CN111991405B

CN111991405B - 莪术二酮联合白果新酸在制备促进骨形成药物中的应用

Info

Publication number: CN111991405B
Application number: CN202010882691.8A
Authority: CN
Inventors: 张锦芳; 田楠楠
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2040-08-28
Also published as: CN111991405A

Abstract

本发明涉及莪术二酮联合白果新酸药物新用途，尤其涉及莪术二酮联合白果新酸在制备促进骨形成药物中的应用。莪术二酮与白果新酸联用，具有显著的促间充质干细胞向成骨细胞分化及促成骨作用，以其为活性成分制备的促进成骨的药物可促进间充质干细胞向成骨细胞分化、促进成骨细胞的成骨作用，促进骨再生，改善骨新生缓慢的病理状态。作为一个有效的骨折以及骨质疏松等治疗方案，为莪术二酮联合白果新酸制剂开发了新的用途，同时也为骨折以及骨质疏松患者提供了新的治疗药物，为促进骨形成的临床治疗提供了新的方法。

Description

莪术二酮联合白果新酸在制备促进骨形成药物中的应用

技术领域

本发明涉及莪术二酮联合白果新酸药物新用途，尤其涉及莪术二酮联合白果新酸在制备促进骨形成药物中的应用。

背景技术

骨质疏松是一种与增龄相关的骨骼疾病，随着年龄增长发病率增高。2016 年中国60岁以上的老年人骨质疏松患病率为36％，其中男性为23％，女性为 49％，这说明骨质疏松已成为我国面临的重要公共卫生问题。骨质疏松最严重后果是骨质疏松性骨折。伴随的骨折延迟愈合与骨折不愈合一直是骨科常见疾病，其发病率可占所有骨折总数的5-10％，也是骨科疾病治疗中的难点。非手术疗法主要以药物改善局部血液循环、促进骨再生与骨形成，以达到干细胞向成骨细胞分化，促进骨的再生，达到骨折愈合的目的。而骨质疏松是以骨量减少、骨微细结构破坏为特征，导致骨脆性增加，强度受损，从而使骨折危险性增加的一种全身性骨骼疾病。全球大约有超过2亿的女性遭受骨质疏松症的折磨。抑制骨吸收和促进骨形成是临床上用来预防和治疗骨质疏松症的主要治疗措施。骨坏死，各种原因导致的血液循环障碍导致骨细胞的缺血坏死是主要原因，改善及促进血液循环，增加新骨再生是其主要治疗方案。

目前，临床上对于骨质疏松患者或老年的低骨量，伴有骨折高风险的人群，建议补充钙剂和(或)维生素D作为基础措施之一，与抗骨质疏松药物联合应用。对于老年骨质疏松患者，推荐双膦酸类药物作为骨质疏松治疗药物，但长时间使用双膦酸盐类药物会增加非典型性股骨骨折风险。雷洛昔芬是一种选择性雌激素受体调节剂，可与雌激素受体结合在不同靶组织导致受体空间构象发生不同改变，从而在不同组织发挥类似或拮抗雌激素的不同生物效应。在骨骼与雌激素受体结合，发挥类雌激素的作用，抑制骨吸收，增加骨密度，降低椎体骨折发生的风险。但雷洛昔芬不适用于男性骨质疏松患者。因此，对于老年骨质疏松患者如何有效安全使用抗骨质疏松药物是目前临床医师、药师关注的问题之一。虽然双膦酸盐类、重组人甲状旁腺素、雷洛昔芬等药物总体安全性较好，但由于药物本身的局限性，目前我国骨质疏松诊疗现状也并不理想，亟待开发出新的有效促成骨药物，保障我国群体特别是中老年人群健康具有重要意义。

莪术二酮(Curdione)，是一种多存在于牦牛儿苗科、杜鹃花科和姜科植物 (如莪术)中的酮类化合物。莪术二酮能够诱导肿瘤细胞停滞于G1期，抑制其增殖，并且可作用于肿瘤细胞凋亡相关通路的多个靶点。白果新酸(Ginkgo biloba)，是存在于银杏叶、果和外种皮中的生物活性成分,以外种皮中的含量为最高，作为一种药食同源的植物，归肝、胃、肾经。虽然有报道称白果新酸对具有一定程度的抗炎作用，但是莪术二酮联合白果新酸作为促成骨药物的应用却鲜有报道。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供莪术二酮联合白果新酸的药物新用途。

具体的，提供莪术二酮联合白果新酸在制备促进骨形成药物中的应用。

进一步的，莪术二酮联合白果新酸在制备治疗骨质疏松、骨坏死、骨折愈合迟缓的药物中的应用。

本发明还提供一种用于促进骨形成的药物组合物，包括莪术二酮、白果新酸和药学上可接受的辅料。

进一步的，莪术二酮和白果新酸的质量比为4:1。

进一步的，药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂或注射剂。

本发明利用天然中药提取物莪术二酮与药食同源植物有效成分白果新酸联用，具有显著的促间充质干细胞向成骨细胞分化及促成骨作用，以其为活性成分制备的促进成骨的药物可促进间充质干细胞向成骨细胞分化、促进成骨细胞的成骨作用，促进骨再生，改善骨新生缓慢的病理状态。作为一个有效的骨折以及骨质疏松等治疗方案，为莪术二酮联合白果新酸制剂开发了新的用途，同时也为骨折以及骨质疏松患者提供了新的治疗药物，为促进骨形成的临床治疗提供了新的方法。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为莪术二酮联合白果新酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响；

图2为莪术二酮联用白果新酸对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响；其中：2A为碱性磷酸酶活性分析莪术二酮与白果新酸联用对成骨细胞的影响； 2B为成骨细胞钙化结节染色检测莪术二酮与白果新酸联用的影响；*表示P＜ 0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001；

图3为莪术二酮联用白果新酸对成骨分化相关基因表达水平的影响；

图4为制作大鼠股骨骨折模型后，X-ray检查莪术二酮联用白果新酸对SD 大鼠股骨骨折愈合的影响；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001；

图5为制作大鼠股骨骨折模型后，micro-CT检查莪术二酮联用白果新酸对 SD大鼠股骨骨折愈合的影响；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。

下述实施例所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了莪术二酮联合白果新酸在制备促进骨形成药物中的应用。

具体的，提供了莪术二酮联合白果新酸在制备治疗骨质疏松、骨坏死、骨折愈合迟缓的药物中的应用。

具体的，莪术二酮和白果新酸的质量比为4:1。

具体的，药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂或注射剂，莪术二酮和白果新酸在药物组合物中的质量百分含量为10％-90％。

实施例1

本实施例提供一种莪术二酮联合白果新酸胶囊剂，其制备方法为：称取莪术二酮400mg与白果新酸100mg，加入4000mg微晶纤维素、500mg羧甲基淀粉钠、400mg十二烷基硫酸钠辅料充分混合均匀，采用辊压法干法制粒，再与适量的硬脂酸镁混合混匀，填充入3#空心胶囊，制成规格为8mg/粒的胶囊剂供口服使用。

实施例2

本实施例提供一种莪术二酮联合白果新酸片剂，其制备方法为：称取莪术二酮400mg与白果新酸100mg，再加入2000mg淀粉、150mg交联PVP、400mg羧甲基淀粉钠混合均匀，用5％PVP的75％乙醇溶液作粘合剂，制备软材，然后用 18目筛制粒，65℃干燥后2h，20目整粒后加入适量滑石粉，混合均匀，压制成片，制成规格为12mg/片的片剂供口服使用。

实施例3

本实施例提供一种莪术二酮联合白果新酸注射剂，其制备方法为：称取莪术二酮800mg与白果新酸200mg，加枸橼酸钠500mg，氯化钠1800mg，加1000ml 的注射用水，搅拌使溶解，除菌滤过，灌封，经15分钟的100℃流通蒸汽灭菌，制成每支2mg/2ml的注射液供注射使用。

实施例4

本实施例为莪术二酮联用白果新酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响。

4.1药物与试剂

莪术二酮、白果新酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

胎牛血清(FBS)购自Capricorn Scientific，二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma。

4.2实验方法

骨髓来源的间充质干细胞的培养：

取36岁，男性健康志愿者捐献的骨髓，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心收集单核细胞，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次后，将这些单核细胞直接种于细胞培养瓶中，加入含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素及10％胎牛血清(Invitrogen公司)的α-MEM(Invitrogen公司)培养基，置于37℃、5％CO₂的温箱中孵育，继续培养5-7天(换液周期为3天/次)，可以观察到间充质干细胞集落形成。细胞扩增后，取P3～P8代用于相关实验。以MTT法测定药物对骨髓间充质干细胞的毒性，实验重复3次以上。

实验分组及给药：

将莪术二酮与白果新酸溶解于DMSO溶液，配制成工作液，以此验证不同浓度的莪术二酮与白果新酸对间充质干细胞增殖的影响。以MTT法测定细胞的活力。将间充质干细胞接种于96孔细胞培养板(100μL/孔)，37℃5％CO₂培养箱中培养过夜，待细胞贴壁。24h后，每组加入80μM莪术二酮和(或)20μM 白果新酸，每组2个复孔。化合物持续处理24、48、72h后，每孔加入10μL MTT 液，继续孵育4h，终止反应，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO，中低速震荡溶解结晶15min，用酶联免疫检测仪测定每孔OD值。实验设不接种细胞且用完全培养基代替化合物组(空白组)和接种细胞且用完全培养基代替化合物组 (对照组)。

按下列公式计算细胞生长抑制率：

抑制率＝[(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)]×100％

根据药物在不同剂量下对细胞增殖的抑制率,计算出IC50值用于比较分析。

统计方法：

计量资料用均数±标准差表示，采用SPSS16.0软件行ANOVA方差分析并以 LSD-t检验进行组间比较，P<0.05可认为具有统计学意义。

4.3实验结果

如图1所示，结果表明，80μM的莪术二酮联合白果新酸对细胞活性没有抑制，也无显著的毒性作用，表明该药物对间充质干细胞是安全的。

实施例5

本实施例研究莪术二酮与白果新酸联用对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。

5.1药物与试剂

4％中性甲醛、0.25％磷酸蛋白酶、碱性磷酸酶显色试剂盒、茜素红染色液购于北京索莱宝科技有限公司。

5.2实验方法

取P3～P8代间充质干细胞用于相关实验。为研究莪术二酮与白果新酸联用对间充质干细胞向成骨分化的影响，采用经典的间充质干细胞在体外诱导成骨分化的平台。并在此分化过程中添加莪术二酮、白果新酸、莪术二酮联用白果新酸研究对成骨分化的效果，对照处理为非诱导组。在诱导分化的第7天，将培养板中培养基去掉，加入PBS洗涤2次，然后采用4％中性甲醛固定，采用碱性磷酸酶(ALP，成骨分化中特异性标志物)染色法，进行定性与定量处理。在 560nm下测定吸光度值进行定量，实验重复3次以上。实验结果如图2A所示。

实验方法与内容同上，诱导分化的第12～14天，将培养板中培养基去掉，加入PBS洗涤2次，然后采用4％中性甲醛固定，采用茜素红染色法，对间充质干细胞成骨分化过程中最重要的成分钙(Ca²⁺)的沉积，进行定性检测与定量测量的处理。在560nm下测定吸光度值进行定量，实验重复3次以上。实验结果如图2B所示。

统计方法：

5.3实验结果

如图2A所示，莪术二酮联用白果新酸组的成骨分化标志物碱性磷酸酶(ALP) 表达显著增加。同时对各组进行ALP绝对值含量测定，也证实实验结果。结果表明，莪术二酮联用白果新酸可明显促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

由图2B茜素红染色检测可知，钙在间充质干细胞的收集与成骨聚集在莪术二酮联用白果新酸组显著增加，对钙的定量也证实这一结果。该结果表明莪术二酮联用白果新酸可明显促进骨髓间充质干细胞成骨分化，促进钙在细胞中的累积及基质的形成。

实施例6

本实施例是通过RT-qPCR实验检测莪术二酮与白果新酸联对成骨细胞分化基因表达水平的影响。

6.1药物与试剂

莪术二酮、白果新酸等购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

Trizol、PrimeScript^TM RT Master Mix、

Premix Ex Taq^TM II和无 RNA酶水购自大连Takara公司。

6.2实验方法

取P3～P8代间充质干细胞用于相关实验。细胞经80μM莪术二酮和(或) 20μM白果新酸给药处理并培养6d后，加入1ml Trizol吹打转移至1.5ml EP 管中，静置5min；加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，静置5min；4℃，12000 g，离心15min，取上清液转移至另一新的1.5ml EP管中；加入0.5ml异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀后，室温静置10min；4℃，12000g，离心10min，弃上清，管底沉淀即为RNA；加入1ml 75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤EP管壁； 4℃，7500g，离心5min，弃上清；室温晾干样品；加入适量RNase-free water 溶解沉淀；取2μLRNA样品进行定量；按以下的配方于冰上操作配制逆转录反应体系，配制好体系后，混匀，离心，放入PCR仪，进行PCR：37℃15分钟(反转录反应)，85℃5秒(反转录酶的失活反应)，最后生成的产物cDNA，95℃激活PCR反应，94℃变性45s，60℃退火34s，72℃扩增1min，从变性至扩增共35个循环，最后72℃延伸10min，反应结束后确认扩增曲线、融解曲线及 Ct值，根据2^-△△Ct法计算各成骨相关基因RUNX2、BSP、OCN以及COL1A1的相对表达量，实验结果如图3所示。

统计方法：

6.3实验结果

由图3可知，分组干预6d后，莪术二酮与白果新酸联合处理比两药分别单独作用时成骨分化相关基因RUNX2、BSP、OCN和COL1A1的表达水平显著升高。

实施例7

本实施例为莪术二酮与白果新酸联合用药促进大鼠股骨骨折愈合的研究结果。

7.1大鼠股骨骨折模型制作及愈合情况实验

取12周成年健康雄性SD大鼠，体重260g左右，适应性饲养7d后随机分组法分为4组：对照组、莪术二酮组、白果新酸组、莪术二酮联合白果新酸治疗组，每组5只，作骨科股骨横断骨折模型。股骨横断骨折在骨科中属于严重创伤，愈合难度较大，在造模的过程中同时进行冲洗骨髓腔的操作，增大愈合难度。在造模3天后各组予以等量生理盐水、莪术二酮及白果新酸部位注射，注射6周分别处死各组大鼠，取股骨予X-ray、micro-CT检测，其结果如图4、图5所示。

统计方法：

7.2实验结果

X-ray检查莪术二酮联合白果新酸对SD大鼠股骨骨折的愈合情况如图4所示，结果显示6周后骨痂塑形改建,，骨折愈合，莪术二酮与白果新酸联合用药组骨痂形成、骨折愈合较对照组明显，与单独的莪术二酮或白果新酸用药相比的愈合效果更佳。

micro-CT检查的图片如图5所示，在6周时莪术二酮联合白果新酸在骨小梁立体测量学的指标与对照组的差异有统计学意义，在6周时莪术二酮联合白果新酸组的BV、TV分别比对照组高，结果有统计学意义(P<0.05)。结果表明，莪术二酮与白果新酸联用能促进骨折部位骨小梁较早的形成和改建，促进矿盐的沉积，促进骨折愈合。

本发明利用天然中药提取物莪术二酮与药食同源植物有效成分白果新酸联用具有显著的促间充质干细胞向成骨细胞分化及促进骨形成作用，以其为活性成分制备的促进骨形成的药物可促进间充质干细胞向成骨细胞分化、促进成骨细胞的成骨作用，促进骨再生，改善骨新生缓慢的病理状态，同时对间充质干细胞无明显生物毒性。有助于治疗因骨再生与骨重建异常导致的骨质疏松、骨坏死以及各种骨折愈合迟缓等，为莪术二酮联合白果新酸制剂开发了新的用途，同时也为骨折以及骨质疏松患者提供了新的治疗药物，具有非常好的开发应用前景。

以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。

Claims

1.莪术二酮联合白果新酸在制备促进骨形成药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，莪术二酮联合白果新酸在制备治疗骨质疏松、骨坏死、骨折愈合迟缓的药物中的应用。

3.一种用于促进骨形成的药物组合物，其特征在于，包括莪术二酮、白果新酸和药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述莪术二酮和白果新酸的质量比为4:1。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂或注射剂。