CN107648592B - 趋化因子ccl4作为制备治疗骨折药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种趋化因子CCL4作为制备治疗骨折药物的应用。本应用使用趋化因子CCL4作为制备治疗骨折药物，通过药物中的CCL4成分能有效促进人的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，从而快速修复受损骨组织，具有较好的疗效。此外方法简单，只需直接向患者骨折部位进行注射即可，并且治疗周期短。

Description

趋化因子CCL4作为制备治疗骨折药物的应用
技术领域
本发明属于药品技术领域，涉及趋化因子CCL4作为制备治疗骨折药物的应用。
背景技术
骨折是临床上比较常见的骨科疾病，每个人一生至少一次骨折的机会。随着中国老龄化的加剧，骨质疏松症是一种日益重要的公共卫生问题。毫无疑问，髋关节骨折的发生率已经随之迅速增长。来自北京的一项重要研究表明，从2002年到2006年，年龄超过50岁人群，髋关节骨折发生率，女性增加了58％，男性增加了49％。同时，该研究还比较了1990-1992年间与2002-2006年间髋部骨折发病率，年龄超过50岁的女性髋部骨折增加了2.76倍，男性增加了1.61倍。并且髋关节骨折发生率增加，常常导致死亡率增加。新加坡中国健康研究(SCHS)发现，那些已经发生髋部骨折的患者，在随后五年内死于其他疾病的风险较未发生过骨折的人高很多。
因此，除了意外导致的骨折，毫无疑问，在人口老龄化的今天，骨质疏松症及其导致的脆性骨折，在今后的几十年中将成为一项严重的健康问题。
骨折的愈合是一个“瘀去，新生，骨合”的过程，骨折的愈合过程一般分为炎症反应期、修复期和缩型期三个阶段。具体如下：
1.血肿形成
骨组织和骨髓都富含血管，骨折后常伴有大量出血，填充在骨折的两断端及其周围组织间，形成血肿。一般在数小时内血肿发生血液凝固。和其他组织的创伤一样，此时在骨折局部还可见轻度中性粒细胞浸润。
2.纤维性骨痂形成
大约在骨折后的2～3天，从骨内膜及骨外膜增生的纤维母细胞及新生毛细血管侵入血肿，血肿开始机化。这些增生的组织逐渐弥合，填充并桥接了骨折的断端，继而发生纤维化形成纤维性骨痂，或称暂时性骨痂(provisional callus)。肉眼上骨折局部呈梭形肿胀。约经1周左右，上述增生的肉芽组织及纤维组织部分可进一步分化，形成透明软骨。
3.骨性骨痂形成
骨折愈合过程的进一步发展，是骨母细胞产生新生骨质逐渐取代上述纤维性骨痂。开始形成的骨质为类骨组织，以后发生钙盐沉着，形成编织骨(woven bone)，即骨性骨痂。纤维性骨痂内的软骨组织，发生钙盐沉着而演变为骨组织，参与骨性骨痂的形成。此时所形成的编织骨，由于其结构不够致密，骨小梁排列比较紊乱，故仍达不到正常功能需要。
4.骨痂改建或再塑
上述骨痂建成后，骨折的断端仅被幼稚的、排列不规则的编织骨连接起来。为了符合人体生理要求而具有更牢固的结构和功能，编织骨进一步改建成为成熟的板层骨，皮质骨和髓腔的正常关系也重新恢复。改建是在破骨细胞的骨质吸收及骨母细胞新骨质形成的协调作用下进行的。在一般情况下，经过上述步骤，骨折部恢复到与原来骨组织一样的结构，达到完全愈合。
目前骨折治疗方法主要有保守疗法及手术治疗方法。根据骨折部位及骨折类型，治疗所采用的方法也不同。但是这些治疗方法，骨折愈合需要的时间比较长。近年来随着组织工程学和生物医学的发展，一些生长因子例如BMP、TGF-β、FGF、神经生长因子NGF等均报道在老鼠的骨折模型中可促进骨折愈合。此外，基因改造的骨髓间充质干细胞(MSCs)已经用于骨折的治疗，并且展示出了诱人的治疗前景。
趋化因子，也称做趋化激素、趋化素或者化学激素，是一种小分子的细胞因子家族蛋白。CCL4是趋化因子的一种，又名MIP-1β，参与多种免疫应答和炎症应答，作为白细胞的趋化剂和活化剂发挥作用。趋化因子CCL4通常应用于细胞的迁移领域，可用于细胞治疗，而趋化因子在骨折治疗领域的应用目前从未报道过。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，本发明提供一种趋化因子CCL4作为制备治疗骨折药物的应用，具体方案如下：
趋化因子CCL4作为制备治疗骨折药物的应用。
优选地，所述药物中以CCL4为唯一活性成分。
优选地，所述药物组分包括CCL4和PBS溶液。
优选地，所述药物组分包括CCL4和生理盐水。
优选地，所述药物中CCL4的浓度为40-60ng/ml。
最佳地，所述药物中CCL4的浓度为50ng/ml。
上述应用，所述药物是在现有技术的基础上，采用西药制剂常规方法制备成任何可药用的注射剂。
上述应用，所述注射剂每次使用剂量是100μl，直接皮下注射到患者的骨折部位。可以根据患者的骨折面积相应调整每次注射的剂量，骨折面积越大，每次注射的剂量越多。
上述应用，所述注射剂每隔1天-3天注射一次。更佳地，所述注射剂每隔2天注射一次。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本应用使用趋化因子CCL4作为制备治疗骨折药物，通过药物中的CCL4成分能有效促进人的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，从而快速修复受损骨组织，具有较好的疗效。此外方法简单，只需直接向患者骨折部位进行注射即可，并且治疗周期短。
附图说明
图1是CCL4制剂对间充质干细胞的毒性研究；
图2是间充质干细胞的ALP活性检测；
图3是成骨分化相关的标记基因检测；
图4是间充质干细胞的钙结节检测；
图5是间充质干细胞的X-ray检测；
图6是间充质干细胞的micro-CT检测。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面通过实施例进一步说明本发明的作用，而非本发明的限制。
实施例1
1.材料和方法
1.1骨髓来源的间充质干细胞的培养
取36岁，男性健康志愿者捐献的骨髓，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心收集单核细胞，用PBS洗涤两次后，将这些单核细胞直接种于细胞培养瓶中，加入含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素及10％胎牛血清(Invitrogen公司)的α-MEM(Invitrogen公司)培养基，置于37℃、5％CO2的温箱中孵育，继续培养5-7天(换液周期为3天/次)，可以观察到间充质干细胞集落形成。细胞扩增后，取P3～P8代用于相关实验。
1.2药物
PBS，CCL4均购于美国Sigma Chemical公司。
1.3统计
计量资料用均数±标准差表示，采用SPSS16.0软件行ANOVA方差分析并以LSD-t检验进行组间比较，P<0.05可认为具有统计学意义。
1.4CCL4制剂对间充质干细胞毒性的研究
将CCL4溶于PBS溶液，配制成0,5,10,20,50,100ng/ml的浓度梯度。为验证不同浓度的CCL4制剂对间充质干细胞的毒性，我们以MTT法测定细胞的活力。将间充质干细胞接种于96孔板内，并用不同浓度的CCL4制剂处理72小时后，在培养基中加入5mg/ml的MTT，孵育4h后在显微镜下读数。存活率＝活细胞数/总细胞数*100％。
如图1所示，结果表明，在CCL4浓度为1-100ng/ml范围内，CCL4对细胞活性略有抑制，但无显著的毒性作用，表明该药物对间充质干细胞是安全的。
实施例2
1材料和方法
1.1骨髓来源的间充质干细胞的培养
取36岁，男性健康志愿者捐献的骨髓，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心收集单核细胞，用PBS洗涤两次后，将这些单核细胞直接种于细胞培养瓶中，加入含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素及10％胎牛血清(Invitrogen公司)的α-MEM(Invitrogen公司)培养基，置于37℃、5％CO2的温箱中孵育，继续培养5-7天(换液周期为3天/次)，可以观察到间充质干细胞集落形成。细胞扩增后，取P3～P8代用于相关实验。
1.2药物
PBS，CCL4均购于美国Sigma Chemical公司。
1.3统计
计量资料用均数±标准差表示，采用SPSS16.0软件行ANOVA方差分析并以LSD-t检验进行组间比较，P<0.05可认为具有统计学意义。
1.4CCL4制剂促进间充质干细胞成骨细胞分化
将CCL4溶于PBS溶液，配制成10和50ng/ml的浓度。为研究CCL4对间充质干细胞向成骨分化的影响，我们在间充质干细胞在体外诱导成骨分化的过程中添加10ng/ml和50ng/ml的CCL4来诱导成骨分化。在诱导分化的第5天和第10天，收集细胞，裂解后检测ALP活性。在诱导分化的14-15天，收集细胞用RNeasy小提试剂盒(Qiagen公司)从细胞中提取总RNA，测量RNA浓度后用MMLV逆转录酶(invitrogen公司)根据提供的操作指南进行逆转录。用实时定量PCR检测分析细胞内成骨相关标记基因的表达状况，如BMP2；ALP；MSX2；RUNX2；Osx；OCN；ColA1等。最后在诱导分化的第14-15天，甲醛固定后，采用茜素红染色，确定钙结节的形成。
我们选定浓度为10和50ng/ml的CCL4进行间充质干细胞成骨分化的检测。在分化的第5和第10天，检测ALP活性。结果如图2所示，2个浓度的CCL4均明显促进了间充质干细胞的成骨分化，50ng/ml的CCL4效果更好。接下来，在诱导分化第15天，提取细胞的总RNA进行逆转录和实时定量PCR(real time PCR)检测。检测的成骨分化相关的标记基因包括BMP2；ALP；MSX；Runx2；Osx；OCN；ColA1(如图3所示)。结果表明，50ng/ml的CCL4明显提升了这些标志基因的的表达。最后茜素红染色表明，CCL4处理明显促进了钙结节的而形成(如图4所示)。这些结果表明，CCL4是一个潜在的促进间充质干细胞向成骨分化的有效小分子。
实施例3
大鼠骨折的建立和CCL4治疗，方案如下：
选用8-10周龄SPF级雄性小鼠20只(实验动物中心提供)，适应性喂养10-14天。根据我实验室已经建立好的小鼠股骨骨折模型，将小鼠在麻醉状态下，横向开窗将小鼠右腿的股骨中断骨折，然后采用钢钉固定。将小鼠随机分为PBS对照组和药物治疗组(100μl的50ng/ml CCL4)，每组10只。每隔两天在骨折位置注射PBS或治疗药物，共计三次。所有动物自由摄水及摄食(标准饲料，含钙1.33％，磷0.95％)，在室温25～28℃，湿度75～80％清洁级环境中喂养。分别于不同时间取材，进行x-Ray和micro-CT检测。采用西药制剂常规方法制备50ng/ml CCL4的注射剂。
具体方法如下：试验期间每隔3天注射一次50ng/ml CCL4，剂量为100μl，共注射7周。分别于不同时间点取样进行X-ray检测。结果证明药物治疗组的骨折愈合情况明显好于对照组(图5)。并且，对第7周的样本进行3D的micro-CT检测，结果表明药物治疗组有更好的矿化骨痂(图6)。
实施例4
采用西药制剂常规方法制备CCL4浓度为50ng/ml的注射剂。在医院随机选取20名骨折患者，将CCL4浓度为50ng/ml的注射剂注射到患者的骨折部位，每隔两天注射一次，8周后所有患者均明显好转，12-16周痊愈。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.趋化因子CCL4在制备治疗骨折药物中的应用，其特征在于，所述药物中以CCL4为唯一活性成分；所述药物中CCL4的浓度为40-60ng/ml；所述药物是由药物制剂常规方法制备成的可药用的注射剂。
2.根据权利要求1所述的趋化因子CCL4在制备治疗骨折药物中的应用，其特征在于，所述药物组分包括CCL4和磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)。
3.根据权利要求1所述的趋化因子CCL4在制备治疗骨折药物中的应用，其特征在于，所述药物组分包括CCL4和生理盐水。
4.根据权利要求1所述的趋化因子CCL4在制备治疗骨折药物中的应用，其特征在于，所述药物中CCL4的浓度为50ng/ml。
5.根据权利要求1所述的趋化因子CCL4在制备治疗骨折药物中的应用，其特征在于，所述注射剂每次使用剂量是100μl。
6.根据权利要求1所述的趋化因子CCL4在制备治疗骨折药物中的应用，其特征在于，所述注射剂每隔1天-3天注射一次。
7.根据权利要求6所述的趋化因子CCL4在制备治疗骨折药物中的应用，其特征在于，所述注射剂每隔2天注射一次。
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