KR20160008987A

KR20160008987A - 뇌신경계 질환 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물

Info

Publication number: KR20160008987A
Application number: KR1020150100059A
Authority: KR
Inventors: 김치화; 조성국; 김현아; 권수현; 유민주; 윤성태; 이재현; 황유경
Original assignee: 주식회사 녹십자랩셀; 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2014-07-15
Filing date: 2015-07-14
Publication date: 2016-01-25
Also published as: KR101741182B1

Abstract

본 발명은 유전자 이상에 의해 발병하는 뇌신경계 질환의 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물은 비강내 투여시 헌터증후군의 원인이 되는 유전자인 IDS를 치료용 물질로 줄기세포에서 발현시켜 효과적으로 뇌로 전달하였으며, 뇌에 존재하는 GAG를 분해시킬 수 있었다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 비강내 투여용 조성물은 유전자 이상에 의해 발병하는 헌터증후군, 멘케스증후군, 렛트증후군 등의 뇌신경계 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

뇌신경계 질환 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물{INTRANASAL COMPOSITION COMPRISING STEM CELLS EXPRESSING A SUBTANCE FOR TREATING BRAIN-NERVOUS SYSTEM DISEASES}

본 발명은 뇌신경계 질환 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 이상에 의해 발병하는 뇌신경계 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 물질을 발현하는 줄기세포를 뇌에 전달함으로써 헌터증후군(Hunter syndrome), 멘케스증후군(Menkes syndrome) 및 레트증후군(Rett syndrome) 등을 포함하는 뇌신경계 질환의 치료 또는 증상 개선에 사용할 수 있는 비강내 투여용 조성물에 관한 것이다.

중추신경계(Central Nervous System, CNS)는 뇌와 척수를 포함하는 신경계로서 말초신경계(Peripheral Nervous System, PNS)와 함께 신체 기작과 행동을 제어하는 중요한 역할을 한다. 중추신경계 질환으로는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성측삭경화증(루게릭병, ALS, Amyotrophic Lateral Sclerosis), 뇌졸중(Stroke), 척수손상(Spinal cord injury) 등이 있다. 또한, 중추신경계 질환으로 분류되지 않는 유전자 변이(genetic mutation)가 발병 원인인 뇌신경계 희귀 질환이 다수 존재하며 효과적 치료약물의 개발을 필요로 한다. 유전자 변이가 원인인 뇌신경계 희귀 질환에는 헌터증후군, 멘케스증후군, 레트증후군 등이 속해 있다.

헌터증후군 또는 제2형 점액다당질증(mucopolysaccharidosis type II)은 이듀로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase; IDS)의 결핍으로 인해 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)과 같은 뮤코다당체가 분해되지 못하여 리소좀 내에 축적되는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage diseases, LSD) 중 하나이다. GAG는 신체의 모든 세포 내에 축적되어 여러 가지 증상을 초래하는데, GAG는 뇌신경세포의 라이소좀에도 축적되어 신경계 이상과 발달 지연이 초래될 수 있다.

멘케스증후군은 구리 이온의 전달체인 ATP7A 유전자의 변이가 원인이 되어, 구리의 대사과정에 장애가 생겨 구리 결핍 및 구리의존 효소의 기능에 문제가 발생하는 질병이다. 꼬인 머리카락과 퇴행성 신경장애 등이 대표 증상이며, 뇌신경계에서 변이된 ATP7A는 혈관을 통하여 이동된 Cu⁺² 이온을 뉴론(neuron)으로 원활하게 전달하지 못해 혈관세포에는 구리가 축적되고, 뇌신경세포에는 구리의 결핍이 일어나게 된다. 현재 치료법은 히스티딘과 구리이온을 이용하여 구리 결핍을 완화시킬 뿐 근본적 치료법이 없다.

레트증후군은 MECP2(methyl CpG binding protein 2)의 돌연변이가 원인으로, 정상 MECP2는 메틸화 프로모터(methylated promotor)의 전사를 특이적으로 억제하여 신경의 발달 및 생존 등에 관련된 유전자들의 발현을 조절하지만, 레트증후군은 이러한 전사억제가 조절되지 않아 신경발달에 이상이 생기게 된다. 현재 근본적인 치료방법은 없다.

위와 같은 뇌신경계 질환의 성공적인 치료를 위해서는 약물을 뇌신경계에 효율적으로 전달하는 것이 매우 중요하다. 그러나, 뇌신경계 조직이 단단한 두개골(skull)과 혈액뇌장벽(BBB, blood brain barrier)으로 둘러싸여 있기 때문에 치료 약물의 전달 효율이 매우 낮다. 또한 기존의 일반적인 약물 투여 방법인 정맥 또는 동맥투여의 경우 환부에 필요한 약물보다 많은 양의 약물 투여가 필요하고 이에 따른 부작용을 수반하는 문제점이 있다.

한편, 뇌에 약물을 주입하기 위한 방법으로 사용될 수 있다고 알려진 척수강내(intrathecal) 또는 뇌실내(intraventricular 또는 intracerebroventricular) 투여는 환부에 국소적 투여는 가능하지만, 침습적 방법의 단점인 시술의 어려움, 환자에게 높은 위험성, 반복투여가 용이하지 않은 한계점이 있다 (Li YH et al., Experimental and Molecular Pathology, 2015 Apr;98(2):145-51).

헌터증후군의 경우, 질환을 치료하기 위하여, 골수 이식방법, 효소 보충방법 및 유전자 요법 등이 다양하게 시도되어 왔다. 골수 이식방법은 해당 질환의 증상은 현저히 개선되지만 환자와 조직적합항원(HLA, human leukocyte antigen)이 맞는 대상을 구하기 어려운 단점이 있다. 유전자 요법은 정상적인 IDS 유전자를 아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스 또는 비바이러스성 벡터를 이용하여 체내로 주입하는 방법으로, 현재 실험적인 수준에 머물고 있을 뿐, 임상적으로 사용되고 있지는 못하다. 효소 보충방법은 외부에서 생산된 IDS를 체내에 투여하는 방법으로, 투여방법이 간단한 장점이 있지만 지속적으로 효소를 투여해야 하므로 치료 비용이 많이 소요되는 단점이 있으며, 현재 미국 FDA의 승인을 받은 엘라프라제(Elaprase^®; Shire Pharmaceuticals Group) 및 국내 식약처 허가를 받은 헌터라제(Hunterase^®; 녹십자)가 시판 중에 있으며, 두 약물 모두 정맥주사로 투여하고 있다. 그러나 정맥내로 투여된 IDS는 혈액뇌장벽(BBB)을 통과하지 못하여 인지능력 및 뇌질환 개선 치료 효과를 볼 수 없는 제한적인 단점이 있다. 따라서, IDS를 CNS에 효과적으로 전달할 수 있는 새로운 조성물의 개발이 요구된다.

이러한 목적을 달성하기 위한 종래의 시도로 BBB를 통과하여 뇌로 들어가는 항체를 개발하였다. 이는 뇌질환을 치료하는 항체기반 요법에 근거한 것이다. 그러나 지금까지 만들어진 항체 중 BBB를 통과하는 것은 거의 없었다. BBB는 뇌를 혈류 중의 병원체로부터 보호해주는 장벽이지만 대부분의 약물분자가 뇌로 들어가는 것을 막기 때문이다. 뇌 안의 항체 농도는 혈류 중의 항체 농도보다 약 1,000배 낮다고 한다. BBB 통과 항체 연구는 또한 항체공학의 기본적인 원칙에 도전이 필요하다. 항체와 수용체 간의 상호작용 강도를 친화성(affinity)이라고 하는데 친화성이 높으면 높을수록 상호작용은 강해진다. 대부분의 항체 설계자들은 최고의 친화성을 가진 항체를 만들려고 노력하였다. 그러나 대부분의 항체가 뇌혈관에 결합한 채 그 조직을 관통하지 못하였다.

최근, 중추신경계 질환에서 단백질 약물 또는 줄기세포 등을 비강내로 주입하면 혈액뇌장벽을 우회하여 후각기관(olfactory)과 3차 신경계 통로(trigeminal neural pathways)를 통해 비침습적 방법으로 뇌에 전달할 수 있다는 것이 알려졌다. 이는 뇌에 효율적으로 치료물질을 전달할 수 있고 전신에 약물이 노출되어 생기는 부작용을 감소시킬 수 있는 방법으로 유용하다. 이러한 장점을 이용하여 뇌종양, 뇌척수염등의 치료를 위해 줄기세포를 비강을 통해 뇌로 주입하는 연구들이 보고된 바 있다. 예를들어, 뇌척수염 동물 모델에서 신경줄기세포를 비강내로 주입했을 때, 1일 후에 신경조직으로 이동하며, 이는 신경줄기세포를 정맥 투여하면 신경조직으로 이동하는데 21일 이상이 걸리는 것과 비교했을 때 매우 효과적인 결과를 보여준다(Shuai Wu et al., Journal of Clinical Cell Immunology, 2013 Jun 1;4(3) 및 Balyasnikova IV et al., Molecular Therapy, 2014 Jan;22(1):140-8). 또한 파킨슨병 마우스모델에서 중간엽줄기세포를 비강투여한 결과 기존 약물들의 전달이 어려웠던 뇌신경계의 심층부인 소뇌편도(amygdala), 해마회(hippocampus)와 같은 조직까지 세포가 이동하여 치료효과를 보이는 연구 결과도 보고된 바 있다 (Li YH et al., Experimental and Molecular Pathology, 2015 Apr;98(2):145-51). 따라서, 비강내 투여를 이용하여 뇌로 치료물질을 전달 하는 것은 기존 침습적 방법에 비하여 상대적으로 반복투여가 용이한 이점이 있다. 뇌신경계에 줄기세포를 포함한 다양한 치료물질의 효율적 전달이 가능한 방법으로 CNS 질환의 약물 전달에 매우 유용한 방법이 될 수 있다.

한편, 대표적인 CNS 질환인 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease)등의 치료를 위한 유전자조작 줄기세포의 연구 및 임상이 진행되었다. 예를 들어, 파킨슨 질병모델 래트(Rat)에 레트로바이러스(retrovirus)를 통해 GDNF(glial derived neruotrophic factor)를 발현하는 중간엽줄기세포 (MSC)를 줄무늬체(striatum)에 이식했을 때, 이식한 MSC 주변의 도파민 뉴런 말단이 스푸라우팅(sprouting)되는 것이 알려져 있으며(Moloney, T.C. et al., Brain Research, 2010), 8명의 알츠하이머병 환자에게 NGF(nerve growth factor)를 발현하는 자가 섬유아세포(fibroblast)를 전뇌(forebrain)에 이식하는 임상 1상도 실시된 바 있다(Tuszynski, M.H. et al., Nature Medicine, 2005). 그러나 위 예시의 줄기세포는 모두 침습적 방법으로 이식되었다.

현재까지 헌터증후군, 멘케스증후군, 레트증후군 등 유전자 이상에 의해 발병되는 뇌신경계 희귀 질환에서 유전자조작 줄기세포를 비강내로 투여하여 치료 및 기능 개선 효과를 확인한 예는 알려진 바 없다.

Li YH et al., Experimental and Molecular Pathology, 2015 Apr;98(2):145-51 Shuai Wu et al., Journal of Clinical Cell Immunology, 2013 Jun 1;4(3) Balyasnikova IV et al., Molecular Therapy, 2014 Jan;22(1):140-8 Moloney, T.C. et al., Brain Research, 2010 Tuszynski, M.H. et al., Nature Medicine, 2005

본 발명자들은, 유전자 변이가 원인이 되는 뇌신경계 희귀 질환의 효과적인 세포/유전자 치료 방법을 연구하던 중, NSC의 비강 내 투여를 실시하여 14일 이상까지 뇌조직 내에 전달된 NSC 세포가 생존하여 장기간 머무르는 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 하여 유전자 변이에 의한 뇌신경계 질환에 정상 유전자를 발현하는 줄기세포를 비강내로 주입하여 뇌신경조직에서 치료효율을 보일 수 있는 세포조성물에 관한 발명을 착안하였다. 앞서 설명한 것처럼, 약물 및 세포를 비강내 투여로 뇌에 전달할 수 있음은 이미 밝혀져 있지만, 치료물질을 발현하는 줄기세포를 비강내로 투여하여 헌터증후군 등 유전자변이에 의한 뇌신경계 희귀 질환에서 효율을 확인한 것은 아직 알려진 바 없다. 따라서, 본 발명은 뇌신경계 질환 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 주된 목적은 유전자 변이가 원인이 되어 발병하는 뇌신경계 질환 치료에 적용할 수 있는 정상 유전자를 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전자 변이에 의해 발병되는 뇌신경계 희귀 질환 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물을 제공한다.

본 발명은 유전자 변이에 의해 발병되는 뇌신경계 희귀 질환 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물을 이용함으로써, 질환 치료용 물질을 중추신경계에 전달시켜 전달된 물질이 뇌에서 치료효과를 발휘하는데 유용하게 사용될 수 있다.

바람직하게는 IDS를 발현하는 줄기세포를 비강내로 투여하여 뇌에서 발현된 IDS가 뇌에 존재하는 GAG를 분해시킬 수 있는 바, 헌터증후군을 포함한 뇌신경계 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 신경줄기세포(NSC)의 비강내 투여 3일후(P3) 및 14일후(P14)의 뇌조직의 NSC를 확인한 사진이다.
도 2는 유전자 발현 벡터 pcDNA3.1-IDS-RFP(상단)와 pCMV-ATP7A-GFP(하단)의 발현 부위의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 pcDNA3.1-IDS-RFP 벡터로 형질감염된 HEK293 세포에서의 RFP 단백질의 발현을 형광 현미경을 이용하여 관찰한 사진이다.
도 4는 pcDNA3.1-IDS-RFP 벡터로 형질감염된 HEK293 세포에서의 IDS 단백질의 발현량(IDS-RFP_1 및 IDS-RFP_2)과 형질감염되지 않은 HEK293 세포에서의 발현량(no transfection)을 ELISA에 의해 비교한 결과이다.
도 5는 리포펙타민을 이용하여 pcDNA3.1-IDS-RFP 벡터로 형질감염된 huBM-MSC 세포(3 x 10⁵ 세포 및 6 x 10⁵ 세포)에서의 G418 선별 전 및 후의 IDS 단백질의 발현량을 ELISA에 의해 측정한 결과이다.
도 6은 전기천공법에 의해 pcDNA3.1-IDS-RFP 벡터로 형질감염된 huBM-MSC 세포에서의 IDS 단백질의 발현량을 마우스 한마리에 투여된 IDS 총 단백 함량을 ELISA에 의해 측정한 결과이다.
도 7은 전기천공법에 의해 pcDNA3.1-IDS-RFP 벡터로 형질감염된 huBM-MSC 세포에서의 RFP 단백질의 발현을 형광현미경과 FACS 분석을 통해 확인하고 세포의 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 IEM 비강내 투여에 따른 뇌조직 내 IEM 존재를 MSC 마커와 RFP 항체로 면역염색하여 관찰한 사진이다.
도 9는 IEM 비강내 투여에 따른 olfactory bulb에서의 IEM 존재를 RFP 형광으로 관찰한 사진이다.
도 10은 마우스에 huBM-MSC 세포를 비강내 투여한 후, 뇌를 적출하여 CD105로 조직염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(#1: 1번 마우스, #2: 2번 마우스).
도 11은 본 발명에 따른 단기 효능 시험의 스케줄을 나타낸 것이다.
도 12는 PBS를 비강 투여한 야생형(WT) 마우스, PBS를 비강 투여한 넉아웃 마우스, huMSC 자체를 비강 투여한 넉아웃 마우스 및 IEM(IDS-expressed MSC) 비강 투여한 넉아웃 마우스 그룹에서 소변(A), 뇌(B) 및 간(C)에서의 GAG 함량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 PBS를 비강 투여한 야생형(WT) 마우스, PBS를 비강 투여한 넉아웃 마우스, huMSC 자체를 비강 투여한 넉아웃 마우스 및 IEM(IDS-expressed MSC) 비강 투여한 넉아웃 마우스 그룹에서 뇌 조직 내의 GAG를 특이적으로 염색하는 alcian blue 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 PBS를 비강 투여한 야생형(WT) 마우스, PBS를 비강 투여한 넉아웃 마우스, huMSC 자체를 비강 투여한 넉아웃 마우스 및 IEM(IDS-expressed MSC) 비강 투여한 넉아웃 마우스 그룹에서 뇌 조직내의 MSC를 CD105 마커로 조직염색 한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 장기 효능 시험의 스케줄을 나타낸 것이다.
도 16은 PBS를 비강 투여한 야생형(WT) 마우스, PBS를 비강 투여한 넉아웃 마우스, huMSC 자체를 비강 투여한 넉아웃 마우스 및 IEM(IDS-expressed MSC) 비강 투여한 넉아웃 마우스 그룹에서 소변(A), 뇌(B) 및 간(C)에서의 GAG 함량을 나타낸 그래프이다.
도 17은 PBS를 비강 투여한 야생형(WT) 마우스, PBS를 비강 투여한 넉아웃 마우스, huMSC 자체를 비강 투여한 넉아웃 마우스 및 IEM(IDS-expressed MSC) 비강 투여한 넉아웃 마우스 그룹에서 뇌 조직 내의 GAG를 특이적으로 염색하는 alcian blue 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 PBS를 비강 투여한 야생형(WT) 마우스, PBS를 비강 투여한 넉아웃 마우스, huMSC 자체를 비강 투여한 넉아웃 마우스 및 IEM(IDS-expressed MSC)를 비강 투여한 넉아웃 마우스 그룹에서 뇌 조직의 CD105 조직염색 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 뇌신경계 질환의 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 뇌신경계 질환의 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는 비강내 투여용 조성물을 포함하는, 뇌신경계 질환의 치료용 줄기세포 치료제를 제공한다.

상기 질환은 유전자 이상에 의해 발병하는 뇌신경계 희귀 질환일 수 있다.

상기 질환은 헌터증후군(Hunter syndrome), 멘케스증후군(Menkes disease), 레트증후군(Rett syndrome), 테이-삭스병(Tay-Sachs Disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 헐러증후군(Huler syndrome), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden Spatz syndrome), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy) 또는 크라베병(Krabbe disease)일 수 있고, 바람직하게는 헌터증후군 또는 멘케스증후군일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 헌터증후군일 수 있다.

상기 유전자는 이듀로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase; IDS) 유전자, ATP7A 유전자, MECP2(methyl CpG binding protein 2) 유전자, BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor) 유전자, HEXA(lysosomal beta-N-acetylhexosaminidase A) 유전자, SMPD1 (Sphingomyelin phosphodiesterase 1) 유전자, 알파-L-이듀로니다제(alpha-L-iduronidase, IDUA) 유전자, 판토테네이트 카이네이즈 2(pantothenate kinase 2, PANK2) 유전자, 아릴설파타제 A(Arylsulfatase A) 유전자 또는 GALC(Galactosylceramidase) 유전자일 수 있고, 바람직하게는 IDS 유전자 또는 ATP7A 유전자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 IDS 유전자일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "이듀로네이트-2-설파타제" 또는 "IDS"는 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 및 데르마탄 설페이트(dermatan sulfate)의 분해에 관여하는 효소로서, 본 발명에서는 결핍시 헌터증후군 또는 제2형 점액다당질증(mucopolysaccharidosis type II)을 유발할 수 있는 효소를 지칭한다.

또한, 본 명세서에 사용된 용어 "IEM(IDS-expressed MSC)"은 IDS를 발현하는 간엽줄기세포를 지칭하며, 특히 IDS 발현벡터로 형질전환되어 IDS를 발현하는 간엽줄기세포를 지칭한다.

상기 줄기세포는 간엽 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 혈관내피전구세포 또는 신경 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 간엽 줄기세포는 골수, 지방, 탯줄 또는 제대혈 유래 간엽 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 인간 골수 유래 간엽줄기세포(huBM-MSC)일 수 있다.

상기 줄기세포는 유전자 이상에 의해 발병하는 뇌신경계 질환의 치료용 물질이 되는 정상 유전자를 항시적으로 발현하도록 IDS 유전자, ATP7A 유전자, MECP2 유전자, BDNF 유전자, HEXA 유전자, SMPD1 유전자, IDUA 유전자, PANK2 유전자, 아릴설파타제 A 유전자 또는 GALC 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질감염될 수 있고, 바람직하게는 IDS 유전자 또는 ATP7A 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질감염될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 IDS 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질감염될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "IDS 발현벡터" 및 "ATP7A 발현벡터"는 각각 IDS 유전자 및 ATP7A 유전자를 포함하는 벡터로서, 예를 들면 포유동물에서 표적 단백질을 발현하는 것으로 알려진 통상의 발현 벡터(예컨대, pcDNA3.1, pCMV6-Entry)의 적절한 제한효소 부위에 IDS 또는 ATP7A 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 "IDS 발현벡터" 및 "ATP7A 발현벡터"는 각각 "pcDNA3.1-IDS-RFP" 및 "pCMV-ATP7A-GFP"일 수 있다. 상기 pcDNA3.1-IDS-RFP 및 pCMV-ATP7A-GFP는 각각 IDS 및 ATP7A를 인코딩하는 뉴클레오타이드와 각각 RFP(red fluorescent protein) 및 GFP(Green fluorescent protein)를 인코딩하는 뉴클레오타이드가 융합된 단편을 포함한다. 상기 벡터에서 IDS 또는 ATP7A의 발현 여부가 RFP 또는 GFP에 의한 형광에 의해 확인될 수 있는바, 상기 벡터는 본 발명에 따른 조성물의 투여시 세포의 이동을 관찰하는데 유용하다.

본 발명에 따른 줄기세포는 통상적인 바이러스성 또는 비바이러스성 형질감염 방법, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터(Lentviral vector), 레트로바이러스 벡터(Retroviral vector), 리포좀(liposome), 양이온성 중합체(cationic polymer) 또는 전기천공법(electroporation)을 이용한 형질감염에 의해 발현벡터로 형질감염될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 줄기세포는 전기천공법을 이용하여 발현벡터로 형질감염될 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 비강내 투여용 조성물에 유효성분으로 포함되는 "IDS를 발현하는 간엽줄기세포"는 뇌로 전달되어 뇌 GAG를 감소시킴으로써 헌터증후군을 치료하는데 효과적이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복투여될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 비강내 줄기세포 투여 효율 확인 및 투여용 유전자 발현 벡터 제조

<1-1> 신경줄기세포(NSC)의 비강내 투여에 따른 뇌조직 내 세포 확인

형광표지자(qtracker 525)를 함유하는 NSC의 비강내 투여(IN administration) 에 따른 뇌조직에서의 이동 및 세포의 잔존을 확인하였다. 야생형(WT) 마우스(n=6)에 NSC를(10ul / 1X10⁵/ul) 비강내 투여하고, 3일 후(n=3)와 14일 후(n=3)에 동결절편을 제작하여 형광현미경으로 세포를 관찰하였다. 상기 결과는 도 1에 나타내었다. NSC 비강내 주입 3일 후, olfactory bulb와 frontal lobe 부분에서 NSC가 존재하는 것을 확인 하였으며, 주입 후 14일 이상 뇌조직 내에 형광표지로 확인할 수 있는NSC를 확인하였다.

<1-2> IDS 및 ATP7A 유전자 발현 벡터의 제조

헌터증후군의 치료 유전자로서, IDS 유전자와 RFP(Red fluorescent protein) 유전자가 융합된 형태로 발현하는 코딩 서열을 합성하여 pcDNA3.1 벡터에 NheI 과 XhoI 제한 효소 site 를 이용하여 클로닝하였다.

멘케스증후군의 치료 유전자로서, ATP7A 유전자가 GFP(Green fluorescent protein)유전자와 융합된 형태로 발현하는 코딩서열을 pCMV6-Entry 벡터에 SgfI 과 MluI 제한 효소 site를 이용하여 클로닝한 벡터를 구입하여 사용하였다(Origene).

각 벡터의 RFP 또는 GFP 형광표지를 이용하여 세포 내 발현 확인이 가능하도록 제조되었다(도 2). 상기 제조된 벡터를 각각 "pcDNA3.1-IDS-RFP" 및 "pCMV-ATP7-GFP"로 명명하였다.

실시예 2: IDS 발현벡터로 형질감염된 HEK293 세포주에서의 IDS 발현

HEK293 세포 스톡(KCLB cat #21573)을 37℃ 수조에서 녹인 후, 이를 37℃의 10 mL의 배양 배지(DMEM + 10% FBS)에 넣었다. 상기 혼합물을 1,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 얻어진 세포 펠렛을 12 mL의 배양 배지에 재현탁시켰다. 상기 현탁액을 T75 플라스크에 넣은 다음 배양하였다. 이때 2~3일 간격으로 확인하여 컨플루언시가 90% 가량 되면 트립신-EDTA 용액으로 세포를 떼어낸 다음, 1:6~1:10의 비율로 계대 배양하였다.

형질감염 전날, 상기 배양된 HEK293 세포를 6-웰 플레이트에 1~6 x 10⁵ 세포/웰로 시딩하였다. 한편, 1.5 mL 튜브에 Opti-MEM^® I Reduced Serum Medium 125 uL(Gibco)와 리포펙타민^® 3000 형질감염 시약(Invitrogen) 3.75 uL를 넣고, 또 다른 1.5 mL 튜브에 Opti-MEM 125 uL, pcDNA3.1-IDS-RFP 2.5 ug 및 P3000 5 uL를 넣었다. 상기 두 튜브를 섞어준 다음 상온에서 5분간 방치하였다. 이후, 상기 혼합물을 HEK293 세포가 시딩되어 있는 6-웰 플레이트에 넣은 다음 배양하였다. 배양 2일째에 형광 현미경(올림푸스, IX51-F32PH)으로 RFP의 발현을 관찰하였다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, 대부분의 세포에서 RFP가 발현됨을 확인할 수 있었다.

또한, 배양 3일째에 HEK293 세포의 배양액으로부터 IDS 발현량을 ELISA로 분석하였다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, IDS 발현벡터로 형질감염된 세포에서 IDS가 약 10배 더 높게 발현됨을 확인할 수 있었다.

실시예 3: IDS 발현벡터로 형질감염된 인간 골수 유래의 MSC( huBM - MSC ) 세포에서의 IDS 발현

<3-1> 리포펙타민에 의해 형질감염된 huBM - MSC 세포에서의 IDS 발현 확인

형질감염 전날, 배양된 인간 골수 유래의 MSCs(P3, 2X10⁶, 1 mL) 세포를 6-웰 플레이트에 1~6 x 10⁵ 세포/웰로 시딩하였다. 한편, 1.5 mL 튜브에 Opti-MEM^® I Reduced Serum Medium 125 uL(Gibco)과 리포펙타민^® 3000 형질감염 시약(Invitrogen) 3.75 uL 넣고, 또 다른 1.5 mL 튜브에 Opti-MEM 125 uL, pcDNA3.1-IDS-RFP 2.5 ug 및 P3000 5 uL를 넣었다. 상기 두 튜브를 섞어준 다음 상온에서 5분간 방치하였다. 이후, 상기 혼합물을 HEK293 세포가 시딩되어 있는 6-웰 플레이트에 넣은 다음 배양하였다.

상기 형질감염된 MSC를 배양한 후, 배양액 내 IDS의 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 상기 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, G418 선별 전 3일째 배양액에서 14.26 ng/mL(3 x 10⁵ 세포) 및 21.31 ng/mL(6 x 10⁵ 세포)의 IDS가 발현되었음을 확인할 수 있다. 또한, G418 선별 후 IDS의 발현량이 감소되었는데, 이는 G418 선별에 의해 huBM-MSC 세포가 많이 사멸되어 발현량이 현저히 떨어짐을 보여준다.

<3-2> 전기천공법에 의해 형질감염된 huBM - MSC 세포에서의 IDS 발현 확인

상기 <3-1>에서 보는 바와 같이, 리포펙타민에 의해 형질감염된 huBM-MSC 세포에서의 IDS 발현량이 높지 않아 형질감염 방법을 전기천공법으로 바꾸었다.

인간 골수 유래의 MSCs(P3, 2X10⁶, 1 mL) 스톡(세포바이오(서린); Cat #: CB-BMMSC-003)을 질소탱크에서 꺼내어 37℃ 수조에서 5분간 해동하였다. 상기 세포를 15 mL 튜브에 넣은 다음, 10% FBS가 보충된 DMEM 배지 4 mL을 넣어 1,100 rpm에서 6분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 12 mL의 10% FBS DMEM을 넣어 세포 펠렛을 현탁시켰다. 상기 현탁된 세포를 T75 플라스크에 플레이팅한 후 2일간 배양하였다. 2일후 배양된 huBM-MSC의 배지를 제거한 다음, PBS 5 mL로 한번 세척하였다. PBS 제거 후, trypLE (Gibco) 1 mL 및 PBS 4 mL을 각 디쉬에 넣고 5-10분간 배양하였다. 떨어진 세포를 50 mL 튜브에 모아서 1100 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 제거한 후 PBS 10 mL을 넣고 잘 현탁시켰다. 현탁된 세포 40 uL를 추출하여 ADAM(Digital bio) 장비를 이용하여 세포 계수를 하고, 남은 세포는 다시 원심분리를 하였다. 원심분리 후, 상층액을 제거하고, 최종 세포 펠렛에 2x10⁶ / 20 ug pcDNA3.1-IDS-RFP (stock 1 ug/uL, IDS-RFP) / 100 uL(total volume, R버퍼)의 농도가 되도록 R버퍼와 DNA를 섞은 다음 약 15분간 배양하였다. 이후, Invitrogen사의 Neon(electroporator)을 이용하여 990 V/40 ms/1 pulse로 전기천공하여 huBM-MSC 세포를 형질감염시켰다. 10% FBS DMEM 10 mL에 잘 섞은 후 100 mm 디쉬에 플레이팅하였다.

상기 형질감염된 MSC를 배양한 후 IDS의 발현량을 1개월 단기효력(short-term) 및 3개월 장기효력(long-term)에서 측정하였다. 상기 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, 전기천공법에 의한 형질감염시 마우스 한마리당 투여된 huBM-MSC는 총 IDS 단백 함량 450ng 이상을 가짐을 확인하였다.

<3-3> 전기천공법에 의해 형질감염된 huBM - MSC 세포에서의 RFP 발현 확인

상기 실시예 <3-2>에서 형질감염된 huBM-MSC 세포의 배양액으로부터 IDS의 발현을 RFP를 형광 현미경으로 관찰하여 확인하였다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이, 형질감염된 huBM-MSC 세포에서 RFP가 발현되는 것을 확인하였다.

또한, RFP 발현량을 형광현미경과 FACS 분석을 통해 확인하고 세포의 생존률은 propidium-iodide(PI) 염색 후 ADAM세포수 측정기를 이용하여 분석하였다. 도 7 에서 보는 바와 같이, MSC세포에서 보이지 않는 RFP가 RFP를 도입한 MSC (IEM)에서는 관찰되는 것을 확인하였으며, 약 50% 이상의 도입 효율을 가지는 것을 볼 수 있다. 상기 결과들은 IDS 발현벡터로 형질감염된 간엽줄기세포가 IDS를 효과적으로 발현한다는 것을 보여준다.

실시예4 : IEM 비강내 투여에 따른 뇌조직 내 IEM 존재 확인

<4-1> 뇌조직 내 MSC 및 IEM 면역염색 확인

상기 실험에서 RFP 형광을 관찰한 동결절편을 MSC 마커(CD71, green)와 IDS-RFP의 RFP에 반응하는 항체로 면역 염색하였다. MSC만 주입한 군에서는 MSC만 면역염색 되었으며, IEM 군에서는 MSC와 RFP가 염색되었으며, 두개의 형광이 같은 위치에 있는 것을 확인하였다. 비강내 주입법으로 뇌조직에 전달된 세포에서 IDS-RFP가 정상적으로 발현되고 있음을 보여주는 결과이다. 상기 결과는 도 8로 나타내었다.

<4-2> 뇌조직내 RFP 형광확인

헌터증후군 모델 마우스에서 비강 내 주입을 통한 IDS발현 MSC(IEM)의 뇌 조직 내 존재를 확인하기 위하여, PBS, MSC, IEM을 각각 주입 한 후, 뇌조직을 적출하여 동결절편으로 RFP 형광을 관찰하였으며 상기 결과는 도 9에 나타내었다.

주입 하루 후 세포의 유무를 관찰 하였기 때문에 뇌 안쪽으로의 이동은 확인 되지 않았으나, olfactory bulb에서 RFP를 나타내는 세포들이 존재 하는 것을 확인할 수 있으며, 이 결과는 비강내 투여한 세포가 뇌로 이동하였고, 정상적으로 IDS 유전자를 발현하고 있다는 것을 보여준다(도 9).

실시예 5: huBM - MSC 세포의 마우스에의 비강내 투여에 따른 세포 이동 확인

간엽줄기세포의 비강내 투여에 따른 뇌로의 이동을 확인하기 위하여, huBM-MSC 세포를 PBS 중에 1x 10⁶ 세포/8ul로 준비하였다. 헌터증후군 모델 마우스를 포란으로 흡입 마취시킨 다음, 마우스의 한쪽 코에 상기 세포를 비강 주입하고, 10초간 마취 상태가 유지되도록 하였다. 비강내 투여된 huBM-MSC 세포가 뇌로 이동되는지를 확인하였다. 투여 4일째에 마우스의 뇌를 적출하여 인간 MSC 세포의 마커인 CD105로 조직염색을 수행하였다.

구체적으로, 적출된 뇌 조직을 15ml 튜브에 넣고 파라포름알데하이드를 채워 4℃에 24시간 동안 반응시켰다. JENIA사에 의뢰하여 파라핀 블록을 만들어 5 μm 두께로 절개하여 슬라이드를 제작하였다. 준비된 슬라이드를 자일렌 5분 - 자일렌 5분 - 자일렌 5분 - 100% EtOH 5분 - 95% EtOH 3분 - 90% EtOH 3분 - 85% EtOH 3분 - 80% EtOH 3분 - 70% EtOH 3분 - 60% EtOH 3분 - PBS 보관 순으로 순차적으로 처리하여 탈파라핀화하였다. PBS에 보관중인 슬라이드를 0.1 M 구연산나트륨 완충액(pH 6.0)에 넣고 전자레인지에서 가열하였다. 기포가 올라오면 끄고 5분간 식힌 후 다시 기포가 올라올 때까지 가열하였다. 이것을 3회 반복 하였다. 가열 처리한 조직을 DW로 3회 행군 후 0.1% 트리톤 X-100을 녹인 PBS(PBST)로 10분간 3회 세척하였다. 1% BSA, 1% 정상 염소 혈청을 녹인 블로킹 용액에 Cy5-항-인간 CD105를 1:100으로 희석하여 항체를 붙이고 4℃에서 밤새 방치하였다. 이후, 0.1% 트리톤 X-100을 녹인 PBS(PBST)로 10분간 5회 세척한 후, 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 상기 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 보는 바와 같이, 비강내 투여에 의해 간엽줄기세포들이 뇌로 이동하였음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: IDS를 발현하는 huBM - MSC 세포의 마우스에의 비강내 투여에 따른 생체내( in vivo ) 단기 효능 시험

IDS를 발현하는 huBM-MSC(IEM) 세포의 투여에 따른 단기(4주) 효능을 살펴보기 위하여, 마우스를 4 그룹으로 준비하였다.

첫 번째 그룹은 야생형(WT) 마우스(n=9)로서 PBS를 주사하였고, 두 번째 그룹은 넉아웃 마우스(n=9)로서 PBS를 주사하였으며, 세 번째 그룹은 넉아웃 마우스(n=9)로서 huMSC 자체를 주사하였고, 네 번째 그룹은 넉아웃 마우스(n=8)로서 IDS를 발현하는 huBM-MSC 세포(IEM)를 주사하였다. 단기 효능 시험은 2주 간격으로 세 차례 IEM을 투여하였다. 상기 단기 효능 시험의 스케줄을 도 11에 나타내었다.

huMSC 및 IDS로 형질감염된 huBM-MSC 세포의 경우 투여 전에 RFP 형광 단백질을 관찰하였고, IDS 발현량을 확인하였다. 상기 측정된 IDS 발현량을 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 1차 투여를 위한 MSC에서는 354.672ng / 1 x 10⁶ 세포, 2차 투여를 위한 MSC에서는 682.788 ng / 1 x 10⁶ 세포, 3차 투여를 위한 MSC에서는 440.341ng / 1 x 10⁶ 세포의 IDS가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

<6-1> GAG의 정량

투여전과 투여 후 2주 간격으로 뇌, 간 조직 및 소변을 채취하여 각각 GAG 함량을 측정하였다. 뇌 및 간의 경우 BCA로 전체 단백질을 측정하여 GAG 함량을 보정하였고, 소변의 경우 크레아틴 함량을 측정하여 GAG 함량을 보정하였다.

GAG의 측정을 위해, 뇌, 간 조직 또는 소변 샘플 50 uL를 1.5 mL 튜브에 넣었다. 8M GuHCl 50 uL을 첨가한 후 섞어 주고 실온에서 15분간 반응시켰다. 이후, SAT 용액 50ul을 첨가하여 실온에서 15분간 배양하였다. 이후, Alcian blue working solution(sigma) 750 uL를 첨가하고 볼텍싱한 후 실온에서 최소 15분 이상 교반하면서 반응시켰다. 상기 반응 용액을 12,000 g에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 다음, DMSO 500 uL를 첨가하여 볼텍싱하고, 실온에서 15분간 반응시켰다. 상기 반응액을 12,000 g에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 후, Gu-Prop solution 500 uL를 첨가하여 펠렛을 완전히 현탁시켰다. 상기 현탁액을 96 웰 플레이트에 웰당 240ul씩 넣고 ELISA 리더에 의해 600~620 nm에서 GAG를 정량하였다.

이후, 뇌와 간의 경우 BCA법에 의해 총 단백질을 측정하여 보정하였다.

한편, 소변의 경우, 소변 샘플 50 uL를 96 웰 플레이트에 넣고, 크레아틴 분석 완충액 42 uL, 크레아티나아제 2 uL, 크레아틴 효소 믹스 2 uL 및 크레아틴 프로브 2 uL를 섞어 상기 소변 샘플이 들어 있는 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 상기 웰 플레이트를 빛을 차단한 상태에서 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 570nm ELISA 리더에서 값을 읽어 크레아틴을 정량하였다. 상기 크레아틴 값으로 GAG를 보정하였다.

상기 소변, 뇌 및 간에서의 GAG 양을 도 12에 나타내었다. 도 12에서 보는 바와 같이, IEM 투여 그룹에서 소변 GAG 감소량은 나타나지 않았다. 국부적으로 뇌 내로 전달된 IEM 세포가 전신성 효과가 없음을 보여주고 있다(도 12A). 또한 뇌로 전달된 IEM 세포의 뇌 GAG 감소 효과도 없음을 확인하였다(도 12B). 그러나 간 GAG 변화량을 조사해 본 결과 IEM 투여 그룹은 IDS KO 마우스에 PBS를 투여해준 그룹과 비교하여 통계적으로 유의하게 GAG 감소가 되었음을 확인하였다(도 12C). 이는 비강내 투여로 투여된 IEM 세포 중 일부가 혈액을 통해 간으로 이동되어 간에 쌓여 있는 GAG를 분해했을 것으로 추측된다.

<6-2> 조직 염색- alcian blue 염색

GAG를 특이적으로 염색하는 alcian blue 물질로 뇌 조직 내의 GAG를 염색하여 IDS로 형질감염된 huBM-MSC 세포 투여에 의한 변화를 관찰하였다.

구체적으로, 적출된 뇌 조직을 15ml 튜브에 넣고 파라포름알데하이드를 채워 4℃에 24시간 동안 반응시켰다. JENIA사에 의뢰하여 파라핀 블록을 만들어 5 μm 두께로 절개하여 슬라이드를 제작하였다. 준비된 슬라이드를 자일렌 5분 - 자일렌 5분 - 자일렌 5분 - 100% EtOH 5분 - 95% EtOH 3분 - 90% EtOH 3분 - 85% EtOH 3분 - 80% EtOH 3분 - 70% EtOH 3분 - 60% EtOH 3분 - PBS 보관 순으로 순차적으로 처리하여 탈파라핀화하였다. 3% 아세트산 100 mL에 1g alcian blue (sigma)를 잘 녹이고(약 pH 2.5), 앞서 탈파라틴화한 슬라이드를 넣고 30분간 염색하였다. 염색 후 흐르는 물에서 2분 동안 염료를 닦아낸 후 멸균수로 5분간 2회 세척하였다. 이후, 60% EtOH 5분 - 70% EtOH 3분 - 80% EtOH 3분 - 85% EtOH 3분 - 90% EtOH 3분 - 95% EtOH 3분 - 100% EtOH 3분 - 자일렌 5분 - 자일렌 5분 - 자일렌 5분 순으로 탈수한 다음, 광학현미경(Olympus; IX51-F32PH)을 이용하여 관찰하였다. 상기 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서 보는 바와 같이, PBS 투여한 KO 마우스에서 GAG 응집이 나타나는 반면 IEM 투여 그룹이나 MSC 투여 그룹에서는 이러한 응집이 사라져 GAG가 분해되었음을 보여주고 있다.

<6-3> 조직 염색- huCD105 - Cy5 염색

huBM-MSC 및 IEM의 세포 이동을 human MSC 세포 특이적인 CD105 로 염색하여 확인하였다.

구체적으로, 적출된 뇌 조직을 15ml 튜브에 넣고 파라포름알데하이드를 채워 4℃에 24시간 동안 반응시켰다. JENIA사에 의뢰하여 파라핀 블록을 만들어 5 μm 두께로 절개하여 슬라이드를 제작하였다. 준비된 슬라이드를 자일렌 5분 - 자일렌 5분 - 자일렌 5분 - 100% EtOH 5분 - 95% EtOH 3분 - 90% EtOH 3분 - 85% EtOH 3분 - 80% EtOH 3분 - 70% EtOH 3분 - 60% EtOH 3분 - PBS 보관 순으로 순차적으로 처리하여 탈파라핀화하였다. PBS에 보관중인 슬라이드를 0.1 M- PH 6.0 - 구연산나트륨 완충액에 넣고 전자레인지에서 가열하였다. 기포가 올라오면 끄고 5분간 식힌 후 다시 기포가 올라올 때까지 가열하였다. 이것을 3회 반복 하였다. 가열 처리한 조직을 DW로 3회 행군 후 0.1% 트리톤 X-100을 녹인 PBS(PBST)로 10분간 3회 세척하였다. 1% BSA, 1% 정상 염소 혈청을 녹인 블로킹 용액에 Cy5-항-인간 CD105를 1:100으로 희석하여 항체를 붙이고 4℃에서 밤새 방치하였다. 이후, 0.1% 트리톤 X-100을 녹인 PBS(PBST)로 10분간 5회 세척한 후, 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 상기 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에서 보는 바와 같이, 뇌 조직 안쪽으로 많은 MSC 세포가 이동된 것을 확인할 수 있었으며, 이로 인해 도 13과 같이 GAG가 분해되었음을 알 수 있었다.

실시예 7: IDS를 발현하는 huBM - MSC 세포의 마우스에의 비강내 투여에 따른 생체내( in vivo ) 장기 효능 시험

IDS를 발현하는 huBM-MSC 세포의 장기 효능을 살펴보기 위하여, 마우스를 4 그룹으로 준비하였다.

첫 번째 그룹은 야생형(WT) 마우스(n=9)로서 PBS를 주사하였고, 두 번째 그룹은 넉아웃 마우스(n=8)로서 PBS를 주사하였으며, 세 번째 그룹은 넉아웃 마우스(n=8)로서 huMSC 자체를 주사하였고, 네 번째 그룹은 넉아웃 마우스(n=8)로서 IDS로 형질감염된 huBM-MSC 세포(IDS-expressed MSC (IEM))를 주사하였다. 장기 효능 시험은 2주 간격으로 7차례 IEM을 투여하였다. 상기 장기 효능 시험의 스케줄을 도 15에 나타내었다.

huMSC 및 IDS로 형질감염된 huBM-MSC 세포의 경우 투여 전에 RFP 형광 단백질을 관찰하였고, IDS 발현량을 확인하였다. 상기 측정된 IDS 발현량을 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 사용된 세포들은 1차 462.777, 2차 650.482, 3차 651.317, 4차 155.827, 5차 717.518, 6차 1073.175, 7차 220.624 ng/ 1 x 10⁶ 세포의 IDS를 발현하고 있는 것으로 확인되었다.

<7-1> GAG의 정량

투여전과 투여 후 4주 간격으로 소변을 채취하였고, 7번째 투여 후 3일째에 뇌와 간 장기를 적출하였다.

상기 뇌, 간 조직 및 소변 샘플로부터 실시예 <6-1>과 동일한 방법에 의해 GAG를 정량하였다.

상기 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16에서 보는 바와 같이, IEM 투여 그룹의 경우 소변 GAG 함량이 감소되지 않았다(도 16A). 단기 효력 시험의 GAG 함량 결과와 마찬가지로 장기 효력 시험에 투여된 IEM 세포의 전신성 효과 또한 없는 것으로 결론 내릴 수 있다. 뇌 조직 또한 IEM 세포의 투여에 의해 GAG 감소량은 나타나지 않았고, 간 GAG 감소를 보여 단기효력과 같은 결과를 얻었다. 이 또한 비강내로 투여된 IEM 세포가 간으로 이동되어 GAG를 분해하였음을 시사하고 있다.

<7-2> 조직 염색- alcian blue 염색

실시예 <6-2>와 동일한 방법으로 뇌 조직 내의 GAG를 염색하여 IDS로 형질감염된 huBM-MSC 세포 투여에 의한 변화를 관찰하였다.

상기 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 보는 바와 같이, 특히 IEM 투여 그룹에서는 같은 뇌조직 부위에서 응집이 완전히 사라지는 것으로 나타났다

<7-3> 조직 염색- huCD105 - Cy5 염색

실시예 <6-3>과 동일한 방법으로 huBM-MSC 및 IEM 의 세포 이동을 human MSC 세포 특이적인 CD105 로 염색하여 확인하였다.

상기 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 보는 바와 같이, 장기효력시험의 뇌 조직 염색 결과에서 많은 huBM-MSC 세포가 뇌 피질 부위까지 전달됨을 확인하였다. 그리고 IDS KO 마우스의 뇌 조직 내에 GAG 응집이 많이 관찰되나 huBM-MSC 및 IEM 투여 그룹에서 모두 응집이 감소됨을 보여주고 있다.

본 연구는 보건복지부의 재원으로 한국보건산업진흥원의 보건의료기술연구개발사업 지원에 의하여 이루어진 것임(과제고유번호: HI12C0066).

Claims

뇌신경계 질환의 치료용 물질을 발현하는 줄기세포를 포함하는, 비강내 투여용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 질환이 유전자 이상에 의해 발병하는 뇌신경계 희귀 질환인 것을 특징으로 하는, 비강내 투여용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 질환이 헌터증후군(Hunter syndrome), 멘케스증후군(Menkes syndrome), 레트증후군(Rett syndrome), 테이-삭스병(Tay-Sachs Disease) 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 헐러증후군(Huler syndrome), 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden Spatz syndrome), 이염성백질이영양증(metachromatic leukodystrophy) 또는 크라베병(Krabbe disease)인 것을 특징으로 하는, 비강내 투여용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 유전자가 이듀로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase; IDS) 유전자, ATP7A 유전자, MECP2(methyl CpG binding protein 2) 유전자, BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor) 유전자, HEXA(lysosomal beta-N-acetylhexosaminidase A) 유전자, SMPD1(Sphingomyelin phosphodiesterase 1) 유전자, 알파-L-이듀로니다제(alpha-L-iduronidase, IDUA) 유전자, 판토테네이트 카이네이즈 2(pantothenate kinase 2, PANK2) 유전자, 아릴설파타제 A(Arylsulfatase A) 유전자 또는 GALC(Galactosylceramidase) 유전자인 것을 특징으로 하는, 비강내 투여용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포가 간엽 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 혈관내피전구세포 또는 신경 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 비강내 투여용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 간엽 줄기세포가 골수, 지방, 탯줄 또는 제대혈 유래 간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 비강내 투여용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포가, IDS 유전자, ATP7A 유전자, MECP2 유전자, BDNF 유전자, HEXA 유전자, SMPD1 유전자, IDUA 유전자, PANK2 유전자, 아릴설파타제 A 유전자 또는 GALC 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질감염된 것을 특징으로 하는, 비강내 투여용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 줄기세포가, IDS 유전자 또는 ATP7A 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질감염된 것을 특징으로 하는, 비강내 투여용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 형질감염이 렌티바이러스 벡터(Lentviral vector), 레트로바이러스 벡터(Retroviral vector), 리포좀(liposome), 양이온성 중합체(cationic polymer) 또는 전기천공법(electroporation)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 비강내 투여용 조성물.
제1항에 따른 비강내 투여용 조성물을 포함하는, 뇌신경계 질환의 치료용 줄기세포 치료제.