KR20070109979A

KR20070109979A - 신경퇴행성 증상의 치료를 위한 인간 신경 세포의 이식

Info

Publication number: KR20070109979A
Application number: KR1020077012097A
Authority: KR
Inventors: 마틴 마살라; 칼 케이. 조; 토마스 쥐. 하젤; 오사무 가끼노하마; 바실리스 콜리앗소스; 준 얀; 폴 제이. 레이어; 마가렛 제이. 벨라도
Original assignee: 뉴럴스템, 인크.
Priority date: 2004-11-17
Filing date: 2005-11-17
Publication date: 2007-11-15
Also published as: KR101429284B1; RU2007122507A; JP2015062735A; CN104042629A; PH12015501195B1; JP5805551B2; EP2913393A1; EP2913393B1; CN101084303A; JP5424559B2; US9220730B2; KR101505347B1; JP2008520687A; IL183092A; IL183092A0; WO2006055685A2; EP2913393B8; US20160228471A1; PH12015501195A1; US20100055075A1

Abstract

신경퇴행성 증상의 치료 방법이 제공된다. 신경 줄기 세포를 뉴런 퇴화 구역에 및/또는 그로부터 떨어진 곳에 이식할 수 있다. 상기 방법은 교체될 뉴런에 상응하는 특정한 유형의 뉴런이 생성되는 구역으로부터 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 특정한 유형의 뉴런의 성장 및/또는 재생에 영향을 미치는 성장 인자를 분비하는 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 신경 조직으로 이식시 신경퇴화와 관련된 징후를 극복하는데 충분한 양 및 충분한 방식으로 신경전달물질을 일체화 및 생성할 수 있는 뉴런으로 분화하는, 외부에서 배양되어 증대된 신경 기원체를 이식함으로써, 신경 회로에서 특정한 신경전달물질을 생성하는 세포가 결여됨으로 인해 발생하는 여러 신경퇴행성 장애를 비롯한 장애의 치료 방법을 개시한다.

신경 줄기 세포, 신경퇴행성 증상

Description

신경퇴행성 증상의 치료를 위한 인간 신경 세포의 이식{Transplantation of Human Neural Cells for Treatment of Neurodegenerative Conditions}

본 발명의 방법은 세포 이식을 통해 질환을 치료하는데 특히 유익한 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 신경 줄기 세포 (NSC)를 이용하여 신경퇴행성 증상을 치료하는 방법을 제공한다.

신경퇴행성 장애는 외상성 또는 허혈성 척수 또는 뇌 손상과 같은 질환, 유전적인 증상 또는 손상의 결과로서 뉴런 악화와 관련된 증상을 특징으로 한다.

사지의 골격근 수축을 지배하는 척수의 회로는 흥분성 운동 뉴런 및 억제성 GABA-생성 (즉, GABA-제조) 및 글리신-생성 (즉, 글리신-제조) 개재뉴런을 포함한다. 운동 뉴런은 척수의 회색질의 전각에서부터 시작되는 신경이다. 운동 뉴런의 축색은 근섬유를 자극하는 원심성 운동 섬유로서 척수의 분절로부터 나온다. 운동 뉴런에 의해 전도된 충격은 근섬유가 수축하는 것을 자극한다. GABA, 감마-아미노 부티르산은 전기 전위의 신경 전도를 억제하거나 완충하는 신경전달물질로서 작용하는 포유동물 신경계의 천연 발생 대사물이다. GABA-생성 개재뉴런의 손실은 운동 뉴런에 의해 발생하는 근육 수축의 억제 조성(tonality)의 조절장애를 일으킨다. 억제성 개재뉴런에 의해 발휘되는 흥분성 뉴런에 대한 조절 없이, 흥분성 뉴런의 과흥분(overfiring)은 사지 근육의 비제어된 경련성 수축 또는 비제어된 경직 을 유도한다. 운동 뉴런의 손실은 대상체가 근육을 수축시킬 수 없어서 결국 움직일 수 없게 되는 이완성 대마비를 일으킨다.

척수에서 GABA-생성 개재뉴런이 손상된 한 예로는 하행 흉부 또는 흉복부 대동맥의 일시적인 교차-결찰술과 관련된 합병증이 있다. 이러한 교차-결찰술은 흉부 또는 흉복부 대동맥의 동맥류를 치료하기 위한 혈관 수술에서 필수적인 단계이다. 교차-결찰술 동안, 척수의 일부분은 혈액 순환이 이루어지지 않아 허혈이 생기게 될 수 있다. 허혈 간격의 지속 시간에 따라, 후속적인 신경퇴행성 장애가 대부전 마비 또는 완전히 발전된 경련성 또는 이완성 대마비로서 신경퇴행적으로 발현될 수 있다.

허혈-유도된 뉴런 퇴화를 유도하는 메카니즘의 일부만이 알려져 있고, 상기 메카니즘이 흥분성 아미노산, 프로스타글란딘 및/또는 산소 유리 라디칼의 과도한 방출/활성과 연관이 있을 수 있지만, 일시적 허혈성 차단에 의해 영향을 받은 척수의 뉴런 집단은 널리 정의되어 있다. 예를 들어, 완전히 발전된 경련성 대마비가 있는 동물로부터 취한 척수에 대해 병리조직학적으로 분석한 결과, 소형 억제성 뉴런의 선택적인 손실이 나타났지만, 알파-운동 뉴런은 이전의 허혈성 척추 분절에서 잔존하였다. 척추 허혈성 손상이 있는 인간 대상체에서 유사한 척추 뉴런 병리학이 기재되었다.

반대로, 이완성 대마비가 있는 동물에서, 전괴사성 신경퇴행성 변화가 복측 운동 뉴런뿐 아니라 소형 억제성 및 흥분성 개재뉴런 둘다에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 척추 허혈 후 뉴런 퇴화 동안, 국지적인 미세신경교의 손상-의존성 활 성화, 및 염증 변화, 예컨대 대식구에 의한 침윤 또한 병소적인 또는 전체적인 뇌 허혈로서 발견되었다. 손상 정도에 따라, 염증 변화는 전형적으로 허혈성 차단 2 내지 7일 이후에 최대가 된 다음, 허혈 기간 이후 2 내지 4주에 걸쳐 염증 요소의 점진적인 손실을 보인다.

20 내지 30년 전에, 다양한 물질의 척추 이식의 치료 잠재성을 동물 모델에서 평가하려는 상당한 노력이 이루어졌다. 따라서, 세포주 또는 예리하게 단리된 척수 태아 조직을 손상된 구역에 전달하였고, 또한 직접적인 척추 유전자 요법을 이용하여 기계적 외상성 손상을 비롯한 척추 손상, 화학적 병소화 척수, 또는 진행성 α-운동 뉴런 퇴화가 있는 유전자 조작된 동물 (ALS 트랜스제닉 마우스 또는 래트)의 여러 모델에서 신경퇴행성 장애를 경감시켰다.

일반적으로, 연구 결과, 태아 조직으로부터 생성된 이식편에서 뉴런의 표현형이 장기간 생존하고 보존되는 것으로 밝혀졌지만, 시험관내에서 증대된 신경 전구체에서는 그렇지 않았다. 실제로, 시험관내에서 증대되어 기계적 또는 화학적으로 손상된 척수에 이식된 신경 전구체가 일부 제한된 뉴런 분화 및 성숙을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 세포는 비-뉴런 세포 유형으로 우세하게 분화한다. 이러한 우세한 비-뉴런 분화 메카니즘이 완벽히 이해되어 있진 않지만, 이전에 손상된 부위에서 염증전 사이토킨 (예컨대, TNFα, TGFβ)의 국지적인 방출이 연관된 가능성이 있는 것으로 가정된다.

신경퇴화는 세포 요법에 대해 특별히 도전하는 생물학적 환경을 제시하고, 정립된 신경퇴행성 질환에 존재하는 세포 사멸 신호 (문헌 [Rothstein et al., 1992; Howland et al., 2002; Turner et al., 2005])는 이식편 생존에 적합하지 않을 수있다. 또한, 성인 척수는 재생을 가능하게 하는 세포 및/또는 신호가 결여된 것으로 보고되었고 (파크(Park) 등의 2002년 문헌), 대다수의 NSC 이식에 대한 연구는 불량하거나 제한된 분화를 나타내었다 (카오(Cao) 등의 2002년 문헌; 얀(Yan) 등의 2003년 문헌; 얀(Yan) 등의 2004년 문헌).

세포 치료법에서의 주요한 문제점 중 하나는 이식된 세포의 낮은 세포 생존율 (5％ 미만)이다. 지금까지 이식된 세포는 모두 생체내에 주사된 직후에 상당수가 사멸하였다. 따라서, 효과적인 투여양으로 세포를 전달하기 위해, 최종 투여량의 20 배 이상으로 주사하여야 한다. 이는 매우 대규모의 세포 제조를 필요로 하며, 이는 추가의 제한 및 경제적인 장애물이 된다. 또한, 생체내에서 이러한 세포의 생존율이 유지될 수 없었다. 세포 요법의 효과적인 투여량을 재현가능하게 투여하는 것을 입증하는데 실패하여, 정부 및 다른 규제 기관, 예컨대 식약청에서 사용 허가를 받을 수 없었다.

국지화된 단일 영역이 아니라 신체, 조직 또는 기관의 큰 영역, 예컨대 전체 신경계에 걸쳐 분포된 신경퇴행성 질환 및 증상의 치료를 위한 추가의 시도가 제시된다. 예를 들어, ALS에서 신경퇴화는 운동 피질에 있는 운동 뉴런뿐 아니라 전체 척수를 따라 존재하는 운동 뉴런이 서서히 사멸되는 것과 관련이 있다. 마찬가지로, 대부분의 리소좀 질환에서, 뉴런 파괴는 뇌 및 척수의 대부분의 구역과 관련이 있다. 알쯔하이머(Alzheimer)병은 대부분의 대뇌와 관련이 있다. 심지어 더욱 국지화된 신경퇴행성 질환, 예컨대 파킨슨(Parkinson)병 및 헌팅톤(Huntington)병에 서도, 선조체의 발병 영역은 매우 크며, 수술적으로 도달할 수 있는 이식 영역보다 훨씬 더 크다. 따라서, 신경퇴행성 질환의 세포 치료법은 보다 광범위한 이식 절차를 요구할 것으로 예상된다.

따라서, 신경퇴행성 증상의 개선된 치료 방법이 요구된다. 또한, 이식시에 상기 확인된 모든 제한을 극복하고 기능적인 이익을 제공하는 인간 신경 줄기 세포 및 인간 신경 기원체(progenitor)의 개선된 배양 및 이식 방법이 요구된다. 따라서, 본 발명의 신경퇴행성 증상의 치료 방법은 생체내에서 강건한 뉴런 분화를 제공하고, 다양한 신경퇴행성 증상하에 장기간 뉴런 생존을 허용하고, 발달 신호가 결여된 성인 조직에서 뉴런의 치료적으로 관련된 하위 집단으로 성숙하는 것을 허용하며, 세포 자체의 위치보다 광범위한 치료 범위를 제공한다.

<요약>

본 발명의 방법은 신경퇴행성 증상을 치료하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명의 방법은 세포가 신경퇴행성 증상을 경감시킬 수 있도록, NSC가 필요한 대상체에게 NSC, 신경 기원체, 또는 시험관내에서 증대된 신경 전구체를 이식하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명의 방법은 신경퇴행성 증상의 치료에 사용될 공여 세포를 확인, 단리, 증대 및 제조하는 것을 포함한다. 이식될 공여 세포는 상기 증상, 그의 징후 및/또는 그의 효과에 기여하는 요소에 상응하거나 그것이 결여되도록 선택될 수 있다.

본 발명의 방법의 세포는 질환 상태 또는 증상을 경감시키기 위해, 이식시에 뉴런의 하부 구조내에 일체화되기에 충분한 양의 뉴런을 생성하는 세포를 포함한 다. 실시양태에서, 본 발명의 방법은 포유동물의 중추 신경계로부터 단리되어 시험관내에서 증대된 다능성(multipotential) 신경 기원체 또는 신경 줄기 세포를 이식함으로써 신경퇴행성 질환 또는 증상을 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, 증대된 신경 줄기 세포를 이식함으로써, 경련, 경직, 발작, 마비 또는 임의의 다른 근육 과활성의 징후가 있는 다양한 형태의 척수병으로 고통받는 대상체에서 보행 기능을 개선시킬 수 있다.

치료 방법은 충분한 개수의 GABA-제조 뉴런 및/또는 글리신-제조 뉴런으로 분화할 수 있는 적합한 개수의 NSC를 이식을 통해 손상된 뉴런 영역에 공급하여, 과활성 신경 회로를 비롯한 결함이 있는 신경 회로를 약화시키는 것을 포함할 수 있다.

실시양태에서, 본 발명의 방법은 운동 뉴런 질환에서 운동 기능을 복구하는 것을 포함한다. 운동 뉴런으로 분화할 수 있는 적합한 개수의 또는 치료 유효량의 NSC 또는 신경 기원체를 신경퇴행성 척수와 같은 신경퇴화된 하나 이상의 영역에 제공하여, 운동 기능을 복구할 수 있다. NSC는 신경퇴화된 신경근 접합부를 교체함으로써 치료 효과를 발휘한다.

이와 관련하여 또는 대안적으로, NSC는 더 많은 신경퇴행 조직의 뉴런이 장기간 동안 생존하도록 상기 뉴런을 보호하는 영양 분자를 발현하여 방출함으로써 치료 효과를 발휘한다. NSC-유래된 뉴런은, 퇴행성 운동 뉴런 질환이 있는 대상체에서 NSC가 숙주 운동 뉴런과 과도하게 상호 연관된 복측근 및 자극 근육으로 돌출되도록 자극될 수 있다. 따라서, 실시양태에서, 인간 태아 척수로부터의 NSC를 요 수에 이식할 수 있고, 여기서 이들 세포는 숙주 뉴런과 시냅스 접촉을 형성하고, 운동 뉴런 성장 인자를 발현 및 방출하는 뉴런으로 분화될 수 있다.

실시양태에서, 본 발명의 방법은 숙주 조직에 일체화되어 하나 이상의 성장 인자를 숙주 뉴런에게 제공하고, 이로써 상기 조직에 존재하는 신경퇴행성 영향으로부터 조직을 보호하는 신경 줄기 세포 또는 신경 기원체를 제공하는 것을 포함한다. 상기 방법은 유효량의 하나 이상의 성장 인자가 NSC에 의해 분비되도록 충분한 개수의 NSC 또는 신경 기원체를 척수 영역에 도입하는 것을 포함한다.

실시양태에서, 본 발명의 방법은 신경퇴행성 증상에서 세포 교체를 위해 줄기 세포의 임상적 평가에 동물 모델을 사용하는 방법을 제공하는 것을 포함한다.

실시양태에서, 본 발명의 방법은 이식된 NSC의 뉴런으로의 분화 효율을 증가시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 이식시에 이식편 중 충분한 개수의, 예컨대 20％의 세포가 뉴런의 운명을 받아들이도록, 미분화된 상태의 매우 풍부한 NSC 또는 신경 기원체를 증대시키는 것을 포함한다.

실시양태에서, 본 발명의 방법은 이식될 NSC 또는 신경 기원체의 개수를 증가시키지 않고 분화된 세포의 개수를 증가시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은 이식시에 NSC 또는 신경 기원체가 생체내에서 10 배만큼 계속해서 분할하고, 이로써 종양을 일으키지 않고 전달된 세포의 총 개수를 효과적으로 증가시키도록 하는 방식으로 증대된 공여 집단을 제조하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법의 세포는 태아, 신생아, 청소년, 성인, 또는 포유동물의 사후 조직으로부터 단리되거나 입수될 수 있다. 본 발명의 방법의 세포는 중추 신경 계, 혈액, 또는 뉴런으로 분화하는 임의의 다른 적합한 줄기 세포 공급원으로부터 단리되거나 입수될 수 있다. 상기 세포는 또한 배(胚)의 줄기 세포로부터 입수될 수 있다. 예를 들어, 실시양태에서, 상기 세포는 발달중인 태아 척수로부터 단리된 신경상피 세포를 포함한다. 특정 예에서, 신경 전구체 세포는 중추 신경계의 특정한 하위 구역으로부터 단리된 신경 기원체일 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 신경 줄기 세포를 배양물 중에서 증대시킨다. 실시양태에서, 신경 전구체 세포는 배양물 중에서 증대될 수 있고 분화시에 뉴런 및 신경교 둘다를 생성할 수 있는 다능성 NSC일 수 있다.

상기 세포는 이식시에 시험관내에서 미분화되거나, 전-분화되거나, 완전히 분화될 수 있다. 실시양태에서, 상기 세포는 뉴런 계통으로 분화하도록 유도된다. 본 발명의 방법의 세포는 염증전 사이토킨 및 손상 조직에 존재하는 다른 환경 인자의 존재하에 계내에서 뉴런으로 분화될 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여, 질환, 장애 또는 증상의 경감을 위해 적절한 구역으로 세포를 이식 또는 도입함으로써 신경 회로를 치료할 수 있다. 일반적으로, 신경 조직, 또는 이식된 세포의 생존을 지원하는 비-신경 조직으로 이식한다. 본 발명의 방법에 이용되는 NSC 이식편은 NSC가 강력한 임상적 효과를 발휘할 수 있는 신경퇴행성 증상 또는 질환의 발병 및 진행 형태의 신경퇴행성 환경에서 양호하게 생존한다.

일부 예에서, 신체의 멀리 떨어진 영역으로 이식하여, 세포가 의도된 표적으로 이동할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 인간 NSC의 부분 이식을 포함 할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "부분 이식"은 신경 퇴화된 일부 영역 또는 그의 전체 영역보다 작은 영역에만 증대된 NSC를 이식하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 인간 NSC의 척수 요부 분절로의 부분 이식이 있다. 퇴행중인 운동 뉴런에 대한 NSC의 효과의 적어도 일부는 전형적인 세포 메카니즘을 통해 퇴행중인 숙주 운동 뉴런에 신경 영양 인자 및 영양 사이토킨을 전달하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 척수의 요부 분절로 NSC를 부분 이식할 경우, 운동 뉴런 질환의 트랜스제닉 동물 모델에서 NSC가 생존하고, 강력히 뉴런으로 분화하며, 바로 인접한 이식 영역뿐 아니라 멀리 떨어진 이식 영역에서 운동 뉴런의 생존 및 기능을 자극하는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 방법은 경련, 경직, 또는 근육 과활성 증상의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하고, 시험관내에서 상기 신경 줄기 세포를 증대된 집단으로 증대시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 증대된 집단을 농축시키고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입시키는 것을 포함한다. 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 상기 증상은 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 졸중, 다발성 경화증, 뇌성마비, 간질, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 만성 허혈, 유전적인 증상, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된다.

실시양태에서, 상기 신경 줄기 세포는 중추 신경계, 말초 신경계, 골수, 말초 혈관, 제대혈 및 하나 이상의 배로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 단리된다.

실시양태에서, 상기 포유동물은 발달중인 포유동물이다.

실시양태에서, 상기 발달중인 포유동물의 재태 기간은 약 6.5 내지 약 20 주이다.

실시양태에서, 상기 신경 줄기 세포는 인간 태아 척수로부터 단리된다.

실시양태에서, 상기 신경 줄기 세포의 증대는 혈청의 부재하에 신경 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다.

실시양태에서, 상기 신경 줄기 세포의 증대는 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함한다.

실시양태에서, 상기 성장 인자는 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 집단은 생체내에서 1,000개 이상의 GABA-제조 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 집단은 생체내에서 1,000개 이상의 글리신-제조 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 상기 증대된 집단의 40％ 이상은 척수에서 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 집단의 도입은 수용자 척수의 다수개의 영역으로 치료 유효량의 적어도 일부분을 주사하는 것을 포함한다.

실시양태에서, 상기 증대된 집단의 30％ 이상은 시험관내에서 뉴런을 분화시 킬 수 있다.

또다른 실시양태에서, 신경 줄기 세포가 제공된다. 상기 신경 줄기 세포는 경련, 경직 또는 근육 과활성 증상을 치료할 수 있다. 상기 신경 줄기 세포를 포유동물로부터 단리하여, 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시킨다. 상기 줄기 세포를 포함하는 증대된 집단을 농축하고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입한다. 상기 증대된 집단의 20％ 이상은 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있다.

본 발명의 방법의 또다른 실시양태에서, 만성 통증의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하고, 시험관내에서 상기 신경 줄기 세포을 증대된 집단으로 증대시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 증대된 집단을 농축시키고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입시키는 것을 포함한다. 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 집단은 1,000개 이상의 GABA-제조 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 집단은 1,000개 이상의 글리신-제조 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 상기 영역은 배각을 포함한다.

실시양태에서, 상기 영역은 수막강내 공간을 포함한다.

추가의 실시양태에서, 신경 줄기 세포가 제공된다. 상기 신경 줄기 세포는 만성 통증을 치료할 수 있다. 상기 신경 줄기 세포를 포유동물로부터 단리하여, 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시킨다. 상기 줄기 세포를 포함하는 증대된 집단을 농축하고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입한다. 상기 증대된 집단의 20％ 이상은 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있다.

본 발명의 방법의 또다른 실시양태에서, 운동 뉴런 퇴화의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하고, 시험관내에서 상기 신경 줄기 세포을 증대된 집단으로 증대시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 증대된 집단을 농축시키고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입시키는 것을 포함한다. 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 상기 운동 뉴런 퇴화는 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 졸중, 다발성 경화증, 뇌성마비, 간질, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 만성 허혈, 유전적인 증상, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된다.

실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 뉴런 서브타입이 풍부한 영역으로부터 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함하고, 상기 뉴런 서브타입은 운동 결핍을 경감시키는데 효과적인 성장 인자를 생성한다.

실시양태에서, 상기 증대된 집단은 치료 유효량의 하나 이상의 성장 인자를 분비하는데 충분한 양으로 뉴런으로 분화할 수 있는 신경 줄기 세포를 포함한다.

실시양태에서, 상기 방법은 운동 뉴런이 풍부한 영역으로부터 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함한다.

추가의 실시양태에서 척수공동증을 치료할 수 있는 신경 줄기 세포가 제공된다. 상기 신경 줄기 세포를 포유동물로부터 단리하여, 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시킨다. 상기 줄기 세포를 포함하는 증대된 집단을 농축하고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입한다. 상기 증대된 집단의 20％ 이상은 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있다.

본 발명의 방법의 또다른 실시양태에서, 척수공동증의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하고, 시험관내에서 상기 신경 줄기 세포을 증대된 집단으로 증대시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 증대된 집단을 농축시키고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 누공에 도입시키는 것을 포함한다. 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수의 누공에서 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 상기 척수공동증은 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 외 상성 뇌 손상, 졸중, 다발성 경화증, 뇌성마비, 간질, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 만성 허혈, 유전적인 증상, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된다.

실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 뉴런 서브타입이 풍부한 영역으로부터 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함하며, 상기 뉴런 서브타입은 척수공동증을 경감시키는데 효과적인 성장 인자를 생성한다.

실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 집단은 1,000개 이상의 뉴런을 생성할 수 있다.

실시양태에서, 상기 증대된 집단의 신경 줄기 세포 100,000개 이상을 수용자 척수의 누공에 도입시킬 수 있다.

추가의 실시양태에서, 척수공동증을 치료할 수 있는 신경 줄기 세포가 제공된다. 상기 신경 줄기 세포를 포유동물로부터 단리하여, 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시킨다. 상기 줄기 세포를 포함하는 증대된 집단을 농축하고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 누공에 도입한다. 상기 증대된 집단의 20％ 이상은 수용자 척수의 누공에서 뉴런을 생성할 수 있다.

본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 시험관내에서 하나 이상의 신경 줄기 세포를 신경 줄기 세포의 증대된 집단으로 증대시키는 방법이 제공된다. 각각 의 신경 줄기 세포의 증대는 분화없이 세포의 30 배 세포-배가를 넘는다. 상기 방법은 중추 신경계 조직으로부터 신경 줄기 세포를 해리하고, 하나 이상의 세포외 단백질을 배양 용기에 제공하는 것을 포함한다. 상기 세포외 단백질은 적어도 약 10 ㎍/mL의 폴리-D-리신 및 약 1 mg/ml의 피브로넥틴를 포함한다. 상기 방법은 또한 혈청의 부재하에 상기 배양 용기에서 해리된 신경 줄기 세포를 배양하고, 상기 배양 용기에 하나 이상의 성장 인자를 첨가하는 것을 포함한다. 상기 성장 인자는 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 방법은 전면생장되기 전에 상기 배양된 세포를 계대배양하는 것을 추가로 포함한다.

실시양태에서, 증대된 신경 줄기 세포는 뉴런으로 분화할 수 있다.

실시양태에서, 상기 신경 줄기 세포의 증대는 배양 배지에 가용성 인자로서 피브로넥틴를 첨가하는 것을 포함한다.

실시양태에서, 세포의 해리 및 세포의 계대배양은 효소성 해리를 포함한다.

실시양태에서, 상기 효소성 해리는 세포를 트립신으로 처리하는 것을 포함한다.

실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 집단을 신경퇴행성 증상의 치료를 위해 수용자 신경계의 하나 이상의 영역에 도입한다.

따라서, 기존의 약리학적 전략에 비한 본 발명의 방법의 이점은 이식된 NSC가 최적의 생활성 조건하에 퇴행중인 운동 뉴런에 전달될 수 있는 영양 분자를 분비하는 능력을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 이점은 인간 태아 척수로부터의 NSC를 배양하고 증대시켜, NSC가 요수에 성공적으로 생착하는 것을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 방법의 추가의 이점은 NSC 집단이 높은 비율로 뉴런 분화를 달성하는 방법을 제공하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법의 또다른 이점은 NSC의 부분 이식으로부터 임상적 효과를 달성하는 것을 포함한다.

추가 도면 및 본 발명의 방법의 이점은 하기 발명의 상세 설명 및 도면에 기재되고, 이들로부터 명확해질 것이다.

도 1. 인간 척추 줄기 세포의 증대. 인간 척추 기원체 (NSC로서도 알려짐) 세포주는 7 내지 8 주령의 사후 태아 척수 조직으로부터 단리하였고, 약 130 일의 순 배양 기간 동안 연속적으로 계대배양하였다. 각 계대배양에서, 수확시 수거된 세포수를 플레이팅시의 개시 세포수로 나누어, 세포수를 배수-증가시켰다. 누적 배수-증가 (왼쪽 Y 축)는 각 계대배양에서 배수-증가를 곱하여 얻어졌다. 각 계대배양시, 세포의 배가 시간 (오른쪽 Y 축)은 세포수의 배수-증가를 각 배양 기간 (X 축)으로 나누어 계산하였다. 이 과정을 3회 반복하였다 (연속 증대 1, 2 및 3).

도 2. 증대된 인간 척추 줄기 세포의 형태. (A) 고정되고 염색되지 않은 증대 배양물의 상 대비도, 20x 대물렌즈, (B) 항-네스틴 항체 염색.

도 3. 증대된 인간 척추 줄기 세포로부터 수득된, 분화된 배양물의 특징. 계대배양 15 내지 16의 증대된 세포를 배양물 중에서 대략 14 일 동안 분화시키고, 고정하고, 다양한 뉴런-특이적 항체로 염색하였다. (A) Tau 및 MAP2; (B) 제3형 베타 튜불린; (C) GABA; (D) 아세틸콜린 트랜스퍼라제.

도 4. 인간 중뇌 줄기 세포의 증대. 인간 중뇌 기원체 (NSC로도 알려짐) 세포주를 7 내지 8 주령의 사후 태아 중뇌 조직으로부터 단리하고, 약 170일의 순 배양 기간 동안 연속적으로 계대배양하였다. 각 계대배양에서, 수확시 수거된 세포수를 플레이팅시의 개시 세포수로 나누어, 세포수를 배수-증가시켰다. 누적 배수-증가 (왼쪽 Y 축)는 각 계대배양에서 배수-증가를 곱하여 얻어졌다.

도 5. 증대된 인간 중뇌 줄기 세포의 도파민 흡수 활성. 생세포 중의 도파민 운반체 활성 (DAT)은 분석시에 22일 또는 44일 동안 분화된 인간 중뇌 줄기 세포주 및 그의 클론성 하위세포주로부터 측정하였다. 상기 세포를 DAT 억제제 노미펜신(nomifensine) (10 μM)의 존재 (+) 또는 부재 (-) 하에 방사능 표지된 도파민과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하여 혼입되지 않은 도파민을 제거하고, 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail) 중에 용해시켰다. 이어서, 전체 세포 방사성 (dpm)을 신틸레이션 계수를 사용하여 측정하였다.

도 6. 인간 중뇌 줄기 세포주의 뉴런 분화 및 도파민성 분화의 유도에 대한 외인성 인자의 효과. 2종의 인간 중뇌 줄기 세포주 (527RMB 및 796RMB)로부터의 냉동보존된 신경 줄기 세포를 해동시키고, bFGF 존재하에 4-웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 40,000개의 세포 밀도로 플레이팅하고, 6일 동안 증식시켰다. 그후, bFGF를 제거하고, 세포를 추가 8 일 동안 분화시켰다. 세르톨리 세포(sertoli cell) 조건화된 배지 (SCCM, N2 중 1:1 희석)에 노출하는 시기 및 노출 지속시간에 기초하여, 세포를 4개의 군으로 나누었다. 제1 군은 증식 및 분화 동안 SCCM에 노출시켰고 (조건 1); 제2 군은 증식 동안에만 노출시켰고 (조건 2); 제3 군은 분화시에만 노출시켰고 (조건 3); 제4 군은 SCCM에 노출시키지 않았다 (대조군). 배지를 2일에 한번씩 교체하고, 유사분열 물질을 증식기 동안 매일 첨가하였다. 조건 당 4개의 웰을 다중 마커에 대해 염색되도록 유지하였다. 분화에 따라, 4％ 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 고정시키고, MAP2ab (도 6A) 및 티로신 히드록실라제 (도 6B)에 대한 항체, 및 GFAP 및 GalC를 사용하여 면역염색하였다. 면역염색된 세포를 40x 대물렌즈를 이용하여 카운팅하고, 각 웰에 대해 3개 이상의 영역에서 카운팅하였다. 임의의 조건 하에 유지한 세포를 분석했을 때 GFAP+ 또는 GalC+ 세포가 거의 검출되지 않거나 전혀 검출되지 않으면, 이러한 항원은 분석에서 제외하였다.

도 7. 인간 척추 줄기 세포 이식에 의한 래트에서의 경련/경직 및 운동 결핍 감소. 요추의 허혈성 병변으로 경련성 래트를 생성하였다. 제1 군 (흑색 원)에서, 배양에 의해 (계대배양 16) 증대된 인간 척추 줄기 세포를 래트 (n=9)에 이식시키고, 다른 대조군 (백색 원, n=7)에는 세포 없이 배지만 제공하였다. 면역 저해제 (FK506)를 연구 기간 (8 주) 동안 상기 2개의 군에 매일 1 mg/kg 투여하였다. 개별 동물의 운동 통합성을 매주 BBB 스코어로 평가하였다.

도 8. 인간 척추 줄기 세포 이식에 의한 래트에서의 경련/경직 및 운동 결핍의 감소. 경련성 래트를 요추의 허혈성 병변에 의해 생성하였다. 제1 군 (흑색 원 및 흑색 사각형)에서, 배양에 의해 (계대배양 16) 증대된 인간 척추 줄기 세포를 래트 (n=13)에 이식시키고, 다른 대조군 (채워진 삼각형, n=6)에는 세포 없이 배지만 제공하였다. 면역 저해제 (FK506)를 연구 기간 (12 주) 동안 상기 2개의 군에 3 mg/kg 투여하였다. 개별 동물의 운동 통합성을 매주 1회 BBB 스코어로 평가하였다.

도 9. 생세포 (L, 적색) 및 죽은-세포 (대조군, C) 이식편 (청색)을 갖는 경우 임상학적 및 병리학상 측정의 진행 분석 (A-B) 및 종점 분석 (C-E)을 보여주는, G93A SOD1 래트에서의 운동 뉴런 질환의 중증도에 대한 인간 NSC 치료의 효과.

A-B. 패널 A는 관찰 과정에 통틀어 실험군 동물 및 대조군 동물 간의 유의한 구분을 나타내는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 도식이다 (P=0.0003). 패널 B는 2개의 동물 군 간의 근육 약화의 측정 (BBB 및 경사면 스코어)에 있어서의 구분을 나타낸다 (각각 P=0.00168 및 0.00125).

C-E. 실험군 및 대조군 래트에서 생존 (C), 시간-대-질환-발병 (D) 및 운동 뉴런 수 (E)의 종점 분석. 패널 C는 2개의 군 사이의 수명에 있어서 유의한 11일 차이를 나타낸다 (P=0.0005). 패널는 2개의 군 사이의 시간-대-질환-발병에서 유의한 7일 차이를 나타낸다 (P=0.0001). 패널 E는 살아있는 NSC 군 및 죽은 NSC 군 간의 요추 돌기(lumbar protuberance)에서 3,212개 세포의 차이를 나타낸다 (P=0.01). 패널 E의 하부에 삽입된 것은 128일령의 대표적인 실험군 래트 (위) 및 대조군 래트 (아래) 간의 운동 뉴런 생존에 있어서의 차이를 도시하고; 화살표는 측운동 뉴런 군을 나타낸다. 크기 바: 150 ㎛.

본 발명의 방법은 신경퇴행성 증상의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 신경 줄기 세포를 제조하고 이를 필요로 하는 대상체로 이식하기 위한 것이다. 이식용 세포를 제조하는 것은 특정 세포 집단을 신경퇴행성 증상의 치료제로서 상업적으로 사용하기에 충분한 수준으로 시험관내 증대시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 신경퇴화 또는 손상된 신경 영역의 치료 방법은 신경퇴행성 증상을 경감시키기에 충분한 유효수의 신경 줄기 세포를 해당 영역에 공급하는 것을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 신경퇴행성 증상은 뉴런의 손상 또는 악화를 포함하는, 임의의 질환 또는 장애 또는 징후, 또는 그의 원인 또는 효과를 포함할 수 있다. 신경퇴행성 증상에는, 이에 제한되지 않지만, 알렉산더(Alexander)병, 알페르(Alper)병, 알쯔하이며병, 근위축성 측삭 경화증, 혈관확장성 운동실조증, 카나반(Canavan)병, 코케인 증후군, 피질기저핵 변성, 크루츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병, 헌팅톤병, 케네디(Kennedy)병, 크라베(Krabbe)병, 루이소체 치매, 마치도-조세프(Machado-Joseph)병, 다발성 경화증, 파킨슨병, 펠리제우스-메르츠바하(Pelizaeus-Merzbacher)병, 니만-피크(Niemann-Pick)병, 원발성 측삭 경화증, 레프섬(Refsum)병, 산드호프(Sandhoff)병, 실더(Schilder)병, 스틸-리차드슨-올슨제위스키(Steele-Richardson-Olszewski)병, 척수로(Tabes Dorsalis), 또는 손상된 뉴런과 연관된 임의의 다른 증상이 포함될 수 있다. 다른 신경퇴행성 증상에는 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 졸중, 외상성 뇌 손상 및 유전성 증상이 포함되거나 이로 인해 야기된 것이 포함될 수 있다.

본 발명의 방법은 신경퇴행성 증상을 경감시키기 위한 NSC의 용도를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "NSC"는 또한 신경 또는 뉴런 기원체, 또는 신경상피성 전구체를 지칭할 수 있다. NSC는 이들의 능력에 따라 각각 CNS의 3가지 주요 세포 유형 (뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포)으로 분화하는 것으로 기능적으로 정의될 수 있다.

실시양태에서, NSC는 각각의 세포가 뉴런, 성상세포 또는 희소돌기아교세포로 분화하는 능력을 갖는 다능성이다. 실시양태에서, NSC는 각각의 세포가 CNS의 3가지 세포 유형 중 2종으로의 분화하는 능력을 갖는 2능성(bipotential)이다. 실시양태에서, NSC는 시험관내에서 뉴런 및 성상세포 둘다를 생성하는 적어도 2능성 세포를 포함하고, 생체내에서는 적어도 뉴런을 생성하는 단능성 세포를 포함한다.

성장 조건은 세포가 하나의 세포 유형 또는 또다른 세포 유형으로 분화하는 방향에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 세포가 단일 계통으로만 발생하지 않음을 나타낸다. 뉴런 분화가 바람직해지는 배양 조건에서, 세포, 특히 인간 CNS로부터의 세포는 대부분 뉴런 및 성상세포에 대하여 2능성이고, 희소돌기아교세포로의 분화는 최소이다. 따라서, 본 발명의 방법의 분화된 세포 배양물은 뉴런 및 성상세포로 발생할 수 있다. 실시양태에서, 뉴런 대 성상세포의 비는 50:50에 접근할 수 있다.

본 발명의 방법은 포유동물 CNS의 구역에 존재하는 NSC, 예를 들어 신경상피를 얻는 것을 포함한다. NSC가 단리될 수 있는 다른 CNS 구역으로는 CNS의 뇌실 및 뇌실하부, 및 유사분열 전구체 및 유사분열후 뉴런을 비롯한 다른 CNS 구역이 포함된다. 실시양태에서, 본 발명의 방법은 발달 중인 포유동물의 CNS 구역에 존재하는 NSC를 사용할 수 있다.

실시양태에서, NSC는 원하는 뉴런 집단에 대해 천연적으로 신경원성인 영역으로부터 얻어진다. 원하는 뉴런 집단은 신경학 증상에서 상실되거나 불활성화된 표현형을 대체 또는 보강할 수 있는 특이적 뉴런 표현형을 갖는 세포를 포함할 수 있다.

특정 신경퇴행성 질환 또는 증상을 치료하기에 유용한 것을 비롯한, 다양한 상이한 뉴런 서브타입은 태아 발생 동안 CNS의 상이한 영역이나 구역으로부터 및 상이한 재태 기간에 걸쳐 NSC를 단리함으로써 얻을 수 있다. CNS의 상이한 영역이나 구역으로부터 및 상이한 재태 기간에 걸쳐 단리된 NSC는 뉴런의 증대 및 분화능을 최적으로 하기 위해 사용된다. 포유동물 CNS의 특징 중 하나는 뉴런 서브타입이 다양하다는 것이다. 예를 들어, 단일 집단의 NSC는 배양시 단지 몇몇 구별되는 뉴런 서브타입만을 자발적으로 생성할 수 있다. 추가로, 특정 태아 재태 기간으로부터의 세포는 배양된 세포와 생리학적으로 관련성이 성립될 수 있다.

본 발명의 방법의 실시양태에서, 대상체로 이식하고자 하는 세포는 손상된 신경 영역에 대한 인간 태아의 대응부분(counterpart)으로부터 유래된다. 실시양태에서, NSC는 재태 기간 약 6.5 내지 약 20 주에 인간 태아 CNS 구역으로부터 단리된다. 실시양태에서, 태아 척수로부터의 세포는 재태 기간 약 7 내지 약 9 주에 단리된다. 단리가능한 신경 줄기 세포 집단의 비율은 공여체의 연령에 따라 다양할 수 있음을 인지할 것이다. 세포 집단의 증대능은 또한 공여체의 연령에 따라 다양할 수 있다. NSC의 이러한 구역적 및 시간적 특이성은 NSC가 운명-제한적 기원체로서 작용하지만, 블랭크 세포(blank cell) 또는 세포 단일 집단으로서 작용하지 않음을 나타낸다.

GABA-제조 뉴런을 포함하는 시험관내 집단의 비율은 일반적으로 약 5 내지 10％에서 일정하다.

복측 중뇌의 NSC는, 예를 들어, 동일한 재태 기간에 척수로부터 얻은 NSC와 구분된다. 특히, 복측 중뇌로부터의 NSC는 티로신-히드록실라제-발현 도파민성 뉴런을 배타적으로 발생시키키지만, 척수로부터의 NSC는 아세틸콜린-제조 콜린성 뉴런을 배타적으로 생성한다. 그러나, 이러한 두가지 세포 유형은 더 많이 국지화되어 있는 글루타메이트- 및 GABA-제조 뉴런을 자발적으로 생성한다. 따라서, 실시양태에서, 본 발명의 방법은 복측 중뇌로부터 NSC를 얻어, 티로신-히드록실라제-발현 도파민성 뉴런의 이식에 의해 적어도 부분적으로 경감되거나 상쇄되는 증상을 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 추가로 척수로부터 NSC를 얻어, 아세틸콜린-제조 콜린성 뉴런의 이식에 의해 적어도 부분적으로 경감되거나 상쇄되는 신경퇴행성 증상을 치료하는 것을 포함한다.

따라서, 도파민성 뉴런의 상실을 특징으로 하는 파킨슨병과 같은 운동 장애의 치료를 위해, 본 발명의 방법의 실시양태는 도파민성 뉴런의 신경발생이 상당히 발생하는 복측 중뇌와 같은 영역으로부터 유래된 NSC의 사용을 포함한다. 추가로, NSC는 도파민성 뉴런의 신경발생이 상당히 발생하는 인간 태아 발생의 재태 기간에 얻어질 수 있다. 따라서, 실시양태에서, 본 발명의 방법은 재태 기간 약 7 내지 약 9 주에 유래된 복측 중뇌로부터 NSC를 얻어, 운동 장애를 치료하는 것을 포함한다.

복측 운동-뉴런의 손실로부터 발생하는, 근위축성 측삭 경화증 또는 이완성 대마비와 같은 운동 뉴런 질환을 치료하기 위해, 본 발명의 방법의 실시양태는 복측 운동-뉴런의 신경발생이 상당히 발생하는 영역 (예, 척수)으로부터 유래되고 인간 태아 발생의 재태 기간에 복측 운동-뉴런의 신경발생이 상당히 발생하는 동안 얻어지는 NSC의 사용을 포함한다. 따라서, 실시양태에서, NSC는 재태 기간 약 7 내지 약 9 주에 척수로부터 단리되어, 운동 뉴런 질환을 치료할 수 있다.

그러나, 일부 경우, 이러한 구역 특이성의 한계가 실제 목적에 대해 사실상 광범위함이 인정될 것이다. 따라서, 경부, 흉부, 요추 및 천수 분절과 같은 다양한 척수 영역으로부터의 NSC를 이식하여 NSC의 상응하는 기원 이외의 위치를 치료하기 위해 상호교환적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 경부 척수로부터 유래된 NSC를 환자의 요추 분절 내에 이식함으로써 상기 세포를 경련 및/또는 경직을 치료하는 데 사용할 수 있다.

NSC는 또한 출생-후 및 성인 조직으로부터도 단리될 수 있다. 출생-후 및 성인 조직으로부터 유래된 NSC는 뉴런 및 신경교로의 이들의 분화능과 관련해서 뿐만 아니라, 이들의 성장 및 분화 특징에 있어서 정량적으로 동동하다. 그러나, 다양한 출생-후 및 성인 CNS로부터의 NSC의 시험관내 단리 효율은, 더 풍부한 NSC 집단을 보유한 태아 조직으로부터의 NSC 단리보다 더 낮을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 태아-유래의 NSC와 마찬가지로, 본 발명의 방법은 신생아 및 성인 공급원로부터 유래된 약 30％ 이상의 NSC를 시험관내에서 뉴런으로 분화시킬 수 있다. 따라서, 상기 기재된 태아-유래된 NSC의 경우에서 같이 출생-후 및 성인 조직을 사용할 수 있지만, 태아 조직을 사용하는 것이 더 바람직하다.

다양한 뉴런 서브타입은 배양시 증대된 배의 줄기 세포의 조작으로부터 얻어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 기초하여, 필요에 따라 다른 부적절하거나 원하지 않는 세포로부터 특이적인 뉴런 서브타입을 단리 및 정제하여 결과를 개선할 수 있고, 동일한 신경퇴행성 증상의 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 NSC는 한 부위로부터 유래되어, 자가이식편으로서 동일한 대상체 내 다른 부위로 이식될 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법에서 NSC는 유전학적으로 동일한 공여체로부터 유래되어 동질이식편으로서 이식될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에서 NSC는 동종의 유전학적으로 일치하지 않은 구성원으로부터 유래되어 동종이식편으로서 이식될 수 있다. 다르게는, NSC는 인간이 아닌 기원으로부터 유래되어 이종이식편으로서 이식될 수 있다. 강력한 면역저해제의 개발에 따라, 비-인간 신경 전구체, 예를 들어 돼지 기원의 신경 전구체의 동종이식편 및 이종이식편을 인간 대상체에 이식할 수 있다.

샘플 조직은 임의의 표준 방법에 의해 해리될 수 있다. 실시양태에서, 피펫을 이용하여 부드러운 기계적 분쇄에 의해 조직을 해리시키고, 2가 양이온-무함유 염수 완충액을 사용하여 해리된 세포의 현탁액을 형성한다. 충분히 해리시켜 대량의 단일 세포를 얻는 것은 과도한 국부 세포 밀도를 피하는 데 바람직하다.

NSC의 성공적인 상업적 적용을 위하여, 다수의 연속적인 계대배양을 통해 안정한 증대 및 분화능을 갖는, 강건하고 일관된 배양을 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, CNS 발생의 상이한 영역 및 연령으로부터의 개별 NSC 세포주를 장기간 안정하게 증대시키고 이들의 구별되는 기원체 성질을 유지하하기 위해 배양 방법을 최적화할 수 있다.

결국, 놀랍게도 NSC의 기질로의 점착을 촉진하면, NSC 또는 기원 세포의 유사 분열 속도가 가속화되어, 이에 따라 NSC 또는 기원 세포의 보다 강건한 배양이 상당히 향상된다는 것이 밝혀졌다. 특히, 과도한 국부 세포 밀도를 피하고 유사분열 물질 농도를 유지하는 것 이외에도, 세포외 매트릭스 단백질의 농도가 NSC의 장기 유사분열능 및 분화능에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 세포외 매트릭스 단백질은 폴리-D-리신, 폴리-L-리신, 폴리-D-오르니틴, 폴리-L-오르니틴, 피브로넥틴 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 다른 세포외 매트릭스 단백질은 피브로넥틴, 라민, 콜라겐, 및 이들의 조합의 다양한 이소형, 단편, 재조합 형태 또는 합성 모방체를 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가로, 본 발명의 방법이 효과적인 세포 점착을 촉진하여, 세포독성이 없거나 또는 세포 분열을 지체시키는 배양의 전체 지속기간 동안, 각각의 개별 세포가 배양 기질에 점착될 수 있는 임의의 다른 적합한 성분을 포함할 수 있음이 인정되어야 한다.

세포외 매트릭스 단백질은 세포 점착을 촉진하는 데 효과적일 수 있지만, 상이한 아미노산 중합체, 예를 들어 폴리-L/D-오르니틴 또는 폴리-L/D-리신은 각 개별 세포주에 대해 특정 농도에서 세포에 독성일 수 있다. 인큐베이션 지속기간은 또한 디쉬 표면에 침착된 최종 중합체 양에 영향을 미쳐, 세포의 생존력에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 NSC에 대하여, 중합체의 농도는 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 mg/mL의 범위 내에 있을 수 있다. 실시양태에서, 폴리-D-리신 100 ㎍/ml을 0.01M HEPES 완충액 또는 물 중에 중성 pH에서 용해시켜 배양 용기에 도포한다. 배양 용기를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 배양 용기를 물로 철저히 세정하고 건조시킨 다음 사용한다.

본 발명의 방법은 또한 세포외 매트릭스 단백질로 배양 용기를 이중-코팅하는 것을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 배양 용기를 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체로 처리한 후에, 상기 기재된 폴리-L/D-오르니틴 또는 폴리-L/D-리신을 도포한다. 실시양태에서, 인간 혈장으로부터 제조된 피브로넥틴 단백질을 사용한다. 그러나, 피브로넥틴 단백질의 임의의 다른 적합한 형태 또는 공급원은, 돼지 또는 소 피브로넥틴, 재조합 피브로넥틴, 피브로넥틴 단백질 단편, 합성 펩티드, 및 피브로넥틴의 다른 화학적 모방체와 같은 것이 사용될 수 있음이 인정되어야 한다. 실시양태에서, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 1 mg/mL의 피브로넥틴을 도포할 수 있다.

인간 척수로부터의 NSC을 증대시키는 것을 포함하는 실시양태에서, 세포외 단백질이 배양 용기에 결합하고 이를 코팅하기에 충분한 기간 동안 폴리-D-리신 100 ㎍/mL로 배양 용기를 처리한다. 이러한 기간은 약 5 분 내지 약 3 시간일 수 있다. 그후, 배양 용기는 물로 세척할 수 있다. 배양 용기를 공기-건조시킨 후, 실온에서 대략 5 분 내지 수시간 동안 약 25 mg/ml의 피브로넥틴, 또는 37℃에서 대략 1 시간 내지 수일 동안 약 1 mg/ml의 피브로넥틴으로 상기 용기를 처리할 수 있다. 이후, 피브로넥틴을 제거할 수 있고, 배양 용기를 1회 이상 세척하거나 사용 시까지 PBS 중에 저장할 수 있다.

다르게는, 피브로넥틴을, 세포에 직접 공급되는 가용성 인자로서 성장 배지에 첨가할 수 있다. 이 실시양태에서, 피브로넥틴을 배양 용기에 처리하는 것 이외에 또는 이 대신에, 피브로넥틴 1 ㎍/mL을 성장 배지 내에 첨가함으로써 NSC를 증대시킬 수 있다. 피브로넥틴-코팅된 용기는 저장 기간이 비교적 짧기 때문에, 세포 플레이팅시 가용성 인자로서 성장 배지 내로 부착 단백질을 공급하는 것이 NSC의 대량 상업적-규모 배양에 특히 유리하다. 이 방법은 또한 cGMP 프로토콜 하에 요구되는, 실질적으로 정확한 조건 및 재현성을 요구하는 신경 줄기 세포주의 제조 및 치료용의 신경 줄기 세포주 제조에 유용하다.

실시양태에서, 단리된 NSC를 cm² 당 약 1,000 내지 약 20,000개의 세포 밀도로 배양 용기에 첨가한다. 이러한 밀도는 세포 농도의 국지화를 피하면서 배양 용기 중 개별 세포의 분산 및 점착에 기여하여 NSC 배양을 풍부하게 한다.

실시양태에서, NSC를 혈청의 부재하에 증대시킨다. 실시양태에서, NSC의 유사분열능 및 분화능을 불안정화하기에 충분한 혈청 농도에 NSC가 노출되는 것을 피하기 위해, NSC를 제한된 혈청-무함유 배지 중에서 배양한다. 추가로, 백혈병 억제성 인자 (LIF) 또는 모양체 신경영양성 인자 (CNTF)와 같은 특정 성장 인자에 NSC가 노출되면, 또한 NSC가 불활성화될 수 있으므로, 이를 피해야만 한다.

NSC 성장을 향상시키는 배양 과정의 임의의 단계에서 유사분열 물질을 배양물에 첨가할 수 있다. 유사분열 물질은 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF), 상피 성장 인자 (EGF), 전환 성장 인자-알파 (TGFa), 및 그의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법의 NSC는 2가지 이상의 배양 형태로 성장 및 증대될 수 있다. 한가지 배양 형태는 응집 형태, 일반적으로 현탁 배양으로서 지칭되는 클러스터(cluster)된 응집 형태로서 지칭되는 응집 형태를 포함한다. 또다른 배양 형태는 점착 배양으로서 지칭되는 분산된 비-응집 형태를 포함한다.

본 발명의 방법에 따른 NSC의 분산 점착성 배양에 있어서, 세포는 단층을 형성하며, 여기서 개개의 새포는 초기에 배양 기질에 직접적으로 접촉한다. 점차적으로, 인큐베이션 기간 후에, 세포는 드믄드믄 클러스터를 형성할 수 있고, 여기서 바닥층에 있는 세포가 독립적으로 기질에 부착되어 있더라도, 하나 이상의 추가 세포층이 바닥층 위에 형성된다. 이러한 클러스터화는 특히 고밀도의 세포가 배양물에 접종되는 경우 또는 높은 세포 밀도에 도달한 경우 발생하며, 실시양태에서, NSC 또는 기원 세포의 최적의 증대, 또는 NSC의 다능성 능력을 최적으로 유지하기 위해 상기 클러스터화를 최소화한다. 본 발명의 방법의 실시양태에 따른 분산 점착성 배양에서, 인간 NSC는 세포 분할 당 약 4 일 미만으로 분할할 수 있다.

분산 점착성 배양의 또다른 구분되는 특징은, 본 발명의 방법의 NSC가 분할되어, 각각 이들의 다능성 능력을 유지하는 딸 세포를 생성한다는 것이다. 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따른 NSC의 분산 점착성 배양은 실질적인 분화 없이 적어도 20 배 세포-배가의 증대능을 포함한다. 대부분의 NSC는 적어도 50 배 세포-배가로 증대된 후에, 신경원성 분화능을 상실할 수 있다. 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따른 분산 점착성 배양에서 증대된 NSC는 뉴런 분화를 향상시키는 것으로 입증되며, 실시양태에서, 약 30％ 이상 뉴런을 분화시킨다. 많은 경우, 50％ 이상의 NSC가 뉴런으로 분화한다. 분산 점착성 형태의 배양이 보다 바람직한 배양 형태이지만, 상이한 배양 방법은 시험관내 또는 생체내 분화능을 다르게 하면서, 선천적으로 구별되는 세포 집단의 단리를 허용할 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 유전적 변형 또는 바탕영양세포의 포함 없이 다양한 공급원으로부터 NSC의 클로성 단리를 허용한다. 따라서, 매우 적은 수, 바람직하게는 세포 cm² 당 1000개 미만의 세포를 상기 기재된 바와 같이 제조된 세포 배양 디쉬에 시딩할 수 있다.

NSC 시딩 몇일 후에, 세포는 잘-구분된 콜로니를 형성할 수 있다. 상기 콜로니는 적어도 약 250 내지 약 2000개 세포의 원하는 크기까지 성장할 수 있다. 실시양태에서, 하나 이상의 세포 콜로니를 손을 사용하여 찍어 다중-웰 플레이트와 같은 새로운 세포 배양 디쉬에 개별적으로 접종한다.

단리된 클론성 집단을 연속적인 계대배양에 의해 증대시켜, 다중 신경 줄기 세포주를 확립하는 데 사용할 수 있다. 이러한 많은 클로날 세포주는 척수, 중뇌 및 후뇌를 비롯한 다양한 인간 CNS 영역으로부터 단리된다. 클로날 세포주는 뉴런 서브타입과 같은 특정 세포 표현형을 보다 높은 비율로 풍부하게 하는 데 유용하다. 예를 들어, 티로신 히드록실라제-발현 도파민성 뉴런, GABA-생성 뉴런, 콜린성 뉴런, 및 다른 특이적 표현형의 뉴런에 대해 풍부한 클로날 세포주가 본 발명의 방법에 따라 단리될 수 있다.

실시양태에서, 폴리클로날 또는 모노클로날 신경 줄기 세포주는 특정 서브타입의 뉴런이 더 풍부하게 되도록 유도될 수 있다. 다수의 성장 인자, 화학물질 및 천연 성분을 스크리닝하여, 중뇌 또는 척수의 NSC로부터의 특정 뉴런, 예를 들어 티로신 히드록실라제-발현 도파민성 뉴런 및 아세틸콜린-제조 콜린성 뉴런에 대한 효과적인 유도제를 확인하였다. 인자 또는 화학물질 또는 이의 조합은 NSC의 유사분열 단계 및/또는 분화 단계 동안 도입될 수 있다. 실시양태에서, 도파민성 표현형에 대한 신경 줄기 세포주는 공여 집단으로서 풍부하게 되어 파킨슨병을 치료한다.

다양한 뉴런 서브타입은 시험관내 목적하는 분화 패턴을 갖는 줄기 세포의 단리로부터 얻어질 수 있다. 시험관내 결과는 실질적으로 생체내에서 재현될 수 있다. 이것은 줄기 세포의 생체내 가능한 효능은 줄기 세포의 시험관내 분화 패턴에 의해 예측될 수 있음을 의미한다. 살아있는 출생-후 대상체내로 주사함에 따라, 미분화 또는 전-분화 상태의 NSC는 대부분 시험관내 관찰된 생체내 분화 패턴을 생성한다. 따라서, 시험관내 티로신 히드록실라제-제조 뉴런으로 발달하는 NSC는 또한 생체내 티로신 히드록실라제-제조 뉴런을 생성한다. 반대로, 구조적으로 티로신 히드록실라제-제조 뉴런으로 시험관내 발달하지지 못하는 NSC는 생체내 티로신 히드록실라제-제조 뉴런도 생성하지 못한다.

그러나, 시험관내에 존재하는 분화 신호는 생체내 신호에 비해 제한된 것이다. 따라서, 분화된 뉴런의 상당한 분획은 주요 신경전달물질 표현형을 발현시킬 수 없다. 구심성 또는 원심성 뉴런으로부터의 신호와 같은 추가 신호, 또는 천연 신호를 모방한 것과 같은 제제는, NSC의 유사분열 단계 동안 또는 이들의 분화 동안 분화된 표현형을 재형성하는 데 사용될 수 있다. NSC는 생체내 뿐만 아니라 시험관내에 존재하는 신호에 반응하는 능력을 갖는다. 따라서, 허혈-손상된 척수 내로 이식되는 경우, 척추 NSC는 시험관내에서보다 GABA-제조 뉴런을 실질적으로 더 많은 비율로 생성한다. 따라서, NSC는 가소성이다. NSC의 이러한 가소성 성질은 이들의 다능성 특징이고, 이와 같이 이러한 가소성은 표현형-유도 제제, 및 그의 성질을 바꾸기 위해 NSC 집단과 추가로 조합될 수 있는 조건을 확인하는 데 사용될 수 있다.

실시양태에서, 이러한 재-프로그래밍은 척수 조직으로부터의 NSC를 처리하여 운동 뉴런 표현형의 발현을 향상시키는 것을 포함한다. 처리 조건은 NSC 또는 이들의 분화된 세포를 다양한 근육 세포 또는 말초 신경계-유래된 세포, 예를 들어 신경 능선 세포 또는 신경절 뉴런과 함께 공동-배양하는 것을 포함한다. NSC는 또한 운동 뉴런 또는 척수에서 발현 및 생성되는 것으로 알려진 분자 칵테일로 처리되어, 운동 뉴런 표현형으로의 NSC 발현을 향상시킬 수 있다.

인간 중뇌의 도파민성 표현형의 향상된 NSC 발현을 유도하기 위해, NSC는 분자, 예를 들어 리튬, GDNF, BDNF, 플레이오트로핀(pleiotrophin), 에리트로포에이틴, 세르톨리 세포와 같은 세포로부터의 조절된 배지, 또는 임의의 다른 적합한 화학물질 또는 스크리닝으로 얻어진 세포, 또는 그의 조합으로 처리된다. 이러한 유도는 이식된 NSC가 생체내 도파민성 표현형을 발현 및 유지할 수 있게 할 수 있다.

실시양태에서, 본 발명의 방법의 NSC는 이식을 위해 전-분화된 세포를 포함할 수 있다. 세포 수율의 최대화 및 절차 간소화를 위해, 미분화된 세포의 집단을 주로 포함하는 전면생장 배양물을 이식을 위해 수확하였다. 그러나, 세포 밀도가 증가되었기 때문에, 자발적으로 막 분화를 시작한 세포의 작은 집단이 또한 존재할 수 있음을 인지해야 한다.

실시양태에서, 계대배양된 NSC는 기질로부터 세포를 수확하거나 탈착하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 본 발명의 방법은 1종 이상의 효소를 사용하여 기질로부터 세포를 수확 또는 탈착하는 것을 포함한다. NSC의 세포 주기 시간이 세포 표면에 있는 유사분열 물질 수용체를 실활화하기에 충분하게 짧은 경우에, 효소 처리를 하지 않을 수 있다. 그러나, 인간 NSC의 세포 주기 시간은, 효소 처리에 민감하지 않은 설치류 NSC보다 더 길다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 인간으로부터 유래된 NSC를 수확하기 위해 효소 처리가 사용된다. 인간 NSC는 효소 처리의 존재하에 유사분열 물질에 대해 일시적으로 내성이 될 수 있지만, 유사분열 물질 수용체의 반복적인 실활화는 NSC 비율을 감소시킬 수 있다.

실시양태에서, 세포를 수확한 후, 간단한 원심분리에 의해 세포를 농축한다. 세포를 추가로 세척하고, 최종 임상적으로 사용가능한 용액, 예를 들어 염수, 완충 염수 중에 재현탁시키거나, 다르게는 저장 또는 동면 용액 중에 재현탁시킨다. 별법으로, 세포를 디메틸술폭시드 또는 임의의 다른 적합한 동결 방지제를 가한 배지 등의 동결 배지 중에 재현탁시켜, 저장 동안 동결시킬 수 있다.

동면 용액을 제조하여 장기간 동안 생세포의 생존력을 유지한다. 실시양태에서, 저장 용액을 변형하여 즉시 사용가능한 제제 중의 생세포를 즉시 사용을 위한 이식 수술 부위에 운송하기 위해 사용할 수 있다. 생세포를 원거리 부위에 운송하기 위한 적합한 조건은 또한 약 0℃ 내지 약 20℃의 안정한 온도 범위를 24 시간 이상 유지할 수 있는 절연 장치를 포함한다. 약 0℃ 내지 약 8℃에서 약 24 시간 내지 약 48 시간 동안 저장된 생세포는 질환 또는 증상의 치료를 위해 이식가능하다.

실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 임상적으로 사용가능한 동면 또는 동결 용액과 같은 용액 중에 세포를 농축한다. 실시양태에서, 세포 투여를 위한 세포 밀도와 동일 또는 상이할 수 있는 적합한 세포 밀도로 세포를 농축한다. 실시양태에서, 투여를 위한 세포 밀도는 주사 부위, 주사 부위의 신경퇴행 상태, 유리한 효과를 위해 필요한 최소 투여량 및 독성 부작용 고려와 같은 인자에 따라 약 1,000개 세포/㎕ 내지 약 1,000,000개 세포/㎕로 다양할 수 있다. 실시양태에서, 본 발명의 방법은 약 5,000 내지 약 50,000 세포/㎕의 세포 밀도로 세포를 주사하는 것을 포함한다.

증대된 세포를 치료 영역에 전달하기 위해 현탁시킨 배지의 부피는 본원에서 주사 부피로서 언급될 수 있다. 주사 부피는 주사 부위 및 조직의 신경퇴행 상태에 따라 좌우된다. 보다 구체적으로, 주사 부피의 하한은 세포 고밀도의 점성 현탁액의 실제 액체 취급법 및 세포의 클러스터로의 경향성에 의해 결정될 수 있다. 주사 부피의 상한은 숙주 조직의 손상을 피하는 데 필요한 주사 부피 및 실제 수술 시간에 의해 가해지는 압축력의 한계에 의해 결정될 수 있다.

공지된 방법을 사용하는 경우, 공여 세포는 세포 생존률이 낮기 때문에, 효과적인 치료를 시도하기 위해, 비교적 작은 영역에 세포를 대량으로 전달할 필요가 있다. 그러나, 주사 부피는 숙주 조직에 가해지는 유체정역학 압력이고, 높은 주사 부피와 연관된 연장된 주사 시간은 수술 위험을 악화시킨다. 추가로, 공여 세포 과주사는 숙주 실질 조직의 압축 및 추후 손상을 야기한다. 부피 제한을 상쇄시키기 위해, 공지된 방법은 세포 밀도가 높은 주사용 현탁액의 제조를 요구한다. 그러나, 높은 세포 밀도는 이식된 세포의 단단한 클러스터화를 촉진하고, 세포 이동을 억제하거나, 또는 효과적인 치료를 방해하도록 제한된 영역을 넘어 확장되고, 숙주 조직 내로의 일관된 통합을 손상시킨다.

반대로, 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포의 개선된 생체내 생존률의 결과로서, 주사 당 더 적은 수의 세포가 요구된다. 사실, 주사 시로부터 6개월 후에 주사된 세포 수의 3 내지 4배가 존재하는 것으로 보여져서, 본 발명의 방법이 양적 생존률에 있어 유의하게 이용됨이 입증된다. 또한, 이러한 양적 생존으로 인하여, 목적하는 세포 투여량의 재현 투여가 달성될 수 있다. 따라서, 실시양태에서, 세포는 약 1,000 내지 약 200,000 세포/㎕의 밀도로 농축된다. 실시양태에서, 약 5,000 내지 약 50,000 세포/㎕가 효과적인 생착을 위해 사용되었다. 또다른 실시양태에서, 약 10,000 내지 30,000 세포/㎕이 사용된다. 실시양태에서, 주사 부위당 약 100 ㎕ 미만의 주사 부피로 현탁된 세포를 치료 영역에 전달할 수 있다. 예를 들어, 다중 주사가 척추 신경로를 따라 양측으로 이루어질 수 있는 인간 대상체의 신경퇴행성 증상의 치료에 있어서, 주사 부위 당 0.1 및 약 100 ㎕의 주사 부피를 사용할 수 있다.

세포를 목적하는 영역 내로 주사하기 위한 임의의 적합한 장치가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 실시양태에서, ㎕ 미만의 부피를 실질적으로 일정한 유속으로 일정 기간에 걸쳐 전달할 수 있는 시린지(syringe)를 사용한다. 니들 또는 가요성 튜브 또는 임의의 적합한 전달 장치를 통해 상기 장치 내로 세포를 로딩할 수 있다.

실시양태에서, 신경퇴행성 증상의 치료를 위한 바람직한 주사 부위는 하나 이상의 척수 영역을 포함한다. 실시양태에서, 세포는 하나 이상의 특정 구획, 또는 척수의 경부, 흉부 또는 요추 구역과 같은 척수의 구역 내로 이식된다. 예를 들어, 요추 구역에서는, 단 5쌍의 신경근만이 척추의 골성관을 가로질러 존재하며, 각 쌍의 신경근은 넓은 영역에 걸쳐 분포된 각 요추 수준으로 척추골에 존재한다. 척수 요추 구역에는 신경근이 저밀도로 존재하기 때문에, 요추 구역은 세포의 주사를 위한 안전한 부위를 제공하기에 특히 적합하다. 실시양태에서, 세포는 척수 실질의 중간 대역에 이식된다.

실시양태에서, 세포는 약 5 및 약 50 개 부위에 주사된다. 실시양태에서, 세포는 척추의 양측에 있는 약 10 내지 약 30 개 부위에 주사된다. 2개 이상의 부위는 대략 100 미크론 내지 약 5000 미크론의 거리 만큼 분리되어 있을 수 있다. 실시양태에서, 주사 부위 사이의 거리는 약 400 내지 약 600 미크론이다. 척추 분절에 걸친, 실질적으로 연속의 인접한 공여 세포 존재의 생성에 기초하여 그라고 래트 또는 돼지와 같은 동물 모델에서 약 2 내지 3 개월 생존을 달성하는 것으로 증명된 평균 주사 부피에 기초하여, 주사 부위 사이의 거리를 측정할 수 있다. 실시양태에서, 경련/경직과 같은 징후 또는 운동 뉴런 생존을 치료하기에 유용한, 적어도 몇몇 요추 분절의 길이를 연결하는 척수의 정중선의 양측을 따라 세포를 주사한다. 인간에서 실제 주사 횟수는 동물 모델에서의 결과로부터 추정될 수 있다.

실시양태에서, 주사의 표적 부위는 척수의 회색질이다. 회색질 내에, 특정 수준의 라미나(lamina)에 NSC이 침착되도록 니들 팁을 위치시킬 수 있다. 예를 들어, GABA/글리신-제조 뉴런을 전달하여 경련/경직을 치료하기 위해, NSC는 라미나 V-VII을 포함한 영역에 전달된다. 다르게는, NSC는 다양한 척추 분절의 회색질의 배각에 또는 그 근처에서 경부로부터 요부까지 전달되어, 신경병증성 통증 또는 만성 통증을 치료할 수 있다. 다르게는, NSC는 다양한 척추 분절의 회색질의 배각에 또는 그 근처에서 경부로부터 요부까지 전달되어, ALS와 같은 운동 뉴런 질환을 치료할 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 세포는 다수의 뉴런을 생체내에서 생성할 수 있다. NSC가 이식 전에 명백히 전-분화되지 않은 경우, NSC는 분화 전에 생체내 2 내지 4의 세포 분열을 증식시켜, 이에 따라 다수의 효과적인 공여 세포를 추가 증가시킬 수 있다. 분화에 따라, 뉴런은 특이적인 신경전달물질을 분비한다. 추가적으로, 뉴런은 성장 인자, 효소 및 다른 단백질, 또는 상이한 조건에 대해 유익한 성분을 생체내 이식 주변의 환경내에 분비한다. 따라서, 다수의 뉴런을 생체내 생성시키는 이식된 세포의 능력으로 인하여 그리고 신경퇴행성 증상이 뉴런-유래된 요소를 비롯한 요소에 의해 야기되거나 또는 이러한 요소를 손실시킬 수 있기 때문에, 다양한 증상이 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다. 따라서, 이러한 뉴런-유래된 요소, 예를 들어 성장 인자, 효소 및 다른 단백질의 결핍으로 인한 CNS 조직 퇴화로부터 고통받는 대상체는 본 발명의 방법에 의해 효과적으로 치료될 수 있다.

성장 인자, 효소 및 다른 단백질, 또는 이식된 뉴런에 의해 분비되는 성분에 대해 반응하는 증상에는 유전성 리조솜 질환, 예를 들어 테이-삭스(Tay-Sach)병, 니만-피크병, 바텐(Batten)병, 크라브(Crabb)병, 운동실조증 등이 포함된다.

추가로, 본 발명의 치료 방법에는 손상 또는 신경퇴화된 뉴런을 대체할 수 있는 시험관내 증대된 세포를 이식하는 것을 포함하고, 다른 뉴런에 대한 억제 또는 자극 효과, 및/또는 뉴런 재생에 기여하는 방출 영양 인자를 제공한다.

실시양태는 손상 또는 신경퇴화된 뉴런의 대체물로서의 추가 운동 뉴런을 공급하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 척수의 누공 내에 충분한 신경 기반을 제공하여 공동화를 충전시키는 것을 포함한다. 신경 기반은 외상성 척추 손상, 유전성 증상 또는 임의의 기타 원인으로부터 기인하는 척수공동증과 연관된 누공의 확장을 지연시킬 수 있는 경우에 충분하다. 충분한 신경 기반을 제공하는 것은 또한 척수 신경퇴행으로부터 야기되는 추가 합병증 완화를 보조하는 것으로 인정되어야 한다.

모든 NSC가 소정 질환에 대해 치료적인 것은 아니다. 상이한 질환에 영향을 미치는 뉴런 집단의 유형은 상이할 수 있다. 따라서, 치료적으로 유효한 NSC 공여 집단은 상실된 신경 요소를 대체하는 것에 기여한다. 예를 들어, 경련, 발작, 운동 장애, 및 기타 근육 과활성 장애의 치료는 GABA 또는 글리신을 생성하는 억제성 뉴런으로 분화할 수 있는 치료 유효량의 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 구분되는 NSC 집단은 분화된 뉴런 표현형을 검사함으로써 시험관내에서 평가될 수 있다. 시험관내 분화 패턴은 이어서 적절한 신경전달물질 표현형의 관점에서 뿐만 아니라 뉴런의 적절한 형태, 이동 및 다른 표현형적 특징의 관점에서 적절한 표현형을 생체내 생성하는 세포 효율을 예측하는 데 사용된다.

실시양태에서, 징후의 병인과 연관된, 손상 또는 파괴된 뉴런 서브타입에 상응하는 뉴런 서브타입을 생성할 수 있는 NSC를 이식한다. 예를 들어, 대상체에서 흥분 회로의 과활성은 척추 외상, 흉부/흉복부 대동맥 수술, 졸중, 간질, 뇌 외상, 헌팅톤병, 방광 실금, 과활성 장 운동, 및 손상 또는 유전성 증상으로부터 발생하는 임의 기타 비조절성 근육 수축으로부터의 유전성 증상 또는 뉴런 손상에 의해 야기될 수 있다. 다수의 상이한 병인성 기원으로 인해, 경련, 발작, 또는 기타 과활성은 척수와 대조적으로 뇌에서 발생한다. 예를 들어, 초점성 간질은 회로에 대해 음조성 조절을 가하는 GABA의 결핍으로 인한 비조절성 과활성으로부터 발생하는 것으로 생각된다. 결국, 본 발명의 방법은 시험관내 증대된 NSC의 이식에 의해 영향을 받는 영역에 GABA 또는 글리신과 같은 억제성 신경전달물질을 제공하는 것을 포함한다. 경련, 발작 및 다른 과활성의 경우에서, 예를 들어, 억제성 뉴런, 예를 들어 GABA-제조 또는 글리신-제조 뉴런으로 분화할 수 있는 다수의 NSC는 생체내 생성되어, 경련, 발작 및 다른 뉴런 과활성과 연관된 하나 이상의 과활성 신경 회로를 상쇄시키기 위해 이식된다. 따라서, 본 발명의 방법은 간질, 및 발작 유사 증상을 치료하기 위해 적용될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 부전, 마비, 경련, 경직, 또는 뇌허혈로부터 발생하는 임의의 기타 운동, 언어 또는 인지 징후를 치료하기 위해 적용될 수 있다. 뇌허혈은 뇌에서의 졸중 사건의 결과로서 또는 뇌로의 혈액 순환이 유의한 기간 동안 방해를 받은 심장 마비로부터 발생할 수 있다. 따라서, 이는 상기 기재된 척수 허열과 유사하다. 일부 졸중 대상체에서는 중추 기원의 발작, 및 기억력 상실, 마비 또는 부전과 같은 다른 결손이 발병한다. 뇌허혈로부터의 이러한 결손은 또한 해마 및/또는 다른 뇌 영역에서 억제성 개재뉴런의 선택적인 손실로 인한 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 부전, 마비, 경련, 또는 다른 운동, 언어 및 인지 징후를 앓고 있는 졸중 대상체를 치료하기 위해 적용될 수 있다.

부전마비, 이완성 대마비, 및 근육 수축의 통제 상실과 관련된 다른 증상, 예컨대, ALS, 외상성 척수 손상, 허혈성 손상, 또는 유전성 증상에 의해 초래된 증상의 경우에, 본 발명의 방법에는 뉴런을 이식하여 운동 뉴런의 손실을 느리게 하기 위한 충분한 영양 효과를 제공하는 것이 포함된다. 특히, 본 발명의 방법은 최적의 생체이용률의 조건 하에 퇴행중인 운동 뉴런에 전달될 수 있는 영양 분자를 분비하는, 이식된 NSC의 능력을 촉진한다. 그러한 영양 분자에는 세포외 분비된 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 예컨대 슈퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD1), 리소좀 효소 및 비-단백질성 분자, 예컨대 세포-생산된 항산화제가 포함된다. 이식된 세포에 의해 분비된 다른 영양 인자에는 구형 세포-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 혈관 표피 성장 인자 (VEGF), 플레이오트로핀, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 에리트로포이에틴, 미드카인, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1) 및 인슐린-유사 성장 인자 2 (IGF-2) 또는 다른 임의의 유익한 영양 요소가 포함될 수 있다.

광범위한 신경퇴행성 증상을 치료하기 위한 본 발명의 방법의 능력에 기여하는 다른 인자에는 존재하는 뉴런 섬유를 따라 광범위하게 이동하는 NSC-분화된 세포의 능력이 포함된다. 이식된 세포의 이동은 공여체 뉴런 및/또는 신경교의 전체적 분포 및 일체화, 및 그러한 세포에 의해 분비된 치료 요소의 전체적 또는 분산된 공급을 초래한다.

세포의 광범위한 이동은 그러한 치료가 필요한 대상체의 신경계 및 신체를 통해 주요 치료 단백질 및 물질의 전체적이고 안정한 전달을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 방법의 세포는 치료 단백질 및 물질에 대한 효과적인 전달 비히클이다. 그러한 전달 목적을 위해, 본 발명의 방법에는 CNS 실질, 심실, 경막하, 수막강내 및 경막외 공간, 말초 신경계 부위를 비롯한 신경계 내의 다양한 부위 뿐만 아니라 장, 근육, 내혈관계 및 피하 부위를 비롯한 신경계 외부 영역에 세포를 이식하는 것이 포함된다.

실시예 1. 인간 척수 신경 줄기/기원 세포의 증대

재태 기간이 대략 7 내지 8.5주인 공여체 중 하나 이상에서 척수를 얻었다. 척수의 단일 인접 조직을 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺-유리 인산염 완충 염수 중에서 기계적 분쇄를 이용하여 해리하였다. 이어서, 생성된 세포 현탁액을 폴리-L-오르니틴 또는 폴리-D-리신, 및 인간 피브로넥틴 또는 다른 세포외 기질 단백질 둘 다로 미리 코팅한 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 조직 배양-처리된 플레이트 또는 플라스크에 100 μg/ml 폴리-D-리신을 넣고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 이를 물로 3회 세척하고, 건조시켰다. 이어서, 여기에 25 mg/ml을 넣고 5분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 때로는, 1시간 동안 실온에서 10 mg/ml 피브로넥틴을 사용하였다. 때로는, 18시간 동안 37℃에서 1 mg/ml 피브로넥틴을 사용하였다. N2 (DMEM/F12 + 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 푸트레신 및 프로게스테론)로 이루어진 배지에 1 인간 재조합 기초 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 보충하였다. 실시양태에서, 0.1 ng/ml 내지 100 ng/ml의 범위가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 최적으로는, 10 ng/ml의 bFGF가 사용되었다.

생성된 초기 배양물은 유사분열후 뉴런 및 증식성 NSC의 단층으로 이루어졌다. 후속적으로, 대략 5 내지 약 20일 동안 배양한 후, 분할하는 네스틴-양성 NSC가 배양물에서 분할되지 않는 뉴런 또는 서서히 분할하는 신경교에 비해 우위를 차지하였다. 이러한 배양 조건 하에, NSC가 증대를 위해 선택적으로 선호되었다. 증대중인 NSC 집단을 온화한 효소 처리, 예컨대 트립신을 사용함으로써 계대배양하였다. 세포를 혈청이 없거나 또는 실질적으로 혈청이 없는 배지에서 배양하였다. 세포에서 낮은 농도의 혈청이 허용될 수도 있지만, 혈청이 NSC의 신경교 분화를 촉진하는 다수의 사이토킨, 예컨대 LIF 및 CNTF를 함유하기 때문에 세포를 혈청에 노출시키는 것은 피하는 것이 좋다. 따라서, 계대배양 동안, 혈청보다는 특정 효소 억제제, 예컨대 트립신 억제제를 첨가함으로써 사용된 효소를 정지시켰다. 각각의 계대배양에서, 회수된 세포를 카운팅하고, 추가 증대를 위해 분획을 다시 시딩하였 다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 방법을 이용하여, 인간 NSC의 성장 및 분화 특성을 유지하면서, 집단을 10¹⁸-배수 증가 초과로 증대시킬 수 있다. 세포를 재현가능하게 증대시킬 수 있다. 도 1에 제시된 바와 같이, 세포의 연속적 계대배양을 세포의 재현가능한 성장 곡선 및 배가 시간으로 3회 반복하였다. 증대하는 동안, 거의 모든 세포는 유사분열 신경상피 세포의 생체내 마커인 네스틴을 발현시켰고, 분화된 뉴런 및 신경교의 항원, 예컨대 제3형-베타 튜불린 및 GFAP는 존재하지 않았다. 세포는 또한 관계된 뉴런 전구체의 가능한 마커인 PSA-NCAM, 희소돌기아교세포의 마커인 O4 및 GalC, 및 방사형 신경교의 마커인 RC2에 대한 면역염색에 음성이었다. 따라서, 면역염색에 의해 결정된, NSC는 연장된 증대 기간 동안 항원 프로파일의 이들의 발현을 안정하게 유지하였다. 형태 및 네스틴 발현의 예를 도 2 A 및 B에 각각 도시하였다.

실시예 2. 인간 척수 신경 줄기/기원 세포의 분화

NSC의 증대 동안 임의의 지점에서, 배양물 중 bFGF와 같은 유사분열 물질의 제거에 의해 배양물을 분화시킬 수 있다. 유사분열 물질의 제거 후 약 1 내지 3일 내에 NSC의 분화가 일어나고, 뚜렷한 이질 세포 형태가 나타났다. 분화 후 대략 4 내지 7일째, 뉴런-특이적 항원, 예컨대 MAP2c, tau 및 제3형 베타 튜불린은 면역염색에 의해 가시화될 수 있다. 대략 12 내지 14일째, 연장된 다발화 축삭 과정은 세포밑 단백질 수송의 명백한 편극화와 함께 배양물을 통해 명백하였다. 대략 28일째, 시냅스 단백질, 예컨대 시냅신 및 시냅토피신은 축삭 말단에 국지화되었으 며, 이는 반점 염색으로 나타났다. 성상세포의 부가적 공급층이 뉴런의 장기간 성숙을 추가로 촉진하기 위해 제공될 수 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 인간 척수 NSC의 분화는 뉴런 및 신경교의 혼합된 배양물을 생성하며, 여기서 뉴런은 뉴런-특이적 항원, 예컨대 tau, MAP2ab (A) 및 제3형 베타 튜불린 (B)를 강력하게 발현시키고, 이는 배양물의 대략 50％를 포함한다. 도 3B에 도시된 바와 같이, 배양물은 수 센티미터만큼 늘어나는 긴 다발의 축삭 케이블을 자발적으로 생성하였다. 도 3C에 도시된 바와 같이, 뉴런의 상당 비율이 GABA-생성을 나타내었다. 콜린성 운동 뉴런이 또한 배양물에 존재하였다 (도 3D). 배양물 중의 상당한 GABA 뉴런의 존재는 특정 회로에서 GABA 생성의 감소에 의해 야기된 다양한 신경학상 증상을 치료하기 위한 인간 척수 NSC의 유용함을 예측하게 하였다. 마찬가지로, 콜린성 뉴런의 존재는 인간 척수 NSC가 운동 뉴런을 분화시킬 수 있으며, 운동 뉴런의 점진적 퇴화에 의해 야기된 다양한 운동 뉴런 질환을 치료하기 위한 이들의 유용성을 예측하였음을 증명하였다. 치료를 위해, NSC를 추가의 표현형-증진 조건 하 또는 부재 하에 증대시키고, 회수하고, 결핍된 신경 영역에 주사하였다.

실시예 3. 인간 중뇌 신경 줄기/기원 세포의 증대.

태아 재태 기간 7 내지 8.5주의 중뇌 조직을 얻었다. 중뇌 조직에서 NSC를 실시예 1에 기재된 바와 같이 얻었다. 세포를 순수한 배양기간 160일에 걸쳐 연속적으로 계대배양하였으며, 증대 결과를 도 4에 제시하였다. 증대 기간에 걸쳐, NSC는 이들의 다능성 및 신경성 뿐만 아니라 이들의 분화능을 안정적으로 유지시켜 도파민 뉴런을 발생시켰다. 도파민 뉴런을 티로신 히드록실라제 (TH) 및 도파민 수송체 (DAT)의 뉴런 발현에 의해 평가하였다.

DAT 발현은 도파민-생성 뉴런의 마커이다. 뉴런에서 DAT 발현은 배양물에서 분화된 뉴런의 시냅스 막을 통해 방사성표지된 도파민을 수송하는 그의 기능을 측정함으로써 평가할 수 있다. 분화된 인간 중뇌 NSC 및 모노클로날 유도된 인간 중뇌 NSC로부터의 배양물의 DAT 기능은 방사성표지된 도파민 흡수 분석에 의해 평가하였다 (도 5). 분석 결과, 인간 중뇌 NSC의 강력한 기능성 도파민 활성을 나타냈다. 또한, 도파민 표현형은, 특히 분화와 동시에 도파민 뉴런의 비율을 보다 높게 하는 경향이 있는 NSC의 단리된 모노클로날 집단에 의해 풍부해질 수 있음이 증명되었다 (도 5).

풍부한 도파민 뉴런을 생성하는 NSC는 특히 파킨슨병의 치료에 유용하다. 유사하게는, 특이적 표현형의 증진된 분화에 대해 조직으로부터 단리되는 때에 미리 프로그래밍된 NSC는 다른 바람직한 특정 뉴런, 예컨대 알쯔하이머병의 치료에 유용한 전뇌 콜린성 뉴런, 운동 뉴런 질환, 예컨대 ALS의 치료에 유용한 척수 콜린성 뉴런, 우울증의 치료에 유용한 세로토닌 뉴런, 및 간질 및 헌팅톤병의 치료에 유용한 GABA-생성 뉴런을 단리하는 데 이용될 수 있다.

실시예 4. 인간 중뇌 신경 줄기/기원 세포의 분화.

인간 중뇌 NSC/기원체는 실시예 2에 기재된 바와 같이 분화될 수 있다. NSC의 유사분열 동안 또는 이들의 분화 동안, 바람직한 표현형의 비율은 다양한 외인성 인자와 함께 배양물의 처리에 의해 풍부해질 수 있다. 인간 중뇌 NSC로부터의 도파민 표현형을 풍부하게 할 수 있는 인자의 예는 도 6A 및 6B에 도시된 바와 같 이, 세르톨리 세포로부터 조건화된 배지에 의해 증명되었다.

도 6A 및 6B에 제시된 연구에서, 냉동보존된 신경 줄기 세포를 해동시키고, 4-웰 챔버 슬라이드에서 유사분열 물질의 존재 하에 각 웰에 40,000개의 세포의 밀도로 플레이팅하고, 6일 동안 증식시킨 후, 유사분열 물질을 제거하고, 세포를 8일 동안 분화시켰다. 세르톨리 세포 조건화된 배지 (SCCM, N2a 중 1:1로 희석함)에 노출하는 시기 및 노출 지속시간에 기초하여, 세포를 4개의 군으로 나누었다. 제1 군은 증식 및 분화 동안 SCCM에 노출시켰고 (조건 1); 제2 군은 증식 동안에만 노출시켰고 (조건 2); 제3 군은 분화 동안에만 노출시켰고 (조건 3); 제4 군은 SCCM에 노출시키지 않았다 (대조군). 배지를 2일에 한번씩 교체하고, 유사분열 물질을 증식기 동안 매일 첨가하였다. 조건 당 4개의 웰을 다중 마커에 대해 염색되도록 유지하고, 3종의 세포주, 796MB, 527MB 및 566SC에 대해 시험하였다. 측정가능한 TH-양성 뉴런을 갖지 않는, 척수로부터 유래된 566SC 세포는 도면에서 생략하였다.

분화에 따라, 4％ 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 고정시키고, MAP2 [MAP2ab 서브타입을 인식하는 AP20 클론 (시그마 (Sigma))], 뉴런-특이적 β-튜불린 [TuJ1 (코반스 (Covance))], 및 티로신 히드롤라제 (펠-프리즈 (Pel-Freez)), 뿐만 아니라 GFAP (다코 (Dako)) 및 GalC (케미콘 (Chemicon))에 대한 항체를 사용하여 면역염색하였다. 면역염색된 세포를 40x 대물렌즈를 이용하여 카운팅하고, 각 웰에 대해 3개 이상의 영역에서 카운팅하였다. 임의의 조건 하에 유지한 세포를 분석했을 때 GFAP+ 또는 GalC+ 세포가 거의 검출되지 않거나 전혀 검출되지 않았으면, 이러한 항원은 분석에서 제외하였다. 또한, 566SC 세포는 상기 기재된 조 건 하에 유지시킨 후에는 정량하기에 너무 밀집되어 있어서, 최종 분석에 포함시키지 않았다.

분석 결과, 인간 중뇌 NSC는 외인성 인자로 처리함으로써 도파민 뉴런을 더욱 풍부하게 하는 유용한 단백질 인자 또는 화학물질을 찾는 데 영향을 받을 수 있다는 것이 증명되었다. 따라서, 신규한 합성/천연 화학물질 및 단백질 인자는 인간 NSC를 이용함으로써 효과적으로 스크리닝되어 특정 적응증, 예컨대 파킨슨병의 치료를 위해 특히 유용한 집단을 얻을 수 있다.

실시예 5. 래트에서 인간 척수 신경 줄기/기원 세포의 이식에 의한 경련 및 경직의 치료.

일시적 척수 허혈을 유도하기 위해, 이전에 문헌 [Taira, (1996)]에 기재된 기술을 이용하였다. 스프라그 돌리 (Sprague Dawley; SD) 래트를 할로탄 (1.5％)으로 마취시켰다. 2 Fr 포가티 (Fogarty; 등록상표) 카테터를 왼쪽 대퇴부 동맥 및 하행 흉부 대동맥을 통해 왼쪽 쇄골하동맥 수준으로 통과시켰다. 대동맥 폐색 수준 미만의 말초 동맥압력 (DBP)을 측정하기 위해, 꼬리 동맥에 폴리에틸렌 (PE-50) 카테터를 꽂았다.

척수 허혈은 염수 0.05 mL로 대동맥내 풍선 카테터를 팽창시켜 유도하였다. PE-50 카테터를 꽂은 경동맥으로부터 동맥혈 일부 (10.5 내지 11 cc)를 빼냄으로써 대동맥 폐색 기간 동안 전신 저혈압을 다시 유도하였다. 대략 40 mm Hg의 전신 저혈압은 이러한 방법으로 유도될 수 있다. 폐색의 효능은 꼬리 동맥에서 측정된 DBP의 즉각적이고 지속적인 하강에 의해 증명되었다. 척수 허혈이 유도된 지 대략 10분 후, 풍선을 탈기시키고, 경동맥에서 빼낸 혈액을 재주입하였다. 동맥 혈압이 안정화되었을 때 (재순환 후 약 20 내지 30분 내), 동맥선을 제거하고, 상처를 봉합하였다.

척수 허혈의 유도 이후, 운동 기능의 회복은 변형된 21-점 개방 필드 운동 척도 (BBB 척도)를 이용하여 대략 2일 간격으로 평가하였다. BBB 스코어가 0 내지 4인 동물만 이식 연구를 위한 실험군으로 선택하였다.

허혈성 병변 후 약 7 내지 21일째, BBB 스코어가 0 내지 4인 경련 래트를 실내 공기 중에서 1.5 내지 2％ 할로탄으로 마취시키고, 척수 단위 장치에 두었다. 이어서, Th11-L2 추골의 부분 추궁절제술을 수행하였다. 팁 직경이 80 내지 100 μm인 유리 모세관을 압력-조절 미세주사기에 연결하였다. 주사 당 5,000, 10,000, 15,000 또는 20,000 인간 신경 줄기/기원 세포를 함유하는 세포 현탁액 0.5 μl를 래트에게 주사하였다. 각각의 래트에게 척수의 양 옆 (왼쪽 및 오른쪽)에 총 6 내지 8회 주사하고, 노출된 L2-L6 절편 사이에 균등하게 분포시켰다. 주사의 중심은 중심 회색질 (척추각 V-VII) (L3 레벨에서 척수의 등쪽 표면으로부터의 거리: 1 mm)을 표적으로 하였다. 이식 후, 절개부를 3％ H₂O₂ 및 페니실린/스트렙토마이신 혼합물로 씻어내고, 2층으로 봉합하였다. 이어서, 래트가 회복되도록 두었다.

척수 이식하기 약 3일 전에 모든 동물에게 FK-506 (Prograf; Fujisawa; 1mg/kg; 복막내)로 면역억제 처리를 시작하였다. 이식에 이어, 전체 생존기간 동 안 동물들에게 매일 면역억제 처리를 하였다. 이러한 이식의 면역거부가 FK-506으로 효과적으로 방지될 수 있다. 래트는 대략 2 또는 7주 동안 생존하였다 (각각의 시점에 대해 n=5).

생존기간의 말기에서, 래트를 펜토바르비탈 (40 mg/kg; 복막내)로 마취시키고, 헤파린첨가된 염수로 1 내지 2분 동안 심장을 통해 관류시키고, 이어서 0.1 M 인산염 완충액 (PB) 중 4％ 파라포름알데히드로 관류시켰다. 척수를 절개하고, 동일한 고정액으로 밤새 4℃에서 후고정시켰다. 후고정 이후, 척수 조직을 총 3일 동안 농도 구배의 수크로스 용액 (10, 20 및 30％)에서 동결보호시켰다. 이어서, 냉동 관상, 시상동 또는 가로방향 척수 절편 (10 내지 30 μm)을 절단하였다. 면역조직화학을 위해, 유리 부유 절편 (30 μm)을 5％ 정상 염소 혈청 (NGS), 0.2％ 트리톤 X100 (TX)를 함유하는 0.1 M의 PBS (pH = 7.4)에 2시간 동안 실온에서 두어 비-특이적 단백질 활성을 차단하였다. 여기에 다양한 1차 인간 특정 항체를 넣고 밤새 4℃에서 인큐베이션시켰다.

1차 항체와 함께 인큐베이션시킨 후, 절편을 PBS로 3회 세척하고, 형광 마커 (알렉사 (Alexa) 488 또는 594; 4 μl/ml; 분자 프로브 (Molecular Probes))에 접합된 2차 염소 항 토끼 또는 마우스 항체를 넣고 인큐베이션시켰다. 모든 차단 및 항체 제조는 0.1 M PBS/0.2％ TX/5％ NGS 중에서 하였다. 이중 표지화 실험을 위해, 상이한 종으로부터의 1차 항체를 동시에 적용하고, 이어서 상이한 형광 마커에 접합된 2차 항체를 적용하였다. 대조 실험에서는, 1차 항체를 제외하였다. 일반적인 핵 염색을 위해, DAPI (3 μl/ml)를 최종 2차 항체 용액에 첨가하였다. 염색 한 후, 절편을 실온에서 건조시키고, 연장 안티-페이드 키트 (Prolong anti-fade kit; 분자 프로브)로 커버링하였다.

슬라이드를 레이카 (Leica) 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 영상 (512 x 512 픽셀)을 올림푸스 디지털 카메라로 캡쳐하고, 아도비 포토샵 5.5 (아도비 시스템즈 (Adobe Systems, Mountain View, CA))로 처리하였다. 이중 염색된 절편에서 상이한 항체들의 동시-국지화(co-localization)를 확인하기 위해, 니콘 현미경 상에 탑재된 포토메트릭스 (Photometrics) CCD (어플라이드 프리시젼, 인크. (Applied Precision, Inc.))를 포함하는 델타비젼 디컨볼루션 (DeltaVision deconvolution) 현미경 시스템으로 영상을 캡쳐하였다. 일반적으로, 0.1 또는 0.2 μm까지의 공간을 둔 60개의 광학 섹션을 찍었다. 사용된 렌즈는 20x, 40x 및 60x (NA 1.3)였다. 데이터 세트의 회절을 풀고, 실리콘 그래픽스 옥탄 워크스테이션 (Silicon Graphics Octane workstation) 상에서 소프트웍스 (SoftWorx) 소프트웨어 (어플라이드 프리시젼, 인크.)를 이용하여 분석하였다.

인간 핵 NUMA 항체에 대해 면역반응하는 이식된 뉴런의 총수는 입체형태학적인 비편향성 체계적 샘플링을 이용하여 측정하였다. 10개마다, 분획기 샘플링 계획을 적용한 후에 L2-L6 척수 단편으로부터 찍은 이전에 염색한 절편을 입체형태학적 정량화를 위해 이용하였다. 광학 영상 (1 μm 두께)을 숫자 구경 1.3인 100x 오일 침지 대물렌즈를 사용한 레이카 DMLB 현미경에 의해 얻었다. 디지털 카메라 (올림푸스), 및 스테이지프로 (StagePro)-제어 동력화 Z 스테이지 (미디어 사이버네틱스 (Media Cybernetics))와 함께 공급되는 이미지프로 (ImagePro) 소프트웨어 (미디어 사이버네틱스)를 이용하여 광학 영상을 캡쳐하였다. 이어서, 이식된 세포의 총수를 분획 공식 N = Q x 1/hsf x 1/asf x 1/ssf (여기서, N은 양성 핵의 총수이고, Q는 카운팅한 세포의 총수이고, hsf는 가장 높은 샘플링 분획이고, asf는 영역 샘플링 분획이고, ssf는 슬라이스 샘플링 분획임)에 적용하여 계산하였다.

허혈성 척수에서 이식된 인간 NSC의 3차원으로 재구성된 영상을 제공하기 위해, 연속적으로 절단된 척수로부터 얻은 이전에 저장된 영상을 이용하였다. 평균적으로, 약 60 내지 100개의 연속적 섹션을 3차원 재구성을 위해 이용하였다. 첫 번째 단계에서, 여러 층의 연속적 영상을 엘립스 (Ellipse) 소프트웨어를 이용하여 열고, 맞춤 개발 얼라인 모듈 (Allign module; 비디토 (VidiTo), SK)을 이용하여 정렬하였다. 정렬 과정은 모든 연속적인 척수 영상에서의 정의하는 2개의 형태학적 기준점 (제1 기준점: 중심관의 중심; 제2 기준점: 전각의 중심 경계), 및 모든 영상의 후속적 컴퓨터-처리된 정렬로 구성된다. 배각 및 전각의 경계선을 확인하기 위해, 라미나 맵스 모듈 (Laminar Maps module; 엘립스)을 이용하여 이전에 정렬된 여러 층의 영상에 선을 그렸다. 최종적으로, 이전에 정렬되고 라미나 맵-표지된 영상의 층을 3-D 생성자 (미디어 사이버네틱스)를 사용한 3차원 재구성을 위해 이용하였다.

2 내지 3주 동안 래트 성상세포 상의 인간 척수 NSC의 배양물은 대부분의 배양물에서 시간 의존성 성숙 및 뉴런 표현형의 발달을 나타내었다. 이는 NSE 또는 MOC에 대한 인간-특이적 항체로 염색함으로써 확인되었다. 잘 발달된 축삭수상돌기 가지가 있는 다수의 뉴런도 확인되었다. NSE 양성 뉴런의 대다수 (85 내지 90 ％)는 GABA 양성이었다. 축삭 및 수상돌기에서의 시냅토피신의 발현은 특정 MOC 양성 뉴런에서 관찰되었다.

허혈성 손상 후 21일째에 이식된 경우, 세포의 활발한 생존이 관찰되었다. 이는 NUMA, MOC 또는 NSE, 모든 인간-특이적 항체에 대한 명확히-확인된 양측성 이식편 면역반응으로 발현된다. 이식된 척수 단편으로부터 얻은 가로방향 절편의 분석은 개별적 주사 부위 사이에서의 NUMA 양성 세포의 명백한 이동을 나타내었다. 대다수의 NUMA-양성 세포는 MOC 면역반응과 함께 동시-국지화를 나타내었다.

공초점 현미경으로 분석된 척수 절편의 NUMA 및 GABA 항체로의 이중 표지화는 평균 25 내지 35％ GABA 양성 세포를 나타내었다. GABA-생성 표현형의 일관적 발현은 생존 7주에 이식된 모든 동물에서 나타났다.

동일한 시점에서 (즉, 이식 후 7주), 시냅토피신 및 NUMA 항체로의 이중-염색은 이식편 내에서 밀집된 시냅토피신-양성 네트워크를 나타내었다.

특정 경우에서만, NUMA-양성 세포는 GFAP 항체와 함께 동시-국지화를 나타낼 것이다. 이들 세포는 전형적으로 이식편의 주변에 국지화되었다.

NUMA-양성 세포의 입체형태학적 측정은 개별적 이식편 내에 평균 75,460 ± 5,697개의 존속하는 이식된 세포를 제시하였다. 이는 원래 주사된 것보다 평균 3 내지 3.6배 이상의 세포를 나타낸다. 세포-주기 항원인 Ki67은 활발한 유사분열 세포의 마커이다. 이식 후 2 또는 7주에서 척수 절편의 염색은 이식 후 2주에서만 hKi67 면역반응을 나타냈다. 특정 경우에서만 (1 내지 2개의 세포/10개 절편) 생존 7주에서 세포 Ki67-양성 세포였다. 이러한 결과는 이식된 인간 척수 NSC 및 이 들의 자손이 초기 2주의 기간 동안 평균 약 3배 세포-배가에 상응하는 수로 증대하고, 이어서 유사분열후에 안정적으로 일체화되는 것을 나타낸다.

이식된 L3-L5 단편의 부피 재구성은 MOC 항체 및 DAPI로 염색된 40 μm-두께 연속적인 척수 절편 (총수 150 내지 200개의 절편)으로부터 찍은 영상을 이용하여 수행하였다. 3차원 이식 재구성은 회색질의 범위 내에 분포된 잘 인식된 전후 방향 MOC-양성 이식편을 제시하였다. 도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, 인간 척수 NSC의 기능적 효과는 세포를 이식하고, BBB 스코어에 의해 회복 운동 이익을 측정함으로써 평가하였다.

본 연구에서 관찰된 행동 회복의 정도에 관하여, 본 발명자들은 이식 후 세 가지 주요 군을 발견하였다. 첫 번째, 가장 활발한 회복 및 걸을 수 있는 능력을 보인 동물 (BBB <16), 두 번째, 하부 사지에서 3개의 모든 관절의 활발한 움직임에서 개선을 보였으나 일어서지 못한 동물 (BBB 8 근처), 그리고, 세 번째는 어떤 회복도 보이지 않은 동물 (즉, 비-반응자)이었다. 이식에 대한 반응성이 상이한 이유가 명확하지 않기 때문에, 본 발명자들은 이상억제된 1차 구심성신경 및/또는 α-운동 뉴런과 관련된 이식 위치의 미묘한 차이가 작용한 것이라고 생각하였다. 또한, 본 연구에서 동물들이 세 달밖에 생존하지 않았다는 것도 주의해야 한다. 본 발명자들은 장기간 이식-후 생존 및 지속적인 물리적 회복이 기능적 회복과 높은 정도로 연관되어 있을 것으로 생각하였다. 그럼에도 불구하고, 처리군과는 대조적으로 유의하지 않은 회복이 보존액만 주사된 임의의 동물에서 관찰되었다.

실시예 6. 인간 척수 NSC의 이식에 의한 운동 뉴런 질환의 치료.

본 발명의 방법의 NSC는 막강하고 중요한 임상 및 생물학적 이점을 둘 다 가진다. 이 때문에, 본 발명의 방법은 ALS와 같이 중추 신경계를 통해 퍼진 증상 뿐만 아니라, 상기 기재된 척수 허혈에서와 같이 특정 영역에 국지화된 증상의 치료를 가능하게 하였다. ALS에서, 요수에 이식하는 것은 단편적 운동 장치의 다른 필수적 부분, 즉 호흡 운동을 책임지는 경부 운동 뉴런 기둥을 없앨 수 있지만, 척수에 NSC를 이식하는 본 발명의 방법은 삭상조직을 통한 숙주 운동 뉴런에 대한 광범위한 효과가 발생할 수 있는 CSF로의 BDNF 및 GDNF의 방출, 및 이식된 세포로부터의 다른 인자의 방출을 촉진하였다.

본 발명에 이르러 놀랍게도 신경퇴행성 척수 환경의 요추 단편으로의 인간 NSC의 부분적 이식편이 생존하고, 광범위한 뉴런 분화를 수행하고, 이식 부위 및 다른 위치 모두에서 운동 뉴런 생존 및 기능을 촉진한다는 것이 발견되었다. NSC는 인간 ALS (근위축성 측삭 경화증)의 모델인 SOD1 G93A 래트의 징후의 발병 및 수명 연장을 유의하게 지연시켰다.

SOD1 G93A 래트는 ALS의 특히 공격적인 형태의 신경병리학 및 임상 징후에 대한 포괄적 모델을 나타낸다 (문헌 [Nagai et al., 2001; Howland et al., 2002]). 인간 태아 척수로부터의 NSC는 뉴런의 광범위한 분화가 일어나고, 분화된 뉴런은 그 결과로서 숙주 뉴런과의 시냅스 접촉점을 형성하고, GDNF 및 BDNF를 발현하고 방출하는 SOD1 G93A 래트 및 마우스의 요수로 이식될 수 있다. 예를 들어, 급성 운동 뉴런 질환을 특징으로 하는 래트 SOD1 G93A 모델은 질환에서 NSC의 이로운 효과를 연구 및 증명하는 데 이용될 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 방법에서 이용된 NSC 이식편은 신경퇴행성 환경에서 잘 생존하고, 강력한 임상 효과를 발휘하였다. 이러한 효과의 적어도 일부는 이들 이식편의 운동 뉴런 성장 인자를 발현하고 방출하는 능력과 연관되어 있었다. 따라서, 요추 돌출부에 제한되는 제한된 이식 스케줄에도 불구하고, 본 발명의 방법의 이식된 NSC는 급성 운동 뉴런 질환의 발병 및 진행을 지연시키고, 이들 동물의 수명을 10일 초과로 연장시켰다.

재태 기간 8주의 사후 인간 태아의 척수 조직으로부터의 인간 NSC (NSI-566RSC)를 이식 전에 약 10 내지 12개의 계대배양에 대해 섬유아세포 성장 인자 (FGF-2)를 함유하는 혈청이 없는 배지에서 증대시켰다 (문헌 [Johe et al., 1996]). 이들 세포의 운명은 인간 핵 항원 (HNu)에 대한 항체로 확실히 추적하였다 (문헌 [Yan et al., 2003]). 이들 세포를 이용한 모든 외과적 절차는 기체 마취 및 무균 방법을 이용하여, 참고로 본원에 포함되는 존스 홉킨스 의학 연구소 (Johns Hopkins Medical Institutions)의 동물 관리 위원회 (Animal Care and Use Committee) (엔플루란:산소:아산화질소=1:33:66)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다.

생존 또는 사멸 NSC는 현미경 안내 하에 코프 (Kopf) 척수 정위 (stereotaxic) 유닛 상에 표본제작된 혼합된 성별의 9-주령의 (220 내지 300 g) SOD1 G93A 래트의 요추 돌출부 (L4 ＆ L5)로 이식하였다. 죽은 세포를 이식 전에 냉동 및 해동을 반복함으로써 준비하였다. 세포 현탁액을 실라스틱 튜브를 통해 10 μl 해밀톤 (Hamilton) 미세주사기에 연결된 당겨진 빗각 유리 미세-피펫으로, 전각의 두 측면의 전각으로 무균 조건 하에 대략 8회 주사 (주사 부위 당 5 x 10⁴ NSC, 한 측면 당 4 군데의 주사 부위)하여 전달하였다. 모든 래트에게 FK-506 (1 mg/kg 복막내)을 주입하여, 처리하지 않은 동물 또는 시클로스포린을 투여받은 동물에서, 이식편 생존은 한 달을 넘지 않았다는 파일럿 데이터에 기초한 면역 거부를 예방하였다.

래트를 운동 강도 및 중량에 대해 2주 시험하였다. 운동 강도 시험에는 바쏘 (Basso), 베아티 (Beattie) 및 브레스나한 (Bresnahan) (BBB) 운동 등급 척도 (locomotor rating scale) (문헌 [Basso et al., 1995]), 및 경사면 척도 (문헌 [Rivlin and Tator, 1977])가 포함되었다. BBB 스코어 시험을 위해, 동물을 약 4 또는 5분 동안 개방된 필드에서 시험하였다. 모든 운동 수행을 기록하고, 척도에 따라 등급화하였다. 경사면 시험을 위해, 래트를 경사면 매트에 두고, 각을 래트의 위치가 약 5초 동안 안정화될 수 있는 최대 지점으로 조정하였다. 이어서, 이 각을 동물의 경사면 스코어로 기록하였다. BBB 및 경사면 스코어를 다변량분산분석 (MANOVA)에 이어 사후 피셔 LSD (Fisher LSD post hoc) 시험에 의해 분석하였다. 질환 발병은 체중이 갑자기 감소하는 시점으로 정의하였다. 이식 유형 (생존- 또는 사멸-세포 이식)의 효과로서의 병의 추이를 두 군 사이의 질환 발병 나이 및 사멸 나이의 비교 (스튜던트 t 시험과 함께), 뿐만 아니라 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 생존 분석에 이어 장기간-순위 시험 (long-rank test)에 의해 분석하였다.

하나의 관절만 움직이거나 모든 관절에서 움직임이 전혀 없고, 동물이 죽어가는 것으로 고려되는 단계인 BBB 스코어 (하기 참조)가 3 미만인 경우에는, 래트를 관류-고정으로 안락사시켰다.

4％ 중성-완충된 파라포름알데히드로 관류시킨 동물로부터 조직을 준비하였다. 뿌리 및 요추 신경에 부착된 흉부-요추 척수 단편을 추가 4시간 동안 동일한 고정액에 침지시킴으로써 추가로 고정시켰다. 전체 이식된 영역 및 블록 경계선의 위, 아래 1 mm를 포함하는 블록을 동결방지시키고, 추가 공정을 위해 냉동시켰다. L3-S1 뿌리를 전체-표본을 제조하면서, 또는 지근을 분리한 후, 유리 피펫의 가열-응고된 팁으로 개별적으로 처리하였다. 블록은 가로 또는 시상면에서 절편화시켰다 (35 μm). NSC 생존 및 분화는, 대부분의 경우 다른 세포 마커와 함께 인간-특이적 마커인 HNu와 합한 이중-표지 면역형광으로 연구하였으며, 이는 문헌 [Yan et al., 2004]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

본 연구의 면역형광 표본으로부터 임의적으로 선택된 고-출력 (100x) 필드 상에서 HNu (+) 세포, 뿐만 아니라 HNu 및 표현형 마커로 이중적으로 표지화된 세포의 총수를 세는 비-입체형태학적 방법을 NSC 분화를 연구하기 위해 이용하였다. 이식 영역을 통해 약 1 mm 떨어진 6개 절편 중에서 한 필드씩을 각각의 동물로부터 이용하였다. 각각의 경우에 대해 카운팅한 6개의 모든 영역으로부터 HNu (+) 및 이중-표지된 프로파일의 개수를 모으고, 각 실험 프로토콜에 따라 군집화하였다. 단일 및 이중-표지된 세포의 평균 수를 각각의 처리군 (한 군 당 n=6)에 대해 생성하였다.

생존 또는 사멸 세포로 이식된 래트 (각각 n=4)에서 운동 뉴런 생존을 평가하기 위해, 생후 128일째 희생시킨 동물의 조직을 평가하였다. 각 동물의 L3-S1 영역에서의 모든 6번째 절편을 입체형태학적 요건에 따라 샘플링하고 (문헌 [Yan et al., 2004]), 뚜렷한 하나의 핵 및 직경 35 μm 초과인 체세포를 갖는 다극 세포로 확인된 α-운동 뉴런의 수를 광학 분획기로 문헌 [Yan et al., 2004]에 기재된 바와 같이 카운팅하였다. 생존 대 사멸 세포로 이식된 동물 간의 차이를 스튜던트 t 시험으로 분석하였다.

운동 신경영양 인자의 ELISA 결정을 위해, CSF를 기체 마취 하에 동물의 4번째 심실로부터 25 G 주사로 샘플링하였다. 이식 부위 및 그에 인접한 영역을 함유한 조직 샘플을 1 mm 두께의 새로운 척수 슬라이스로부터 가로로 절개하였다. CSF 또는 조직 샘플을 처리하고, 우선 총 단백질을 문헌 [Sheng et al., 2003]에 기재된 바와 같이 측정하였다. GDNF 및 BDNF의 수준을 이-맥스 면역분석 시스템 (E-Max ImmunoAssay system; 프로메가 (Promega, Madison, WI))을 이용하여 CSF 및 척수 샘플에서 측정하였다. TMB-색원체 흡광도를 450 nm에서 읽었다. 생 이식편, 이식편에 인접한 영역 및 사멸-세포 이식편으로부터의 샘플 간의 농도의 변화를 일원 변량분석 (one-way ANOVA)에 이어 터키의 사후 다중 비교 시험 (Tukey's Multiple Comparison post hoc test)으로 분석하였다. 생존 대 사멸 세포로 이식된 동물 사이에서의 CFS 농축의 차이를 스튜던트 t 시험으로 분석하였다.

운동 신경영양 인자의 웨스턴 블랏팅을 위해, ELISA에 대해서와 같이 제조된 CSF 또는 척수로부터의 단백질 샘플을 분자량 마커로 전기영동하고, 니트로셀룰로 스 막으로 수송하였다. 블랏을 5％ 당나귀 혈청을 함유하는 pH 7.4의 TBS 중에서 차단한 후, GDNF 및 BDNF 항체 (1:500; 밤새, 4℃)에서 우선 인큐베이션시키고, 이어서 HRP-연결된 당나귀 항-염소 IgG (GDNF에 대해) 및 항-래빗 IgG (BDNF에 대해) (1:2000; 잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch))에서 인큐베이션시켰다 (1시간, 실온). 모든 항체를 5％ 당나귀 혈청을 함유하는 TBS로 희석하였다. 블랏을 슈퍼시그날 케미루미네센트 서브스트레이트 (SuperSignal Chemiluminescent Substrate; 피어스 (Pierce))로 현상하고, 코닥-XAR 필름 (이스트만 코닥 (Eastman Kodak, Rochester, NY))에 노출시켰다. 이어서, 블랏을 스트립핑하고, β-액틴 항체 (1:500, 시그마) 및 HRP-연결된 당나귀 항-마우스 IgG (1:10000, 잭슨 이뮤노리서치)로 다시 블랏팅하였다. 면역반응 밴드를 바이오-라드 퀀티티 원 소프트웨어 (Bio-Rad Quantity One software; 바이오-라드 래보러토리즈 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA))로 분석하였다. 밴드 밀도 비 (GDNF 또는 BDNF: β 액틴)를 동물 당 계산하고, ELISA 실험의 경우에서와 같이 통계 분석을 위해 군의 평균을 유입하였다.

이식-후 22주에서 SOD1 G93A 래트의 척수에서 인간 NSC는 인간-특이적 HNu 항체로 면역염색함으로써 확인되었다. HNu (+) 세포가 전각 (A)에서 생존하였고, 그의 대다수에서 뉴런 계통 마커, 예컨대 미세소관-결합된 에피토프 TUJ-1로 염색된 것으로 나타났다. 인간 NSC는 그의 인간 핵 단백질 (HNu) 서명에 의해 확인되었고, 그의 표현형 운명은 HNu, 및 신경 전구체, 뉴런 및 신경교 세포에 대해 특이적인 에피토프에 대한 이중 면역세포화학으로 추적하였다. SOD1 G93A 래트의 실험 말기에서, 인간 NSC는 강력한 착상 및 우수한 장기간 생존을 나타내었다. 대부분의 HNu(+) 세포 (70.4 ± 6.4％)는 TUJ-1의 이들의 동시-국지화에 기초한 뉴런 계통으로 분화되었다. HNu(+) 세포의 대략 1/5 (19.2 ± 5.6％)이 네스틴으로 동시-국지화되었고, 매우 소수의 HNu(+) 세포 (1.3 ± 0.9％)가 GFAP에 대해 양성이었다.

숙주 회로에서 인간 NSC의 일체화 능력을 이식/숙주 세포에 대한 세포체 마커, 및 숙주 또는 이식 말단에 대해 선택적인 마커로 시험하였다. 이식 기원을 구성하기 위해 HNu로, 뉴런 분화를 구성하기 위해 TUJ-1로, 래트 및 마우스 에피토프를 인식하지만 인간 에피토프는 인식하지 못하는 전-시냅스 단백질 바순 (Bassoon) (BSN)에 대한 모노클로날 항체로 절편을 염색하였다. 실질 위치에서 다수의 HNu(+), TUJ-1(+) 세포는 래트 기원의 시냅스 부톤 (bouton)에 의해 접촉되는 것으로 밝혀졌다.

공초점 현미경에서, HNu (+) 핵 및 TUJ-1 (+) 세포질을 갖는 NSC-유래된 뉴런 세포는 래트 말단에 의해 접촉되었다. 역으로, TUJ-1 및 인간-특이적 시냅토피신으로 염색된 조직표본은 숙주 뉴런, 특히 크고 작은 운동 뉴런과 병치된 작은 부톤의 밀집된 말단 필드를 나타냈다. 숙주 운동 뉴런은 다수의 이식-유래된 부톤에 의해 접촉되었다. HNu 및 인간 NF-70에 대해 염색된 가로방향 섹션은 다수의 이식-유래된 축삭이 왼쪽에 이식편을 남겨두고, 전섬유단의 백질을 따라 우선적으로 진행하였음을 나타내었다. ChAT 면역반응성을 갖는 세포/과정은 전각에서 백질로부터의 회색질을 설명하는 데 이용되었다. 신경섬유 에피토프 NF70에 대한 인간-특 이적 항체로 표지된 다수의 축삭은 이식 부위와 관련하여 다수의 인간 NSC가 사출 뉴런으로 분화되고, 이들 축삭은 전각의 백질에 대해 선호도를 나타낸다는 것의 증거임을 발견하였다.

SOD1 G93A 래트의 요수로 이식된 NSC는 수명을 연장시키고, 운동 뉴런 사멸, 및 질환의 발병 및 진행을 지연시켰다. 생존-세포 (L) 및 사멸-세포 (대조군, C) 이식편을 갖는 경우에서의 임상 및 병리적 측정의 진행 분석은 도 9에 도시되어 있다. 생존 NSC가 이식된 동물은 카플란-마이어 및 종점 분석 둘 다에 의해 유의하게 증가된 수명을 나타내었다. 카플란-마이어 플랏 (도 9A)은 관찰의 진행을 통해 실험 및 대조 동물 간의 유의한 분리를 나타내었다 (P=0.0003). BBB 개방 필드의 시간 플랏 및 경사면 시험 스코어 (도 9B)는 사멸 NSC를 이식한 동물에 비해 생존 NSC를 이식한 동물에서 근육 약화가 유의하게 서서히 진행되는 것을 나타내었다.

Tg 래트의 요추 돌출부 (L3-S1)에서 운동 뉴런 생존에 대한 NSC의 효과를 생존 또는 사멸 NSC를 이식한 동물의 작은 군에서 조사하고, 생후 128일째에 안락사시켰다. 사멸 NSC를 이식한 동물의 평균 수명은 138일인 한편, 생존 NSC를 이식한 래트는 149일 동안 생존하였다. 따라서, 수명에서 유의한 11일의 차이가 실험 및 대조 래트 사이에서 발생하였다 (P=0.0005). 평균 시간-대-질환-발병은 사멸 세포를 이식한 동물에 대해서는 115일이었고, 생존 NSC를 이식한 동물에 대해서는 122일이었다. 유의한 7일의 차이가 두 군 사이의 시간-대-질환-발병에서 관찰되었다 (P=0.0001).

α-운동 뉴런의 입체형태학적으로 측정된 수는 생존 NSC를 이식한 동물의 경 우 6,418이고, 사멸 NSC를 이식한 래트의 경우 3,206이었으며, 즉 동일한 나이의 대조 동물과 비교하여 실험군의 요추 돌출부에 2배 많은 뉴런이 있었다. 생존 및 사멸 NSC 군 사이에 요추 돌출부에서 상이한 3,212개의 세포가 생후 128일된 대표 실험 및 대조 래트에서 관찰되었다 (P=0.01).

퇴행중인 운동 뉴런의 인간 NSC에 의해 수득된 신경보호의 잠재적 메커니즘에는 포유동물 운동 뉴런에서 전형적 영양 효과를 갖는 2개의 펩티드 [BDNF 및 GDNF]의 발현 및 방출이 포함된다 (문헌 [Henderson et al., 1994; Koliatsos et al., 1993]). 이식된 SOD1 G93A 래트의 척수에서 GDNF 및 BDNF의 발현 및 방출을 결정하였다. 척수 표본 및 CSF 샘플은 BDNF 및 GDNF에 대해 웨스턴 블랏팅 및 ELISA로 평가하였다. 생존 세포를 이식한 래트 (L1 및 L2) 및 사멸 세포를 이식한 동물 (C)의 실질 및 CSF에서의 GDNF 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. L1은 이식 부위 전체의 농도를 나타내는 한편, L2는 조직 중 위 또는 아래의 한 절편에서의 농도를 반영하였다. 군 사이의 변화는 유의하며, 이는 L1 또는 L2, 및 C 군 사이의 큰 차이에 의해 초래되었다.

실험군 (생존-세포, L) 및 대조군 (사멸-세포, C) 사이의 CSF 농도의 차이는 또한 t 시험에 의해 유의하였다. ELISA는 이식 부위에서 0.912 ± 0.050 pg/μg의 농도, 및 생존 NSC-이식된 동물의 척수에서 제거된 한 단편에서 0.819 ± 0.115 pg/μg의 농도를 나타내었다. 사멸 NSC를 이식한 동물에서, 이 농도는 이식편을 함유하는 척수 단편에서 0.368 ± 0.026 pg/μg이었다. CSF에서, GDNF 농도는 실험에서 0.027 ± 0.012 pg/μl였고, 0.006 ± 0.002 pg/μl였다. 이들 데이터는, 척수에서 GDNF의 발현 및 방출에 대해 3배수 증가, 및 생존 NSC를 갖는 동물의 CSF에서 GDNF 분비에 대해 5배수 증가를 증명하였다.

웨스턴 블랏팅은 또한 생존 NSC를 이식한 동물에서 높게 표준화된 GDNF 농도를 나타내었다. GDNF 웨스턴 블랏팅은 16 kDa 단백질을 검출함으로써 증가하는 ELISA 패턴을 확인시켰다. 웨스턴 블랏팅은 또한 생존-세포 이식편에서 0.860 ± 0.007, 및 사멸-세포 이식편에서 0.708 ± 0.052의 표준화된 GDNF 밀도를 나타내었다.

실험 래트 및 대조군의 실질 및 CSF에서의 BDNF의 ELISA 염색을 결정하였다. ELISA 분석은 이식 부위 (L1)에서 0.086 ± 0.014 pg/μg의 농도, 실험 동물의 이식으로부터 제거된 한 절편 (L2)에서 0.054 ± 0.009 pg/μg의 농도를 나타내었다. 대조군 래트에서, BDNF 농도는 이식-함유 절편에서 0.010 ± 0.003 pg/μg였다. 실험 및 대조 CSF 농도 간의 차이가 유의하다. CSF에서, BDNF 농도는 실험 동물에서 0.041 ± 0.013 pg/μl, 대조군에서 0.010 ± 0.008 pg/μl였다. 이러한 발견은 척수에서 BDNF 농도에 대해 8배수 증가, 및 실험 동물의 CSF에서 4배수 증가를 나타내었다. 이와 함께, ELISA 데이터는 생존 NSC를 이식한 동물, 특히 CSF에서의 BDNF와 비교하여, GDNF의 보다 널리 퍼진 분비를 시사하였다.

면역세포화학은 또한 대다수의 이식된 HNu(+) 세포가 GDNF를 발현하는 것을 나타내었다. 생 이식편을 갖는 동물에서 GDNF의 공급원은 이식된 세포 그 자체였다. HNu (적색) 및 GDNF (녹색)에 대해 이중 염색된 표본에서, 이식된 NSC의 세포질에서 충분한 GDNF 면역반응이 증명되었다. 생 이식편을 이식한 동물에서, 숙주 운동 뉴런에서 분비 소낭을 구성하는 구형 세포질 구조에서 강력한 GDNF 면역반응이 있었다.

GDNF로 염색된 숙주 운동 뉴런 및 인간 시냅토피신 (후자는 이식-유래된 말단을 표지화하기 위해)을 통한 공초점 현미경은 혈관 구조에서 GDNF의 국지화를 나타내었으나, 도시된 숙주 운동 뉴런의 표면에 위치하는 이식-유래된 말단에서는 나타나지 않았다. 인간 시냅토피신 항체로 염색된 절편 (숙주 운동 뉴런을 신경발달시키는 모든 이식 말단을 표지화하기 위해) 및 GDNF는 숙주 운동 뉴런과 접촉하는 부톤에서 2개의 단백질의 임의의 동시-국지화의 결여를 나타내었다.

생 이식편을 갖는 래트는 이식편에서 발생 경로의 합성, 및 중심관 내 및 주변에서 신경발달 구조를 나타내었다. 숙주 운동 뉴런과 접촉하는 양 말단에서의 GDNF 단백질의 부재와 대조적으로, 중심관을 신경분포시키는 대다수의 NSC-유래된 축삭 말단은 GDNF 면역반응으로 동시-국지화되었다. 인간 시냅토피신 및 GDNF의 널리 퍼진 동시-국지화는 중심관에서 상의 세포를 신경분포시키는 이식-유래된 말단에서 관찰되었다. 이러한 해부학상 패턴은 GDNF가 아마도 역수송을 통해 이식편을 신경분포시키는 숙주 운동 뉴런 말단에 의해 수용되고, 트랜스-시냅스 수송체를 통해 이들 뉴런에 전달하는 것이 아님을 나타낸다 (문헌 [Rind et al., 2005]).

SOD1 G93A 래트의 전각에서 진행중인 신경퇴행성 과정에 대한 이식된 NCS의 명백한 저항이 특히 호전되었다. 본원에 보고된 NSC의 생존 및 광범위한 분화는, SOD1 G93A를 하버링하는 운동 뉴런을 필요로 하는 염증/흥분독성 신호전달 (문헌 [Rothstein et al., 1992; Howland et al., 2002; Turner et al., 2005])이 세포 상에서 명백한 독성을 갖지 않는다는 것을 강력하게 나타내었다. 이 인자만이 퇴행중인 운동 뉴런 질환에서 운동 기능을 회복하기 위해 이식편을 사용하는 미래의 세포적 전략에 대한 낙관론을 일으켰다.

실시예 7. 인간 척수 신경 줄기/기원 세포의 이식에 의한 외상성 척수 손상의 치료, 척수공동증의 치료.

증대된 인간 척수 줄기 세포를 면역억제된, 성체 암컷 스프라그-돌리 또는 면역결핍된 흉선샘이 제거된 털이 없는 래트에게 주사하였다. C _4-5 타박상 병변이 이식 1개월 전에 두 군 모두에서 생겼다. 이식 수용체 (n=24)가 이식-후 60 내지 150일 생존하였다. 인간-유래된 NSC는 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포로 이루어진 큰 세포 군체를 형성하였다. 이 이식편들은 일정하고 완전하게 각각의 병변을 채웠다. 미성숙으로 보이는, NeuN+/인간 핵+ 뉴런은 종종 공여 세포군의 50％를 구성하였다. 이들 뉴런은 이식 부위로부터 2 cm 이상의 거리에서 회색질 및 백질 둘 다를 통해 인간 신경섬유+ 프로세스를 보냈다. 강력한 인간-특이적 시냅토피신 면역반응이 숙주 및 이식 뉴런 둘 다의 인접부에서 인식되었고, 외관상 반응하지 않는, GFAP+ 세포를 공여체 뉴런과 병치하였다. 또한, 이러한 이식편들은 숙주 공급원으로부터 일어나는 것으로 보이는 TH+ 및 5HT+ 섬유의 성장을 지지하였다. 따라서, NSC의 이러한 라인은 척수내 회색질 회복에 선호되는 1차 태아 CNS-유사 성질을 가지는 것으로 보인다.

본원에 기재된 현재의 바람직한 실시양태에 대한 다양한 변화 및 변형이 당 업자에게 명백할 것으로 이해되어야만 한다. 그러한 변화 및 변형은 본 발명의 방법의 취지 및 범위에 벗어나지 않으며, 그의 의도된 이점을 감소하지 않으면서 이루어질 수 있다. 따라서, 그러한 변화 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 한다.

Claims

a) 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하는 단계;

b) 상기 신경 줄기 세포를 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시키는 단계;

c) 상기 증대된 집단을 농축시키는 단계; 및

d) 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입시키는 단계

를 포함하며, 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는, 경련, 경직 또는 근육 과활성 증상의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 증상이 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 졸중, 다발성 경화증, 뇌성마비, 간질, 헌팅톤(Huntington)병, 근위축성 측삭 경화증, 만성 허혈, 유전적인 증상, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포를 중추 신경계, 말초 신경계, 골수, 말초 혈관, 제대혈 및 하나 이상의 배(胚)로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 단리하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 포유동물이 발달중인 포유동물인 방법.
제4항에 있이서, 상기 발달중인 포유동물의 재태 기간이 약 6.5 내지 약 20 주인 방법.
제4항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포를 인간 태아 척수로부터 단리하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 혈청의 부재하에 신경 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 성장 인자가 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단이 생체내에서 1,000개 이상의 GABA-제조 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단이 생체내에서 1,000개 이상의 글리신-제조 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 증대된 집단의 40％ 이상이 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단의 도입이 수용자 척수의 다수개의 영역으로 치료 유효량의 적어도 일부분을 주사하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 증대된 집단의 30％ 이상이 시험관내에서 뉴런으로 분화할 수 있는 것인 방법.
포유동물로부터 단리하여 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시킨 신경 줄기 세포이며, 상기 줄기 세포를 포함하는 증대된 집단을 농축하고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입하고, 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인, 경련, 경직 또는 근육 과활성 증상을 치료할 수 있는 신경 줄기 세포.
a) 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하는 단계;

b) 시험관내에서 상기 신경 줄기 세포를 증대된 집단으로 증대시키는 단계;

c) 상기 증대된 집단을 농축시키는 단계; 및

d) 치료 유효량의 상기 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입시키는 단계

를 포함하며, 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인, 만성 통증의 치료 방법.
제16항에 있어서, 상기 만성 통증이 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 졸중, 다발성 경화증, 뇌성마비, 간질, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 만성 허혈, 유전적인 증상, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포를 중추 신경계, 말초 신경계, 골수, 말초 혈관, 제대혈, 하나 이상의 배, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 단리하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 포유동물이 발달중인 포유동물인 방법.
제19항에 있어서, 상기 발달중인 포유동물의 재태 기간이 약 6.5 내지 약 20 주인 방법.
제19항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포를 인간 태아 척수로부터 단리하는 방 법.
제16항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 혈청의 부재하에 신경 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 성장 인자가 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제16항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단이 1,000개 이상의 GABA-제조 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제16항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단이 1,000개 이상의 글리신-제조 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 증대된 집단의 40％ 이상이 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제16항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단의 도입이 수용자 척수의 다수개의 영역으로 치료 유효량의 적어도 일부분을 주사하는 것을 포함하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 영역이 배각을 포함하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 영역이 수막강내 공간을 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 증대된 집단의 30％ 이상이 시험관내에서 뉴런으로 분화할 수 있는 것인 방법.
포유동물로부터 단리하여 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시킨 신경 줄기 세포이며, 상기 줄기 세포를 포함하는 증대된 집단을 농축하고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입하고, 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인, 만성 통증을 치료할 수 있는 신경 줄기 세포.
a) 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하는 단계;

b) 시험관내에서 상기 신경 줄기 세포를 증대된 집단으로 증대시키는 단계;

c) 상기 증대된 집단을 농축시키는 단계; 및

d) 치료 유효량의 상기 증대된 집단의 하나 이상의 신경 줄기 세포를 수용자 척수의 영역에 도입시키는 단계

를 포함하며, 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인, 운동 뉴런 퇴화의 치료 방법.
제33항에 있어서, 상기 운동 뉴런 퇴화가 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 졸중, 다발성 경화증, 뇌성마비, 간질, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 만성 허혈, 유전적인 증상, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포를 중추 신경계, 말초 신경계, 골수, 말초 혈관, 제대혈 및 하나 이상의 배로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 단리하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 포유동물이 발달중인 포유동물인 방법.
제36항에 있어서, 상기 발달중인 포유동물의 재태 기간이 약 6.5 내지 약 20 주인 방법.
제36항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포를 인간 태아 척수로부터 단리하는 방법.
제33항에 있어서, 하나 이상의 뉴런 서브타입이 풍부한 영역으로부터 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함하고, 상기 뉴런 서브타입이 운동 결핍의 경감에 효과적인 성장 인자를 생성하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 증대된 집단이 치료 유효량의 하나 이상의 성장 인자를 분비하기에 충분한 양으로, 뉴런으로 분화할 수 있는 신경 줄기 세포를 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 운동 뉴런이 풍부한 영역으로부터 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 혈청의 부재하에 신경 줄기 세포를 증대시키는 것을 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
제43항에 있어서, 상기 성장 인자가 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제33항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단이 1,000개 이상의 GABA-제조 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제33항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단이 1,000개 이상의 글리신-제조 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제33항에 있어서, 상기 증대된 집단의 40％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제33항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단의 도입이 수용자 척수의 다수개의 영역으로 치료 유효량의 적어도 일부분을 주사하는 것을 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 증대된 집단의 30％ 이상이 시험관내에서 뉴런으로 분화할 수 있는 것인 방법.
포유동물로부터 단리하여 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시킨 신경 줄기 세포이며, 상기 줄기 세포를 포함하는 증대된 집단을 농축하고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 하나 이상의 영역에 도입하고, 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인, 운동 뉴런 퇴화를 치료할 수 있는 신경 줄기 세포.
a) 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하는 단계;

b) 시험관내에서 상기 신경 줄기 세포를 증대된 집단으로 증대시키는 단계;

c) 상기 증대된 집단을 농축시키는 단계; 및

d) 치료 유효량의 상기 증대된 집단을 수용자 척수의 누공(syrinx)에 도입시키는 단계

를 포함하며, 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수의 누공에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인, 척수공동증의 치료 방법.
제51항에 있어서, 상기 척수공동증이 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 외상성 뇌 손상, 졸중, 다발성 경화증, 뇌성마비, 간질, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 만성 허혈, 유전적인 증상, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래되는 것인 방법.
제51항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포를 중추 신경계, 말초 신경계, 골수, 말초 혈관, 제대혈 및 하나 이상의 배로 이루어진 군으로부터 선택된 공급원으로부터 단리하는 방법.
제53항에 있어서, 상기 포유동물이 발달중인 포유동물인 방법.
제54항에 있어서, 상기 발달중인 포유동물의 재태 기간이 약 6.5 내지 약 20 주인 방법.
제54항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포를 인간 태아 척수로부터 단리하는 방법.
제51항에 있어서, 하나 이상의 뉴런 서브타입이 풍부한 영역으로부터 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함하고, 상기 뉴런 서브타입이 척수공동증의 경감에 효과적인 성장 인자를 생성하는 방법.
제51항에 있어서, 운동 뉴런이 풍부한 영역으로부터 신경 줄기 세포를 단리하는 것을 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 혈청의 부재하에 신경 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
제60항에 있어서, 상기 성장 인자가 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제51항에 있어서, 상기 증대된 집단이 치료 유효량의 하나 이상의 성장 인자를 분비하기에 충분한 양으로, 뉴런으로 분화할 수 있는 신경 줄기 세포를 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단이 1,000개 이상의 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제51항에 있어서, 상기 증대된 집단의 40％ 이상이 척수에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제51항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단의 도입이 수용자 척수의 다수개의 영역으로 치료 유효량의 적어도 일부분을 주사하는 것을 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 상기 증대된 집단의 30％ 이상이 시험관내에서 뉴런으로 분화할 수 있는 것인 방법.
제51항에 있어서, 상기 증대된 집단의 신경 줄기 세포 100,000개 이상을 수 용자 척수의 누공으로 도입하는 방법.
포유동물로부터 단리하여 시험관내에서 증대된 집단으로 증대시킨 신경 줄기 세포이며, 상기 줄기 세포를 포함하는 증대된 집단을 농축하고, 치료 유효량의 증대된 집단을 수용자 척수의 누공에 도입하고, 상기 증대된 집단의 20％ 이상이 수용자 척수의 누공에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인, 척수공동증을 치료할 수 있는 신경 줄기 세포.
중추 신경계 조직으로부터 신경 줄기 세포를 해리하는 단계;

적어도 약 10 ㎍/mL의 폴리-D-리신 및 약 1 mg/ml의 피브로넥틴을 포함하는 하나 이상의 세포외 단백질을 배양 용기에 제공하는 단계;

혈청의 부재하에 상기 배양 용기에서 해리된 신경 줄기 세포를 배양하는 단계;

상기 배양 용기에 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 첨가하는 단계; 및

전면생장되기 전에 상기 배양된 세포를 계대배양하는 단계

를 포함하며, 각각의 신경 줄기 세포의 증대가 분화없이 30 배 세포-배가를 넘는 것인, 시험관내에서 하나 이상의 신경 줄기 세포를 신경 줄기 세포의 증대된 집단으로 증대시키는 방법.
제69항에 있어서, 상기 증대된 신경 줄기 세포가 뉴런으로 분화할 수 있는 것인 방법.
제69항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포의 증대가 배양 배지에 가용성 인자로서 피브로넥틴을 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제69항에 있어서, 세포의 해리 및 세포의 계대배양이 효소성 해리를 포함하는 것인 방법.
제72항에 있어서, 상기 효소성 해리가 세포를 트립신으로 처리하는 것을 포함하는 방법.
제69항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단을 신경퇴행성 증상의 치료를 위해 수용자 신경계의 하나 이상의 영역에 도입시키는 방법.