon av nervestamceller inkluderer å eksponere nervestamcellen for minst én vekstfaktor, og hvor celle-ekspansjonen overstiger tretti cellefordoblinger uten differensiering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor den ekspanderte populasjon kan danne GABA-produserende nevroner in vivo; eller hvor den ekspanderte populasjon kan danne glysinproduserende nevroner in vivo; eller hvor minst 40 % av den ekspanderte populasjonen kan danne nevroner i ryggmargen; eller hvor minst 30 % av den ekspanderte populasjonen kan differensiere til nevroner in vitro; eller hvor polymeren er valgt fra gruppen bestående av poly-D-lysin, poly-L/D-lysin, poly-L-lysin, poly-D-ornitin, poly-L-ornitin, fibronektin, lamin, kollagen og kombinasjoner derav.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, hvor vekstfaktoren er utvalgt fra gruppen som består av bFGF, EGF, TGF-alfa, ccFGF og kombinasjoner av disse.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor nervestamcellen er isolert fra en kilde valgt fra gruppen som består av et sentralnervesystem, et perifert nervesystem, beinmarg, perifert blod, navlestrengsblod og minst ett embryo.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvor pattedyret er et pattedyr under utvikling.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor gestasjonsalderen til pattedyret under utvikling er mellom omtrent 6,5 og omtrent 20 uker.