KR101902832B1

KR101902832B1 - 조골 및 파골 세포의 분화 억제용 조성물 및 골질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물

Info

Publication number: KR101902832B1
Application number: KR1020180062660A
Authority: KR
Inventors: 문태철; 홍은미; 민상현; 김근중; 이태훈
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2018-10-01
Anticipated expiration: 2038-05-31

Abstract

본 발명은 특정 화합물을 포함함으로써, 조골 세포 분화를 억제할 뿐만 아니라 파골 세포 분화 또한 억제하는 효과를 가져, 치주염 등을 포함하는 골질환에 대한 우수한 약효 및 건강기능성을 나타낼 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

조골 및 파골 세포의 분화 억제용 조성물 및 골질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 {Composition for inhibiting differentiation of osteoblast and osteoclast and medicinal composition for preventing or treating bone diseases}

본 발명은 조골 및 파골 세포의 분화 억제용 조성물, 골질환의 예방 또는 치료용 의약적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

골조직은 파골 세포(osteoclast)에 의한 골흡수와 조골 세포(osteoblast)에 의한 골형성 과정이 지속적으로 유지되고 있다. 조골 세포는 골 형태발생 단백질 2 (Bone Morphogenetic Protein 2, BMP2) 등의 신호인자에 의해 분화가 촉진된다. 조골 세포 분화의 후기 단계에서 생성되는 RANKL(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-β Ligand) 신호전달물질에 의해 파골 세포의 분화가 촉진되며 분화가 완료되면 세포자멸(apoptosis)이 일어난다. 따라서 두 세포의 분화 및 활성의 조화가 정상적인 골재생 과정에 중요하다. 그러나 조골 세포 분화를 억제하는 인자는 대개 파골 세포 분화를 촉진하거나 영향을 주지 않는다고 알려져 있다.

한편, 치주염증은 치근단 세균감염에 대한 면역세포의 방어작용에 의한 염증반응으로 급성과 만성으로 나뉠 수 있다. 치주염증에 주로 관여하는 호중구는 염증매개물질인 프로스타글란딘을 분비한다. 프로스타글란딘 등의 세포신호전달 물질에 의해 골조직을 흡수하는 파골 세포가 활성화되어 염증부위 주변의 치조골 소실이 관찰된다. 만성치주염 치료제 개발을 위해 골재생 촉진제 또는 골흡수 억제제 개발이 요구된다.

또한, 비정상적인 뼈의 성장을 억제하고 정상적인 골재생 과정을 회복하기 위한 조골 세포 분화 억제제 및 파골 세포 억제제 개발이 요구된다.

일본공개특허 2012-107933

본 발명은 특정 화합물을 포함하는 조골 및 파골 세포 분화 억제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 특정 화합물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 효과를 가지는 특정 화합물을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조골 및 파골 세포 분화 억제용 조성물:

[화학식 1]

.

2. 위 1의 조성물을 포함하는 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 관절염, 치주염으로이루어진 군에서 선택된 골질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

3. 위 1의 조성물을 포함하는 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 관절염, 치주염으로 이루어진 군에서 선택된 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.

본 발명의 조성물은 조골 세포 분화를 억제할 뿐만 아니라 파골 세포 분화 또한 억제하는 효과를 가짐으로써 치주염 등을 포함하는 골질환에 대한 우수한 약효 및 건강기능성을 나타낼 수 있다.

도 1은 4가지 cell line MG63(A), U2OS(B), MC3T3E1(C), U393(D)에 본 발명 화합물을 농도별(2~10μM)로 처리했을 때 세포생존능을 평가한 결과이다.
도 2는 마우스 골수에서 분리한 단핵세포에 RANKL과 함께 본 발명 화합물을 처리하여 파골 세포 분화능에 미치는 영향을 Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) activity assay kit(Sigma-Aldrich, 387A-1kt)를 사용하여 확인한 결과이다.
도 3은 293T 세포에 AP1 또는 NFkB에 반응하는 luciferase 벡터를 도입시키고 본 발명 화합물을 처리하여 AP1과 NFkB의 발현 억제능을 reporter assay로 확인한 결과이다.
도 4는 마우스 두개골 세포에서 분리한 조골세포의 전구세포에 hBMP2와 함께 본 발명 화합물을 처리하여 조골세포 분화능에 미치는 영향을 alkaine phosphatase(ALP)의 활성을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 마우스 두개골 세포에서 분리한 조골세포의 전구세포에 hBMP2와 함께 본 발명 화합물을 농도별로 처리하여 조골세포 분화능에 미치는 영향을 alkaine phosphatase(ALP)의 활성을 통해 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조골 및 파골 세포 분화 억제용 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함한다.

[화학식 1]

본 발명에 포함되는 화학식 1로 표시되는 화합물은 천연으로부터 유래될 수도 있고, 공지의 화학적 합성 방법을 이용하여 합성될 수도 있다.

화학식 1로 표시되는 화합물의 염은 약학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 염일 수 있다. 염은 예를 들면 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산， 인산, 황산， 브롬화수소산, 요드화수소산， 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트， 페닐-치환된 알카노에이트， 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류， 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적 또는 식품학적으로 무독한 염류로는 설페이트， 피로설페이트， 바이설페이트， 설파이트， 바이설파이트, 니트레이트， 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트， 메타포스페이트， 피로포스페이트 클로라이드， 브로마이드， 아이오다이드, 플루오라이드， 아세테이트 프로피오네이트， 데카노에이트， 카프릴레이트， 아크릴레이트， 포메이트， 이소부티레이트， 카프레이트， 헵타노에이트， 프로피을레이트, 옥살레이트， 말로네이트， 석시네이트， 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트， 말리에이트， 부틴- 1,4-디오에이트, 핵산 -1，6-디오에이트, 벤조에이트， 클로로벤조에이트， 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트， 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트， 벤젠설포네이트， 를투엔설포네이트， 클로로벤젠설포네이트， 크실렌설포네이트， 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트， 페닐부티레이트， 시트레이트， 락테이트， β_하이드톡시부티레이트, 글리콜레이트， 말레이트， 타트레이트 메탄설포네이트， 프로판설포네이트， 나프탈렌 -1-설포네이트 나프탈렌 -2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

상기 산 부가염은 통상의 방법， 예를 들면， 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고， 이 염을 수화성 유기 용매, 예를 들면 메탄을， 에탄을， 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 화학식 1로 표시되는 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고， 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한， 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고， 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때， 금속염으로는 나트륨， 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한， 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예를 들어，질산은)과 반응시켜 얻는다.

뼈는 살아 있는 조직이기 때문에 오래된 뼈는 일정하게 파괴되고 다시 새로운 뼈를 만들어내는 재형성 과정을 거친다. 이러한 과정 중에서 파골 세포는 오래되어 불필요하게 된 뼈 조직을 파괴하여 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지할 수 있도록 도와주고 조골 세포는 파괴된 뼈를 다시 재생시키는 역할을 한다. 이 작용은 하루 24시간 계속 일어나며 1년에 성인의 뼈의 약 10 - 30%가 이런 식으로 다시 만들어진다. 그러므로 파골 세포와 조골 세포 간의 균형은 매우 중요하며, 이 균형은 여러 호르몬과 기타 몸의 화학 성분 등에 의해 조절된다.

일반적으로 알려진 조골 세포의 골형성, 파골 세포의 골흡수에 영향을 미치는 물질들은 조골 세포 분화를 억제하는 경우 대개 파골 세포 분화를 촉진하거나 영향을 주지 않는다. 그런데, 본 발명자들은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 경우 조골 세포 분화를 억제함과 동시에 파골 세포 분화도 억제함을 발견하였고, 이에 본 발명을 고안하였다.

본 발명의 조골 및 파골 세포 분화 억제용 조성물은 투여된 개체에서의 조골 세포 분화와 파골 세포 분화를 억제할 수 있다. 이에, 조골 세포로부터의 골형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 파골 세포로부터의 골흡수를 억제할 수 있어, 조골 작용과 파골 작용의 조절이 가능하고, 이에 따라 조골 작용과 파골 작용의 균형이 붕괴되어 발생할 수 있는 다양한 골질환에 대해 약효, 건강기능성을 나타내는 조성물로서 활용될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 조골 및 파골 세포 분화 억제용의 의약 조성물일 수 있고, 또한 조골 및 파골 세포 분화 억제용 건강기능식품일 수 있다.

상기 골질환은 조골 세포와 파골 세포의 활성 불균형에 의해 유발되는 골질환으로서 이는 예를 들면 골결손, 골다공증, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골 관절염, 치주염, 골종양, 골암 등일 수 있고, 구체적으로는 골종양, 골암, 치주염일 수 있다.

상기 골암의 경우, 뼈의 비정상적인 성장에 의해 발생하며, 원발성 악성 종양 중 가장 흔한 골육종암은 10대 성장기에 가장 많이 발생한다. 팔, 다리, 골반 등 인체의 뼈 조직 어디에서나 일어날 수 있으며, 주로 무릎 주변의 뼈에서 잘 발생한다. 골암 조직은 정상적인 뼈 조직과 달리 골밀도가 감소된 형태로 생성되어 병리학적 골절을 일으킬 수 있다. 골종양 치료를 위해 절단수술, 방사능 치료, 약물투여 등을 시행한다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물은 비정상적인 뼈의 성장을 억제하고 정상적인 골재생 과정을 회복할 수 있으므로, 이러한 골암에 대해 약효를 나타낼 수 있다.

상기 치주염증은 치근단 세균감염에 대한 면역세포의 방어작용에 의한 염증반응이다. 치주염증에 주로 관여하는 호중구는 염증매개물질인 프로스타글란딘을 분비한다. 프로스타글란딘 등의 세포신호전달 물질에 의해 골조직을 흡수하는 파골 세포가 활성화되어 염증부위 주변의 치조골 소실이 관찰된다. 또한, 만성치주염은 지속적인 치주근단 부분의 염증 및 치조골 부식을 나타내는 데, 치주염이 악화되어 치아를 살릴 수 없는 경우 발치를 하고 임플란트를 시행한다. 이를 예방하기 위해 치주염 초기단계에서 감염을 일으키는 세포수 감소를 위한 항생제 투여 및 염증매개물질에 의한 파골세포 활성화를 극복할 수 있는 파골세포 억제제(상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물)를 투여하여 만성치주염의 완화 및 치료를 기대할 수 있다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물은 골흡수 억제의 효과를 통해 치주염증의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명의 의약 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함한다.

본 발명에서 "예방"이란, 골질환을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 "치료"란, 골질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 의약적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 의약 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명에서 "의약적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.

나아가 본 발명의 의약 조성물은 종래에 알려져 있는 골질환의 치료물질과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 본 발명의 의약 조성물은 골질환의 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에서 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 골질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

필요에 따라, 본 발명의 의약 조성물은 공지의 항골질환 화합물을 추가적으로 포함할 수 있다.

이러한 항골질환 화합물로는 신코닌, 갈색거저리 추출물, 알로에-이모딘 및 오메가-3 지방산, 아르테아뉴인 B, 인돌-2-카르복실레이트 유도체, 유포비아 인자 L1, 스컬캅플라본 유도체, 프락시넬론 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 의약 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 0.01~1000mg/kg/day로, 바람직하게는 0.1~500㎎/kg/day로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함한다.

상기 골질환은 전술한 범위 내의 것일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.

상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 건강기능식품을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

하기의 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 #35라 표현하고 사용하였다.

실시예 1. 세포독성 평가를 위한 MTT assay

4가지 cell line(MG63, U2OS, MC3T3E1, U393)에 #35를 농도별(2~10uM) 처리했을 때의 세포생존능을 평가했다. 24well plate에 well당 0.5x10⁴~0.1x10⁵개의 세포를 넣고 동시에 #35를 처리한 뒤 7일간 배양했다. 이 후 세포생존능 분석 시약(DoGen, EZ-3000)을 배지 용량의 1/10 로 처리 후 37℃에 30분간 배양하고 450nM에서 확인했다.

도 1을 참조하면, 본 발명 화합물은 세포생존능에 영향을 주지 않는 것으로 확인되는 바, 세포독성은 없는 것으로 보인다.

실시예 2. 마우스 골수세포의 분리 및 파골세포의 분화

12주령 암컷 마우스의 골수(bone marrow)를 관골(hip bone), 넙다리뼈(femur) 및 정강뼈(tibia)에서 분리하여 대식세포 콜로니 자극인자(Macrophage Colony Stimulating Factor, M-CSF, PeproTech, cat# 315-02, 30ng/ml)가 포함된 α-MEM 배지(Gibco, 12561-056, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 3일 동안 배양하여 단핵세포(monocyte)만을 분리하였다. 분리한 단핵세포에 RANKL(PeproTech, cat# 315-11, 50ng/ml)을 처리하여 파골 세포 분화를 유도하였다. 여기에 PIN1 inhibitor #35(10μM)를 함께 처리하여 3일 또는 5일 동안 배양하였다.

실시예 3. 파골세포 분화 억제능 분석을 위한 TRAP 염색 및 분석

마우스 골수에서 분리한 단핵세포 1x10⁴개를 96 well plate에 넣고 RANKL과 함께 처리하여 PIN1 inhibitor #35(10μM)가 파골 세포 분화능에 미치는 영향을 확인하였다. 파골 세포 분화시 발현이 증가하는 Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)의 활성을 TRAP activity assay kit(Sigma-Aldrich, 387A-1kt)를 사용하여 확인하였다.

염색 후 현미경으로 파골 세포 분화시 형성되는 다핵 세포를 현미경으로 확인하였으며, well당 12 장의 이미지를 찍어 다시 하나의 well 이미지로 합친 뒤 이를 Image J software를 이용하여 전체 면적당 분화면적비율을 도 2(A)에 나타내었다.

또한 분화된 파골세포수를 세어 도 2(B)에 나타내었고, 분화된 파골세포 안에 내재된 세포핵의 개수가 3-5개, 6-10개, 11-20개, 21개 이상인 파골세포를 구분하여 도 2(C)에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 본 발명 화합물을 처리시에 정상적으로 파골세포를 분화시킨 그룹에 비해 분화면적, 파골세포의 수, 거대다핵세포 모두 유의하게 줄어든 것을 확인할 수 있는 바, 본 발명 화합물의 파골세포 분화 억제능을 확인할 수 있다.

실시예 4. 파골세포 분화 억제능 분석을 위한 Reporter assay

파골세포의 분화과정에 있어, NFkB와 AP1 단백질은 파골세포의 세포자멸을 막고, 파골세포의 분화를 돕는 신호전달체로서 역할한다. 따라서, NFkB와 AP1의 단백질 발현 억제를 확인한다면, 파골세포 분화 억제능을 확인할 수 있다.

도 3을 참조하면, 293T 세포(Human embryonic kidney cells 293)에 NFkB 또는 AP1에 반응하는 luciferase 벡터를 도입시키고 본 발명 화합물을 처리하여 확인한 결과, NFkB와 AP1의 발현이 억제됨을 확인할 수 있는 바, 본 발명 화합물의 파골세포 분화 억제능을 확인할 수 있다.

실시예 5. 마우스 두개골 세포의 분리 및 조골세포의 분화

3일령 마우스에서 두개골 세포(calvarial cells)를 분리하여 ascorbic acid (A.A)가 없는 α-MEM 배지(WELGENE, LM008-53, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin)에서 3일 동안 배양하여 조골 세포의 전구세포로 분화를 유도한다. 이 전구세포에 hBMP2(Sino biological, 10426-HNAE 100-200ng/ml) 를 처리하여 조골 세포 분화를 유도한다. 이 때 PIN1 inhibitor #35를 함께 처리하고 2일 마다 배지를 갈아주며 7일 동안 배양한다.

실시예 6. 조골세포 분화 억제능 분석을 위한 ALP 염색

마우스 두개골 세포에서 분리한 조골세포 전구세포 4x10³개를 96 well plate에 넣고 hBMP2 를 처리하여 조골 세포 분화를 유도한다. 이 때 PIN1 inhibitor #35를 함께 처리하여 7일 동안 배양한다. 조골 세포 분화능 분석을 위해 조골 세포 초기 분화단계에서 발현이 증가하는 alkaine phosphatase(ALP)의 활성을 확인하기 위해 분화 유도 7일 후 배지를 버리고, HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution, welgene)로 한 번 세척한 후 차가운 70% 에탄올을 넣고 1시간 동안 세포를 고정한다. 에탄올을 버리고 HBSS로 세척한 후 NBT solution(Sigma, B1911- 100ML)를 well당 100ul를 넣고 37℃에서 10분 동안 염색한다. HBSS로 2번 세척하여 남아있는 염색약을 제거한다.

ALP염색 후 그 발색정도를 Image J software를 이용하여 측정한 뒤 그래프로 나타내어 비교하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 참조하면, hBMP2에 의한 조골세포 분화가 #35(10μM) 처리에 따라 억제됨을 확인할 수 있다.

또한, 상기와 같은 방법으로 #35를 농도별로 처리하였을 때의 발색정도를 측정한 뒤 그래프로 나타내어 비교하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5를 참조하면, hBMP2에 의한 조골세포 분화가 #35의 처리농도가 높아질수록 조골세포 분화 억제능이 증가함을 확인할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물로서,
상기 골질환은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 관절염, 치주염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물:
[화학식 1]

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삭제
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
상기 골질환은 골결손, 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 관절염, 치주염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 건강기능식품:
[화학식 1]

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