WO2017135753A1 - 혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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svz
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neural stem
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배재성
진희경
박민희
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경북대학교 산학협력단
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Definitions

  • composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising stem cells overexpressing vascular endothelial growth factor as an active ingredient
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising stem cells overexpressing vascular endothelial growth factor as an active ingredient.
  • NDDs neurodegenerative diseases
  • AD Alzheimer's disease
  • Parkinson's disease Parkinson's disease
  • PD Parkinson's disease
  • the relationship between brain aging and neurodegenerative diseases is not yet fully understood. However, there are many common characteristics between the two processes, such as brain cell death and decreased brain capacity.
  • Nemanpick disease is a rare autosomal recessive hereditary disease with various clinical symptoms due to the accumulation of sphingolipids and cholesterol in various organs due to metabolic disorders of sphingol ipid.
  • the subtypes of A, B, C, and D are classified according to the causal gene and clinical manifestations, and it is known that A and B types are caused by deficiency of sphingomyel inase. It has been shown to occur due to the impaired transport of cholesterol.
  • Type C with clinically diverse subacute chronic course It is reported that the prevalence is about 0.6 to 0.8 per 100,000 people, and C1 type due to mutation of PC1 gene accounts for about 95% of the total.
  • Type C Nimanpick disease cholesterol is characteristically accumulated in the visceral organs and nervous system. Symptoms of accumulated organs are expressed, and fatality is mainly determined by the progression of central nervous system deposition. Recent studies have shown that sphingosine is the major deposition material for type C nymanpick disease.
  • Type C Neimanpick disease can be clinically diverse, and its incidence has been reported from newborns to 70s. The disease duration ranges from a few days to 60 years. Hepatomegaly, gait disorders, eye movement disorders, and cognitive impairments are relatively characteristic.In the central nervous system, selective invasion of the cerebellum and brainstem causes dysmyel inat ion and cerebellar perkinase cell (Purkinje).
  • VEGF vascular endothel ial growth factor
  • PKC vascular endothel ial growth factor
  • VEGF receptors are found in various cancer tissues, and the effect of VEGF on cell division has been reported in cancer cells. Recently, the correlation between VEGF and neurodegenerative diseases has been increasing.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, including stem cells overexpressing Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) as an active ingredient.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • Another object of the present invention is to provide a use of stem cells overexpressed vascular endothelial growth factor (VEGF) for the preparation of a preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating neurodegenerative diseases, characterized in that the vascular endothelial growth factor (VEGF) overexpressed stem cells are administered to the subventricular zone (SVZ) of an individual in need thereof. It is.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, including stem cells overexpressing Vascular endothelial growth factor (VEGF) as an active ingredient.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • the present invention provides a use of stem cells overexpressed vascular endothelial growth factor (VEGF) for the preparation of a preventive or therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides a neurodegenerative disease characterized by administering stem cells overexpressing vascular endothelial growth factor (VEGF) to the subventricular zone (SVZ) of an individual in need thereof. Provide methods of prevention or treatment.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, which comprises as an active ingredient a pleasant cell in which Vascular endothelial growth factor (VEGF) is overexpressed.
  • vascular endothel ial growth factor VEGF
  • VEGF vascular endothel ial growth factor
  • vascular endothelial growth factor GenBank. ID: Li_001025366.2
  • the vascular endothelial growth factor (VEGF) includes a protein having an amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence and a functional equivalent of the protein.
  • stem cell as used herein is capable of differentiating into various body tissues. As undifferentiated cells having the ability, they can be classified into tot ipotent stem cel l, pluripotent stem cel l, and mult ipotent stem cel l. Stem cells may be adult stem cells, embryonic stem cells, medial stem cells, tumor stem cells or induced pluripotent stem cells, depending on the origin or type of the stem cells.
  • Neural stem cells are capable of self-reproduction (sel f-renewal) and are capable of differentiating into nervous system cells. Follicles are cells that can differentiate into neurons, astrocytes, and ol igodendrocytes.
  • MSO meenchymal stem cell
  • MSO refers to a variety of mesodermal cells including bone, cartilage, fat, muscle cells, or Multipotent stem cells with the ability to differentiate into ectoderm cells such as neurons
  • the mesenchymal stem cells are preferably selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, chorion, decidual membrane, and placenta. Can be derived from.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from humans, fetuses, or mammals except humans. More preferably, the non-human fluid may be a dog, a cat, a monkey, a cow, a sheep, a pig, a horse, a rat, a mouse, or a guinea pig, and the like, and the origin thereof is not limited.
  • the active ingredient is a concept including a stem cell culture solution containing the stem cells, a concentrate of an additive culture, and the like.
  • Stem cells overexpressing Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) of the present invention may be due to a recombinant vector comprising a gene encoding a vascular endothelial growth factor. Since the recombinant vector should be able to overexpress the VEGF gene in the stem cells, the recombinant vector is preferably in the form of a recombinant expression vector.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • the recombinant expression vector is a commercially available basic vector (ie, a backbone vector) that contains regulatory sequences (e.g., promoters, secretion sequences, enhancers, upstream activation sequences, Transcription terminators).
  • the recombinant expression vector may include a selection marker, and the selection marker may include an antibiotic resistance gene such as a kanamycin resistance gene or a neomycin resistance gene, and a fluorescent protein such as a green fluorescent protein or a red fluorescent protein. It doesn't work.
  • the transformation can be carried out according to known methods, for example, calcium phosphate transfect ion, electrophoresi s, transduct ion, DEAE-dextran mediated transformation (DEAE- dextran mediated transfect ion), microinject ion, cat ini c 'l ipid-transfect ion, bal l ist ic introduct ion It is not limited to this.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases of the present invention is It is characterized in that the injection directly into the subventricular zone (SVZ) of the subject. In the early stages of development, neural tubes are made, and the cavity of the neural tube forms the ventricle.
  • SVZ subventricular zone
  • the cell layer closest to the ventricles is called the ventricular zone, and an additional proliferative cell layer is formed over the ventricular zone through the neurogenesis process, called the subventricular zone.
  • Progenitor cells present in the ventricular and subventricular zones have the characteristics of neural stem cells, and through complex control methods, neurons, astrocytes, and oligodendons that make up the central nervous system Differentiation into cells (ol igodendrocytes) [Dehay and Kennedy, Nat Rev Neurosc i 8: 438-450, 2007; Molyneaux et al.
  • the neural stem cells in the SVZ region of the Neimanpick disease mouse are compared with normal mice, and the expression of VEGF is significantly decreased.
  • These neural stem cells showed an abnormal pattern of migration to thalamus rather than the normal migration pathway described above.
  • inflammatory reactions were increased in thalamus and cortex of Neiman's disease mice, and cholesterol and sphingolipids accumulated in the brain, resulting in a loss of sensory and motor function in animals.
  • the present inventors directly administered neural stem cells overexpressing VEGF in the SVZ region of Neimanpick disease mice, reduced abnormal migration of neuronal cells and suppressed inflammatory reactions in thalamus and cortex.
  • the effect was to recover and improve survival.
  • the present inventors tried to administer not only neural stem cells overexpressing VEGF but also vectors capable of overexpressing normal neural stem cells or VEGF in the SVZ region of Neimanpick disease mice. In other words, improving the damaged SVZ environment was not possible with either normal neuronal stem cells or VEGF alone, and it was confirmed that the effect is only exerted when VEGF is administered in the form of overexpressed neuronal cell.
  • the "damaged SVZ environment” means that the VEGF expression of the neural stem cells present in the SVZ is reduced, indicating abnormal movement to the thal amus, and "improvement” means by administering the neural stem cells overexpressing the VEGF to the SVZ. Inhibit abnormal movement of neuron cells and restore normal brain function.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may exhibit the effect of preventing or treating not only Nimanpick disease, but also degenerative planetary diseases caused by brain accumulation of reduced cholesterol or sphingolipids of neural stem cells in the SVZ environment.
  • the neurodegenerative diseases include Niemannpick disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, schizophrenia (schi zophreni a), Gaucher's disease, Fabry's disease, Tay-Sax (Tay-) Sachs disease, Sandhof f disease and cerebellar ataxia can be any one or more selected from the group consisting of.
  • Preferably may be Nimanpick disease or cerebellar ataxia, Most preferably, it may be Nimanpick disease, but is not limited thereto.
  • the Niemann-Pick disease is a disease in which lipids accumulate in reticuloendothelial cells and corresponds to genetic diseases.
  • Neiman pick disease of the present invention is not limited to the type, for example, it may be a type A, B type, C type, D type, E type or F type Nimanpick disease.
  • the Neimanpick disease of the present invention may be a Type C Neimanpick disease.
  • Type C Niemann Pick's disease is euki one of various neurological disorders, such as protein, carbohydrate, and, with accumulation of the seuping lipid and cholesterol in the cells because of metabolic disorders of lipid main organic material forming a biological memory - mental retardation is a genetic disease to be.
  • cerebellar neurons are damaged and their number decreases and the inflammatory response is increased.
  • the cerebellar ataxia refers to a neurological disease in which movement due to a cerebellar dysfunction and a symptom of coordination between movements does not occur, and is caused by various medical, neurological diseases, or genetic predispositions. Includes all cerebellar ataxia.
  • Alzheimer's, Parkinson's, Lou Gehrig's and Schizophrenia are reported to have reduced numbers and proliferation of neural stem cells present in the SVZ environment, as with Neiman's disease (Nat Rev Neurosci. 2007 Sep; 8 (9): 712- 23. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2017 Jan; 174 (1): 93-112).
  • the administration of neural stem cells overexpressing VEGF in the SVZ region resulted in an increase in the survival rate of neural stem cells in the SVZ environment and a decrease in the inflammatory response of the brain.
  • Gaucher disease, Fabry disease, Tay-Sachs disease and Sandhof f disease are caused by lipid accumulation in the brain, such as the Neimanpick, due to impaired lipid metabolism.
  • lipid accumulation in the brain such as the Neimanpick
  • FEBS Lett. 2010 May 3; 584 ( 9): 1748-59. when VEGF overexpressed neuroencapsulation cells in the SVZ region resulted in decreased brain accumulation of cholesterol and sphingolipids, using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Neurodegenerative diseases can be prevented or treated.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the composition are conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbet, manny, starch, acacia rubber, phosphate, alginate, gelatin, silicic acid Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, stearic acid magnesium and mineral oils. It is not limited to this.
  • the pharmaceutical composition may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, in addition to the above components.
  • the composition of the present invention can be used in the form of a general pharmaceutical formulation.
  • Parenteral preparations can be prepared in the form of sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions or lyophilized preparations, oral administration in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups or wafers. It can be prepared in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms.
  • the therapeutic composition of the present invention can be administered with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a binder for example, in the case of oral administration, a binder, a suspending agent, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a pigment, or a flavor may be used.
  • a buffer, a preservative, a painless agent, Solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc. may be used in combination.
  • bases, excipients, lubricants, preservatives, and the like may be used.
  • Administration in a suitable manner may include administration via a general route of introducing the desired substance to the patient.
  • the administration method includes intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration, and rectal administration, but is not limited thereto. Is administered directly to the subventricular zone.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • Preferred modes of administration and preparations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular or injectable.
  • Injectables include aqueous solvents such as physiological saline or ring gels, non-aqueous solvents such as vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g.
  • oleic acid, etc. oleic acid, etc.
  • alcohols e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol or glycerin
  • a stabilizer e.g, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium pyrosulfite, BHA, tocope, EDTA, etc.
  • emulsifier e.g, buffer for pH control, microbial development Preservatives to prevent (eg, phenyl mercury nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.) may be included.
  • the method for treating or preventing degenerative neurological diseases using the composition of the present invention includes administering a therapeutically effective amount of the therapeutic composition of the present invention.
  • the pharmaceutically effective amount is well suited to the medical field such as the type of disease, the age of the patient, weight, health, sex, sensitivity to the patient's drug, route of administration, method of administration, frequency of administration, duration of treatment, combination or drug It can be easily determined by those skilled in the art according to known factors.
  • the present invention can also provide a food composition comprising stem cells overexpressed Vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • the food composition may be a health functional food.
  • 'Health functional food' refers to foods that have bioregulatory functions such as prevention and improvement of disease, biological defense, immunity, recovery from illness, and inhibition of aging, and should be harmless to the human body when taken in the long term.
  • the active ingredient of the present invention may be added to a health functional food for the purpose of preventing or improving degenerative neurological diseases.
  • the stem cells overexpressing Vascular endothel ial growth factor (VEGF) of the present invention as a food additive
  • the stem cells overexpressing the Vascular endothel ial growth factor (VEGF) May be added as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the combined amount of active ingredient can be suitably determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the active ingredient of the present invention in the production of food or beverage is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less based on the raw material.
  • the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • the kind of food examples include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, other noodles, 3 ⁇ 4, dairy products including ice cream, various soups, drinks, tea, Drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, and the like, all include health foods in the usual sense.
  • the health beverage composition of the present invention may include various flavors or natural carbohydrates and the like as an additional component, as in a general beverage.
  • the natural carbohydrates described above may be used such as monosaccharides such as glucose and fructose, maltose and disaccharides such as sucrose, and natural sweeteners such as dextrin and cyclodextrin, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 10 g, preferably about 0.01 to 0.1 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, And carbonating agents used in the carbonated beverage.
  • the composition of the present invention may include a pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks and vegetable drinks. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical but is usually chosen in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the 'treatment' of the present invention is associated with degenerative neurodegenerative or degenerative neurological disease
  • Ameliorating the symptoms of a disease is referred to generically, which may include treating, substantially preventing, or ameliorating the condition, as long as it results from a disease associated with degenerative planetary disease or neurodegenerative disease. It includes but is not limited to alleviating, healing or preventing branch symptoms or most symptoms.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating degenerative neurological disease of stem cells overexpressing Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • the present invention provides a use of a fungal cell overexpressed vascular endothelial growth factor (VEGF) for the preparation of a preventive or therapeutic agent for degenerative neurological diseases administered to the subventricular zone (SVZ).
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • the present invention provides a method for preventing or treating degenerative neurological disease, characterized in that the vascular endothelial growth factor (VEGF) is administered to the subventricular zone (SVZ) of an individual in need thereof. to provide.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SVZ subventricular zone
  • the 'effective amount' of the present invention inhibits abnormal migration of neural stem cells to thalamus, inhibits the accumulation of cholesterol in the cerebral cortex, sphingolipids, or alleviates the inflammatory response in thalamus and cortex.
  • the term 'individual' may be an animal including an animal, preferably a mammal, especially a human, and includes cells, tissues, It may be an institution. The subject is a patient in need of the effect
  • the degenerative neurological disease is as described above.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • 2A is an experimental design diagram for confirming migration of SVZ nerve stem cells by injecting MPI0, a neuronal stem cell-labeled fluorescent substance, into SVZ of normal and NP-C mice.
  • FIG. 3A shows NGAP / CD133 split-cre injected into SVZ of NPC ′′ ′′ 1 or VEGF ′′ ′′ 1 mice to induce damage of neural stem cells in the SVZ environment. This is an experimental design to determine how damage to SVZ affects the entire brain by reducing expression.
  • FIG. 3E shows NPC "" 1 or GFAP / CD133 split-cre injected into SVZ for 4 weeks
  • FIG. 3F shows NPC m injected with GFAP / CD133 split-cre in SVZ for 4 weeks.
  • VEGF “" 1 is an expression of inflammation of thalamus and cortex in mice (GFAP: astrocyte,
  • Figure 3g shows the NPC "" 'or 4 weeks injected with GFAP / CD133 split-cre in SVZ.
  • 4A and 4B show NPC "" 'or 4 weeks of GFAP / CD133 split-cre injection into SVZ;
  • FIG. 5A shows an experiment for injecting normal neural stem cells (WT NSCs), neural stem cells (VEGFtg NSCs) overexpressing VEGF, and a vector (VEGF OX vector) overexpressing VEGF to improve the damaged SVZ environment of NP-C mice. This is about design.
  • 5C and 5D show the inflammatory response of SVZ, Thalamus, and Cortex after injecting a total of four weeks into normal neuroencapsulation cells, neuroblastoma cells overexpressing VEGF, and vector overexpressing VEGF in SVZ of NP-C mice.
  • GFAP astrocyte
  • Iba-1 microglia
  • n 6 per group. ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001. Data is expressed as mean s.e.m.
  • NPC mutant mice lacking the Balb / C and NPC1 genes was that the grid is maintained through the genotyping by PCR, NPC fl / fl, VEGF fim mice were maintained through gakgakwa system through cross-breeding. Mice were placed in experimental groups using the Block randomization method. To eliminate prejudice, it was not involved in data collection and data analysis. All mouse experiments were approved through the yungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
  • Direct cerebellar infusion of the VEGF microsphere was implanted into the cerebellum using glass capillaries (1.2 mm x 0.6 mm).
  • the scan coordinates were 5.52 mm in front of bregma and an injection depth of 2.50 mm 3.
  • the infusion rate was 3 mg implanted at a flow rate of 0.15 ⁇ / mn.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • R & D System Catalog No. 293-VE-010
  • PLGA Po 1 y (1 ac ti c-co) containing the human recombinant vascular endothelial growth factor (VEGF) using water-in-oil-in-water emulsi f icat ion method -g 1 yco 1 ic acid
  • VEGF-A vascular endothelial growth factor -A
  • PLGA microspheres lactic acid and glycolic acid of PGLA 1: 1 ratio, molecular weight of 40,000 to 75,000.
  • the brain tissue of the mouse was cut to a thickness of 50 ⁇ m using vibratome, and then anti-VEGF (rabbit, 1: 500, abeam), anti-S0X (mouse, 1: 100, R & D), anti-GFAP (rabbit, 1 : 500, DAK0), anti-Iba-1 (rabbit, 1: 500, DAK0) and anti-Calbindin (rabbit, 1: 100, milipore) were incubated together.
  • anti-VEGF rabbit, 1: 500, abeam
  • anti-S0X mimouse, 1: 100, R & D
  • anti-GFAP rabbit, 1 : 500, DAK0
  • anti-Iba-1 rabbit, 1: 500, DAK0
  • anti-Calbindin rabbit, 1: 100, milipore
  • the site of SVZ, thalamus, cortex, cerebellum Analysis was performed using a laser scanning confocal microscope equipped with Fluoview SV1000 imaging software (Olympus FV1000, Japan) or an Olympus BX51 microscope. Metamorph software (Molecular Devices) was used to quantify the percentage of area of stained area to area of total tissue. The number of cells in the stained region was quantified by Vi siomorph software (Vi sioMorph) using stereology.
  • NPZ-C mouse neural stem cells In order to confirm abnormal migration of NPZ-C mouse neural stem cells into Thalamus in which SVZ-injured mice or SVZ were injected with neural stem cells overexpressing VEGF, SVZ and Thalamus sites were extracted from the mouse brain. Each tissue was extracted from i-ce-cold Hibernate A / B27 / Glutamax medium (HABG) (Invi trogen), soaked in papain (Worthington) solution and reacted for 30 minutes at 37 ° C to decompose the tissue.
  • HABG Hibernate A / B27 / Glutamax medium
  • the decomposition tissue Opt i prep (Sigma) densi ty gradient solution and centrifuged glutamax (0.5 mM) ', and then separating the layer containing the neural stem cells gentamycin (10 ug / ml, Invi trogen) using , Neurobasal A (Invitrogen) / B27 medium containing mouse f ibroblast growth factor 2 (mFGF2, 5 ng / ml, Invi trogen) and mouse platelet-der ived growth factor-bb (mPDGFbb, 5 ng / ml, Invi trogen) Incubated for 1 week.
  • mFGF2 mouse f ibroblast growth factor 2
  • mPDGFbb mouse platelet-der ived growth factor-bb
  • the cultured neural stem cells grew into spherical Neurospheres, and after one week, the cells were collected and digested, and then cultured in 24 wel l plates with 1x104 cells. Neurospheres generated after incubation for one week were counted under a microscope, and the neurosphere minimum cutoff size was limited to 50 ⁇ m. Cultivation of neural stem cells for normal and VEGF overexpression of neural stem cells in the SVZ of NP-C mice was inoculated into single cells by culturing Neurosphere and injecting cells with Tr iple select (Gibco) solution. .
  • Cerebral and cerebellum of each mouse were harvested containing 50 mM HEPES (Invitrogen), 150 mM sodium chloride solution (NaCl) (Sigma), 0.2% Igepal CA-630 (Sigma) and protease inhibi tor (Mi l ipore).
  • the homogeneous complete layer was added and homogenized using a homogenizer and centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. After 10 minutes, additional centrifugation was performed for 30 minutes at 13,000 rpm.
  • the brains of each mouse were extracted and a homogenized solution containing 50 mM phosphate buf fer, 500 mM sodium chloride solution (NaCl), 25 mM cholic acid and 0.5% Tr iron X-100 was added and a homogenizer was used. Homogenized and centrifuged for 10 minutes at 13,000 rpm. After 10 minutes, only the organic soluble layer was separated and cholester levels were measured using Amplex Red Cholesterol Assay Kit (Molecular Probes).
  • Hot-plate tests and tail-response tests were performed to determine the sensory capacity of SVZ-damaged mice or NP-C mice infused with SVZ overexpressing VEGF.
  • the hot-plate test keeps the heat ing apparatus (Pan lab / Harvard Apparatus, Spain) at 50 ° C, placing each mouse at the end of the heated surface, the primary nocicept ion or jump or foot lick. The time until was measured. The cutoff time was 60 seconds. Between measurements, the heated surface was wiped with detergent and ethanol and the silver was kept at 50 ° C.
  • the tail-response test measures the time it takes for the tail to react after wrapping the mouse with a blackout cloth, placing the tail on a heated instrument surface (Panlab / Harvard Apparatus, Spain).
  • Open field, rota-rod, and beam tests were performed to determine whether the SVZ-damaged mice or NP-C mice injected with neuronal stem cells overexpressing VEGF in SVZ improved their motor performance.
  • Mice receiving VEGF microspheres directly into the cerebellum were subjected to a Rota-rod test.
  • the Open f ield test placed the mouse in a rectangular box for 10 minutes to measure overall activity and time spent wandering the walls and the rim.
  • the Rota-rod test (Ugo Basile, Comer io, VA, Italy) consists of a machine equipped with a properly sized rod 3 cm in diameter to provide a grip. Exercise measures endurance time in seconds The average value was recorded. Each Rota-rod exercise test did not exceed 5 minutes per session.
  • the beam test measured the time taken to move to the end after the mouse was placed at the start of a 6mm or 12 ⁇ wide bar.
  • SVZ was isolated from mouse and neural stem cells. Expression of VEGF in isolated neural stem cells was measured using real-time quantitative PCR. Total RNA was extracted from neurons using the RNeasy Plus mini kit (Qi agen, Korea, Ltd) and cDNA was synthesized from 5 // g total RNA using a kit from Clontech (Mountain View, CA). In addition, using a Corbett research RG-6000 real-time PCR instrument, 95 ° C, 10 minutes; 95 ° C., 10 seconds; 58 ° C., 15 seconds; Real-time quantitative PCR was carried out by repeating 40 cycles at 72 ° C., 20 seconds;
  • Neural stem cells in the normal SVZ environment can migrate to the Ol factory bulb (OB) via the Rostral migratory stream (RMS), and VEGF expressed in neuronal cells is known to be involved in this migration (Neuron. 70, 687). -702, 2011; J Neurosci. 29, 8704-8714, 2009; J Neurosci Res. 88, 248-257, 2010).
  • OB Ol factory bulb
  • RMS Rostral migratory stream
  • MPI0 a neural stem cell-labeled fluorescent substance
  • Damage to the SVZ tube can cause inflammation of the brain's lower body and cholesterol. Effect on Lipid Accumulation
  • cannula was attached to SVZ of 4 weeks old NPC ii and VEGF fl / fl mice.
  • GFAP / CD133 split-cre was injected into SVZ for a total of four weeks each day as in FIG. 3A. That is, (i) GFAP / CD133 split-cre was injected into SVZ of NPC fl / n mice to prevent NPC1 from being expressed in neural stem cells present in SVZ, or (ii) GFAP in SVZ of VEGF n / fl mice.
  • Neural stem cells with reduced NPC or VEGF expression due to this SVZ problem showed abnormal migration to Thalamus (FIGS. 3D and 3E, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001, n-6 per group).
  • NPC ⁇ migration of neural stem cells with reduced VEGF expression to Thalamus increased inflammatory reaction of Thalamus and cortex (FIG. 3E), which also increased lipid accumulation, cholesterol, a major etiological pattern in NP-C mice.
  • impairment of the SVZ environment results in decreased survival rate of neural stem cells in the SVZ environment and abnormal migration of thalassocytes with reduced NPC or VEGF expression to thalamus, thereby increasing the inflammatory response of Thalamus.
  • cortex inflammation, cholesterol and lipid accumulation were induced. Thus, this shows that damage to the SVZ environment can affect the entire brain.
  • VEGF n received four weeks of GFAP / CD133 split-cre infusion to SVZ to determine whether inflammatory response and cholesterol and lipid accumulation throughout the brain due to SVZ environmental damage affect sensory and motor performance.
  • fl mouse hot-plate which is a sensory test Tai lf li ck test and exercise test, Open f ield, Rota-rod, Beam test were performed.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF Overexpression of normal neural stem cells, VEGF, in order to determine whether the improvement of SVZ environment following the injection of neural stem cells overexpressing VEGF in NP-C mice can improve lipid accumulation in cholesterol, a major etiological pattern of NPC mice The degree of cholester accumulation was confirmed by filipin staining of the cortex of NP-C mice injected with vectors overexpressing neural stem cells, VEGF. As shown in FIGS. 6A and 6B, cholester accumulated in the cortex of NP-C mice injected with neural stem cells overexpressing VEGF in the SVZ environment was decreased and lipid accumulation was also decreased.
  • NP-C NP-C injected with neuroencapsulated cells overexpressing VEGF in SVZ environment through Hot-plate, Tail-flick test and Open field, Rota-rod, and Beam test, which are sensory test of FIGS. 7A and 7B

Abstract

본 발명은 혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포는 퇴행성 신경질환에 의하여 발생한 SVZ 내 신경줄기세포에서의 VEGF 감소를 효과적으로 회복시켜, 신경줄기세포의 비정상적인 이동을 저해하고 염증반응을 억제하며, 대뇌 피질의 콜레스테롤 및 스핑고지질의 축적을 억제하여 동물모델의 행동 및 운동능력의 회복을 야기하는 바, 효과적인 퇴행성 신경질환의 치료제로 활용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신 경질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 출원은 2016년 2월 5일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0015093호 를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
세계적으로 노년인구의 증가로 퇴행성 신경질환 (NDDs)은 심장혈관계 질환에 이어 두 번째 사망원인인 암을 따라잡을 것으로 전망된다. 이에 따라 퇴행성 신경 질환 치료제 시장도 2000년 이후 20% 정도의 고성장을 하고 있는 것으로 나타났다. 이와 같이 퇴행성 신경질환에 대한 관심은 날로 높아지고 있는 실정이다. 퇴행성 신경질환은 점차적으로 신경세포가 소멸됨으로써 인지능력 상실 운 동기능 상실 등을 초래하여 사망에 이르게 하는 질환이다. 니만픽병 (Niemann-pick disease) , 알츠하이머병 (Alzheimers disease, AD) , 파킨슨병 (ParkinsMi' s disease, PD) 등이 대표적이며 노화의 과정에 따라 그 발병빈도가 증가하는 특징이 있다. 뇌 의 노화와 퇴행성 신경질환과의 상관관계에 대해서는 아직 완전하게 밝혀져 있지 않으나 두 가지 과정 간에는 뇌세포의 소멸과 뇌 용량감소 등 공통된 특성들이 많 이 나타나고 있다. 이들 퇴행성 신경질환 중 니만픽병은 스핑고지질 (sphingol ipid)의 대사 장애 로 인해 여러 장기에 스핑고리피드와 콜레스테를이 축적되어 다양한 임상 증상을 보이는 드문 상염색체 열성 유전질환이다. 원인 유전자와 임상 양상에 따라 A, B, C, D의 아형으로 분류되어 A, B 형은 스핑고미엘린분해효소 (sphingomyel inase)의 결핍으로 인해 발생함이 먼저 알려졌고, 이후에 C, D형은 콜레스테롤의 수송장애로 인해 발생함이 밝혀졌다. 임상적으로 아급성의 다양한 만성 경과를 보이는 C형은 보고에 따라 10만명 당 0.6 내지 0.8 명 정도의 유병률을 보이는 것으로 알려져 있 고， PC1 유전자의 변이에 의한 C1형이 전체의 95% 가량을 차지한다. C형 니만픽병 에서 콜레스테를은 내장기관과 신경계에 특징적으로 축적되는 양상을 보이는데， 축 적되는 장기에 따른 증상이 발현되며 치명를은 주로 중추신경계 침착의 진행에 따 라 결정된다. 최근의 연구에 따르면 스핑고신 (sphingosine)이 C형 니만픽병의 주요 한 침착 물질임이 밝혀졌다. C형 니만픽병은 임상적으로 매우 다양한 경과를 보일 수 있어서 발병시기가 신생아부터 70대까지 다양하게 보고되어 있고， 유병기간이 짧게는 수일에서 길게는 60여년에 이른다. 간비종대， 보행장애, 안구운동장애 및 인지장애 등이 비교적 특징적으로 나타나는데, 중추신경계에서는 소뇌와 뇌간을 선 택적으로 잘 침범하여 신경세포의 수초형성장애 (dysmyel inat ion)와 소뇌 퍼킨제세 포 (Purkinje cel l )의 변성을 초래하여 관련한 증상을 유발한다. 그러나， 아직까지 이에 대한 적절한 치료제가 존재하지 않는 바， 니만픽병의 예방 및 치료제의 개발 이 절실한실정이다. 한편， 혈관내피성장인자 (VEGF, vascular endothel ial growth factor)는 혈관 신생 (angiogenesis)과 관련된 가장 중요한 성장 인자 중 하나이다. VEGF는 PKC를 통해 내피 세포를 자극하고 이어서 ERK1/2의 활성화를 유도하나, 이의 정확한 기전 에 대해서는 알려진 바가 없다. 또한 VEGF 수용체가 다양한 암 조직에서 발견되며, 암세포에서 의 VEGF의 세포 분열 촉진 효과가 보고된 바 있으며， 최근에는 VEGF와 퇴행성 신경질환과의 상관관계에 대한 보고도 증가하고 있는 추세이다. 또한, 본 발명자도 종래 연구 및 특허에서 (KR출원번호 10-2014-0149347)에 서 VEGF의 투여가 니만픽병의 치료 및 예방에 이용될 수 있음을 확인한 바 있으나， 이러한 VEGF의 적합한 전달 및 투여에 대한 연구는 아직 보고된 바 없다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에 본 발명자는 혈관내피성장인자 (VEGF)의 효과적인 전달 및 투여 부위를 특정하기 위하여 예의 노력한 결과， 혈관내피성장인자가 과발현된 줄기세포를 니만 픽병 동물모델의 뇌실하영역 (SVZ)에 직접 주입하는 경우, VEGF가 감소된 SVZ영역 으로 VEGF가 효과적으로 전달되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 이에， 본 발명의 목적은 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 혈관내피성장인자 (VEGF)가 과발현된 줄기세포의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 혈관내피성장인자 (VEGF)가 과발현된 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체의 뇌실하 영역 (Subventricular zone, SVZ)에 투여하는 것을 특징 으로 하는 퇴행성 신경질환 예방또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행상신경질환의 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 퇴행성 신경질환 예방 또 는 치료용 제제를 제조하기 위한 혈관내피성장인자 (VEGF)가 과발현된 줄기세포의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 혈관내피성장인자 (VEGF) 가 과발현된 줄기세포를 이를 필요로 하는 개체의 뇌실하 영역 (Subventricular zone, SVZ)에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법 을 제공한다. 이하본 발명에 대하여 상세히 설명한다. 본 발명은 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 즐기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에서 "혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)" 는 혈관내피세포쎄 선택적으로 작용하는 성장인자로 34-42kDa의 당단백질로 이루어져있으며， 세포막에 있는 수용체인 VEGFR-1 에 작용하여 인지질효소 C(phospho l ipase C)를 활성화 시켜 혈관내피 세포를 증식시키고, 혈관의 투과성을 증가시켜 혈장 단백을 배출시키고 섬유소를 침착시킴으로 신생혈관생성을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Shibuya, 1995) . 상기 혈관내피성장인자 (VEGF)를 코딩하는 염기서열은 GenBank ID ：丽_001025366.2의 염기서열이다. 상기 혈관내피성장인자 (VEGF)는 상기 염기서열로 코딩한 아미노산 서열을 갖 는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물 "이란 아미 노산의 부가， 치환 또는 결실의 결과， 상기 서열과 적어도 70% 이상， 바람직하게는 80% 이상， 더욱 바람직하게는 90% 이상， 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로， 상기 염기서열로 코딩된 VEGF와 실질적으로 동일한 활성을 나타내는 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "줄기세포" 는， 다양한 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서， 이는 만능 줄기 세포 (tot ipotent stem cel l ) , 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cel l ) , 다분화능 줄기세포 (mul t ipotent stem cel l )로 분류될 수 있다. 본 발명에서 줄기세포는 그 유래 또는 유형에 따라， 성체줄기세포, 배아줄기 세포, 중간옆 줄기세포， 종양줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있다. 또한， 상기 성체즐기세포는 신경줄기세포 또는 신경전구세포일 수 있다. 신 경줄기세포 (Neural stem cel l , NSC)는 자기 재생산 (sel f-renewal )이 가능하고， 신경계통 세포로의 분화능을 가진 세포로서， 신경줄기세포는 신경 세포 (neuron) , 성상교세포 (astrocyte) , 회소돌기아교세포 (ol igodendrocyte)로 분화될 수 있는 세포이다. 또한， 본 명세서에서 사용된 용어 "중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cel l , MSO" 는 뼈， 연골， 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력올 가진 다분화능 줄기세포
(mul t ipotent stem cel l )이다, 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 제대， 제대 혈， 골수， 지방， 근육， 신경, 피부， 양막， 융모막， 탈락막, 및 태반으로 구성된 군 에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한， 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아， 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포 유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물， 고양이과 동물, 원숭이과 동물， 소, 양， 돼지, 말， 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며， 그 유래를 제한하지 않는 다. 상기 유효성분은 상기 줄기세포를 포함하는 줄기세포 배양액, 상가배양물의 농축물 등을 포함하는 개념이다. 본 발명의 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포는 혈관내피성장인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 백터 에 의한 것일 수 있다. 상기 재조합 백터는 줄기세포내 VEGF 유전자를 과발현시킬 수 있어야 하므로， 재조합 발현 백터 형태인 것이 바람직하다. 상기 재조합 발현 백터는 상업적으로 입수 가능한 기본 백터 (즉， 백본 백터)에 APP 코딩 핵산과 개 과의 신경계 세포에서 기능을 발휘할 수 있는 조절 서열 (예， 프로모터， 분비 서 열, 인핸서， 업스트림 활성화 서열, 전사종결인자 등)을 작동 가능하게 연결하여 제조할 수 있다. 상기 재조합 발현 백터는 선택 마커를 포함할 수 있으며 , 상기 선 택 마커에는 카나마이신 저항성 유전자， 네오마이신 저항성 유전자와 같은 항생제 저항성 유전자 및 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 등이 포함되나， 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환은 공지된 방법에 따라 진행할 수 있는데， 예를 들면 칼슘 포 스페이트 형질전환 (calcium phosphate transfect ion) , 전기천공 (electrophoresi s) , 형질도입 (transduct ion)， DEAE-덱스트란 매개 형질전환 (DEAE- dextran mediated transfect ion) , 미세주입 (microinject ion)， 양이온 지질 -매개 형 질전환 (cat ini c' l ipid-transfect ion) , 총알식 도입 (bal l ist ic introduct ion) 등을 포함하나， 이에 제한되지 않는다. 특히， 본 발명의 상기 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 대상의 뇌실하 영역 (Subventricular zone , SVZ)으로 직접 주입되는 것을 특징으로 한다. 발생 초기 선경판 (neural plate)에서 신경관 (neural tube)이 만들어지고 신 경관의 강 (cavi ty)이 발생 과정을 거치면서 뇌실 (ventr icle)을 형성한다. 뇌실의 가장 가까이 위치한 세포층을 뇌실 영역 (ventricular zone)이라 하고 신경발생 과 정을 거치면서 뇌실 영역 위로 추가의 증식 가능한 세포층이 형성되는 데 이를 뇌 실하 영역 (subventr icular zone)이라고 부른다. 뇌실 영역과 뇌실하 영역에 존재하 는 전구세포들은 신경줄기세포 (neural stem cel l )의 특성을 가지고 있으며 복잡한 제어방법을 거쳐 중추신경계를 구성하는 신경세포 (neuron) , 성상세포 (astrocyte)， 희돌기세포 (ol igodendrocyte)로 분화할 수 있다 [Dehay and Kennedy, Nat RevNeur osc i 8： 438-450 , 2007； Molyneaux etal . , NatRevNeur osc i 8： 427-437 , 2007； Angevine and Si dm an, Naturel92： 766-768 , 1961； Caviness and Takahashi , BrainDevl7 : 159-163 , 1995] . 정상적인 SVZ 환경에서의 신경줄기세포들은 부리쪽 이동 줄기 (rostal migratory stream, RMS)를 통해 후각구 (ol factory bulb, 0B)로 이동하여 뉴런으로 분화하게 된다. 다양한 신호 전달체계가 이러한 신경줄기세포들의 이동 패턴을 조 절하게 되는데 종래 보고에 따르면 VEGF가 이러한 조절 신호들 중 하나이다 (Neuron. 70, 687-702 (2011)， J Neurosci . 29, 8704-8714 (2009) , J Neurosci Res . 88, 2487257 (2010) . ) 본 발명의 일실시예에 따르면, 니만픽병 마우스의 SVZ 영역에 존재하는 신경 줄기세포들은 정상 마우스와 바교해 VEGF의 발현이 현저하게 저하되어 있는 것으로 확인이 되었으며， 이러한 신경줄기세포들은 상기한 정상적인 이동경로가 아닌 thalamus로 이동하는 비정상적인 양상올 나타내었다. 결과적으로, 니만픽병 마우스 의 thalamus와 cortex에 염증반웅이 증가하고 뇌에 콜레스테롤 및 스핑고지질이 축 적되어 동물의 감각기능， 운동기능이 실조되는 현상이 나타났다. 한편， 본 발명자가 니만픽병 마우스의 SVZ 영역에 VEGF가 과발현된 신경줄기 세포를 직접적으로 투여한 결과， 신경즐기세포들의 비정상적인 이동이 감소하고 thalamus와 cortex에서의 염증반웅이 억제되었으며， 동물의 감각기능， 운동기능이 회복되고， 생존율까지 향상되는 효과가나타났다. 본 발명자는 니만픽병 마우스의 SVZ 영역에 VEGF가 과발현된 신경줄기세포뿐 만 아니라， 정상적인 신경줄기세포 또는 VEGF를 과발현시킬 수 있는 백터를 각각 투여해 보았는데 아무런 개선효과가 나타나지 않았다. 즉， 손상된 SVZ 환경을 개선 하는 것은 정상신경줄기세포 또는 VEGF 중 어느 하나만으로는 가능하지 않고， VEGF 가 과발현된 신경즐기세포의 형태로 투여가 되었을 때에만 그 효과가 발휘된다는 것을 확인한 것이다.
SVZ 영역의 손상이 니만픽병의 발병 과정에서 매우 중추적인 역할올 담당한 다는 것과， 손상된 SVZ 환경을 개선함으로써 니만픽병을 비롯한 다양한 퇴행성 신 경질환올 예방 또는 치료할 수 있다는 것은 종래 보고된 바 없는 것으로 본 발명자 가본 발명을 통해 최초로 공개하는 바이다. 상기 "손상된 SVZ 환경" 이라는 것은 SVZ에 존재하는 신경줄기세포의 VEGF 발현이 저하되어 thal amus로의 비정상적인 이동양상을 나타내는 것을 의미하며， 이 를 "개선" 한다는 것은 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 투여하여 신경즐 기세포의 비정상적인 이동을 억제하고， 정상적인 뇌의 기능을 회복시키는 것을 의 미한다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면 SVZ 환경이 손상되면 SVZ 환경 내에 존 재하는 신경줄기세포들의 생존를이 감소하고， 대뇌 피질에 스핑고지질, 콜레스테롤 등이 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 한편， 이렇게 손상된 SVZ 환경에 VEGF가 과 발현된 신경줄기세포를 직접 투여한 결과 신경줄기세포들의 생존률이 증가하고， 스 핑고지질， 콜레스테롤의 축적이 감소하는 결과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서， 본 발명의 약학적 조성물은 니만픽병 뿐만 아니라, SVZ 환경 내 신 경줄기세포들의 감소 콜레스테롤 또는 스핑고지질의 뇌 축적에 의해 나타나는 퇴 행성 신경질환을 예방또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환은 니만픽병， 알츠하이머, 파킨슨병， 루게 릭병， 조현병 ( schi zophreni a) , 고셔 (Gaucher )병， 파브리 (Fabry)병， 테이색스 (Tay- Sachs)병， 샌드호프 (Sandhof f )병 및 소뇌실조증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 니만픽병 또는 소뇌실조증일 수 있으며，. 가장 바람직하게는 니만픽병일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 니만픽 (Niemann-Pick)병은 세망내피 세포에 지질이 축적되 는 질환으로 유전질환에 해당한다. 본 발명의 니만픽병은 그 유형을 제한하지 않으 며， 예를 들어， A형， B형, C형， D형， E형 또는 F형 니만픽병일 수 있다. 특히， 본 발명의 니만픽 병은 C형 니만픽 병일 수 있다. C형 니만피크병은 단백질 ·당질과 더불어 생체를 구성하는 주요 유기물질인 지질의 대사 장애 때문에 세포에 스핑고지질과 콜레스테를이 쌓여 기억 *지능장애 등의 각종 신경장애를 일 으키는 유전질환이다. 본 발명의 일실시예에 따르면， SVZ 환경이 손상되면 소뇌 신경세포가손상되 어 그 수가 감소하고 염증반응이 증가하였으나， VEGF가 과발현된 신경줄기세포를 SVZ에 투여한 결과 소뇌 신경세포의 손상이 예방되고 염증반웅이 완화되는 결과가 나타났다. 따라서， VEGF가 과발현된 신경줄기세포를 SVZ에 투여함으로써 소뇌실조 증 (cerebel lar ataxi a)을 예방또는 치료할수 있다. 본 발명에서 상기 소뇌실조증이란 소뇌의 기능이상으로 인해 동작이 서투르 고 동작간의 협조가 되지 않는 증상이 나타나는 신경질환을 의미하는 것으로， 다양 한 내과적， 신경과적 질환 또는 유전적 소인에 의해 유발되는 소뇌실조증을 모두 포함한다. 알츠하이머， 파킨슨병， 루게릭병 및 조현병은 니만픽병과 마찬가지로 SVZ 환 경 내 존재하는 신경줄기세포의 수 및 증식이 감소되어 있다고 보고된 질환들이다 (Nat Rev Neurosci . 2007 Sep ;8(9) : 712-23. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet . 2017 Jan ; 174( 1) :93-112) . 본 발명의 일실시예에 따르면， SVZ 영역에 VEGF 가 과발현된 신경줄기세포를 투여하면 SVZ 환경의 신경줄기세포 생존율이 증가하고 뇌의 염증반응이 감소하는 결과를 나타냈기 때문에 본 발명의 약학적 조성물을 이 용하여 상기 퇴행성 신경질환들을 예방또는 치료할수 있다. 한편, 고셔 (Gaucher)병， 파브리 (Fabry)병， 테이색스 (Tay-Sachs)병 및 샌드호 프 (Sandhof f )병은 지질대사의 장애로 인해 니만픽경과 같이 뇌에 리피드가 축적이 되어 발생한다고 보고가 되어 있는 질환들이다 (Nature . 2014 Jun 5； 510(7503)： 68- 75 , Trends Cel l Biol . 2003 Apr ; 13(4)： 195-203. , FEBS Lett . 2010 May 3 ; 584(9) : 1748-59. ) . 본 발명의 일실시예에 따르면， SVZ 영역에 VEGF가 과발현된 신경즐기세포를 투여하면 콜레스테를， 스핑고지질의 뇌 축적이 감소하는 결과가 나 타났기 때문에 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 상기 퇴행성 신경질환들을 예 방또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스， 덱스트로스， 수크로스， 솔비틀， 만니를, 전분, 아카시 아 고무， 인산 칼슴, 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘, 미세결정성 셀를로스， 폴리 비닐피를리돈， 셀를로스, 물 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트, 프로 필히드록시벤조에이트， 활석, 스테아르산 마그네슴 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습 윤제， 감미제， 향미제, 유화제, 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할수 있다. 또한， 본 발명의 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제， 현탁제， 유제 또는 동결건조제제， 경구 투여시에는 정제， 트로키， 캡슐， 엘릭시르, 서스펜션， 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며， 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형 태로 제조할 수 있다. 또한， 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 결합체， 활탁제， 붕해제， 부형제， 가용화제， 분 산제, 안정화제， 현탁화제， 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우 에는 완충제 , 보존제， 무통화제, 가용화제 , 등장제 , 안정화제 등을 흔합하여 사용 할 수 있으며， 국소 투여용의 경우에는 기제， 부형제， 윤활제， 보존제 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용하여 퇴행성 신경질환을 치료하는 방법은 적 절한 방법으로 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 복강 내 투여， 정맥 내 투여， 근육 내 투여， 피하 투여， 피내 투여， 경구 투여, 국소 투여， 비내 투여， 폐내 투여 및 직 장 내 투여가 있으나， 이에 제한되지 않으며， 가장 바람직하게는 뇌실하 영역으로 직접 투여된다. 또한， 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치 에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제， 피하 주사제， 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링 겔액 등의 수성 용제, 식물유， 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등)， 알 코올류 (예로， 에탄올， 벤질알코을， 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로， 아스코르 빈산， 아황산수소나트륨， 피로아황산나트륨， BHA, 토코페를, EDTA 등)， 유화제, pH 조절을 위한 완충제， 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로， 질산페닐수은， 치메로살， 염화벤잘코늄， 페놀, 크레솔， 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포 함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하여 퇴행성 신경질환을 치료 또는 예방하 는 방법은， 본 발명의 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한 다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류， 환자의 연령， 체중， 건강， 성별， 환자의 약물에 대한 민감도， 투여 경로， 투여 방법, 투여 횟수， 치료 기간， 배합 또는 동 시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명은 또한 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포를 포함하는 식품 조성물을 제공할 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능성 식품일 수 있다. '건강기능식품' 이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어， 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하 는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다. 본 발명의 유효성분은 퇴행성 신경질환의 예방또는 개선을 목적으로 건강기 능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포를 식품 첨가물로 사용할 경우， 상기 혈 관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포 를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 흔합 양은 사용 목적 (예방， 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로， 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 유효성분은 원료에 대하여 15중량 % 이하， 바람직하게 는 10 중량 이하의 양으로 첨가된다. 그러나， 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식 품의 예로는 육류， 소시지, 빵， 초콜릿， 캔디류, 스낵류， 과자류， 피자， 라면， 기 타 면류, ¾류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품， 각종 수프， 음료수， 차， 드링크 제， 알코을 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며， 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천 연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도 당， 과당과 같은 모노사카라이드， 말토오스， 수크로오스와 같은 디사카라이드， 및 덱스트린， 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나， 사카린， 아스파르탐과 같은 합 성 감미제 등올 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제， 비타민, 전해질, 풍미제， 착색제, 펙트산 및 그의 염 ᅳ 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제， 안정화제, 방부제， 글리세린， 알코을， 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또 는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발 명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 증량부의 범위에서 선택되는 것이 일반 적이다. 본 발명의 상기 '치료' 는 퇴행성 신경질환 또는 퇴행성 신경질환과 관련된 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고， 이는 이러한 질환을 치유하 거나， 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며， 퇴 행성 신경질환 또는 퇴행성 신경질환과 관련된 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나， 이에 제 한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포의 퇴행성 신경질환 예방또는 치료 용도를 제공한다. 또한， 본 발명은 뇌실하 영역 (Subventricular zone, SVZ)으로 투여되는 퇴행 성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 혈관내피성장인자 (VEGF)가 과 발현된 즐기세포의 용도를 제공한다. 또한， 본 발명은 혈관내피성장인자 (VEGF)가 과발현된 줄기세포의 유효량을 이를 필요로 하는 개체의 뇌실하 영역 (Subventricular zone, SVZ)에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때， 신경줄기세포의 thalamus로의 비정상적인 이동을 저해하거나， 대뇌 피질에서 콜레스테를, 스핑고지 질의 축적을 억제하거나， thalamus , cortex에서의 염증반응을 완화시키거나 또는 개체의 운동기능 및 감각기능을 회복시킬 수 있는 양을 말하고， 상기 '개체' 란 동 물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유 래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자
(pat ient ) 일 수 있 . 상기 퇴행성 신경질환에 대해서는 전술한 바와 같다.
【유리한 효과】
본 발명에 따른 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포는 퇴행성 신경질환에 의하여 발생한 SVZ 내 신경줄기세 포에서의 VEGF 감소를 효과적으로 회복시켜， 신경줄기세포의 비정상적인 이동을 저 해하고 염증반웅을 억제하며, 대뇌 피질의 콜레스테를의 축적을 억제하여 동물모델 의 행동 및 운동능력의 회복을 야기하는 바, 효과적인 퇴행성 신경질환의 치료제로 활용될 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 la는 정상 (WT) 및 NP-C마우스와 SVZ 내 존재하는 신경줄기세포들의 비율 을 확인한 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나 타내었다.
도 lb는 정상 (WT) 및 NP-C 마우스의 SVZ 조직에서 분리한 신경줄기세포의 VEGF의 발현을 확인한 도이다 (n = 4 per group). ** p < 0.01. 데이터는 평균土 s.e.m으로 나타내었다.
도 ic는 정상 및 NP-C 마우스 SVZ 면역형광염색을 통해 신경줄기세포 내 발 현하는 VEGF를 확인하고 (좌) 이를 정량하하여 그래프로 나타낸 것이다 (우) (n = 4 per group). *** p < 0.001. 데이터는 평균土 s.e.m으로 나타내었다. 도 2a는 정상 및 NP-C마우스의 SVZ에 신경줄기세포 표지 형광물질인 MPI0를 주입하여 SVZ신경줄기세포의 이주를 확인하기 위한 실험 디자인 도이다.
도 2b는 정상 및 NP-C마우스 SVZ에 MPI0주입 후 7일째와 21일째에 뇌 부위 별로 MPI0 형광물질이 표지된 신경줄기세포 존재 여부를 확인하고， 이를 정량화하 여 그래프로 나타낸 것이다 (n = 6 per group, ®=LV, ®=RMS, ③ =0B, ④ =LLV, ⑤ thalamus). * p < 0.05， ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다. 도 3a는 SVZ 환경에 존재하는 신경줄기세포의 손상을 유도하기 위해 NPC""1 또는 VEGF""1마우스의 SVZ에 GFAP/CD133 split-cre를 주입하여 SVZ 신경즐기세포에 특이적으로 NPC 또는 VEGF의 발현을 감소시켜 SVZ의 손상이 전체 뇌에 어떠한 영향 을주는지 확인하기 위한실험 디자인 도이다.
도 3b는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC""1， VEGF""1마 우스의 SVZ내 신경줄기세포들의 비율을 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01. 데이터는 평균土 s.e.m으로 나타내었다. 도. 3c는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC""1 또는 VEGF 마우스의 SVZ 환경의 염증반웅을 확인한 도이다 (GFAP: astrocyte, Iba-1: microglia, n = 6 per group) . * p < 0.05, *** p < 0.001. 데이터는 평균士 s.e.m 으로 나타내었다. 도 3d는 GFAP/CD133 split-cre와 MPI0를 SVZ에 주입 받은 NPC""1 또는
VEGFfl/fl 마우스의 뇌 부위별로 MPI0 형광물질이 표지된 신경줄기세포 존재 여부를 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다. 도 3e는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC""1 또는
VEGFn/fl 마우스의 SVZ와 Thalamus 조직에서 신경줄기세포의 존재 여부를
Neurosphere(NS) 배양을 통해 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01. 데 이터는 평균士 s.e.m으로 '나타내었다. 도 3f는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC m 또는
VEGF""1마우스의 thalamus, cortex의 염증반웅을 확인한 도이다 (GFAP: astrocyte,
Iba-1： microglia, n = 6 per group). * p < 0.05, ** p < 0.01. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다. 도 3g는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC""' 또는
VEGFn/fl 마우스의 cortex에서 콜레스테롤과 리피드 축적을 확인한 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다.
도 4a 와 4b는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC""' 또는
VEGF""1마우스의 감각 기능 (a) 및 운동 기능 (b) 손상 여부를 확인한 도이다 (n = 10-13 per group) . * p < 0.05, ** p < 0.01. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었 다. 도 5a는 NP-C마우스의 손상된 SVZ 환경을 개선시키기 위해 정상 신경줄기세 포 (WT NSCs), VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 (VEGFtg NSCs), VEGF를 과발현하는 백터 (VEGF OX vector)를 주입하기 위한 실험 디자인에 관한 도이다.
도 5b는 NP-C 마우스의 SVZ에 정상 신경즐기세포， VEGF를 과발현하는 신경즐 기세포, VEGF를 과발현하는 백터를 1주간 두 번씩 총 4주를 주입한 후 SVZ내 신경 줄기세포들의 퍼센트를 확인한 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05， *** p < 0,001. 데이터는 평균土 s.e.m으로 나타내었다.
도 5c와 5d는 NP-C 마우스의 SVZ에 정상 신경즐기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포， VEGF를 과발현하는 백터를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입한 후 SVZ, Thalamus, Cortex의 염증반응을 확인한 도이다 (GFAP: astrocyte, Iba-1: microglia, n = 6 per group) . ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다.
도 5e는 SVZ에 VEGF특 과발현하는 신경줄기세포를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입 받은 NP-C 마우스의 뇌 부위별로 MPI0 형광물질이 표지된 신경줄기세포 의 존 재비율 (%)을 확인한 도이다 (n = 6 per group). * ρ < 0.05, ** ρ < 0.01, *** ρ < 0.001. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다.
도 5f는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입 받은 NP-C 마우스의 SVZ와 Thalamus 조직에서 신경줄기세포의 존재 여부를 Neurosphere(NS) 배양을 통해 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** ρ < 0.01, *** ρ < 0.001. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다. 도 6a는 NP-C 마우스의 SVZ에 정상신경줄기세포， VEGF를 과발현하는 신경줄 기세포, VEGF를 과발현하는 백터를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입한 후 대뇌에 축 적된 콜레스테를 레벨을 filipin 면역염색을 통해 확인하고 이를 정량화하여 그래 프로 나타낸 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균土 s.e.m으로 나타내었다.
도 6b는 NPC 마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입한 후 대뇌에 축적된 리피드 레벨을 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균土 s.e.m으로 나타내었다. 도 7a, 7b 및 7c는 NP-C 마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 1주간 두 번씩 총 4주를 주입한 후， 감각 기능 (a) 및 운동 기능 개선 여부 (b)와 생 존률 증가 여부 (c)를 확인한 도이다 (n = 10-12 per group). * p < 0.05， ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다. 도 8a는 NP-C 마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입한 후 (NP-C/VEGFtg NSCs), 또는 소뇌에 직접적인 VEGF-loaded microsphere를 주입한 후 (NP-C/VEGF microsphere), 분자층 (ML: molecular layer), 소뇌신경세포층 (PCL: Purkinje cell layer), 과립상세포층 (GCL: granular cell layer)으로 이루어진 소 뇌 조직을 염색 (좌)하여 소뇌신경세포층에 존재하는 신경세포의 감소를 확인하고 이를 소뇌의 3번부터 8번까지 각각의 엽 (III~VIII)에서 신경세포 감소를 정량한 도 이다 (우) (η = 3 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균土 s.e.m으로 나타내었다. 도 8b 내지 8d는 NP-C마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입 한 후 (NP-C/VEGFtg NSCs), 또는 소뇌에 직접적인 VEGF-loaded microsphere를 주입 한 후 (NP-C/VEGF microsphere), 염증반웅 (b), 리피드 축적 (c) 및 운동 기능 개선 여부 (d)를 확인한 도이다 (b, c; n = 3 per group, d; n = 7 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균士 s.e.m으로 나타내었다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하본 발명의 실시예를 통하여 보다상세하게 설명한다.
<실시예 1>
심험채료 및 심험방법
1-1. 마우스의 준비
Balb/C 및 NPC1유전자가 결손된 NPC mutant마우스 (NP-C 마우스; 같은 주령 의 정상 마우스에 비해 체중이 적으며， 4~6주령에서부터 심각한 운동기능상실이 나 타나 사지의 떨림과 발작이 나타나고 수명이 대략 9~10주이다)는 PCR을 통한 genotyping을 통하여 그 계통이 유지되었으며 , NPCfl/fl,VEGFfim마우스는 각각와 계 통 간 교배를 통해 유지되었다. 구획 무선화 (Block randomization) 방법을 사용하 여 마우스를 실험군에 배치시켰다. 편견을 제거하기 위하여， 데이터 수집 및 데이 터 분석에는 전혀 관여하지 않았다. 모든 마우스 실험은 경북대학교 동물실험 관련 위원회 ( yungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)를 통하여 승인받았다.
1-2. 약물 및 신경세포 주입
NPCil/fl,VEGFfl/fl정상 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포, VEGF 를 과발현하는 백터 또는 GFAP/CD133 spilt-cre를 주입하기 위해 마우스는 100 mg/ kg 케타민 (ketamine) 및 10 mg/kg 자일라진 (xylazine) 흔합액으로 마취시키고， 정 상 신경줄기세포 (~lxl06cell/3ul), VEGF를 과발현하는 신경줄기세포
(~lxl06cell/3ul),VEGF를 과발현하는 백터 (MGC 12075 clone, Thermo Scientific)를 주입 받았고 (3ul), NPCfl/fl,VEGFfl/il매일 GFAP/CD133 spilt-cre (1:1.5비율， 2ul씩) 를 주입 받았다.
또한 1.63 urn diameter o 1 ys t yr ene/ d i v i nyl benzene-coat ed uorescent iron oxide particles (MPIOs, 3.00 mg Fe/ml , green uorescent dye'- 480 nm excitation, 520 nm emission; Bangs Laboratories, Fishers, IN, USA)이 신경줄기 세포의 이주를 확인하기 위해 사용되었으며， 0.05mg/ml의 PLL (Sigma)과 흔합한 MPI0 (0.67 mg Fe/ml ) 총 1.5ul의 용량이 각 마우스의 SVZ에 주입되었다. 세포 및 약물들의 주입 속도는 0.3 /min의 유속으로 이식되었다.
VEGF microsphere의 직접적인 소뇌 주입은 유리 모세관 (1.2 mm x 0.6 mm)을 이용하여 소뇌 내에 이식되었다. 주사 좌표는 bregma 앞쪽 5.52 mm, 주사 깊이 2.50 隱 였다. 주입 속도는 0.15 μΐ/mn 의 유속으로 3mg 이식되었다.
1-3. VEGF를 포함하는 미소구체 (microsphere)의 제조
VEGF를 포함하는 미소구체 (microsphere)를 제조하기 위해， 인간 재조합 혈 관내피성장인자 (VEGF)를 R&D System 사 (社) (Catalog No. 293-VE-010)로부터 구입하 여 사용하였다. 수중 유중 수적형 유화 (water-in-oil-in-water emulsi f icat ion) 방 법을 이용하여 상기 인간 재조합 혈관내피성장인자 (VEGF)가 포함된 PLGA ( Po 1 y ( 1 ac t i c-co-g 1 yco 1 i c acid)) 미소구체 (microsphere)를 제조하였다. 상기 인간 재조합 혈관내피성장인자 -A(VEGF-A)를 PLGA 미소구체 (PGLA의 lactic acid와 glycol ic acid는 1:1 비율이고, 분자량은 40,000 내지 75,000) 내에 캡슐화하였다.
1-4. 면역형광염색
상기 마우스의 뇌조직을 vibratome을 이용하여 50um의 두께로 자른 후， 항- VEGF (토끼， 1:500， abeam) , 항 -S0X (마우스， 1:100， R&D), 항 -GFAP (토끼, 1:500, DAK0), 항 -Iba-1(토끼， 1:500， DAK0), 항 -Calbindin (토끼， 1:100， milipore)를 함 께 배양하였다. 또한 콜레스테를의 축적 정도를 확인하기 위해 상기 마우스의 조직 을 filipin 염색을 실시하였다. SVZ, thalamus, cortex, cerebellum의 부위를 Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어 (Olympus FV1000 , Japan)를 장착한 레이저 스 캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용하여 분석하였다. Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓 이의 퍼센트를 정량화하였다. 그리고 염색된 부위의 세포 개수는 Stereology를 이 용하여 Vi siomorph software (Vi sioMorph)로 정량화하였다.
1-4. 뉴로스피어 (Neurosphere)의 배양및 정상， VEGF과발혈 신경줄기세포의 배양
SVZ가 손상된 마우스 또는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받 은 NP-C 마우스 신경줄기세포의 Thalamus로의 비정상 이주를 확인하기 위해, SVZ와 Thalamus 부위를 마우스 뇌에서 적출하였다. 각각의 조직을 i ce-cold Hibernate A/B27/Glutamax medium (HABG) ( Invi trogen)에서 적출한 후 papain (Worthington) 용액에 담궈 37°C에 30분 반응시켜 조직을 분해하였다. 그 후， 분해된 조직을 Opt i prep (Sigma) densi ty gradient 용액을 이용하여 원심분리하고 신경줄기세포를 포함하는 층을 분리한 후 glutamax (0.5 mM)', gentamycin (10 ug/ml , Invi trogen) , mouse f ibroblast growth factor 2 (mFGF2 , 5 ng/ml , Invi trogen) 그리고 mouse platelet-der ived growth factor-bb (mPDGFbb, 5 ng/ml , Invi trogen)가 포함된 Neurobasal A ( Invitrogen)/B27 배지에 1주일 배양하였다. 배양한 신경줄기세포는 구 형태의 Neurosphere로 성장하며 1주일 후 세포를 모아 분해한 뒤， 1x104 개의 세포로 24 wel l 플레이트에 배양하였다. 일주일간의 배양 후 생성된 Neurosphere를 현미경상에서 카운트 하였고， Neurosphere 최소 컷오프 사이즈는 50um로 제한하였 다. NP-C 마우스의 SVZ내 정상 및 VEGF 과발현 신경줄기세포 주입을 위한 신경줄기 세포의 배양은 위의 방법으로 Neurosphere를 배양한 후 주입 시 Tr iple select (Gibco) 용액으로 세포를 분리하여 단일 세포로 주입하였다.
1-6. 리피드 측정
각 마우스의 대뇌 및 소뇌를 적출하여 50 mM HEPES ( Invitrogen) , 150 mM 염 화나트륨수용액 (NaCl ) (Sigma) , 0.2 % Igepal CA-630 (Sigma)과 protease inhibi tor (Mi l ipore)를 포함하는 균질 완층액을 첨가하고 호모게나이저를 이용하 여 균질화하여 13 ,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 10분 후, 13 ,000rpm에서 추 가적인 원심분리를 30분 실시하였다. 30분 후 상층액을 취하여 DCM (di chloromethane , Sigma) , DCM： M(d i ch 1 oromethane： methano 1 =1： 3 , Sigma)과 10% 차아염소산나트륨 (NaHCl )을 순서대로 첨가하고 13 ,000rpm에서 1분간 원심분리 후 유기용해층만을 분리하였다. 분리된 시료는 회전진공증발기를 이용하여 건조하였 다. 상기와 같이 건조 지질 추출물을 0.2% Igepal CA-630( Sigma) 내에 재현탁한 후 ， 각 리피드의 농도를 UPLC 시스템을 이용하여 측정하였다.
1-7. 콜레스테를 측정
각 마우스의 대뇌를 적출하여 50 mM phosphate buf fer , 500 mM 염화나트륨수 용액 (NaCl ) , 25 mM chol ic acid와 0.5 % Tr iron X-100을 포함하는 균질완층액을 첨 가하고 호모게나이저를 이용하여 균질화하여 13 , 000rpm에서 10분간 원심분리하였 다. 10분 후, 유기용해층만을 분리하여， Amplex Red Cholesterol Assay Ki t (Molecular Probes)를 이용하여 콜레스테를 레벨을 측정하였다.
1-8. 감각능력 테스트
SVZ가 손상된 마우스 또는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받 은 NP-C 마우스의 감각 능력을 확인하기 위해, 핫-플레이트 테스트와 꼬리 -반응 테 스트를 실시하였다. 핫―플레이트 테스트는 heat ing apparatus (Pan lab/Harvard Apparatus , Spain)를 50 °C로 유지시키고， 마우스 각각을 가열된 표면 끝에 위치시 쪄， 제 1의 통증수용 (nocicept ion) 즉 점프 또는 발 핥기까지의 시간을 측정하였 다. 컷오프 시간은 60초로 하였다. 측정 사이에는， 가열된 표면을 세제 및 에탄올 로 닦고， 50 °C로 은도가 유지되도록 하였다. 꼬리 -반응 테스트는 마우스를 암막 천으로 감싼 뒤， 꼬리를 가열된 기기 표면 (Panlab/Harvard Apparatus , Spain)에 을린 뒤 꼬리가 반응하는데 걸리는 시간을 측정하였다.
1-9. 운동능력 테스트 (Beam walking test )
SVZ가 손상된 마우스 또는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받 은 NP-C 마우스의 운동 능력이 개선되는지 확인하기 위해， Open f ield, Rota-rod, Beam 테스트를 실시하였다. 소뇌에 VEGF microsphere를 직접 주입 받은 마우스는 Rota-rod 테스트를 실시하였다. Open f ield 테스트는 마우스를 10분 동안 사각형의 박스에 넣어 전반적인 활동성과 벽면 및 가운테를 돌아다닌 시간을 측정하였다. Rota-rod 테스트 (Ugo Basi le , Comer io , VA, Italy)는 그립을 제공하기 위해 적절하 게 가공된 직경 3cm의 막대가 설치되어 있는 기계를 4 rpm의 회전속도로， 3회 이상 Rota-rod 운동을 실시하여 실험 동물의 유지시간 (endurance t ime)을 초단위로 측정 하고， 그 평균값을 기록하였다. 상기 각 Rota-rod 운동시험은 회당 5분을 초과하지 않도록 하였다. Beam 테스트는 6mm 또는 12画 너비의 막대의 시작지점에 마우스를 올려놓은 후 끝 지점까지 이동하는 데에 걸리는 시간을 측정하였다.
1-10. 실시간 정량 PCR (Real-t ime quant itat ive PCR)
NP-C 마우스와 SVZ 신경세포에서 VEGF의 발현량을 확인하기 위해 마우스의 SVZ를 분리한 후 신경줄기세포를 분리하였다. 분리한 신경줄기세포에서 VEGF의 발 현량은 실시간 정량 PCR법을 사용하여 측정되었다. 총 RNA를 RNeasy Plus 미니 키 트 (Qi agen, Korea, Ltd)를 사용하여 신경세포로부터 추출하고， Clontech (Mountain View, CA)사의 키트를 사용하여 5 //g 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 또한， Corbett research RG-6000 real-t ime PCR 기기를 사용하여 , 95°C , 10분; 95 °C , 10초; 58°C , 15초; 72°C , 20초;를 1 사이클로 하여 40 사이클을 반복하는 실시 간 정량 PCR을 수행하였다.
1-11. 통계적 분석
각 군과의 비교는 Student ' s t— test를 이용하여 수행하였다. 다른 군과 2개 이상의 군을 비교할 경우, 일원화분산분석 (one way AN0VA) 및 Tukey' s HSD test 를 수행하였다. 전체 생존의 비교는 Log-rank test를 이용하여 수행하였다. 모든 통계학적 분석은 SPSS 통계 소프트웨어를 이용하였다. p < 0.05， p < 0.01， p < 0.001의 경우 유의적인 것으로 간주하였다.
<실시예 2>
NPC마우스의 SVZ에서의 신경줄기세포들의 비율 및 VEGF 발현량 확인
6주령의 NP-C 마우스의 SVZ내 존재하는 신경줄기세포들의 비율을 확인하기 위해， 정상 및 NP-C 마우스의 SVZ를 상기 실시예 1-3에 기재된 방법으로 면역형광 염색하였다. 그 결과 도 la에서 신경줄기세포들의 (S0X2+/GFAP+ , Mashl+ , DCX+ eel Is)의 감소를 확인하였다 (*p < 0.05. n= 6 per group)
또한， 6주령의 NP-C마우스의 SVZ에서의 VEGF의 발현량을 확인하기 위해， 정 상 마우스 (WT)와 NP-C 마우스의 뇌에서 SVZ 부위를 적출한 후 신경줄기세포를 분리 하였다. 분리한 신경즐기세포에서 상기 실시예 1-9에 기재된 방법으로 총 RNA를 추 출 후 cDNA를 합성하여 신경세포 내에 발현하는 VEGF의 발현량을 실시간 정량 PCR 로 분석하였다. 결과는 도 lb에 나타내었다 (**p < 0.01. n= 4 per group) . 신경줄기세포 표지 항체와 VEGF 항체를 이용하여 상기 실시예 1-3에 기재된 방법으로 각 마우스의 SVZ를 면역형광염색하였다. 결과는 도 lc에 나타내었다 (***p<0.001. n= 4 per group) . 도 1에 나타난 바와 같이， 정상 마우스 (WT)에 비해 NP-C 마우스의 SVZ 환경 에 존재하는 신경줄기세포들은 생존률이 감소되어 있었으며， 신경줄기세포 내 VEGF 의 발현이 감소되어 있는 것을 확인할수 있었다.
<실시예 3>
SVZ환경 내 신경줄기세포의 비정상적인 이주 현상 확인
정상 SVZ 환경에 존재하는 신경줄기세포는 Rostral migratory stream (RMS) 를 통해 Ol factory bulb (OB)로 이동할 수 있으며， 특히 신경즐기세포 내 발현하는 VEGF는 이러한 이주에 관여한다고 알려져 있다 (Neuron. 70， 687-702 , 2011； J Neurosci . 29， 8704-8714, 2009； J Neurosci Res . 88 , 248-257, 2010) .
NP-C마우스의 SVZ 내 VEGF가 발현이 감소된 신경줄기세포의 이주 패턴을 확 인해 보기 위해， 정상 및 NP-C 마우스의 SVZ에 신경줄기세포 표지 형광 물질인 MPI0를 주입하였다 (도 2a) . 7일 후， 정상 마우스의 MPI0 표지된 신경줄기세포는 RMS와 0B에 많이 존재하는 반면， NP-C 마우스의 신경줄기세포는 Thalamus에 많이 존재하는 것을 확인하였으며， 21일 후 NP-C 마우스의 신경줄기세ᅳ포는 Thalamus에 더 많이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2b , *p<0.05, **p < 0.01 , ***p<0.001. n= 6 per group) . 즉， 정상적인 상태에서는 SVZ 내 신경줄기세포가 RMS와 0B로 많이 이주하고 thalamus로는 거의 이주를 하지 않는 것에 반해， NP-C 마우스의 SVZ 내 VEGF 발현 이 감소된 신경줄기세포는 RMS와 0B로는 많이 이주하지 않고， thalamus로의 비정상 적인 이주를 한다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
SVZ화경의 손상이 뇌 저체의 염증반웅 및 콜레스테를. 리피드 축적에 미치 는 영향
SVZ 환경에 존재하는 신경줄기세포의 손상이 뇌 전체의 염증반웅에 미치는 영향을 확인하기 위해 4주령의 NPCii , VEGFfl/f l 마우스의 SVZ에 캐뉼라를 장착하여 도 3a 에서와 같이 매일 총 4주간 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 주입하였다. 즉， (i) NPCfl/n 마우스의 SVZ에 GFAP/CD133 split-cre를 주입함으로써, SVZ에 존재하는 신경줄기세포에서 NPC1이 발현하지 못하도록 하였고, 또는 (ii) VEGFn/fl 마우스의 SVZ에 GFAP/CD133 split-cre를 주입함으로써， SVZ에 존재하는 신경줄기세포에서 VEGF가 발현하지 못하도록 한후 나타나는 병리학적 변화를 관찰해 보았다. 그 결과 도 3b와 3c에서 나타난 바와 같이， SVZ에 존재하는 신경줄기세포에 서 NPC1 또는 VEGF의 발현올 저해한 마우스의 SVZ 환경 내 존재하는 신경줄기세포 들의 생존를이 감소하고 염증반웅이 현저히 증가한 것을 확인하였다 (GFAP: astrocyte, Ibaᅳ 1: microglia. *p < 0.05, ***ρ<0.001, η = 6 per group) .
이러한 SVZ의 문제로 인한 NPC 또는 VEGF 발현이 감소된 신경줄기세포는 Thalamus로의 비정상적인 이주를 보였다 (도 3d와 3e, **p < 0.01, ***p<0.001, n - 6 per group) .
NPC ^는 VEGF 발현이 감소된 신경줄기세포의 비정상적인 Thalamus로의 이주 는 Thalamus와 cortex의 염증반웅도 증가시켰으며 (도 3e), NP-C 마우스의 주요한 병인학적인 패턴인 콜레스테를， 리피드 축적 또한 증가시킨다는 것을 확인하였다 ( 도 3f와 3g, GFAP: astrocyte, Iba— 1: microglia. *p < 0.05, **p < 0.01. n = 6 per group) . 상기 결과로부터, SVZ 환경이 손상되면 SVZ 환경 내에 존재하는 신경줄기세 포들의 생존률이 감소하고， NPC 또는 VEGF의 발현이 감소된 신경줄기세포의 thalamus로의 비정상적인 이주를 야기하며， 이로 인해 Thalamus의 염증반응이 증가 하고 더 나아가 cortex의 염증반웅과 콜레스테롤， 리피드 축적이 유도 된다는 것을 알 수 있었다. 따라서， 이는 SVZ환경의 손상이 뇌 전체에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
<실시예 5>
SVZ화경의 손상이 감각 및 운동 능력에 미치는 영향
SVZ 환경 손상으로 인한 뇌 전체의 염증반응 및 콜레스테롤, 리피드 축적이 감각 및 운동 능력에 영향을 주는지 확인하기 위해， SVZ에 GFAP/CD133 split-cre를 총 4주간 주입 받은 NPC""1, VEGFn/fl 마우스를 감각 능력 테스트인 Hot-plate, Tai l-f l i ck 테스트와 운동 능력 테스트인 Open f ield, Rota-rod, Beam 테스트를 실 시하였다.
그 결과， SVZ 환경이 손상된 마우스들은 감소된 감각 기능과 운동 능력을 보 였다 (도 4a와 4b, *p < 0.05 , **p < 0.01. n = 10-13 per group) . 상기 결과로부터, SVZ 환경 손상으로 인한 뇌 전체의 염증반응 및 콜레스테 롤， 리피드 축적은 감각 및 운동 능력을 감소시킨다는 것을 알수 있었다.
<실시예 6>
NP-C마우스의 손상된 SVZ환경의 개선을 통한 염증반응 완화
NP-C마우스의 경우 SVZ에 존재하는 신경줄기세포에서 VEGF의 발현이 감소되 어 있었기 때문에， 손상된 SVZ환경에서 VEGF증가를 통하여 뇌 전체의 염증반응을 완화 시켜줄 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 도 5a에 나타난 바 와 같이 정상신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄세포， VEGF를 과발현하는 백 터를 주 2회， 총 4주간 NP-C마우스의 SVZ에 주입하였다.
도 5b의 결과에서 NP-C마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입하였을 경우에만 감소된 신경줄기세포들의 생존률이 상승하는 것을 확인하였다 Op < 0.05, ***p < 0.001. n = 6 per group) .
도 5c와 5d의 결과에서 NP-C마우스의 SVZ환경과 thalamus , cortex의 염증반 응이 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입하였을 경우에만 감소하는 것을 확인 하였다 (GFAP: astrocyte , Iba-1 : microgl ia. **n=6pergroup) ·이는 정상 신경줄기 세포를 주입한 경우 NP-C 마우스의 SVZ에 감소된 VEGF를 높여주기에 불층분 하다는 것을 알 수 있으며， 또한 VEGF를 과발현 하는 백터의 경우 신경줄기세포 특이적으 로 VEGF를 높여주지 못하기 때문에 염증반웅을 완화시키기 불충분 하다는 것을 알 수 있다. ᅳ
뿐만 아니라, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포는 NP-C마우스의 SVZ 내 신경 줄기세포의 Thalamus로의 비정상적인 이주를 완화시켰다 (도 5e와 5f , ***n=6pergroup) . 따라서 NP-C마우스의 SVZ 환경을 개선시키기 위해서는， 감소된 VEGF를 충분 히 개선 시켜줄 수 있는 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 SVZ에 주입하였을 때에 신경즐기세포의 비정상적인 이주를 개선시켜줄 수 있으며, .동시에 뇌 전체의 염증 반웅을 개선시킬 수 있다는 것을 알수 있었다.
<실시예 7>
NP-C마우스의 손상된 SVZ 환경의 개선을 통한 콜레스테롤 축적 완화
NP-C 마우스의 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선 이 NPC 마우스의 주요한 병인학적인 패턴인 콜레스테를， 리피드 축적을 개선시켜줄 수 있는지 확인하기 위해， 정상 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포， VEGF를 과발현하는 백터를 주입받은 NP-C 마우스의 cortex 부위를 filipin 염색하 여 콜레스테를 축적 정도를 확인하였다. 도 6a와 6b에 나타난 바와 같이 SVZ환경에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 를 주입 받은 NP-C마우스의 cortex에 축적된 콜레스테를이 감소하였으며 리피드 축적 또한 감소하는 것을 확인하였다 Op < 0.05, **p < 0.01, ***p<0.001, n = 6 per group), 상기 결과로부터， VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선이 뇌 전체의 콜레스테를， 리피드 축적을 감소시켜즐 수 있다는 것을 알수 있 었다.
<실시예 8> _
NP-C마우스의 손상된 SVZ환경의 개선을 통한 감각 및 운동 능력 개선
NP-C 마우스의 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선 이 NP-C마우스의 감소된 감각 및 운동 능력을 개선시켜즐 수 있는지 확인하였다. 도 7a와 7b의 감각 능력 테스트인 Hot-plate, Tail-flick 테스트와 운동 능 력 테스트인 Open field, Rota-rod, Beam 테스트를 통해 SVZ환경에 VEGF를 과발현 하는 신경즐기세포를 주입 받은 NP-C 마우스의 감각 및 운동 능력이 개선된 것을 알 수 있었다 (*P < 0.05. **p < 0.01, ***p<0.001, n = 10-12 per group). 뿐만 아니라， NP-C 마우스의 생존률 또한 증가하는 것을 확인하였다 (도 7c， **p < 0.01， n = 10-12 per group).
상기 결과로부터， VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선이 뇌 전체의 콜레스테를， 리피드 축적을 감소시켜 감각 및 운동 능력 개선과 생존률올 증가시키는 것올 알 수 있었다. 따라서 상기 결과들로부터， SVZ환경의 개선이 뇌 전체에 영향을 줄 수 있다 는 것을 알 수 있으며， 특히 NP-C마우스의 SVZ에서 감소된 VEGF는 신경줄기세포에 특이적으로 VEGF를 높여 주었을 때에만 SVZ환경을 개선시킬 수 있었으며， 이는 뇌 전체의 염증 반웅과 콜레스테를 및 리피드 축적, 감각， 운동능력을 개선시켜 줄 수 있다는 것을 알수 있었다.
<실시예 9>
NP-C마우스의 손상된 SVZ 환경의 개선을 통한소뇌 환경 개선
NP-C 마우스의 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선 이 NP-C 마우스의 소뇌 환경 또한 개선시켜 줄 수 있는지 확인하였다. 또한 이러한 SVZ교정에 의한 소뇌 환경 개선 효과를 VEGF mi crosphere의 직접적인 소뇌 이식의 효과와 비교하였다.
도 8a에서 SVZ환경에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받은 NP-C마 우스는 소뇌 신경세포 (Purkinj e neuron , PNs)의 감소가 완화되는 것을 확인하였 다. 이는 VEGF mi crosphere의 직접적인 소뇌 이식보다 더 많은 소뇌 부위에서 우수 한 완화 효과를 보였다. 도 8b에서 소뇌 염증반웅 또한 VEGF를 과발현하는 신경줄 기세포를 주입 받은 NP-C 마우스에서 더 효과적으로 개선되었으며， 도 8c에서 소뇌 리피드 축적 감소에도 더 우수한 효과를 보였다 (*p < 0.05. n = 3 per group) . 도 8d에서 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 의한 SVZ교정은 VEGF mi crosphere의 직접적인 소뇌 이식보다 더 효과적으로 운동 기능을 향상시켰다 (*p < 0.05. n = 7 per group) . 따라서， NP-C 마우스의 SVZ 내 신경줄기세포 특이적인 VEGF를 증가시킴으로 써 SVZ 환경 개선을 통해 소뇌 환경 또한 개선시켜 줄 수 있으며， 이는 SVZ 환경의 개선이 NP-C 마우스의 병인을 완화 시키는데 중요하다는 것을 나타낸다. 특히， 직 접적인 소뇌의 VEGF 증가보다 SVZ 환경개선이 더 효과적으로 병인을 완화시켜줄 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
혈관내피성장인자 (VEGF)가 과발현된 즐기세포의 유효량을 이를 필요로 하는 개체의 뇌실하 영역 (Subventricular zone, SVZ)에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴 행성 신경질환 예방또는 치료 방법.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포， 배아줄기세포, 중간엽 줄기 세포， 종양 줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이 상인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 3】
겨 12항에 있어서， 상기 성체줄기세포는 신경즐기세포 또는 신경전구세포인 것 을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 퇴행성 신경질환은 니만픽병， 알츠하이머， 파킨슨병, 루게릭병, 조현병 (schizophrenia) , 고셔 (Gaucher )병 , 파브리 (Fabry)병 , 테이색스 (Tay-Sachs)병, 샌드호프 (Sandhoff )병 및 소뇌실조증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 줄기세포는 뇌의 염증을 감소시키고， 콜레스테롤 또는 스핑고지질의 축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 6】
퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 혈관내피성장인자 (VEGF)가 과발현된 줄기세포의 용도.
【청구항 7】
혈관내피성장인자 (Vascular endothel ial growth factor , VEGF)가 과발현된 효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조
PCT/KR2017/001216 2016-02-05 2017-02-03 혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2017135753A1 (ko)

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