CN112089719A

CN112089719A - 曲克芦丁在制备成骨相关药物中的应用

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Publication number: CN112089719A
Application number: CN202010929091.2A
Authority: CN
Inventors: 张锦芳; 邵将
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-09-07
Filing date: 2020-09-07
Publication date: 2020-12-18

Abstract

本发明涉及曲克芦丁在制备成骨相关药物中的应用，属于医药技术领域。曲克芦丁在制备成骨相关药物中的应用，为骨折的愈合提供了新的治疗药物。曲克芦丁具有显著的促间充质干细胞向成骨细胞分化及促成骨作用，同时促进骨折区域的血管再生，改善骨新生缓慢的病理状态；将曲克芦丁制备成骨相关药物，开拓了曲克芦丁的新用途。

Description

曲克芦丁在制备成骨相关药物中的应用

技术领域

本发明涉及曲克芦丁在制备成骨相关药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

骨折延迟愈合与骨折不愈合(骨不连)一直是骨科常见疾病，主要原因之一是骨再生病理状态，表现为骨折后超过3个月不愈合，其发病率可占所有骨折总数的5-10％，是骨科疾病治疗中的难点。非手术疗法主要以药物改善局部血液循环、促进骨再生与骨形成，以达到干细胞向成骨细胞分化，促进骨的再生，达到骨折愈合的目的。骨质疏松是以骨量减少、骨微细结构破坏为特征，导致骨脆性增加，强度受损，从而使骨折危险性增加的一种全身性骨骼疾病。全球大约有超过2亿的女性遭受骨质疏松症的折磨，抑制骨吸收和促进骨形成是临床上用来预防和治疗骨质疏松症的主要治疗措施。骨坏死，主要原因是各种因素导致的血液循环障碍，抑制骨细胞的缺血坏死，而改善及促进血液循环，增加新骨再生是其主要治疗方案。

曲克芦丁Troxerutine，CAS号：7085-55-4，分子式：C33H42O19，分子量：742.67500，作为芦丁的重要衍生物，现已发现其能抑制血小板的凝集，有防止血栓形成的作用，同时能对抗5-羟色胺、缓激肽引起的血管损伤，增加毛细血管抵抗力，降低毛细血管通透性，可防止血管通透性升高引起的水肿，对急性缺血性脑损伤有显著的保护作用。但是，曲克芦丁在骨科领域的使用却少有报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供曲克芦丁在制备成骨相关药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：曲克芦丁在制备成骨相关药物中的应用。

曲克芦丁结构式如下式(Ⅰ)所示：

曲克芦丁分子中心的α、β不饱和吡喃酮是生物活性的关键基团，其抗缺氧活性可能与抗自由基、扩张血管、促进干细胞增殖与分化等方面的作用相关。本发明利用骨髓间充质干细胞的成骨分化平台，探讨研究了曲克芦丁对骨髓间充质干细胞的成骨分化和促进成骨的作用，其结果显示曲克芦丁具有促进成骨分化及促进成骨的作用。

本发明证实曲克芦丁在浓度0～200mol/L范围内，对间充质干细胞是安全的，对细胞活性没有抑制作用，也无显著的毒性作用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，曲克芦丁能促进骨折区域的骨髓间充质干细胞向成骨细胞的增殖与分化。

作为本发明所述应用的优选实施方式，曲克芦丁能促进碱性磷酸酶(ALP)的增加，所述曲克芦丁能促进钙在细胞中的累积，所述曲克芦丁能促进基质的形成。

骨髓间充质干细胞成骨分化中标志物为碱性磷酸酶(ALP)，曲克芦丁能明显促进骨髓间充质干细胞成骨分化，能促进碱性磷酸酶显著增加，ALP表达随曲克芦丁浓度增加而递增；能促进钙在细胞中的累积及基质的形成，钙在间充质干细胞的收集与成骨聚集随曲克芦丁用药量浓度的增加而显著增加。

作为本发明所述应用的优选实施方式，曲克芦丁能促进骨折的愈合，所述曲克芦丁能促进新骨的生成。

作为本发明所述应用的优选实施方式，曲克芦丁能促进骨折区域的血管新生、重建与再通。

本发明还提供一种成骨相关的药物组合物，其有效成分包括曲克芦丁。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述曲克芦丁在所述药物组合物中的质量百分含量为10％～99％。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、注射剂中的至少一种。

作为所述药物组合物的优选实施方式，还包括药学上可接受的载体。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述载体选自填充剂、粘合剂、崩解剂、溶剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂中的至少一种。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述填充剂选自淀粉、乳糖、甘露醇、山梨醇、磷酸氢钙、壳聚糖中的至少一种。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述粘合剂选自糊精、卡波姆、黄原胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、麦芽精糊、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素中的至少一种。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述溶剂选自生理盐水和枸橼酸中的至少一种。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述防腐剂选自苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丁酯中的至少一种。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述抗氧化剂选自焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和叔丁基对甲酚中的至少一种。

作为所述药物组合物的优选实施方式，所述表面活性剂选自聚山梨酯80、磷脂和丙二醇中的至少一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述曲克芦丁具有显著的促间充质干细胞向成骨细胞分化及促成骨作用，同时促进骨折区域的血管再生；将曲克芦丁应用于制备成骨相关药物，为骨折提供了新的治疗药物；

(2)以本发明所述的曲克芦丁为活性成分制备的促进成骨的药物可促进间充质干细胞向成骨细胞分化、促进成骨细胞的成骨作用，促进骨再生，改善骨新生缓慢的病理状态；本发明将曲克芦丁制备成骨相关药物，开拓了曲克芦丁的新用途。

附图说明

图1MTT法测定曲克芦丁对骨髓间充质干细胞的毒性，P值无统计学意义；

图2曲克芦丁促进骨髓间充质干细胞成骨分化能力的验证，成骨分化中特异性标志物碱性磷酸酶表达随曲克芦丁浓度的变化结果图，P＜0.05；

图3曲克芦丁促进骨髓间充质干细胞成骨分化能力的验证，钙在间充质干细胞的收集与成骨聚集随曲克芦丁浓度的变化结果图，P＜0.05；

图4曲克芦丁处理大鼠股骨骨折模型，X-ray检查曲克芦丁对SD大鼠股骨骨折的愈合情况图，﹡P＜0.05；

图5曲克芦丁处理大鼠股骨骨折模型，micro-CT检查曲克芦丁对SD大鼠股骨骨折的愈合情况图，﹡P＜0.05；

图6曲克芦丁处理大鼠股骨骨折模型，SD大鼠股骨切片的苏木精—伊红染色法染色结果，检查骨折的愈合图；

图7曲克芦丁处理大鼠股骨骨折模型，SD大鼠股骨切片的苏木精—伊红染色法染色结果，检查血管再生图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例为每片含有20mg曲克芦丁的片剂，其配方如下表1所示：

表1每片含有20mg曲克芦丁的片剂配方

成分	量/片	重量百分含量
			曲克芦丁(纯度＞99％)	20mg	10％
对羟基苯甲酸乙酯	5mg	2.5％
			淀粉	165mg	82.5％
卡波姆	10mg	5％
			合计	200mg	100％

上述片剂的制备工艺按照常规工艺进行。

实施例2

本实施例为每粒含有500mg曲克芦丁的胶囊，其配方如下表2所示：

表2每粒含有500mg曲克芦丁的胶囊配方

成分	量/粒	重量百分含量
			曲克芦丁(纯度＞99％)	500mg	83.33％
淀粉	70mg	11.67％
			黄原胶	30mg	5％
合计	600mg	100％

上述胶囊的制备工艺按照常规工艺进行。

实施例3

本实施例为每支含有200mg曲克芦丁的注射剂，其配方如下表3所示：

表3每支含有200mg曲克芦丁的注射剂配方

上述注射剂的制备工艺按照常规工艺进行。

实验例1

本实验例为曲克芦丁对骨髓间充质干细胞增殖能力影响的研究

1.材料和方法

1.1骨髓来源的间充质干细胞的培养

取36岁，男性健康志愿者捐献的骨髓，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心收集单核细胞，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次后，将这些单核细胞直接种于细胞培养瓶中，加入含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素及10％胎牛血清(Invitrogen公司)的α-MEM(Invitrogen公司)培养基，置于37℃、5％CO₂的温箱中孵育，继续培养5-7天(换液周期为3天/次)，可以观察到间充质干细胞集落形成。细胞扩增后，取P3～P8代用于相关实验，以MTT法测定曲克芦丁对骨髓间充质干细胞的毒性，实验重复3次以上。

1.2药物

PBS，曲克芦丁等购于中国江苏南京飞宇公司。

1.3统计

计量资料用均数±标准差表示，采用SPSS16.0软件行ANOVA方差分析并以LSD-t检验进行组间比较，P<0.05可认为具有统计学意义。

2.实验方法

曲克芦丁水溶率好，为增强溶解率，提高实验准确性，将曲克芦丁溶于DMSO溶液，配制成工作液。以此验证不同浓度的曲克芦丁制剂对间充质干细胞的毒性，本发明以MTT法测定细胞的活力。将间充质干细胞接种于96孔板内，并用不同浓度的曲克芦丁制剂处理72小时后，在培养基中加入5mg/ml的MTT，孵育4h后在显微镜下读数，存活率＝(活细胞数/总细胞数)х100％。

3.实验结果

如图1所示，结果表明，在浓度0～200mol/L范围内，曲克芦丁对细胞活性没有抑制，也无显著的毒性作用，表明该药物对间充质干细胞是安全的。

实验例2

本实验例为曲克芦丁促进骨髓间充质干细胞成骨分化能力的验证

1.材料和方法

1.1实验方法一

取P3～P8代间充质干细胞用于相关实验，为研究曲克芦丁对间充质干细胞向成骨分化的影响，我们采用经典的间充质干细胞在体外诱导成骨分化的平台。并在此分化过程中添加25μM、50μM、100μM、200μM来研究曲克芦丁对成骨分化的效果，对照处理为非诱导组。在诱导分化的第7天，将培养板中培养基去掉，加入PBS洗涤2次，然后采用4％中性甲醛固定，采用碱性磷酸酶(ALP，成骨分化中特异性标志物)染色法，进行定性与定量处理。在560nm下测定吸光度值进行定量，实验重复3次以上，实验结果如图2所示。

1.2实验结果

曲克芦丁可明显促进骨髓间充质干细胞成骨分化，其成骨分化中标志物碱性磷酸酶(ALP)显著增加。如图2所示，实验组的ALP表达随曲克芦丁浓度增加而递增，即蓝色染色越深，ALP表达越旺盛。同时对各组进行ALP绝对值含量测定，也证实ALP表达随曲克芦丁浓度增加而递增。

2.实验方法二

实验方法与内容同实验一，诱导分化的第12～14天，将培养板中培养基去掉，加入PBS洗涤2次，然后采用4％中性甲醛固定，采用茜素红染色法，对间充质干细胞成骨分化过程中最重要的成分钙(Ca²⁺)的沉积，进行定性检测与定量测量的处理，在560nm下测定吸光度值进行定量，实验重复3次以上。

2.2实验结果

曲克芦丁可明显促进骨髓间充质干细胞成骨分化，促进钙在细胞中的累积及基质的形成。实验结果如图3所示，茜素红染色显示，钙在间充质干细胞的收集与成骨聚集随曲克芦丁用药量浓度的增加而显著增加。同时对钙的含量绝对值的测量也证实，钙在间充质干细胞的收集与成骨聚集随曲克芦丁用药量浓度的增加而显著增加。

实验例3

本实验例为曲克芦丁促进大鼠股骨骨折愈合的研究

1.大鼠股骨骨折模型制作及愈合情况实验

取13周成年健康雄性SD大鼠，体重280g左右，适应性饲养3d后随机分组法分为3组，空白组，曲克芦丁低剂量治疗组，曲克芦丁高剂量治疗组，每组4只，予以骨科股骨横断骨折模型制作。股骨横断骨折是骨科中严重创伤，愈合难度大，在造模过程中同时冲洗骨髓腔增大愈合难度。造模3天后各组予以等量生理盐水、曲克芦丁部位注射，注射4周，6周分别处死取股骨予X-ray、micro-CT、石蜡切片的HE染色等检测，其结果如图4、图5、图6、图7所示。

2.1实验结果1：X-ray图片及其统计结果。

X-ray检查曲克芦丁对SD大鼠股骨骨折的愈合情况如图4所示，影像学图片及统计数据显示低剂量曲克芦丁组与对照组相比，大鼠股骨骨折端已出现密度较高的骨痂，骨折线已模糊，骨折出现骨性愈合，高剂量组效果更为显著。上述实验结果表明曲克芦丁可明显促进SD大鼠股骨骨折的愈合。

2.2实验结果2：micro-CT图片及其统计结果。

如micro-CT检查的图片图5显示，低剂量曲克芦丁组与对照组相比，骨密度、骨小梁数量和骨体积分数均显著高对照组(P<0.05)，骨折得到了明显改善，说明曲克芦丁给药后在骨折修复的骨形成阶段，明显促进了大鼠股骨骨折的愈合进程骨痂内的骨量及微结构显著改善。

2.3实验结果3：SD大鼠股骨切片的苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，HE染色)染色结果。

检查骨折的愈合如图6所示，石蜡切片的HE染色结果图片显示，曲克芦丁可明显促进SD大鼠股骨骨折区域的骨髓间充质干细胞向成骨细胞的增殖与分化，并促进新骨生成，促进骨折的愈合。

2.4实验结果4：SD大鼠股骨切片的HE染色法-血管再生。

如石蜡切片的HE染色结果图片如图7所示，曲克芦丁可明显促进SD大鼠股骨骨折区域的血管新生、重建与再通，证实了曲克芦丁可保护血管的能力。

综上所述，本发明的细胞和动物骨折试验结果表明，曲克芦丁具有显著的促间充质干细胞向成骨细胞分化及促成骨作用，同时促进骨折区域的血管再生。以曲克芦丁为活性成分制备的促进成骨的药物，可促进间充质干细胞向成骨细胞分化、促进成骨细胞的成骨作用，促进骨再生，改善骨新生缓慢的病理状态。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.曲克芦丁在制备成骨相关药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述曲克芦丁能促进骨折区域的骨髓间充质干细胞向成骨细胞的增殖与分化。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述曲克芦丁能促进碱性磷酸酶的增加，所述曲克芦丁能促进钙在细胞中的累积，所述曲克芦丁能促进基质的形成。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述曲克芦丁能促进骨折的愈合，所述曲克芦丁能促进新骨的生成。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述曲克芦丁能促进骨折区域的血管新生、重建与再通。

6.一种成骨相关的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分包括曲克芦丁。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述曲克芦丁在所述药物组合物中的质量百分含量为10％～99％。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、注射剂中的至少一种。

9.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述载体选自填充剂、粘合剂、溶剂、崩解剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂中的至少一种；所述溶剂选自生理盐水和枸橼酸中的至少一种。