DE102017116204A1 - Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, welches die Anwendung von Biomarkern umfasst. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Kombination der Biomarker für die Anwendung in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, ein Computergerät, um ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen und ein Gerät, das geeignet ist, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, welches die Anwendung von Biomarkern umfasst. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Kombination der Biomarker für die Anwendung in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, ein Computergerät, um ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen und ein Gerät, das geeignet ist, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen.
  • Regenerative Therapien zur Reparatur von Herzgewebe stehen in den letzten 16 Jahren im Mittelpunkt der präklinischen und klinischen Entwicklung. Von den verschiedenen Ansätzen wird der direkten Anwendung von Knochenmark-Stammzellen im Herzgewebe immer noch die höchste klinische Aufmerksamkeit seit der Erstanwendung am Menschen 2001 und den anfänglichen vielversprechenden klinischen Prüfungen gewidmet (Stamm C, Westphal B, Kleine HD, et al. Lancet. 2003; 361(9351):45-46; Tse HF, Kwong YL, Chan JK, Lo G, Ho CL, Lau CP. Lancet 2003; 361(9351):47-9; Stamm C, Kleine HD, Choi YH, et al. J Thorac Cardiovasc Surg 2007;133(3):717-25). Allerdings konnten in diesen Prüfungen sowohl klinisch relevante Verbesserungen der LVEF (linksventrikulären Ejektionsfraktion) als auch nicht-responsive Patienten in den Behandlungs- wie auch in den Placebogruppen beobachtet werden (Timothy D H, Lem M, Jay H T, Circulation Research 2016; 119:404-406; Nasseri B A, Ebell W, Dandel M, et al. Eur Heart J. 2014, 35(19):1263-74; Bartunek J, Terzic A, Davison B A et al. Eur. Heart J. 2016 Dec 23. pii: ehw543. doi: 10.1093/eurheartj/ehw543).
  • Dies hat die Frage nach einer Induktion regenerativer, von Stammzellanwendung und potenziellen suppressiven Gefäßreparaturfaktoren unabhängiger Mechanismen, die mit CD34+ endotheliale Vorläuferzellen (EPC) assoziiert werden, aufgeworfen (Werner N, Kosiol S, Schiegl T, et al. http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa043814 N Engl J Med. 2005; 353(10):999-1007). Gemäß der jüngst veröffentlichten These ist zu beachten, dass die zentrale Rolle der peripher zirkulierenden CD133/CD34+ EPC mit einer mangelnden Regeneration des Herzens zusammenhängen könnte (Taylor DA, Perin EC, Willerson JT, et al. Cell Transplant 2016;25(9):1675-1687; Bhatnagar A, Bolli R, Johnstone BH, et al. Am Heart J 2016; 179:142-50; Contreras A, Orozco AF, Resende M, et al. Basic Res Cardiol 2017; 112(1):3.).
  • Der Mechanismus der kardialen Regeneration und die Rolle der durch Knochenmark-Stammzellen regulierten Angiogenese bleibt daher ungelöst.
  • Die Erfinder haben nun ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration identifiziert, welches die Bestimmung von Biomarkern umfasst. Die vorliegende Erfindung richtet sich somit auf ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, welches die Bestimmung von Biomarkern nach Anspruch 1 der vorliegenden Patentanmeldung umfasst. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Kombination der Biomarker für die Anwendung in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, ein Computergerät, um das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen und ein Gerät, das geeignet ist, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich somit auf ein Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, wobei das Verfahren umfasst
    1. (i) Bestimmen der Menge von jedem der folgenden Biomarker in einer Probe eines Patienten, wobei die Biomarker ausgewählt sind aus der Gruppe von Wachstumsfaktor, Lymphozyt-Adapterprotein, Glykoprotein, B-Typ natriuretisches Peptid (BNP), zirkulierender endothelialer Vorläuferzellen (EPC), zirkulierender Endothelzellen (CEC), zirkulierender Thrombozyten, zirkulierender mononukleärer Zellen (MNC) und Subpopulationen und Rezeptor/Ligand Expression auf MNC-Subpopulationen,
    2. (ii) Vergleichen der bestimmten Mengen mit einem Ausgangswert und/oder einer Referenz,
    3. (iii) Vorhersagen auf Basis der Ergebnisse des Vergleichs, ob eine Antwort auf die kardiovaskuläre Reparatur beim Patienten zu erwarten ist, nicht zu erwarten ist oder ambivalent ist.
  • Vorzugsweise ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein ex vivo Verfahren. Ferner kann es Schritte außer den ausdrücklich oben erwähnten umfassen. Zum Beispiel können weitere Schritte Probenvorbehandlungen oder weitere Auswertungen oder Anwendungen von Ergebnissen, die mit dem Verfahren gewonnen werden, betreffen. Das Verfahren kann manuell oder unterstützt durch Automatisierung ausgeführt werden. Vorzugsweise kann Schritt (i) ganz oder teilweise durch Automatisierung unterstützt werden, z. B. durch eine geeignete robotische und sensorische Ausstattung. Schritte (ii) und/oder (iii) können durch Datenverarbeitungseinheiten unterstützt werden, welche die jeweiligen Vergleiche und/oder Vorhersagen ausführen.
  • Vorteilhafterweise kann durch die Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die Vorhersagegenauigkeit der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration auf über etwa 80% verbessert werden, bevorzugter auf über etwa 85%, noch bevorzugter auf über etwa 90%.
  • Der Begriff „Vorhersagen“, wie hier verwendet, bedeutet die Einschätzung der Wahrscheinlichkeit mit der ein Patient einen Nutzen aus der kardialen Stammzelltherapie ziehen wird, in dem Sinne, dass eine funktionelle Verbesserung des kardiovaskulären Systems nach der kardialen Therapie vorliegt, wie hierin an anderer Stelle ausführlich definiert.
  • Wie es der Fachmann verstehen wird, ist eine solche Einschätzung üblicherweise nicht gedacht, bei 100% der Patienten, bei denen eine Diagnose zu stellen ist, korrekt zu sein. Der Begriff erfordert jedoch, dass die Beurteilung bei einem statistisch signifikanten Anteil der Patienten (z. B. einer Kohorte in einer Kohortenstudie) korrekt ist. Ob es sich um einen statistisch signifikanten Anteil handelt, kann vom Fachmann ohne Weiteres mittels diverser bekannter statistischer Analysewerkzeuge ermittelt werden, z. B. durch Bestimmen der Konfidenzintervalle, der p-Wert-Bestimmung, den Student-t-Test, den Mann-Whitney-Test usw. Einzelheiten sind in Dowdy und Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983 zu finden. Bevorzugte Konfidenzintervalle betragen mindestens 90 %, mindestens 95 %, mindestens 97 %, mindestens 98 % oder mindestens 99%. Die p-Werte betragen, vorzugsweise, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, oder 0,0001.
  • Der Begriff „kardiovaskuläre Regeneration“, wie hier verwendet, umfasst die Regeneration und/oder Behandlung und/oder Verbesserung von Erkrankungen, die das kardiovaskuläre System betreffen.
  • Der Begriff „Biomarker“ bezieht sich auf Moleküle, deren Anwesenheit, Abwesenheit oder Menge mit medizinischen Zuständen oder Veranlagungen korrelieren. Biomarker können jegliche Moleküle und/oder Zellen oder Subpopulationen davon sein, die beim Patienten vorkommen. Typischerweise sind Biomarker Proteine, Peptide, kleine Moleküle oder Nukleinsäuren wie DNA oder RNA oder Zellen und Subpopulationen davon. Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff vorzugsweise auf Proteine und Peptide, d. h. auf Wachstumshormone wie VEGF, FGF oder Erythropoietin, auf Lymphozyt-Adapterprotein wie SH2B3, auf Glykoproteine wie Vitronectin oder GCSF, auf B-Typ natriuretisches Peptid wie NT-proBNP, auf Zytokine wie THF, auf Interleukine wie IL-6, IL-8 oder IL-10, auf Interferone wie humanes Interferon-gamma induziertes Protein 10, auf insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindende Proteine wie etwa insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendes Protein-2, und/oder insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendem Protein-3, wobei der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor bevorzugt ausgewählt ist aus IGF2, aus Chemokin-Proteine wie SDF-1 und aus Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexen wie SCF.
  • Ferner, gemäß der vorliegenden Erfindung, beziehen sich die Biomarker auf Zellen und Subpopulationen davon, d. h. auf zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPC), die auf ihren Oberflächen Unterscheidungsgruppen (CD, Cluster of Differentiation) tragen oder nicht tragen wie z. B. CD45, CD117, CD184, CD133 und/oder CD146, zirkulierende Endothelzellen (CEC), die auf ihren Oberflächen CD31, CD133, CD146, CD105 und/oderr CD34 tragen, zirkulierende Thrombozyten, zirkulierende mononukleäre Zellen (MNC) und Subpopulationen und Rezeptor/Ligand Expression auf MNC-Subpopulationen, die CD184, CD309, Zelladhäsionsmoleküle (CAM) und/oder Integrin-Rezeptoren tragen.
  • Die Bestimmung der Menge eines Biomarkers, auf den in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, betrifft das Messen der Menge oder Konzentration, vorzugsweise semi-quantitativ oder quantitativ. Die Messung kann direkt oder indirekt erfolgen. Die direkte Messung betrifft das Messen der Menge oder Konzentration des Biomarkers basierend auf einem Signal, das von dem Biomarker selbst gewonnen wird, und dessen Intensität direkt mit der Anzahl der Biomarkermoleküle, die in der Probe vorhanden sind, korreliert. Dieses Signal - hier manchmal als Intensitätssignal bezeichnet - kann z. B. durch Messung eines Intensitätswerts einer spezifischen physischen oder chemischen Eigenschaft des Biomarkers gewonnen werden. Die indirekte Messung umfasst das Messen eines Signals, das von einer sekundären Komponente (d. h. einer Komponente, die nicht selbst der Biomarker ist) oder einem biologischen Auslesesystem gewonnen wird, z. B. messbare Zellreaktionen, Liganden, Marker oder enzymatische Reaktionsprodukte.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung der Menge eines Biomarkers in einer Probe durch alle bekannten Mittel zur Bestimmung der Menge eines Peptids, Proteins, eines kleinen Moleküls, von Nukleinsäuren wie DNA oder RNA oder einer Zelle oder Subpopulationen davon zu erreichen. Diese Mittel umfassen Immunoassays und Verfahren, die markierte Moleküle in verschiedenen Sandwich-, kompetitiven oder anderen Assayformaten nutzen können. Diese Assays basieren vorzugsweise auf Nachweisagenzien wie Antikörper, die den zu bestimmenden Biomarker gezielt erkennen. Die Nachweisagenzien sollen fähig sein, entweder direkt oder indirekt, ein Signal zu generieren, das auf die Anwesenheit oder Abwesenheit des Biomarkers hinweist. Außerdem kann die Signalstärke, vorzugsweise, mit der Menge an Biomarker in einer Probe direkt oder indirekt (z. B. umgekehrt proportional) korreliert werden. Weitere geeignete Verfahren umfassen die Messung einer physischen oder chemischen Eigenschaft, die für den Biomarker spezifisch ist, wie dessen Molekülmasse oder NMR-Spektrum. Diese Verfahren umfassen, vorzugsweise, Biosensoren, optische Geräte gekoppelt mit Immunoassays, FACS-Analyse, Biochips, Analysegeräte wie Massenspektrometer, NMR-Analysatoren oder Chromatographie-Geräte. Ferner umfassen die Verfahren auf ELISA basierende Mikrotiterplatten-Verfahren, vollautomatisierte oder robotische Immunoassays, enzymatische Kobalt-Bindungsassays und Latex-Agglutinationsassays.
  • Vorzugsweise umfasst die Bestimmung der Menge eines Biomarkers die Schritte (a) Zusammenbringen einer Zelle, die eine Zellreaktion auslösen kann, deren Intensität auf die Menge des Biomarkers schließen lässt, mit diesem Biomarker für eine bestimmte Zeitdauer, (b) das Messen der Zellreaktion. Für die Messung von Zellreaktionen wird die Probe oder aufbereitete Probe, vorzugsweise, einer Zellkultur zugegeben und eine interne oder externe Zellreaktion gemessen. Die Zellreaktion kann die messbare Expression eines Reportergens oder die Sekretion einer Substanz, z. B. eines Peptids oder eines kleinen Moleküls, umfassen. Die Expression oder Substanz erzeugt ein Intensitätssignal, das mit der Menge des Biomarkers korreliert.
  • Auch umfasst vorzugsweise die Bestimmung der Menge eines Biomarkers den Schritt, ein spezifisches Intensitätssignal, das von dem Biomarker in der Probe gewonnen werden kann, zu messen. Wie oben beschrieben, kann das Signal die beobachtete Signalintensität bei einer m/z Variablen sein, die für den Biomarker, der in Massenspektren oder einem spezifischen NMR-Spektrum des Biomarkers beobachtet wird, spezifisch ist
  • Der Begriff „Menge“, wie hier verwendet, umfasst die absolute Menge eines Biomarkers, die relative Menge oder Konzentration des Biomarkers sowie jeglichen Wert oder Parameter, der damit korreliert oder daraus abgeleitet werden kann. Diese Werte oder Parameter umfassen die Intensitätssignalwerte von allen spezifischen physischen oder chemischen Eigenschaften, die von den Peptiden mittels direkter Messungen, z. B. Intensitätswerte aus Massenspektren oder NMR-Spektren, erhalten werden. Außerdem umfasst sind alle Werte oder Parameter, die mittels indirekter Messungen, die in dieser Beschreibung an anderer Stelle angegeben sind, erhalten werden, z. B. Reaktionswerte bestimmt aus biologischen Auslesesystemen als Antwort auf die Peptide oder Intensitätssignale, die von spezifisch gebundenen Liganden gewonnen werden. Es versteht sich, dass Werte, die mit den vorgenannten Mengen oder Parameter korrelieren, auch mit allen standardmäßigen mathematischen Operationen ermittelt werden können und ohne Dimensionen verwendet werden können, z. B. in Bewertungssystemen, wie an anderer Stelle hierin beschrieben.
  • Der Begriff „Vergleichen“, wie hier verwendet, umfasst das Vergleichen der Menge des Biomarkers, den die zu analysierende Probe umfasst, mit einer Menge einer geeigneten Referenzquelle, die in dieser Beschreibung an anderer Stelle angegeben ist. Es versteht sich, dass Vergleichen, wie hier verwendet, einen Vergleich der entsprechenden Parameter oder Werte betrifft, z. B. wird eine absolute Menge mit einer absoluten Referenzmenge verglichen, während eine Konzentration mit einer Referenzkonzentration verglichen wird oder ein Intensitätssignal, das von einer Testprobe erhalten wird, mit dem gleichen Typus von Intensitätssignal einer Referenzprobe verglichen wird. Jedoch, ist entsprechend der vorliegenden Erfindung ebenso angedacht, einen Wert auf Basis der gemessenen Mengen des Biomarkers zu berechnen. Der Wert wird mit Referenzintervallen verglichen, die aus einer multivariaten Diskriminanzanalyse abgeleitet wurden, die an Mengen aus einem Kollektiv von Patienten durchgeführt wurde, welches vordefinierte Responder oder Nicht-Responder der kardialen Stammzelltherapie umfasst. Weitere Einzelheiten dazu sind in den beiliegenden Beispielen unten zu finden.
  • Der Vergleich, auf den in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hingewiesen wird, kann manuell oder computergestützt ausgeführt werden. Für einen computergestützten Vergleich kann der Wert der bestimmten Menge mit den entsprechenden Werten geeigneter Referenzen, die von einem Computerprogramm in einer Datenbank gespeichert sind, verglichen werden. Das Computerprogramm kann das Ergebnis des Vergleichs weiter auswerten, d. h. die gewünschte Bewertung in einem geeigneten Ausgabeformat automatisch bereitstellen. Vorzugsweise wird diese Bewertung mittels maschinellem Lernen (ML) ausgeführt. Auf Basis des Vergleichs der bestimmten Mengen und der Referenz ist es möglich, eine Antwort auf die kardiale Regeneration vorherzusagen, z. B. eine Funktionsverbesserung des Herzens nach kardialer Stammzelltherapie. Insbesondere soll es möglich sein, vorherzusagen, ob eine hohe Wahrscheinlichkeit (d. h. der Patient wird ein Responder sein), eine niedrige Wahrscheinlichkeit (d. h. der Patient wird ein Nicht-Responder sein) besteht oder der Patient ambivalent ist. Deshalb ist die Referenzmenge so auszuwählen, dass es entweder ein Unterschied oder eine Ähnlichkeit bei den verglichenen Mengen ermöglicht, jene Probanden zu identifizieren, die in die Gruppe mit Patienten gehören, die ein Symptom einer akuten Inflammation zeigen, und entweder eine ischämische oder eine nicht-ischämische zerebrale Schädigung aufweisen. Das Verfahren ermöglicht es, einen Patienten entweder als einen Patienten, der (i) an einer ischämischen zerebralen Schädigung oder (ii) an einer nicht-ischämischen zerebralen Schädigung leidet, auszuschließen (rule-out) oder zu identifizieren (rule-in).
  • Der Begriff „Referenz“, wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Wert, Schwellenwert oder ein Intervall basierend auf den Mengen der Biomarker, die es ermöglichen, einen Patienten entweder in die Patientengruppe, bei denen ein Nutzen durch die kardiale Therapie erwartet werden kann, bei denen kein Nutzen durch die kardiale Therapie erwartet werden kann bzw. die ambivalent sind, zuzuordnen.
  • Diese Referenz kann ein Schwellenbetrag sein, die diese Gruppen voneinander trennt. Ein geeigneter Schwellenbetrag, welcher die zwei Gruppen trennt, kann ohne weiteres anhand von statistischen Prüfungen, die hierin an anderer Stelle genannt sind, auf Basis der Mengen der Biomarker entweder eines Patienten oder einer Gruppe von Patienten, von denen bekannt ist, dass sie von der kardialen Therapie profitieren oder eines Patienten oder einer Gruppe von Patienten, von denen bekannt ist, dass sie nicht von der Therapie profitieren oder jener, von denen bekannt ist, dass sie ambivalent sind, berechnet werden.
  • Eine Referenz kann, im Prinzip, auch für eine Kohorte von Patienten, wie oben angegeben, auf Basis der Durchschnitts- oder Mittelwerte unter Anwendung statistischer Standardverfahren für einen gegebenen Biomarker berechnet werden. Insbesondere ist die Genauigkeit eines Tests, wie eines Verfahrens, das die Diagnose eines Ereignisses zum Ziel hat oder nicht, am besten durch dessen Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve zu beschreiben (siehe insbesondere Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577). Entsprechend kann die Referenz, die im vorgenannten Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, generiert werden, indem eine ROC-Kurve für die Kohorte, wie oben beschrieben, erstellt und ein Schwellenbetrag daraus abgeleitet wird. In Abhängigkeit von der erwünschten Sensitivität und Spezifität eines diagnostischen Verfahrens ermöglicht die ROC-Kurve die Ableitung von geeigneten Schwellenwerten.
  • Der Begriff „Probe“ bezieht sich auf eine Probe einer Körperflüssigkeit und, vorzugsweise, auf eine Probe von (Voll)blut, Plasma oder Serum. Der Begriff umfasst jedoch auch alle Proben, die von dem vorgenannten Vollblut, Plasma oder Serum durch z. B. Vorbehandlungsschritte gewonnen werden, wie Blutbestandteile des Vollbluts, Plasmas oder Serums, die z. B. durch Teilaufreinigung erhalten werden.
  • Der Begriff „Patient“, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Tier, vorzugsweise auf ein Säugetier und insbesondere auf einen Menschen. Der Patient soll einer kardialen Therapie bedürfen. Vorzugsweise leidet ein Patient, der einer kardialen Therapie bedarf, an einer kardialen Erkrankung wie Herzversagen oder koronarer Arterienerkrankung, z. B. nach Myokardinfarkt und, insbesondere, an Herzversagen.
  • Die Vorhersage, die gemäß dem Verfahren der Erfindung getroffen wird, ermöglicht auch die Bewertung, ob die Wahrscheinlichkeit hoch ist und daher erwartet wird, dass eine Funktionsverbesserung des kardialen Systems bei einem Patienten auftritt, oder ob die Wahrscheinlichkeit so ist, dass der Therapieerfolg ambivalent ist, oder ob die Wahrscheinlichkeit niedrig ist und daher erwartet wird, dass eine Funktionsverbesserung des kardialen Systems bei einem Patienten nicht auftreten wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Kombination von Biomarkern ausgewählt aus der Gruppe von Wachstumsfaktor, Lymphozyt-Adapterprotein, Glykoprotein, B-Typ natriuretisches Peptid (BNP), zirkulierender endothelialer Voräuferzellen (EPC), zirkulierender Endothelzellen (CEC), zirkulierender Thrombozyten, zirkulierender mononukleärer Zellen (MNC) und Subpopulationen und Rezeptor/Ligand Expression auf MNC-Subpopulationen für die Anwendung in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration.
  • Auch richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Computergerät, umfassend einen Prozessor und einen Speicher, der ein oder mehrere mit dem Prozessor gekoppelte maschinelle Lernmodelle verschlüsselt, wobei die Programme den Prozessor ein Verfahren ausführen lassen, das Verfahren umfassend
    1. (i) Vergleichen der bestimmten Mengen des/der Biomarker(s) gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem Ausgangswert und/oder einer Referenz,
    2. (ii) Vorhersagen, auf Basis der Ergebnisse des Vergleichs, ob eine Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration beim Patienten zu erwarten ist, nicht zu erwarten ist oder ambivalent ist.
  • Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Gerät, das geeignet ist, das erfinderische Verfahren auszuführen, umfassend
    • (i) eine Analyseeinheit zur Bestimmung der Menge von jedem der Biomarker gemäß der vorliegenden Erfindung in der Probe des Patienten, und
    • (ii) ein Computergerät gemäß der vorliegenden Erfindung (wie oben genau beschrieben).
  • Der Begriff „Gerät“, wie hierin verwendet, betrifft ein System, welches die vorgenannten Einheiten umfasst, die operativ miteinander verbunden sind, um die Diagnose gemäß den Verfahren der Erfindung zu ermöglichen. Bevorzugte Nachweisagenzien, die für die Analyseeinheit eingesetzt werden können, sind hierin an anderer Stelle offenbart. Bevorzugte Nachweisagenzien sind Antikörper oder andere Proteine, die sich spezifisch an den/die Biomarker binden und nachweisbare Komplexe bilden. Die Analyseeinheit umfasst, vorzugsweise, die Nachweisagenzien in immobilisierter Form auf einem festen Träger, die mit der Probe zusammengebracht werden soll, welche die Biomarker umfasst, deren Menge zu bestimmen ist. Darüber hinaus kann die Analyseeinheit auch einen Detektor umfassen, der die Menge des Nachweisagens, das spezifisch an den/die Biomarker gebunden ist/sind, bestimmt. Die bestimmte Menge kann an die Auswerteeinheit übermittelt werden. Die Auswerteeinheit umfasst ein Datenverarbeitungselement, wie etwa einen Computer, mit einem implementierten Algorithmus zur Ausführung eines Vergleichs zwischen der bestimmten Menge und einer geeigneten Referenz. Geeignete Referenzen können aus Proben von Patienten, die der Erzeugung von Referenzmengen dienen, wie hierin oben an anderer Stelle beschrieben, gewonnen werden. Die Ergebnisse können als parametrische diagnostische Rohdaten, vorzugsweise, als absolute oder relative Mengen ausgegeben werden. Es versteht sich, dass diese Daten eine Interpretation durch den Kliniker benötigen. Jedoch sind auch fachmännische Systemgeräte vorgesehen, wobei die Ausgabe verarbeitete diagnostische Rohdaten umfasst, für deren Interpretation ein klinischer Spezialist nicht erforderlich ist.
  • Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind aus den abhängigen Ansprüchen zusammen mit der nachfolgenden Beschreibung abgeleitet, wobei die Patentansprüche einer bestimmten Kategorie durch die abhängigen Ansprüche einer unterschiedlichen Kategorie ausgeführt werden können und Merkmale der unterschiedlichen Beispiele zu neuen Beispielen kombiniert werden können. Es versteht sich, dass die oben und unten gemachten Definitionen und Erklärungen der Begriffe für alle Ausführungsformen, die in dieser Spezifikation und den begleitenden Ansprüchen beschrieben sind, entsprechend gelten. Im Folgenden werden besondere Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung weitergehend spezifiziert.
  • Günstigerweise kann die Sensitivität und Spezifität der Vorhersagegenauigkeit durch Implementierung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung höher als etwa 80 %, vorzugsweise höher als etwa 85 %, insbesondere höher als etwa 90 %, sein. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung verbessert somit die Entscheidungsfindung der Kliniker vor der Anwendung einer kostspieligen und aufwändigen therapeutischen Maßnahme wie die kardiale Therapie. Die richtige Entscheidung zu treffen, d. h. die Therapie nur dann anzuwenden, wenn sie wirksam ist, wird sicherlich auch für die individuellen Patienten und, angesichts der finanziellen Konsequenzen für das öffentliche Gesundheitswesen als solches, dienlich sein.
  • In den Studien, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, wurde vorteilhafterweise herausgefunden, dass die Analyse der Menge einer Kombination der Biomarker, wobei der Wachstumsfaktor vorzugsweise ausgewählt ist aus VEGF und/oder Erythropoietin und optional aus FGF, das Lymphozyt-Adapterprotein vorzugsweise ausgewählt ist aus SH2B3, das Glykoprotein vorzugsweise ausgewählt ist aus Vitronectin und optional aus GCSF, das B-Typ natriuretische Peptid vorzugsweise ausgewählt ist aus NT-proBNP, die zirkulierenden endothelialen Voräuferzellen (EPC) vorzugsweise ausgewählt sind aus CD45+, CD117+, CD184+, CD133+, CD146+ Zellen, die zirkulierenden Endothelzellen (CEC) vorzugsweise ausgewählt sind aus CD133+, CD146+, CD105+, CD34+ Zellen, die zirkulierenden Thrombozyten, zirkulierenden mononukleären Zellen und Subpopulationen und Rezeptor/Ligand Expression auf MNC Subpopulationen vorzugsweise ausgewählt sind aus CD184+ und/oder CD309+ Zellen, den Zelladhäsionsmolekülen (CAM) und/oder Integrin-Rezeptoren in einer Probe, die vor der kardialen Therapie von einem Patienten, der einer kardialen Therapie bedarf, entnommen wird, z. B. einem Patienten der an Herzversagen leidet, das Vorhersagen ermöglicht, ob jener Patient von der Therapie profitiert, in dem Sinne, dass die kardiale Regeneration oder kardiovaskuläre Reparatur nach der Therapie verbessert ist. Die Techniken zur Messung der Mengen der individuellen Biomarker sind in der Technik bekannt.
  • Durch Anwendung des maschinellen Lernens (ML) wird das Verfahren vorzugsweise ferner unterstützt, da keine individuellen Vergleiche ausgeführt werden müssen Außerdem dient das maschinelle Lernen nutzbringend der Bilanz und der Gewichtung der Parameter, so dass die Zuverlässigkeit der Vorhersage noch weiter verbessert werden kann. Somit wird ein vorteilhaftes Verfahren der vorliegenden Erfindung vorzugsweise unterstützt durch maschinelles Lernen, um die Vorhersagegenauigkeit zu erleichtern und zu verbessern. Gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff „maschinelles Lernen“ das Studieren und die Konstruktion von Algorithmen, die von den Daten lernen und Vorhersagen dazu machen können - wobei die Algorithmen hier strikte statische Programm-Anweisungen überwinden, indem sie datengesteuerte Vorhersagen oder Entscheidungen durch Erstellung eines Modells aus Probeneinträgen treffen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, verwendet ein solches Verfahren weitere Biomarker, wobei die weiteren Biomarker vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe von Zytokin, Interleukin, Interferon, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendes Protein, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor, Chemokin-Protein und/oder Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex.
  • Gemäß solch einem Verfahren ist das Zytokin vorzugsweise ausgewählt aus TNF, ist das Interleukin vorzugsweise ausgewählt aus IL-6, IL-8 und/oder IL-10, ist das Interferon vorzugsweise ausgewählt aus humanem Interferon-gamma induziertem Protein 10, ist das insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindende Protein vorzugsweise ausgewählt aus insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein 2 und/oder insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein 3, ist der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor vorzugsweise ausgewählt aus IGF2, ist das Chemokin-Protein vorzugsweise ausgewählt aus SDF-1 und/oder ist der Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex vorzugsweise ausgewählt aus SCF.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren für die präoperative Vorhersage der Antwort auf Stammzelltherapie und/oder der Induktion einer Angiogenese-Antwort und/oder Gewebereparatur im Zusammenhang mit kardiovaskulärer Erkrankung einschließlich Myokardinfarkt, Schlaganfall und peripheren ischämischen vaskulären Erkrankungen, Herzerkrankung und/oder ischämischer Präkonditionierung angewendet. Solch eine Therapie kann eine Behandlung zur Anwendung eines kardiovaskulären Implantats oder Stents, ventrikulären Unterstützungssystems (VAD), Herzschrittmachers und/oder Okkluders oder einer geeigneten Verschlussvorrichtung umfassen. Ebenfalls kann eine solche Therapie die Behandlung von Diabetes mellitus, Tumorerkrankungen, Zöliakie, rheumatische Erkrankungen, Infektionserkrankungen, Sepsis und/oder Bluthochdruck umfassen. Insbesondere wird das Verfahren für die präoperative Vorhersage zur Verbesserung der linksventrikulären Herzfunktion angewendet, z. B. bei Verschlechterung der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF), nach akutem Myokardinfarkt mit ST-Hebung (STEMI) und koronararterieller Drei-Gefäßerkrankung, indem nacheinander durch akute perkutane Koronarintervention (PCI) und sekundäre Koronararterien-Bypass (CABG)-Revaskularisierung behandelt wird.
  • In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform verwendet das Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, insbesondere auf Stammzelltherapie und/oder Induktion einer Angiogenese-Antwort und/oder Gewebereparatur im Zusammenhang mit kardiovaskulärer Erkrankung, eine Probe, die einem Patienten, der unter einer Herzerkrankung und/oder Arteriosklerose leidet, entnommen wird. Solch eine Probe kann insbesondere von einem Patienten entnommen werden, der unter Angina pectoris, akuter Myokardschädigung, zellulärer Nekrose, Myokardhypertrophie, Herzversagen, vorzugsweise ischämischem Herzversagen, nicht-ischämischem Herzversagen, Myokarditis, Vorhofflimmern, Kammerflimmern und/oder Arteriosklerose leidet.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Profilerstellung der Ergebnisse des Vergleichs an mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Zeitpunkten. Diese Zeitpunkte umfassen vorteilhafterweise eine Probe, die präoperativ und etwa 1, 3, 10, 90 und/oder 180 Tage postoperativ entnommen wird. Durch die Analyse der Proben an mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Zeitpunkten, kann die Spezifität der Vorhersagegenauigkeit günstigerweise auf mehr als 90 %, vorzugsweise auf mehr als 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % und noch mehr erhöht werden.
  • Eine weitere Ausführungsform des günstigen Verfahrens umfasst die Anwendung von klinischen diagnostischen Parametern. Insbesondere werden die Parameter ausgewählt aus Colony Forming Unit (CFU), Hill-Assay, Matrigel-Plug-Assay, Gewicht und/oder linksventrikulärem endsystolischem Volumen (LVESV).
  • Gemäß einer nächsten bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren für die Profilerstellung einer Angiogenese-Antwort verwendet.
  • Eine noch weitere bevorzugte Ausführungsform enthält für das vorteilhafte Verfahren ferner umfassend die Analyse von RNA und/oder DNA und/oder mRNA-Sequenz und/oder funktionale RNA wie mikroRNA und/oder nicht-kodierende RNA und/oder SNP, die eine diagnostische Signatur umfassen. Im Rahmen der Erfindung kann die Signaturanalyse einer RNA und/oder DNA und/oder SNP durch maschinelles Lernen und/oder Signalweganalyse durchgeführt und/oder unterstützt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Signalweganalyse angewendet, um zusammengehörige RNA oder DNA und/oder SNP innerhalb eines Signalwegs oder Signalwegdesigns de novo aus den RNA, DNA und/oder SNP von Interesse zu identifizieren.
  • Auch gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das vorteilhafte Verfahren die Analyse von pharmakokinetischen und pharmakogenetischen Daten mittels RNA- und/oder DNA-Sequenzierung und/oder Netzwerkanalyse von Signalwegen umfassen. Diese pharmakokinetischen Daten können insbesondere bei Patienten erhoben werden, die Medikamente aus der Gruppe ausgewählt aus einem Statin, Acetylsalicylsäure(ASS), einem Betablocker, einem Angiotensin Converting Enzyme (ACE)-Hemmer, einem Angiotensin-II (ATII)-Rezeptorantagonisten, einem Aldosteron-Antagonisten, einem Diuretikum, einem Ca-Antagonisten, einem Antiarrhythmikum, Digitalis, Marcumar und/oder Nitraten.
  • Eine nächste bevorzugte Ausführungsform kann zusätzlich die Analyse des Phänotyps eines Patienten anwenden, wie zum Beispiel der Körpergewichtsanalyse.
  • Gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Vorhersage einer kardiovaskulären Reparatur die Stammzelltherapie, um die Transplantation von CD133 positiven Stammzellen anzuwenden. Diese Stammzelltherapie kann optional mit der CABG-Revaskularisierung kombiniert werden, die zur Induktion der kardialen Regeneration und/oder PCI angewendet wird. Allerdings, beinhaltet eine besonders bevorzugte Ausführungsform, dass die kardiale Stammzelltherapie ferner die Koronararterien-Bypass-Chirurgie umfasst.
  • Vorteilhafterweise werden die kardiale Regeneration und/oder Funktionsverbesserung des Herzens nach kardialer Stammzelltherapie von einer Steigerung der LVEF von mindestens 5 % begleitet.
  • Das vorgenannte erfinderische Verfahren ist nicht auf die Anwendung bei menschlichen Patienten beschränkt, sondern kann auch Tiere umfassen. Für das Verfahren wird jedoch die Anwendung bei(m) menschlichen Patienten bevorzugt. Gemäß der Erfindung kann eine Probe eines solchen Patienten aus Blut, insbesondere peripherem Blut und/oder aus einer Serum- und/oder Plasmaprobe und/oder Biopsiegewebeprobe und/oder einer Probe von zirkulierenden (Stamm)zellen, wie zum Beispiel endothelialen Vorläuferzellen (EPC), gewonnen werden.
  • Wie oben geschildert, betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Kombination von Biomarkern ausgewählt aus der Gruppe von Wachstumsfaktor, Lymphozyt-Adapterprotein, Glykoprotein, B-Typ natriuretisches Peptid, zirkulierender endothelialer Voräuferzellen (EPC), zirkulierender Endothelzellen, zirkulierender Thrombozyten, zirkulierender mononukleärer Zellen und Subpopulationen davon und Rezeptor/Ligand Expression auf MNC-Subpopulationen für die Anwendung in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Wachstumsfaktor vorzugsweise ausgewählt aus VEGF und/oder Erythropoietin und optional aus FGF, das Lymphozyt-Adapterprotein ist vorzugsweise ausgewählt aus SH2B3, das Glykoprotein ist vorzugsweise ausgewählt aus Vitronectin und optional aus GCSF und das B-Typ natriuretische Peptid ist vorzugsweise ausgewählt aus NT-proBNP.
  • Außerdem, umfasst die Kombination von Biomarkern vorzugsweise weitere Biomarker ausgewählt aus der Gruppe von Zytokin, Interleukin, Interferon, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein, Chemokin-Protein und/oder Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex. Noch weiter bevorzugt ist das Zytokin ausgewählt aus TNF, ist das Interleukin ausgewählt aus IL-6, IL-8 und/oder IL-10, ist das Interferon ausgewählt aus humanem Interferon-gamma induziertem Protein 10, ist das insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindende Protein ausgewählt aus insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein-2 und/oder insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein-3, ist der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor vorzugsweise ausgewählt aus IGF2, ist das Chemokin-Protein ausgewählt aus SDF-1 und/oder ist der Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex ausgewählt aus SCF.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination der oben genannten Biomarker in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration angewendet, wobei das Verfahren ferner die Analyse klinischer diagnostischer Daten und/oder RNA und/oder mRNA und/oder funktionaler RNA wie mikroRNA und/oder nicht-kodierender RNA und/oder SNP und/oder die Analyse pharmakokinetischer Daten und/oder Phänotypisierung, z. B. Körpergewicht, umfasst.
  • Insbesondere wird/werden jedoch ein vorteilhaftes Verfahren und/oder eine vorteilhafte Kombination der vorstehenden Biomarker für die präoperative Vorhersage der Antwort auf die Stammzelltherapie angewendet und wobei die Stammzelltherapie von CABG begleitet ist.
  • Der Begriff „Stammzelltherapie“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf alle therapeutischen Ansätze, welche die Transplantation von exogenen Kardiomyozyten in das Herz eines zu behandelnden Patienten umfassen. Die Kardiomyozyten können durch die Umprogrammierung von Nicht-Kardiomyozyten-Vorläuferzellen zu Kardiomyozyten generiert werden. Die Zellen, die umprogrammiert werden sollen, können embryonale Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen, multipotente kardiale Vorläuferzellen, skelettale Myoblasten oder aus Knochenmark gewonnene Stammzellen sein. Des Weiteren können reife Kardiomyozyten auch angewendet werden, insbesondere, wenn sie stimuliert werden, um wieder in den mitotischen Zellzyklus einzutreten. Insbesondere umfasst die kardiale Stammzelltherapie gemäß der vorliegenden Erfindung die Transplantation von CD133-positiven Zellen, insbesondere, CD133-positiven mononukleären Zellen aus dem Knochenmark. Die Zellen können als isolierte Einzelzellen oder in einer vorgeformten Anordnung wie zum Beispiel einem Gewebeblock, der mittels Gewebezüchtungsverfahren geformt wurde, transplantiert werden. Vorzugsweise werden die Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung durch intramyokardiale Injektion transplantiert. Des Weiteren kann der Begriff kardiale Stammzelltherapie auch zusätzliche therapeutische Maßnahmen umfassen, wie Arzneimittelbehandlungen begleitend zum Transplantationsprozess oder andere therapeutische Maßnahmen wie zum Beispiel Chirurgie. Vorzugsweise umfasst die kardiale Stammzelltherapie gemäß der vorliegenden Erfindung ferner die Koronararterien-Bypass-Chirurgie wie in den beiliegenden Beispielen unten beschrieben.
  • Der Begriff „Funktionsverbesserung des Herzens“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine relevante Zunahme der LVEF des Herzens, die beim Vergleich der LVEF vor und nach der Behandlung des Patienten beobachtet wird. Vorzugsweise ist eine relevante Zunahme eine Zunahme von 5 % der LVEF, oder mehr, die nach Behandlung beobachtet wird. Eine Zunahme von weniger als 5 % wird als nicht relevant erachtet. Weitere Parameter, die zusätzlich für das Herausfinden einer funktionellen Verbesserung berücksichtigt werden können, sind eine Größenabnahme des Perfusionsdefektes von mehr als 10 %, eine Abnahme des linksventrikulären endsystolischen Volumens (LVESV) gemäß Quantifizierung mittels MIBI SPECT von mehr als 10 % und eine Zunahme der systolischen Spitzenflussgeschwindigkeit von mehr als 10 % gemessen mittels transthorakaler Echokardiographie.
  • Herzversagen, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jede Funktionsbeeinträchtigung des Herzens, einschließlich linksseitigem Versagen, rechtsseitigem Versagen und biventrikulärem Versagen. Typischerweise bezieht sich der Begriff Herzversagen, wie hierin verwendet, auf das linksseitige Versagen, das zu verringerter Ejektionsfraktionen führt, z. B. eine deutlich verringerte LVEF. Weitere Symptome von Herzversagen sind dem Kliniker bekannt. Herzversagen, wie hierin verwendet, umfasst die akuten und chronischen Formen des Herzversagens und jeglichen Schweregrades, z. B. für linksseitiges Versagen alle Stadien gemäß der Klassifikation der New York Heart Association (NYHA), NYHA I bis IV.
  • Der Begriff „vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf den löslichen Polypeptid-Wachstumsfaktor, der die Angiogenese, Vaskulogenese und vaskuläre Permeabilität stimuliert. Er wird von verschiedenen Zelltypen gebildet. Es gibt drei unterschiedliche VEGF-Polypeptide, VEGF-A, Plazenta-Wachstumsfaktor (PGF), VEGF-B, VEGF-C, und VEGF-D. Vorzugsweise, wie hierin verwendet, ist VEGF-A vorgesehen. Es sind verschiedene Isoformen für VEGF-A bekannt, die durch alternatives Splicing gebildet werden. Die bedeutendsten sind VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, und VEGF206.
  • Vorzugsweise bezieht sich VEGF auf den humanen VEGF-A wie beschrieben in Tischer 1991, J. Biol. Chem. 266 (18): 11947-11954 (offenbart ist die längste Isoform für VEGF-A). Für Aminosäuresequenzen siehe z. B. auch GenBank-Zugangsnummern NP_001020537.2, Gl: 76781480 (die Genbank ist verfügbar beim NCBI, USA unter www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). Der Begriff beinhaltet auch die Varianten der vorgenannten humanen VEGF-Polypeptide. Die Varianten weisen mindestens die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften auf wie das vorgenannte VEGF-Polypeptid. Insbesondere weisen sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften auf, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der VEGF-Polypeptide. Es versteht sich außerdem, dass eine Variante, wie hier genannt, gemäß der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz aufweisen soll, die sich aufgrund der Substitution, Deletion und/oder Addition von mindestens einer Aminosäure unterscheidet, wobei die Aminosäuresequenz der Variante immer noch, vorzugsweise, mindestens zu 50 % 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% oder 99 % mit der Aminosäuresequenz des spezifischen VEGF-Polypeptids identisch ist, vorzugsweise jeweils über die gesamte Länge des humanen VEGF. Der Grad der Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen kann mittels im Fach bekannten Algorithmen bestimmt werden. Vorzugsweise ist der Grad der Identität über ein Vergleichsfenster durch Vergleich zweier optimal aneinander ausgerichteter Sequenzen zu bestimmen, wobei das Fragment der Aminosäuresequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (z. B. Lücken oder Überhänge) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Ausrichtung umfassen kann. Der Prozentsatz wird berechnet durch Bestimmen der Anzahl Positionen an denen identische Aminosäurereste in beiden Sequenzen vorkommen, woraus sich die Anzahl der zusammenpassenden Positionen ergibt, Division der Zahl der zusammenpassenden Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster und Multiplikation des Ergebnisses mit 100, woraus sich der Prozentsatz der Sequenzidentität ergibt. Die optimale Ausrichtung von Sequenzen für den Vergleich kann mit dem Algorithmus für lokale Homologie offenbart von Smith 1981, Add. APL. Math. 2:482, mit dem Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48:443, mit der Ähnlichkeitssuchmethode von Pearson 1988, Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85: 2444, mit computerisierter Umsetzung dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, BLAST, FAST, PASTA und TFASTA im Softwarepaket von Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), oder mit visueller Inspektion durchgeführt werden. Unter der Voraussetzung, dass zwei Sequenzen für einen Vergleich identifiziert wurden, werden vorzugsweise GAP und BESTFIT angewendet, um deren optimalen Ausrichtung und damit den Identitätsgrad zu bestimmen. Vorzugsweise werden die Standardwerte von 5,00 für das Gap-Gewicht und von 0,30 für Längen-Gewicht benutzt. Die oben genannten Varianten können allelische Varianten oder andere spezienspezifische Homologa, Paraloga oder Orthologa sein. Die oben genannten Varianten können allelische Varianten oder andere spezienspezifische Homologa, Paraloga oder Orthologa sein. Ferner können die hierin genannten Varianten Fragmente oder Untereinheiten des spezifischen VEGF-Polypeptids oder die vorgenannten Arten von Varianten enthalten, sofern diese Fragmente die wesentlichen immunologischen und biologischen Eigenschaften, wie oben angegeben, aufweisen. Die Fragmente können z. B. Abbauprodukte der VEGF-Polypeptide sein. Für die Varianten gilt, dass sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften aufweisen, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der VEGF-Polypeptide. Ein bevorzugter Assay ist in den begleitenden Beispielen beschrieben. Umfasst sind ferner Varianten, die sich aufgrund von posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung und Myristoylierung unterscheiden. VEGF kann in gebundener oder freier Form sowie als Gesamt-VEGF-Gehalt in einer Probe nachgewiesen werden.
  • Der Begriff „Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Familie von Wachstumsfaktoren mit Mitgliedern, die an der Angiogenese, Wundheilung, embryonalen Entwicklung und verschiedenen endokrinen Signalwegen beteiligt sind.
  • Der Begriff „Erythropoietin (EPO)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein lösliches Polypeptid, welches ein Zytokin ist. Es wird von Nierenzellen typischerweise unter hypoxischen Bedingungen gebildet.
  • Vorzugsweise bezieht sich EPO auf das humane IL-6, wie beschrieben z. B. in Yanagawa 1984, J. Biol. Chem. 259(5): 2707-2710. Insbesondere weist das humane IL-6 eine Aminosäuresequenz auf wie gezeigt unter der GenBank-Zugangsnummer p01588.1, Gl: 119526. Der Begriff umfasst auch Varianten der vorgenannten humanen EPO-Polypeptide. Die Varianten weisen mindestens die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften wie das vorgenannte EPO-Polypeptid auf.
  • Insbesondere weisen sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften auf, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der EPO-Polypeptide. Es versteht sich außerdem, dass eine Variante, wie hier genannt, gemäß der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz aufweisen kann, die sich aufgrund der Substitution, Deletion und/oder Addition von mindestens einer Aminosäure unterscheidet, wobei die Aminosäuresequenz der Variante immer noch, vorzugsweise, mindestens zu 50 % 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% oder 99 % mit der Aminosäuresequenz des spezifischen IL-6 identisch ist. Die Varianten können allelische Varianten, Spleißvarianten oder andere spezienspezifische Homologa, Paraloga oder Orthologa sein. Ferner umfassen die hierin genannten Varianten Fragmente des spezifischen EPO oder der vorgenannten Arten von Varianten, sofern diese Fragmente die wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften, wie oben angegeben, aufweisen. Die Fragmente können z. B. Abbauprodukte von EPO sein. Für die Varianten gilt, dass sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften aufweisen, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der EPO-Polypeptide. Ein bevorzugter Assay ist in den begleitenden Beispielen beschrieben. Umfasst sind ferner Varianten, die sich aufgrund von posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung und Myristoylierung unterscheiden.
  • Der Begriff „SH2B-Adapterprotein 3 (SH2B3)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Lymphozyt-Adapterprotein (LNK). SH2B3 ist ein Protein, welches beim Menschen durch das SH2B3-Gen auf Chromosom 12 kodiert ist. Es wird ubiquitär in vielen Geweben und Zelltypen exprimiert (Li Y, He X, Schembri-King J, Jakes S, Hayashi J, May 2000. Journal of Immunology. 164(10):5199-206).
  • Der Begriff „Vitronectin (VTN)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Glykoprotein der Hemopexin-Familie, das im Serum, in der extrazellulären Matrix und im Knochen reichlich vorkommt (Boron, Walter F. and Boulpaep, Emile L. „Medical Physiology“. Saunders, 2012, p.1097). Beim Menschen ist es durch das VTN-Gen kodiert. Vitronectin bindet an alpha5beta1-Integrin und fördert somit die Zelladhäsion und Zellspreitung. Es hemmt die membranschädigende Wirkung auf den terminalen zytolytischen Komplementsignalweg und bindet an mehreren Serpinen (Serinproteinase-Inhibitoren). Es ist ein sezerniertes Protein und kommt entweder als einkettige Form oder geschnittene zweikettige Form vor, die von einer Disulfidbrücke zusammen gehalten wird. Von Vitronectin wird vermutet, dass es an der Hämostase und Malignität eines Tumors beteiligt ist.
  • Der Begriff „Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor (G-CSF oder GCSF)“, auch als Kolonie stimulierender Faktor 3 (CSF 3) bekannt, ist ein Glykoprotein, welches das Knochenmark dazu stimuliert, Granulozyten und Stammzellen zu bilden und diese in den Blutkreislauf freizusetzen. Funktional ist es ein Zytokin und ein Hormon, eine Art Kolonie stimulierender Faktor, und wird von einer Vielzahl von verschiedenen Geweben gebildet. G-CSF stimuliert auch Überleben, Proliferation, Differenzierung und Funktion von neutrophilen Vorläuferzellen und reifen Neutrophilen.
  • Der Begriff „B-Typ natriuretisches Peptid oder B-natriuretisches Peptid (BNP)“, auch bezeichnet als ventrikuläres natriuretisches Peptid oder natriuretisches Peptid B, ist ein 32 Aminosäuren umfassendes Polypeptid, das von den Herzkammern als Reaktion auf eine Überdehnung der Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) sezerniert wird. Die Freisetzung von BNP wird durch Calciumionen moduliert. BNP wird so bezeichnet, weil es ursprünglich in Extrakten aus Schweine-Gehirn identifiziert wurde, obwohl es beim Menschen hauptsächlich in den Herzkammern gebildet wird. BNP wird sezerniert gebunden an ein aus 76 Aminosäuren bestehendes N-terminales Fragment im dem sogenannten Prohormon NT-proBNP. Einmal freigesetzt, bindet BNP an die atrialen natriuretischen Faktor-Rezeptoren (NPRA) und in einem geringeren Umfang an NPRB in ähnlicher Weise wie das atriale natriuretische Peptid (ANP), aber mit einer 10-fach geringeren Affinität. Die biologische Halbwertszeit von BNP ist jedoch zweimal länger als die von ANP, und die von NT-proBNP ist noch länger, wodurch diese Peptide bessere Targets als ANP für diagnostische Bluttests darstellen.
  • Der Begriff „Interleukin-6 (IL-6)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein lösliches Polypeptid, da es ein proinflammatorisches Zytokin und anti-inflammatorisches Myokin ist. Es wird von T-Zellen und Makrophagen gebildet.
  • Vorzugsweise bezieht sich IL-6 auf humanes IL-6, wie beschrieben z. B. in Wong 1988, Behring Inst. Mitt 83: 40-47. Insbesondere weist das humane IL-6 eine Aminosäuresequenz auf wie unter der Genbank-Zugangsnummer p05231.1, Gl: 124347 gezeigt. Der Begriff umfasst auch Varianten der vorgenannten humanen IL-6-Polypeptide. Diese Varianten weisen mindestens die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften wie das vorgenannte IL-6-Polypeptid auf. Insbesondere weisen sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften auf, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der IL-6-Polypeptide. Es versteht sich außerdem, dass eine Variante, wie hier genannt, gemäß der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz aufweisen kann, die sich aufgrund der Substitution, Deletion und/oder Addition von mindestens einer Aminosäure unterscheidet, wobei die Aminosäuresequenz der Variante immer noch, vorzugsweise, mindestens zu 50 % 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% oder 99 % mit der Aminosäuresequenz des spezifischen IL-6 identisch ist. Die Varianten können allelische Varianten, Spleißvarianten oder andere spezienspezifische Homologa, Paraloga oder Orthologa sein. Ferner umfassen die hierin genannten Varianten Fragmente des spezifischen IL-6 oder der vorgenannten Arten von Varianten, sofern diese Fragmente die wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften, wie oben genannt, aufweisen. Die Fragmente können z. B. Abbauprodukte von IL-6 sein. Für die Varianten gilt, dass sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften aufweisen, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der IL-6-Polypeptide. Ein bevorzugter Assay ist in den begleitenden Beispielen beschrieben. Umfasst sind ferner Varianten, die sich aufgrund von posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung und Myristoylierung unterscheiden.
  • Der Begriff „Interferon-gamma induziertes Protein 10 (IP-10)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein lösliches Polypeptid, da es ein Zytokin ist, das zur CXC-Chemokin-Familie gehört. Es wird von Monozyten, Endothelzellen und Fibroblasten gebildet.
  • Vorzugsweise bezieht sich IP-10 auf das humane IP-10 wie beschrieben in Booth 2002, Biochemistry 41(33): 10418-10425. Insbesondere weist das humane IP-10 eine Aminosäuresequenz auf wie unter der Genbank-Zugangsnummer p02778.2, Gl: 21542456 gezeigt. Der Begriff umfasst auch Varianten der vorgenannten humanen IP-10-Polypeptide. Diese Varianten weisen mindestens die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften wie das vorgenannte IP-10-Polypeptid auf. Insbesondere weisen sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften auf, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der IP-10-Polypeptide. Es versteht sich außerdem, dass eine Variante, wie hier gemäß der vorliegenden Erfindung genannt, eine Aminosäuresequenz aufweisen kann, die sich aufgrund der Substitution, Deletion und/oder Addition von mindestens einer Aminosäure unterscheidet, wobei die Aminosäuresequenz der Variante immer noch, vorzugsweise, mindestens zu 50 % 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% oder 99 % mit der Aminosäuresequenz des spezifischen IP-10 identisch ist. Die Varianten können allelische Varianten, Spleißvarianten oder andere spezienspezifische Homologa, Paraloga oder Orthologa sein. Ferner umfassen die hierin genannten Varianten Fragmente des spezifischen IP-10 oder der vorgenannten Arten von Varianten, sofern diese Fragmente die wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften, wie oben genannt, aufweisen. Die Fragmente können z. B. Abbauprodukte von IP-10 sein. Für die Varianten gilt, dass sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften aufweisen, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der IP-10-Polypeptide. Ein bevorzugter Assay ist in den begleitenden Beispielen beschrieben. Umfasst sind ferner Varianten, die sich aufgrund von posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung und Myristoylierung unterscheiden.
  • Der Begriff „insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein-3 (IGFBP-3)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein lösliches Polypeptid, da es ein Wachstumsfaktor aus der Familie der insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren ist. Er wird von verschiedenen Zellen gebildet.
  • Vorzugsweise bezieht sich IGFBP-3 auf das humane IGFBP-3 wie beschrieben z. B. in Thweatt 1993, DNA Seq 4(1): 43-46. Insbesondere weist das humane IGFBP-3 eine Aminosäuresequenz, wie unter der Genbank-Zugangsnummer p17936.1, Gl: 146327827 gezeigt, auf. Der Begriff umfasst auch Varianten der vorgenannten humanen IGFBP-3-Polypeptide. Diese Varianten weisen mindestens die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften wie das vorgenannte IGFBP-3-Polypeptid auf. Insbesondere weisen sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften auf, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der IGFBP-3-Polypeptide. Es versteht sich außerdem, dass eine Variante, wie hier genannt, gemäß der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz aufweisen kann, die sich aufgrund der Substitution, Deletion und/oder Addition mindestens einer Aminosäure unterscheidet, wobei die Aminosäuresequenz der Variante immer noch, vorzugsweise, mindestens zu 50 % 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% oder 99 % mit der Aminosäuresequenz des spezifischen IGFBP-3 identisch ist. Die Varianten können allelische Varianten, Spleißvarianten oder andere spezienspezifische Homologa, Paraloga oder Orthologa sein. Ferner umfassen die hierin genannten Varianten Fragmente des spezifischen IGFBP-3 oder der vorgenannten Arten von Varianten, sofern diese Fragmente die wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften, wie oben genannt, aufweisen. Die Fragmente können z. B. Abbauprodukte von IGFBP-3 sein. Für die Varianten gilt, dass sie die gleichen wesentlichen biologischen und immunologischen Eigenschaften aufweisen, wenn sie mit den gleichen spezifischen Assays nachweisbar sind, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, z. B. durch ELISA-Assays, die polyklonale oder monoklonale Antikörper verwenden, für insbesondere die Erkennung der IGFBP-3-Polypeptide. Ein bevorzugter Assay ist in den begleitenden Beispielen beschrieben. Umfasst sind ferner Varianten, die sich aufgrund von posttranslationalen Modifikationen wie Phosphorylierung und Myristoylierung unterscheiden.
  • Der Begriff „insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF2)“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eines von drei Proteinhormonen, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit Insulin aufweisen. Es wird angenommen, dass IFG2 in der Leber sezerniert wird und im Blutkreislauf zirkuliert. Es weist wachstumsregulierende, insulin-ähnliche und mitogene Aktivitäten auf. Der Wachstumsfaktor weist eine starke, aber keine absolute, Abhängigkeit zu Somatropin auf. Es wird angenommen, dass es sich um einen wesentlichen fetalen Wachstumsfaktor handelt.
  • Der Begriff „Stromazell-abgeleiteter Faktor 1 (SDF1)“, auch bekannt als CXC-Motiv Chemokin 12 (CXCL 12), ist ein Chemokin-Protein, welches beim Menschen durch das CXCL-12-Gen auf Chromosom 10 kodiert ist. Es wird ubiquitär in vielen Geweben und Zelltypen exprimiert. Die Stromazell-abgeleiteter Faktoren 1-alpha und 1-beta sind kleine Zytokine, die der Chemokinfamilie angehören, darunter Mitglieder, die Leukozyten aktivieren und oft durch pro-inflammatorische Stimuli wie Lipopolysaccharide, TNF oder IL1 induziert werden. Die Chemokine sind gekennzeichnet durch das Vorhandensein von vier konservierten Cysteinen, die zwei Disulfidbrücken bilden.
  • Der Begriff „Skp1, Cullin, F-Box enthaltender Komplex (oder SCF)“ bezieht sich auf einen Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex, welcher die Ubiquitinierung von Proteinen, die für den proteasomalen Abbau bestimmt sind, katalysiert. Er übernimmt wichtige Rollen in der Ubiquitinierung von Proteinen, die am Zellzyklus beteiligt sind und markiert auch diverse andere zelluläre Proteine für die Zerstörung.
  • Die Bestimmung der Menge eines Biomarkers kann vorzugsweise die Schritte (a) Zusammenbringen eines Biomarkers mit einem spezifischen Liganden, (b) (optionales) Entfernen des nicht-gebundenen Liganden, (c) Messen der Menge des gebundenen Liganden umfassen. Der gebundene Ligand generiert ein Intensitätssignal. Eine Bindung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst sowohl die kovalente als auch die nichtkovalente Bindung. Ein Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung kann jede Verbindung sein, z. B. ein Peptid, Polypeptid, eine Nukleinsäure oder ein kleines Molekül, die sich an das Peptid oder Polypeptid oder Protein oder die Nukleinsäure oder Zelle, die hierin beschrieben werden, bindet. Bevorzugte Liganden umfassen Antikörper, Nukleinsäuren, Peptide oder Polypeptide wie zum Beispiel Rezeptoren oder Bindungspartner für das Peptid oder Polypeptid und Fragmente davon, welche die peptidbindenden Domänen umfassen, und Aptamere, z. B. Nukleinsäure- oder Peptid-Aptamere. Verfahren zur Herstellung solcher Liganden sind im Fach bekannt. Kommerzielle Anbieter bieten zum Beispiel die Identifizierung und Herstellung von geeigneten Antikörpern oder Aptameren an. Der Fachmann ist mit den Verfahren zur Entwicklung von Derivaten von solchen Liganden mit höherer Affinität oder Spezifität vertraut. Beispielsweise können Zufallsmutationen in den Nukleinsäuren, Peptiden oder Polypeptiden eingeführt werden. Diese Derivate können dann hinsichtlich der Bindung gemäß den im Fach bekannten Screeningverfahren, z. B. Phagen-Display, geprüft werden. Antikörper, wie hierin genannt, umfassen sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper, sowie Fragmente davon, wie zum Beispiel Fv-, Fab- und F(ab)2-Fragmente, die ein Antigen oder Hapten binden können. Die vorliegende Erfindung umfasst auch einkettige Antikörper und humanisierte Hybrid-Antikörper, wobei die Aminosäuresequenzen von einem nicht-humanen Spenderantikörper, welcher eine erwünschte Antigenspezifität zeigt, mit den Sequenzen eines humanen Empfängerantikörpers kombiniert werden. Die Spendersequenzen beinhalten in der Regel mindestens die antigenbindenden Aminosäurenreste des Spenders, können aber auch andere strukturelle und/oder funktionell relevante Aminosäurereste des Spender-Antikörpers umfassen. Diese Hybride können anhand diverser Verfahren, die im Fach bekannt sind, hergestellt werden. Vorzugsweise bindet der Ligand oder Wirkstoff spezifisch an das Polypeptid oder Polypeptid. Eine spezifische Bindung gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass sich der Ligand oder Wirkstoff nicht substantiell (kreuzreagieren) an ein anderes Peptid, Polypeptid oder eine andere Substanz in der zu analysierenden Probe binden sollte. Vorzugsweise sollte das spezifisch gebundene Peptid oder Polypeptid mit mindestens einer 3-fach höheren, bevorzugter mit mindestens einer 10-fach höheren und noch bevorzugter mit mindestens einer 50-fach höheren Affinität als jedes andere relevante Peptid oder Polypeptid binden. Eine unspezifische Bindung ist tolerierbar, wenn sie noch eindeutig unterschieden und gemessen werden kann, z. B. gemäß ihrer Größe auf einem Western-Blot oder durch ihrem vergleichsweise höheren Vorkommen in der Probe. Die Bindung des Liganden kann mit im Fach bekannten Verfahren gemessen werden. Vorzugsweise ist das Verfahren semi-quantitativ oder quantitativ. Weitere geeignete Techniken für die Bestimmung eines Biomarkers sind nachfolgend beschrieben.
  • Erstens kann die Bindung eines Liganden direkt, z. B. mittels NMR oder Oberflächen-Plasmon-Resonanz, gemessen werden. Zweitens kann, wenn der Ligand auch als Substrat für die enzymatische Aktivität des Biomarkers von Interesse dient, das enzymatische Reaktionsprodukt gemessen werden (z. B. kann die Menge einer Protease mittels Messung der Menge des gespaltenen Substrats bestimmt werden, z. B. auf einem Western-Blot). Alternativ, kann der Ligand selbst enzymatische Eigenschaften aufweisen und der „Ligand/Peptid bzw. Polypeptid“-Komplex bzw. der Ligand, der von dem Biomarker gebunden wurde, mit einem geeigneten Substrat zusammengebracht werden, womit ein Nachweis durch die Entstehung eines Intensitätssignals ermöglicht wird. Für die Messung von enzymatischen Reaktionsprodukten ist die Menge an Substrat, vorzugsweise, gesättigt. Das Substrat kann auch mit einem nachweisbaren Marker vor der Reaktion markiert werden. Vorzugsweise wird die Probe mit dem Substrat für einen angemessenen Zeitraum zusammengebracht. Ein angemessener Zeitraum bezieht sich auf die Zeit, die notwendig ist, damit sich eine nachweisbare, vorzugsweise messbare Produktmenge bilden kann. Anstatt der Messung der Produktmenge kann die Zeit gemessen werden, die notwendig ist, bis eine bestimmte Produktmenge (z. B. nachweisbar) auftritt. Drittens kann der Ligand kovalent oder nicht-kovalent mit einem Marker gekoppelt werden, womit der Nachweis und die Messung des Liganden ermöglicht wird. Das Markieren kann mittels direkter oder indirekter Verfahren erfolgen. Das direkte Markieren umfasst das direkte Koppeln des Markers (kovalent oder nicht-kovalent) an den Liganden. Das indirekte Markieren umfasst die Bindung (kovalent oder nicht-kovalent) eines sekundären Liganden an den Erstliganden. Der sekundäre Ligand sollte sich spezifisch an den Erstliganden binden. Dieser sekundäre Ligand kann mit einem geeigneten Marker gekoppelt werden und/oder als Ziel (Empfänger) für die tertiäre Ligandenbindung an den sekundären Liganden dienen. Die Nutzung von sekundären, tertiären oder noch höherrangigen Liganden kommt oft vor, um das Signal zu erhöhen. Geeignete sekundäre, tertiäre oder höherrangige Liganden können Antikörper, sekundäre Antikörper und das bekannte Streptavidin-Biotin-System umfassen. Der Ligand oder das Substrat kann auch mit einem oder mehreren im Fach bekannten Tags „getaggt“ werden. Diese Tags können dann als Ziele für höherrangige Liganden dienen. Geeignete Tags umfassen Biotin, Digoxygenin, His-Tag, Glutathion-S-Transferase, FLAG, GFP, myc-Tag, Influenza-A-Virus Hämagglutinin (HA), Maltosebindungsprotein und dergleichen. Im Falle eines Peptids oder Polypeptids ist der Tag vorzugsweise am N-terminalen und/oder C-terminalem Ende. Geeignete Marker sind alle Marker, die anhand eines geeigneten Nachweisverfahrens nachweisbar sind. Typische Marker sind unter anderem Goldpartikel, Latexkugeln, Acridinester, Luminol, Ruthenium, enzymatisch aktive Marker, radioaktive Marker, magnetische Marker (z. B. Magnetbeads, einschließlich paramagnetischer und superparamagnetischer Marker) und Fluoreszenzmarker. Enzymatisch aktive Marker sind unter anderem z. B. Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Beta- Galaktozidase, Luciferase und Derivate davon. Geeignete Substrate für den Nachweis umfassen Diaminbenzidin (DAB), 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, NBT/BCIP (4-Nitrotetrazoliumblauchlorid und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat). Eine geeignete Enzym-Substrat-Kombination kann zu einem gefärbten Reaktionsprodukt, einer Fluoreszenz oder Chemolumineszenz führen, welche mit den im Fach bekannten Verfahren gemessen werden können (z. B. mittels eines lichtempfindlichen Films oder geeigneten Kamerasystems). Im Hinblick auf die enzymatische Reaktion gelten die oben genannten Kriterien sinngemäß. Typische Fluoreszenzmarker umfassen fluoreszierende Proteine (beispielsweise GFP und deren Derivate), Cy3, Cy5, Texas Red, Fluoreszein und die Alexa-Farbstoffe. Weitere Fluoreszenzmarker sind z. B. von Molecular Probes (Oregon) erhältlich. Auch wird die Anwendung von Quantenpunkten als Fluoreszenzmarker in Betracht gezogen. Typische radioaktive Marker umfassen 35S, 125I, 32P, 33P und dergleichen. Ein radioaktiver Marker kann anhand bekannter und geeigneter Verfahren nachgewiesen werden, z. B. mit einem lichtempfindlichen Film oder Phosphorimager.
  • Die Menge an Biomarker kann, vorzugsweise, wie folgt bestimmt werden: (a) Zusammenbringen eines festen Trägers, der einen Liganden für den Biomarker umfasst, wie oben angegeben, mit einer Probe, die den Biomarker umfasst und (b) Messen der Menge des Biomarkers, der an den Träger gebunden ist. Der Ligand, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Peptiden, Polypeptiden, Antikörpern und Aptameren, ist vorzugsweise auf einem festen Träger in immobilisierter Form vorhanden. Die Materialien zur Herstellung von festen Trägern sind im Fach bekannt und umfassen unter anderem kommerzielle erhältliche Säulenmaterialien, Polystyrolkügelchen, Latexkugeln, Magnetbeads, Metallkolloidpartikeln, Glas- und/oder Silizium-Chips und -Oberflächen, Nitrozellulosestreifen, Membrane, Folien, Durazyten, Vertiefungen und Wände von Reaktionsplatten, Plastikröhrchen usw. Der Ligand oder Wirkstoff kann an viele verschiedene Träger gebunden sein. Beispiele für bekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Dextran, Nylon, Amylosen, modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Die Art des Trägers kann für die Zwecke der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein. Geeignete Verfahren für die Fixierung/Immobilisierung des/der Liganden sind bekannt und umfassen unter anderem ionische, hydrophobische oder kovalente Interaktionen und dergleichen.
  • Geeignete Messmethoden gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen auch FACS-Analyse, Radioimmunoassay (RIA), Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Sandwich Enzyme Immunoassays, Elektrochemilumineszenz Sandwich-Immunoassays (ECLIA), Lanthaniden-basierte Lumineszenz-Assay (DELFIA), Scintillation Proximity Assay (SPA) oder Solid-Phase Immuntests. Weitere im Fach bekannte Verfahren (wie zum Beispiel Gelelektrophorese, 2D-Gelelektrophorese, SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Western Blotting und Massenspektrometrie (MS) können entweder allein oder in Kombination mit Markier- und anderen Nachweisverfahren wie oben beschrieben verwendet werden.
  • Für die Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Kit bereitgestellt, der für die Durchführung des erfinderischen Verfahrens geeignet ist, wobei der Kit gemäß der vorliegenden Erfindung Nachweisreagenzien für die Bestimmung mindestens einer der oben genannten Biomarker in einer Probe des Patienten umfasst. Dieser Kit ermöglicht vorteilhafterweise die unkomplizierte Durchführung des erfinderischen Verfahrens und/oder Messung und/oder Bestimmung des(r) Biomarker(s) gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff „Kit“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Sammlung der vorgenannten Komponenten, wobei die Komponenten vorzugsweise separat oder in einem Einzelbehälter bereitgestellt werden. Der Kit kann auch Anweisungen zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Die Anweisungen können in Form eines Handbuchs oder durch einen Computerprogrammcode bereitgestellt werden, der die Vergleiche, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung genannt werden, ausführen kann und dementsprechend eine Diagnose zu stellen, wenn dieser auf einem Computer oder auf einer Datenverarbeitungseinrichtung ausgeführt wird. Der Computerprogrammcode kann auf einem Datenspeicher oder einem Gerät wie zum Beispiel einem Speichermedium (z. B. einer Compact Disc, einem USB-Laufwerk oder einer externen Festplatte) oder direkt auf einem Computer oder Datenverarbeitungseinrichtung bereitgestellt werden. Außerdem kann der Kit, vorzugsweise, Standards als Referenzmengen umfassen, wie hierin an anderer Stelle ausführlich beschrieben.
  • Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden abgeleitet von den Beispielen in Kombination mit den Ansprüchen und den Figuren. Einzelne Merkmale können in einer besonderen Ausführungsform in Kombination mit anderen Merkmalen realisiert werden und begrenzen nicht den Umfang des Schutzes der vorliegenden Erfindung. Die folgenden Beschreibungen von Beispielen gemäß der Erfindung können sich auf die Figuren beziehen, wobei
    • 1 zeigt die SH2B3-Expressionsanalyse in peripherem Blut von Respondern und Nicht-Respondern. Vollblutproben wurden von 21 Patienten vor der koronararteriellen Bypass-Operation (CABG) Revaskularisierung entnommen. Die relative Expression von SH2B3 (a) und die korrespondierenden ΔCT-Werte (b) wurden mittels der 2-ΔΔCT-Methode berechnet. Alle Werte sind als Mittelwerte ± SEM und normiert auf GAPDH und POLR2A, n=13 (Responder); n=8 (Nicht-Responder) präsentiert. ΔCT Werte: p=0,073.
    • 2 zeigt eine drei-dimensionale, t-verteilte Berechnung stochastischer Nachbareinbettung (t-SNE), die sich auf unüberwachtes ML bezieht. Diese unabhängige Methodologie reduziert die Dimensionalität eines vorgegebenen Parametersatzes, z. B. Biomarkerprofils und berechnet somit die Variablen x, y und z, die gleichermaßen auf die neu berechneten Merkmale, die benutzt werden, um die Patienten in verschiedene Gruppe einzuteilen, verweisen. Das Modell wurde danach durch eine polynomiale (n3) Gleichung angepasst, um die z-Achse als geographisches Profil zu visualisieren. Die jeweiligen Farben für die Responder-Patienten (schwarzer Punkt) und Nicht-Responder-Patienten (grauer Punkt) wurden später hinzu addiert. Die klassifizierten Gruppen wurden grob zusammengefasst durch eine schwarze und graue gestrichelte Linie. Die Ergebnisse werden nach 3000 Iterationen erhalten. Die Berechnung des Verhältnisses zwischen Responder und Nicht-Responder ist für jeden Kreis angezeigt. Es ist wahrscheinlicher, dass sich die Nicht-Responder-Gruppe innerhalb der kleineren z-Werte befindet (z <20, Verhältnis < 42 %). Die Responder tendieren dazu, sich innerhalb der hellgrauen Flächen (z >20) einschließlich eines Verhältnisses von über 69 % anzureichern.
    • 3 zeigt die ML-Vorhersageergebnisse für die prä- und postoperativen Zeitpunkte (0 Tage bis 180 Tage) vonklinischen und von klinischen & Labor-Datensätze, um zwischen Respondern und Nicht-Respondern zu unterscheiden. Das Diagramm zeigt die wahre positive Vorhersagerate von fünf unabhängigen Merkmal-ausgewählten ML-Modellen (AdaBoost für die Merkmalsauswahl und RF für die finale Vorhersage). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung für die jeweiligen Genauigkeiten der konstruierten Modelle an, die nach 100 Iterationen erhalten wurden. Die 100 Modell-Iterationen unterscheiden sich gemäß einer einfachen ANOVA (p<0,001) signifikant.
    • 4 zeigt die resultierende Ergebnisse der PERFECT-Studie. Die diagnostische Unterscheidung von primären Endpunktergebnis-Respondern in der PERFECT-Studie anhand von unterscheidungskräftigen präoperativen peripheren Blutparametern, die charakteristisch mit Knochenmark/Blut CD133+, CD34+, CD117+, EPC und Angiogenese-Antwort verknüpft sind.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sollen lediglich die Erfindung veranschaulichen. Sie sollen in keiner Weise als Beschränkung davon ausgelegt werden.
  • Beispiel 1: Design und Beurteilung der klinischen Studie
  • Die Induktion der kardialen Regeneration bei Patienten mit Herzversagen nach Myokardinfarkt und ischämischer Kardiomyopathie waren das Ziel vielfältiger Ansätze einschließlich der Stammzelltherapie. Dabei waren eine mangelnde Wirksamkeit und fehlende Vorhersagbarkeit der Reaktionen bisher die Haupthürden für die Standardisierung der Behandlung und für den Erfolg.
  • Eine klinische Prüfung wurde durchgeführt, um zu beurteilen, ob ein Patient mit ischämischem Herzversagen und versagender Ejektionsfraktion ein geeigneter Kandidat für eine Stammzelltherapie ist und mit hoher Wahrscheinlichkeit einer kardialen Regeneration aus dieser Nutzen erzielen kann. Die klinische Prüfung zeigte einen auffallenden Unterschied bei der kardialen Genesung zwischen Respondern und Nicht-Respondern, die mit einer spezifischen Signaturzusammensetzung der Angiogenesefaktoren im peripherem Blut in Verbindung stand. Die Durchführung der klinischen Studie ist nachfolgend ausführlich beschrieben.
  • Eine Studie wurde begleitend zu der kontrollierten, prospektiven, randomisierten, doppelverblindeten multizentrischen Prüfung („Intra-myocardial Transplantation of Bone Marrow Stem Cells in Addition to Coronary Artery Bypass Graft Surgery (PERFECT)“), die an der Abteilung für Herzchirurgie der Universität Rostock begonnen wurde, durchgeführt. Die Prüfung untersuchte die Wirksamkeit und Sicherheit der intramyokardialen Injektion von CD133+-Zellen bei Patienten mit koronarer Arterienerkrankung nach Myokardinfarkt mit verringerter LVEF und Vorhandensein eines lokalisierten kinetischen/hypokinetischen/hypoperfundierten Bereichs der linken Herzkammer. Frühere Ergebnisse zeigten enge Beziehungen zwischen einigen regenerativen Faktoren und der Antwort von Patienten auf die Therapie (CABG oder CABG plus CD133+ Stammzelleninjektion). Eine Zunahme von mindestens 5 % bei der LVEF, gemessen im MRT, wurde ausgewählt, um eine funktionelle Verbesserung nach 6-12 Monaten Nachbeobachtung zu beschreiben. Die Patienten, bei denen sich die LVEF um mehr als 5 % erhöhte, wurden als Responder definiert; eine Erhöhung um weniger als 5 % oder eine verringerte LVEF definierten die Nicht-Responder.
  • Biomarker
  • Vordefiniert: Bei einer Kohorte von 39 Patienten wurden im Knochenmark (KM) und peripherem Blut (PB) verschiedene hämatopoetische und endotheliale CD133+ EPC-Subpopulationen und die Angiogenesefähigkeit anhand der Koexpressionsanalyse mittels 4-Laser-Durchflusszytometrie-Verfahren (LSR II, Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) für die Quantifizierung von EPC nach Kofärbung mit Färbe-Panels (Ko-Färbe-Panel CD133, 34, 117, 184, 309, 105, 45) und zirkulierenden Endothelzellen (CEC) (Ko-Färbe-Panel: CD31, 146, 34, 45, 105, 184, 309) sowie mittels CFU-EC, CFU-Hill in vitro und Matrigel-Plug-Assay in vivo geprüft. Die NT-proBNP-Analyse sowie die Virusanalyse auf Epstein-Barr-Virus (EBV), Zytomegalievirus (ZMV) und Parvovirus wurden mittels IgG- und Antigenanalyse im Serum aus peripherem Blut durchgeführt. Vor der finalen Datenschließung wurde eine Post-hoc-Analyse der Angiogenesefaktoren und Zytokine im Serum durchgeführt. Post-hoc-Analyse: Eine Analyse der Knochenmark-Subpopulationen und SH2B3 mRNA RT-PCR im peripherem Blut (PB): Als Verfahren und für die Analyse der Biomarker, die in CD133+ und PBMNC-Proben des Knochenmarks untersucht wurden, wurden die zytometrische Bead Analyse (CBA) und der Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und RT-PCR verwendet.
  • Statistische Analyse
  • Die Stratifizierung der Primäranalyse nach Prüfzentrum wurde bei der Berechnung des Stichprobenumfangs vernachlässigt. Anstelle einer Kovarianz-Analyse (ANCOVA), die in der Primäranalyse verwendet wurde, wurde ein Zweistichproben-t-Testszenario mit gleichen Varianzen in Betracht gezogen. Der Stichprobenumfang wurde unter Annahme eines zweiseitigen Typ 1 Fehlers (α) von 5 % und eines Typ 2 Fehlers (β) von 10 % (d. h. einer Power von 90 %) bestimmt. Das Szenario eines Unterschieds in der LVEF in Monat 6 postoperativ zwischen den beiden Behandlungsarmen von 4 bis 5 % wurde als klinisch relevanter Unterschied betrachtet. Bei einem Unterschied von 4,5 und einer Standardabweichung von 7,5 wurden mindestens n=60 Patienten je Gruppe für notwendig erachtet und, bei einer zusätzlichen Ausfallrate von 15 %, waren insgesamt mindestens 142 Patienten zu randomisieren. Der Stichprobenumfang wurde mit dem kommerziellen Programm nQuery Advisor 5.0, Abschnitt 8, Tabelle MTT0-1 berechnet (Hofmann WK, de Vos S, Elashoff D, et al., Lancet 2002; 359(9305):481-6). Die Berechnungen erfolgten mittels zentraler und nicht-zentraler t-Verteilung, wobei der Nicht-Zentralitätsparameter √n δ/√2 ist und δ definiert ist als Effektstärke |µ1-µ2| / σ (O'Brien R G, Muller K E, Signified power analysis for t-tests through multivariate hypothesis. In L K Edward (Ed.) Applied analysis of variance in behavioral science, 1993, New York, Marcel Dekker).
  • Die statistischen Analysen, finale Datensatzberechnung und Vorbereitung wurden von der Köhler GmbH durchgeführt. Die Datenanalyse mit maschinellem Lernen, welches Schlüsselmerkmale und Klassifikation der umfassenden Patientendaten identifizierte, wurde mit überwachten und unüberwachten Algorithmen des maschinellen Lernens gewonnen (Kuhn M, J Statistical Software, 2008; 28(5):1-26). Die Daten wurden vorverarbeitet indem Merkmale mit niedriger Varianz und hoher Korrelation für Dimensionsreduktion unter Einhaltung der Best Practice-Empfehlungen entfernt wurden. Fehlende Messungen wurden mit Nullen, wie es üblicherweise in standardisierten Datenimputationsverfahren erfolgt, aufgefüllt. Folgende überwachte Algorithmen wurden verglichen: AdaBoost, Support Vector Machines (SVM) and Random Forest (RF) (Forman G and Cohen I, 2004. „Learning from Little: Comparison of Classifiers Given Little Training“ doi: 10.1007/978-3-540-30116-5_17). Kleine Datensätze sind oft anfällig für Überanpassung. Es wurden Klassifikatoren, die für das Trainieren bei kleinen Datensätzen geeignet sind, für einen Vergleich der Merkmale bei wenig Training verwendet und gewählt wurde der am besten geeigneter Algorithmus entsprechend Genauigkeit und Robustheit gegenüber Überanpassung (Saeb AT, Al-Naqeb D. Scientifica (Cairo). 2016; 2016:2079704. doi:10.1155/2016/2079704. Epub 2016 May 30). Die überwachten ML-Modelle wurden 10-fach kreuzvalidiert. Die Merkmalsauswahl von AdaBoost und RF wurde dann angewendet, um die Anzahl der Merkmale auf unter 20 weiter zu verringern. Wir haben die t-verteilte stochastische Nachbareinbettung (t-SNE) für die unüberwachte Klassifikation durch maschinelles Lernen und für die nicht-lineare Dimensionalitätsreduktion angewendet (Maaten L V D & Hinton G, Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research, 2008; 9:2579-2605. Doi http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html).
  • ERGEBNISSE
  • Die Analyse der Basischarakteristika von Patienten der Patientengruppe für den Sicherheitsdatensatz (SAS) und der Patientengruppe für den Per-Protokoll-Datensatz (PPS) folgte der Beschreibung der vorgegebenen Kohortenanalysen SAS (n=77) und PPS (n=58) Placebo vs. CD133+. Die Post-hoc-Analyse wurde zusätzlich durchgeführt, um Faktoren zu analysieren, die den Ausgang des primären Endpunktes beeinflussen. Hierfür wurden Patienten als Responder (Zunahme der LVEF >5 % nach 180 Tagen) bzw. Nicht-Responder (Zunahme der LVEF <5 % nach 180 Tagen) zusammengefasst. Gemäß dieser Post-hoc-Analyse waren 35/58 (60,3 %) Patienten Behandlungsresponder und 23/58 (39,7 %) wiesen keine Verbesserung der LVEF auf. Dieses Verhältnis von Respondern zu Nicht-Respondern (NR) war in der Placebogruppe mit 57/43% (R/NR: 17/13 Patienten (Pt.)) und in der CD133+ Gruppe mit 64/36% (R/NR: 18/10 Pt.) vergleichbar (Placebo vs. CD133+: p=0,373).
  • Analyse des Wirksamkeitsendpunkts
  • Die PPS-Wirksamkeitsanalysegruppe (n=58) war characterisiert durch eine verminderte Pumpenfunktion nach MI (gemessen im MRT in Ruhe) gegenüber der Ausgangs-LVEF von 33,5 %, SD ±6,26% [Min-Max 25-49], n=58. Vordefinierter primärer Endpunkt: Sechs Monate nach der Behandlung zeigte die linksventrikuläre Funktion eine erhebliche Zunahme der LVEF von +9,6 % ± SD 11,3% [Min-Max -13 - 42], p<0,001 (n=58). Um eine frühe Verbesserung der linksventrikulären Funktion durch CABG-Revaskularisierung von einem späten myokardialen Reverse-Remodelingsprozess zu unterscheiden, stand einer Untergruppe von Patienten (n=29) eine weitere Zwischenanalyse mit dem MRT bei Entlassung aus dem Krankenhaus zur Verfügung. Hiermit ergaben sich überwiegend späte (Tag 10-180) Zunahmen der ΔLVEF um +6,5 %, SD ±7,92% [Min-Max -11-23], p=0,007 (n=29). In der ANCOVA-Analyse des primären Endpunkts verbesserte sich bei der Placebogruppe die Ausgangs-LVEF 33,5 % auf 42,3 % nach 180 Tagen (ΔLVEF +8,8 %, SE ± 2,17 % [KI 38,0, 46,6], p<0,001;n=30) und bei der CD133+ Gruppe erhöhte sich die LVEF von 33,5 % auf 43,9 % (ΔLVEF +10,4 %, SE ± 2,33 % [KI 39,0, 48,5], p<0,001; n=28). Der Unterschied der Behandlungsgruppe CD 133+ Gruppe gegenüber Placebo war mit +2,58± SE 3,13% [KI -3,7 - 8,9], p =0,414 gemäß ANCOVA-Analyse nicht statistisch signifikant. Die CD133+ Stammzellgruppe zeigte eine Verbesserung der ΔLVEF überwiegend in der Spätphase (Tag 10-180 ΔLVEF) mit +8,8%, SD ±6,38% [Min-Max 4-10], p=0,001 (n=14) gegenüber den Placebo-Kontrollen (Tag 10-180 ΔLVEF) +4,3%, SD ±8,8% [Min-Max -11 - 23], p=0,077 (n=15).
  • Responder (R) / Nicht-Responder (NR)
  • In der Post-hoc-Analyse des primären Endpunkts wurden als Behandlungsresponder definiert, deren ΔLVEF nach 180 Tagen um mehr als 5 % höher gegenüber dem Ausgangswert lag. Verteilt über 35 Responder in einer Kohorte mit 58 Patienten waren die Ergebnisse geprägt von einer Gesamtzunahme der ΔLVEF in der ANCOVA nach 180d/0 von +17,1 %; SE ±2,08 % [KI 12,9.; 21,3], RvsNR, p<0,0001 (180d/0), n=58. Die LVEF-Zunahme betrug +19,1% bei CD133+ vs. +13,9% Placebo, p=0,099, n=35 (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu zeigten Nicht-Responder eine ΔLVEF nach 180d/0 von 0%, SE ±5,73% [KI 22,3; 44,8] p=0,287 (Placebo/NR +3,3%, CD133+/NR -2,4%).
  • Post-hoc sekundärer Endpunkt: Responder zeigten eine signifikante Reduktion in den LV-Dimensionen (LVEDV p=0,008, LVESV p=0,0001) und Reduktion beim NT-pro-BNP, p=0,0002 im Vergleich zu Nicht-Respondern. Dies wurde nicht in einer vergleichbaren Verbesserung im 6MGT widerspiegelt (p=0,811). Die intramyokardiale Gewebe-Wiederherstellung wurde bei Respondern mit Verbesserung der Narbengröße bei RvNR - 8,19g SE ±3,5g, p=0,0238 gefunden. Die mit CD133+ behandelten NR zeigten ebenfalls eine Verkleinerung der Narbengröße (CD133+NR ΔNarbengröße 180d/0: -13,9g, SD ±20,9 g Placebo NR +11,9, SD ±16,7g, p=0,008, n=20) und von nicht-vitalem Gewebe (Δnicht-vitales Gewebe 180d/0: CD133+ NR -12.4g, SD ±19,3g vs. Placebo NR +11,5g, SD ±12,0g, p=0,004, n=19) (Daten nicht gezeigt). Diese Tendenz wurde nicht bei Respondern beobachtet: Narbengröße (CD133+ NR vs. Placebo NR -1,9, SD ±16,0 g vs. Placebo +2,5, SD ±13,2g, p=0,398, n=33) und nicht-vitales Gewebe (CD133+ NR vs. Placebo NR -1,4, SD ±16,7g vs. Placebo +1,8, SD ±12,3 g, p=0,544, n=32). Langzeitüberleben: Das mittelfristige Überleben betrug 76,9± 3,32 Monate (R) vs. +72,3 ± 5,0 Monate (NR), HR 0,3 [KI 0,07-1,2]; p=0,067.
  • Bei den zirkulierenden EPC (CD133+/CD34+/CD117+) im peripherem Blut wurde eine Reduktion um den Faktor 2 bei NR gegenüber R vor der Behandlung festgestellt. Bei den CD34+ MNC-Subpopulationen betrugen die präoperativen Blutspiegel (R): CD34+ 0,072%, SD ±0,05% vs. (NR) 0,039%, SD ±0,017, RvsNR p=0,027. Ein ähnlicher Unterschied wurde präoperativ für die Subpopulationen CD133+, CD133+ und CD117+ gefunden (präoperativ RvsNR: CD133+ 0,048%, SD ±0,031% vs. 0,021%, SD ±0,011%, p=0,005; CD133+CD117+ 0,019%, SD ±0,016% vs, 0,007%, SD±0,008%, p=0,024, n=23) (siehe Tabelle 1). Dieser Unterschied wurde nicht für den Vergleich von Placebo und CD133+ gefunden (Placebo vs. CD133+ Gruppe: CD34+ p=0,975; CD133+ p=0,995; CD133+CD117+ p=0,892; n=24) (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu zeigten die CD146+ CEC höhere präoperative Spiegel bei den Nicht-Respondern gegenüber den Respondern (p=0,053) (Tabelle 1).
  • Postoperativ blieb die Verringerung von EPC bei den NR signifikant bis zur Entlassung: peripheres Blut CD34+ (NR vs. R p= 0.026 präoperativ-op und Tag 10) und CD133+ CD117+ (NR vs. R p=0,024 präoperativ-op und Tag 10) trotz erhöhter postoperativer EPO-Spiegel (NR: präop. 16,9 U/ml, SD ±14,1 U/ml; NR Tag 10: 42,1 U/ml , SD ±23,9 U/ml; p=0,006 präoperativ/Tag 10) und Verringerung von IP10/CXCL10 (NR präoperativ: 157,6 pg/ml, SD ± 94,5pg/ml; NR Tag 10: 95,8 pg/ml, SD ±85,2pg/ml; p=0,01 präoperativ / Tag 10).
  • Die Behandlungsresponder waren gekennzeichnet durch präoperative niedrigere Serumspiegel von pro-angiogenen Faktoren wie VEGF (p=0,056 R/NR), EPO (p=0,023 R/NR), CXCL10/IP10 (p=0,076 R/NR), höheren Spiegeln von IGFBP-3 (p=0,089 R/NR) (Tabelle 1) sowie starker Induktion von VEGF (+26,6pg/ml, p=0,015 präoperativ/Tag10) am Tag 10 nach Eingriff gegenüber Nicht-Respondern (+1,2pg/ml, p=0,913 präoperativ/Tag 10) (Tabelle 1). Isolierte CD133+ Knochenmarkzellen wurden alle positiv auf ihr angiogenes Potenzial in vitro im CFU-EC und in vivo im Matrigel-Plug getestet (Daten nicht gezeigt).
  • Die Thrombozytenzahlen waren bei den NR präoperativ (208 x109/L, SD ±51,2 109/L [KI 73-311], n=23) versus R (257 x109/L, SD ±81,5 109/L [KI 123-620], n=35) (NR vs R: p=0,004, n=58) vor der Behandlung verringert. Bei Verdacht auf eine Knochenmark-Stammzellsuppression durch Auffindung einer erniedrigten Thrombozytenzahl und CD133+ CD34+ EPC-Zahl im PB, haben wir eine RT-PCR-Genexpressionsanalyse der SH2B3 mRNA-Kodierung für das LNK-Adapterprotein SH2B3, welches mit der Hemmung der hämatopoetischen Stammzellenantwort bei EPC und Megakaryozyten in sofort eingefrorenen Blutproben geprüft. Die erste Analyse bei 21 Patienten zeigte eine Tendenz zu einer erhöhten mRNA-Expression im peripherem Blut bei Nicht-Respondern (p=0,073) (siehe Tabelle 1, 1).
  • Tabelle 1: Analyse der Angiogenese-spezifischen Biomarker im Blut. Es wurden Responder gegen Nicht-Responder und Placebo gegen CD133+ Gruppen auf eine Veränderung in den Biomarkern in peripheren Blutproben präoperativ (Untersuchung I) und am Tag 10 postoperativ (Entlassung) analysiert. Die Daten stammen von der Patientengruppe (Kohorte) mit vollständiger Analyse (klinischer Per-Protokoll-Datensatz und Biomarker). In dieser Kohorte wurden alle Proben umgehend verarbeitet, um jegliche Veränderung bei den Proben aufgrund von Lagerung oder Transport zu vermeiden. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung, p-Wert zwischen Zeitpunkt 0 und 10 Tagen, PA-Wert zwischen Responder/Nicht-Responder, Stammzellen/Kontrolle für jeden Zeitpunkt (PB - peripheres Blut, EPO - Erythropoietin).
    Responder versus Non-Responder
    Biomarker (peripheres Blut, Einheit) Zeitpunkt Responder (n=15) P 10 Tage vs 0 Responder (n=8) P 10 Tage vs 0 PA R vs NR
    SH2B3 mRNA (ΔCT %) 0 -1·17 ±0·28 ... -1·56±0·51 ... 0·073
    CD34 (% MNC) - EPC 0. 0·072±0·05 0·197 0·039±0·017 0·116 0·027
    10 d 0·059±0·048 0·027±0·01 0·026
    CD133 (% MNC) - EPC 0 0·048±0·031 0·245 0·021±0·011 0·932 0·005
    10 d 0·041±0·039 0·021±-0·013 0·105
    CD133,117 (% MNC) EPC 0 0·019±-0·016 0·421 0·007±0·008 0·765 0·024
    10 d 0·022±0·024 0·006±0·004 0·024
    CD146 (% MNC) - CEC 0 1·1±0,57 ... 2·2±1·3 ... 0·053
    10 d 1·72±1·73 1·86±1·53 0·853
    IGFBP-3 (ng/ml) 0 2121·9±487· 1 0·115 1623·7±651· 4 0·257 0·089
    10d 1753·6±830· 8 1378·4±518· 7 0·261
    VEGF (pg/ml) 0 24·6±-36·6 0·015 39·6±33·4 0·913 0·056
    10d 51·2±55·8 40·8±-44·5 0·528
    IP-10 (pg/ml) 0 96·7:1:42·6 0·04 157·6±94·5 0·01 0·076
    10d 63·3±28·3 95·8±85·2 0·324
    EPO (mlU/ml) 0 5·9±3·7 0·001 16·9±14·1 0·006 0·023
    10 60·1 ±27·7 42·1 ±23·9 0·180
    Placebo versus CD133+
    Biomarker (peripheres Blut, Einheit) Zeitpunkt Stammzelle (n=11) P Kontrolle (n=13) P PA
    SH2B3 mRNA (ΔCT %) 0 -1·35 ±0·45 ... -1·29±0·41 ... 0·756
    CD34 (% MNC) - EPC 0. 0·062±0·037 0.128 0·064±0·053 0·250 0·975
    10 d 0·041 ±0·038 0·058±0·047 0·363
    CD133 (% MNC) - EPC 0 0·04±0·03 0·338 0·04±0·029 0·619 0·995
    10 d 0·032±0·026 0·038±0·032 0·637
    CD133,117 (% MNC) - EPC 0 0·014±0·013 0·902 0·016±0·017 0·265 0·892
    10 d 0·015±0·02 0·019±0·022 0·626
    CD146 (% MNC) - CEC 0 1·53±1·33 ... 1·48±0·67 ... 0·919
    10 d 1·64±1·55 1·87±1·74 0·750
    IGFBP-3 (ng/ml) 0 1950·6±689· 9 0·139 1946·8±507 0·231 0·972
    10d 1561·6±783· 2 1679·4±742· 6 0·715
    VEGF (pg/ml) 0 30·2±29·1 0·142 29·6±39·1 0·124 0·961
    10d 55·8±-58·5 38·5± 44·7 0·293
    IP-10 (pg/ml) 0 129·2±96·7 0·011 102·9±34·6 0·001 0·275
    10d 83·2±77·9 64·5±22·7 ... 0·457
    EPO (mlU/ml) 0 7·7±3·1 0·001 10·3±12·6 0·001 0·561
    10d 53·5±-30·6 56·4±25·5 0·814
  • Um eine diagnostische Antwortsignatur für R/NR zu identifizieren, haben wir maschinelle Lernverfahren als Werkzeug für die Vorhersage der funktionellen Verbesserung nach kardialer Stammzelltherapie und CABG-Operation verwendet. Erst wurden Analysen durchgeführt, um Überanpassung bei kleinen Populationen ausdrücklich auszuschließen. Dann wurden verblindete Patientendaten aus der PERFECT klinischen Datenbank durch überwachtes ML untersucht, welches in der Lage ist, ähnliche Patienten in unmittelbarer Nähe zu einander zu gruppieren und unterschiedliche Gruppen aufzeigt. Bei Untersuchung der zugrunde liegenden Segmentierung erfolgte zuerst die überwachte ML-Analyse für alle Zeitpunkte, um die Patientencharakteristika in zwei gesonderte Gruppen unterzubringen. Die Berechnung wies die Patientencharakteristika gemäß der ΔLVEF nach 180 Tagen selbstständig zu, die Vorauswahlkriterien > 5% erfüllend (siehe Tabelle 2, 2).
  • Dann wurden maschinelle Lernalgorithmen verwendet, um die entscheidenden Parameter einer Antwortsignatur zu untersuchen. Hierfür wurden der zugrunde liegende PERFECT klinische Datensatz und die Biomarker-Labormessungen kombiniert und analysiert, um die Klassifikationsspezifität der Parameterprofile für Responder und Nicht-Responder vor und nach dem CABG-Operation zu validieren. Insbesondere haben wir unterscheidende primäre und sekundäre Endpunktparameter sowie Thrombozyten- und Leukozytenzahlen angewendet. Bei Anwendung nur der klinischen Parameter (n=160) ergab die Klassifikation eine Spezifität der Responder ausgedrückt als mittlere Genauigkeit von 63,35 % (180 Tage) (Tabelle 2). Die Kombination von präoperativen klinischen Daten (n=49) und Biomarker-Laborparametern (n=142) zeigte jedoch eine höhere Sensitivität der Parameter für Angiogenese/EPC/CEC im peripheren Blut bereits präoperativ, ausgedrückt entsprechend als maximale Genauigkeit von 81,64% ± SE 0,51% [KI 80,65-82,65] (n=31) (Tabelle 2). Interessanterweise gehörten 17/20 der relevanten Parameter zu den Angiogeneseparametern, Knochenmark EPC/CEC-Reaktionen, NT-proBNP und SH2B3-Genexpression im peripheren Blut (Tabelle 2). Bei Anwendung der klinischen Parameter und der Biomarker-Parameter betrug die präoperative Vorhersagegenauigkeit für Responder 79,35% ± SE 0,24% [KI 78,87-79,84] (n=31) und für Nicht-Responder 83,95% ± SE 0,93% [KI 82,10-85,80] (n=31). Die postoperative Auswertung am Tag 10 (n=382) ergab eine Vorhersagegenauigkeit von 82,12% ± SE 0,28% [KI 81,56 - 82,67] (n=31) (R) und 85,89% ± SE 0,67% [KI 84,56 - 87,22] (n=31) (NR) während die Tag 0-180 kombinierte klinische und Biomarkeranalyse (n=522) eine Vorhersagegenauigkeit von 94,77 % ±SE 0.43% [CI 93.92 - 95.63] (n=31) (R) und 92,44% ± SE 0,60% [CI 91,24-93,64] (n=31) (NR) (siehe 3) ermöglichte.
  • Die Merkmalsauswahl auf Basis unseres maschinellen Lernansatzes führte zur Identifizierung von entscheidenden Faktoren für eine mangelnde Reaktion und Induktion einer kardialen Regeneration, was für die diagnostische Auswahl von R/NR vor und während der Überwachung der Behandlung genutzt werden kann. Die Kernfaktoren für eine Labordiagnostik im peripheren Blut waren NT-proBNP, VEGF, Erythropoietin, Vitronectin, zirkulierende EPC/CEC/Thrombozyten, SH2B3 mRNA-Expression, der CFU-Hill-Assay/Matrigel-Plug sowie das Gewicht und der LVESV-Index. Wir haben eine statistische Korrelation der identifizierten Faktoren gefunden und deren diagnostischer Nutzen zur Auswahl von Responder- und Nicht-Responder-Patienten mittels wiederholter Kreuzvalidierung berechnet (siehe 4).
  • Durch ML wurde eine Untergruppe von Labor-Biomarkern zusammen mit spezifischen Merkmalen der klinischen Prüfung ausgewählt. Die rechnerisch ausgewählten Merkmale und Biomarker sind nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt. Die Genauigkeit der Vorhersage wurde über 80 % bestimmt. Tabelle 2: Durch maschinelles Lernen ausgewählte Parameter für die diagnostische Unterscheidung zwischen Respondern und Nicht-Respondern.
    Rechnerisch ausgewählte Merkmale für die klinischen Prüfungsdaten und der Labor-Biomarkeruntergruppe der Rostockgruppe (Tag 0 - präoperativ) N=31 Gewichtung der ausgewählten Merkmale
    NT-proBNP 9 718
    VEGF 7 810
    Erythropoietin 4 262
    Vitronectin 3 898
    CFU_Hill 2 871
    CD45Neg_EPC 2 186
    CD117_184_PB_EPC_IHG 2 146
    CD45_117_184_EPC 2 118
    CD45_133_146_PB_CEC 1 969
    Thrombozyten 1 951
    IGFBP-3 1 922
    CD133 pro ml PB_IHG 1 910
    CD146_PB_CEC 1 799
    CD105_PB_CEC 1 793
    CD45_133_34_105_PB_CEC 1 489
    MatrigelPlug_PB_31 1 475
    CD45_133_34_117_309_EPC 1 420
    Delta_CT_SH2B3 1 393
    Gewicht 1 363
    LVESV 1 352
    Genauigkeit: 81,64%
  • Die Erfindung, die hierin beispielhaft beschrieben ist, kann geeigneterweise in Abwesenheit irgendeines Elements oder mehrerer Elemente, irgendeiner Einschränkung oder mehrerer Einschränkungen, die hierin nicht speziell offenbart ist/sind ausgeübt werden. Somit kann zum Beispiel in jedem vorliegenden Fall jeder der Begriffe „umfassend“, „bestehend im Wesentlichen aus“ und „bestehend aus“ mit einem der beiden anderen Begriffe ersetzt werden. Die Begriffe und Ausdrücke, die verwendet wurden, werden als Begriffe zur Beschreibung und nicht als Beschränkung verwendet und es besteht durch die Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke keine Absicht, Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen, aber es ist erkannt, dass verschiedene Modifikationen im Rahmen der beanspruchten Erfindung möglich sind. Somit versteht es sich, dass, obwohl die vorliegende Erfindung durch bevorzugte Ausführungsformen und optionale Merkmale speziell offenbart wurde, Modifikationen und Variationen der hierin offenbarten Konzepte durch den Fachmann in Betracht gezogen werden können und dass solche Modifikationen und Variationen als im Rahmen dieser Erfindung fallend betrachtet werden, wie sie durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.
  • Alle Referenzen, die in dieser Beschreibung zitiert sind, sind hiermit durch Verweis in Bezug auf deren gesamten offenbarten Inhalt und des speziell in dieser Beschreibung offenbarten Inhalts aufgenommen.
  • Abkürzungscode
    • AE = Unerwünschtes Ereignis
    • AESI = Unerwünschte Ereignisse von spezifischem Interesse
    • AHA = American Heart Association
    • ANCOVA = Kovarianzanalyse
    • BM = Knochenmark
    • BMSZ = Knochenmark-Stammzellen
    • CABG = Koronararterien-Bypass-Chirurgie
    • CAP-EPC = Concentrated Ambient Particles - Endothelial Progenitor Cells
    • CBA = Cytometric Bead Array
    • CCS = Canadian Cardiovascular Society
    • CCTRN = Cardiovascular Cell Therapy Research Network
    • CD = Cluster of Differentiation
    • CEC = zirkulierende Endothelzellen, CEC-Panel, CDs gemessen im PB
    • CFU = Koloniebildende Einheit
    • CI = Konfidenzintervall
    • CMV = Zytomegalievirus
    • EA = Early Antigen
    • EBNA1 = EBV-nukleäres Antigen 1
    • EBV = Epstein-Barr-Virus
    • EC = Endothelzellen
    • ECG = Echokardiographie
    • ELISA = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
    • EPC = endotheliale Vorläuferzellen, EPC-Panel, CDs gemessen im PB
    • EPO = Erythropoietin
    • GMP = Gute Herstellungspraxis
    • HR = Hazard Ratio
    • HIF = Hypoxie-induzierbarer Faktor, Transkriptionsfaktor
    • ICH GCP = Harmonisierte ICH-Leitlinie für die EU, Japan und die USA für die Gute Klinische Praxis
    • IGF-1 = Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1
    • IGFBP2/3 = Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein 2/3
    • IHG = gemäß den ISHAGE-Leitlinien durchgeführte Analyse
    • IL = Interleukin
    • IP-10 = Interferon Gamma-induziertes Protein 10 auch bekannt als C-X-C-Motiv Chemokin 10 (CXCL10)
    • LMCA = linke Haupt-Koronararterie
    • LVEDV = linksventrikuläres enddiastolisches Volumen
    • LVEF = linksventrikuläre Ejektionsfraktion
    • LVESD = linksventrikuläre endsystolische Dimension
    • MACE = schwere unerwünschte kardiovaskuläre Ereignisse
    • ML = maschinelles Lernen
    • MNC = mononukleäre Zellen
    • MRI = Magnetresonanztomographie
    • 6MWT = 6-Minuten Gehtest
    • NT-proBNP = B-Typ natriuretisches Peptid
    • PB = peripheres Blut
    • PBMNC = mononucleäre Zellen aus peripherem Blut
    • PCI = perkutane Koronarintervention
    • PEI = Paul-Ehrlich-Institut
    • PPS = Patientengruppe für den Per-Protokoll-Datensatz
    • SAE = schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis
    • SAS = Patientengruppe für den Sicherheitsdatensatz
    • SDF-1 = Stromazell-abgeleiteter Faktor 1
    • SH2B3 = Lnk [Src-Homologie 2-B3 (SH2B3)] gehört zu einer Familie der SH2-haltigen Proteine mit wichtigen Adapterfunktionen
    • SCF = Stammzellfaktor
    • STEMI = ST-Hebungs-Myokardinfarkt
    • SUSAR = Verdachtsfall einer unerwarteten, schwerwiegenden Nebenwirkung
    • TNF = Tumor-Nekrose-Faktor
    • t-SNE = t-verteilte stochastische Nachbareinbettung
    • VCA = Virus-Capsid-Antigen
    • VEGF = vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor
    • VEGF rec = vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor
    • VEGFR2 / KDR = vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 / Kinase Insert Domain Rezeptor
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (26)

  1. Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, wobei das Verfahren umfasst (i) Bestimmen der Menge von jedem der folgenden Biomarker in einer Probe eines Patienten, wobei die Biomarker ausgewählt sind aus der Gruppe von Wachstumsfaktor, Lymphozyt-Adapterprotein, Glykoprotein, B-Typ natriuretisches Peptid (BNP), zirkulierender Endothelzellen (CEC), zirkulierender Thrombozyten, zirkulierender mononukleärer Zellen (MNC) und Subpopulationen und Rezeptor/Ligand Expression auf MNC-Subpopulationen, (ii) Vergleichen der bestimmten Mengen mit einem Ausgangswert und/oder einer Referenz, (iii) Vorhersagen auf Basis der Ergebnisse des Vergleichs, ob eine Antwort auf die kardiale Reparatur beim Patienten zu erwarten ist, nicht zu erwarten ist oder ambivalent ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Empfindlichkeit und Spezifität der Vorhersagegenauigkeit mehr als etwa 80 % beträgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wachstumsfaktor vorzugsweise ausgewählt ist aus VEGF und/oder Erythropoietin, das Lymphozyt-Adapterprotein vorzugsweise ausgewählt ist aus SH2B3, das Glykoprotein vorzugsweise ausgewählt ist aus Vitronectin und das B-Typ natriuretische Peptid vorzugsweise ausgewählt ist aus NT-proBNP.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Verfahren weitere Biomarker verwendet, wobei die weiteren Biomarker vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe von Zytokin, Interleukin, Interferon, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor, Chemokin-Protein und/oder Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das Zytokin vorzugsweise ausgewählt ist aus TNF, das Interleukin vorzugsweise ausgewählt ist aus IL-6, IL-8 und/oder IL-10, das Interferon vorzugsweise ausgewählt ist aus humanem Interferon-gamma induziertem Protein 10, das insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindende Protein vorzugsweise ausgewählt ist aus insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein-2 und/oder insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein-3, der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor vorzugsweise ausgewählt ist aus IGF2, das Chemokin-Protein vorzugsweise ausgewählt ist aus SDF-1 und/oder der Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex vorzugsweise ausgewählt ist aus SCF.
  6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren für die präoperative Vorhersage der Antwort auf Stammzelltherapie und/oder Induktion einer Angiogenese-Antwort und/oder Gewebereparatur im Zusammenhang mit kardiovaskulärer Erkrankung einschließlich Myokardinfarkt, Schlaganfall und peripherer ischämischer vaskulärer Erkrankungen, Herzerkrankung und/oder ischämischer Präkonditionierung angewendet wird.
  7. Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die Stammzelltherapie gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Probe von einem Patienten entnommen wird, der unter einer Herzerkrankung und/oder Arteriosklerose leidet.
  8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren die Profilerstellung der Ergebnisse des Vergleichs an mindestens zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Zeitpunkten umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Sensitivität und Spezifität der Vorhersagegenauigkeit mehr als etwa 90 % beträgt.
  10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ferner die Anwendung von klinischen Diagnostik-Parametern umfasst.
  11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren für die Profilerstellung der Angiogenese-Antwort verwendet wird.
  12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ferner die Analyse einer RNA- und/oder mRNA-Sequenz und/oder funktionalen RNA wie mikroRNA und/oder nicht-kodierenden RNA und/oder SNP, umfassend eine diagnostische Signatur, umfasst.
  13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ferner die Analyse von pharmakokinetischen und pharmakogenetischen Daten unter Anwendung der RNA- und DNA-Sequenzanalyse und/oder Netzwerksignalanalyse umfasst.
  14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verfahren ferner die Analyse der Phänotypisierung umfasst.
  15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Stammzelltherapie die Transplantation von CD133-positiven Stammzellen umfasst.
  16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Patient ein Mensch ist.
  17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe eine Blut-, eine Serum- und/oder eine Plasmaprobe und/oder eine Biopsiegewebeprobe und/oder eine Probe von zirkulierenden Stammzellen wie EPC ist.
  18. Kombination von Biomarkern ausgewählt aus der Gruppe von Wachstumsfaktor, Lymphozyt-Adapterprotein, Glykoprotein, B-Typ natriuretisches Peptid (BNP), zirkulierender endothelialer Voräuferzellen (EPC), zirkulierender Endothelzellen (CEC), zirkulierender Thrombozyten, zirkulierender mononukleärer Zellen (MNC) und Subpopulationen und Rezeptor/Ligand Expression auf MNC-Subpopulationen für die Anwendung in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration.
  19. Kombination von Biomarkern nach Anspruch 18 für die Anwendung in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, wobei der Wachstumsfaktor vorzugsweise ausgewählt ist aus VEGF und/oder Erythropoietin, das Lymphozyt-Adapterprotein vorzugsweise ausgewählt ist aus SH2B3, das Glykoprotein vorzugsweise ausgewählt ist aus Vitronectin und das B-Typ natriuretische Peptid vorzugsweise ausgewählt ist aus NT-proBNP.
  20. Kombination von Biomarkern nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Kombination ferner einen oder mehrere Biomarker umfasst, wobei die weiteren Biomarker ausgewählt sind aus der Gruppe von Zytokin, Interleukin, Interferon, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein, insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor, Chemokin-Protein und/oder Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex.
  21. Kombination von Biomarkern nach Anspruch 20, wobei das Zytokin vorzugsweise ausgewählt ist aus TNF, das Interleukin vorzugsweise ausgewählt ist aus IL-6, IL-8 und/oder IL-10, das Interferon vorzugsweise ausgewählt ist aus humanem Interferon-gamma induziertem Protein 10, das insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindende Protein vorzugsweise ausgewählt ist aus insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein-2 und/oder insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-bindendem Protein-3, der insulin-ähnliche Wachstumsfaktor vorzugsweise ausgewählt ist aus IGF2, das Chemokin-Protein vorzugsweise ausgewählt ist aus SDF-1 und/oder ist der Multi-Protein-E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex vorzugsweise ausgewählt ist aus SCF.
  22. Kombination von Biomarkern nach einem der Ansprüche 18 bis 21 für die Anwendung in einem Verfahren zur Vorhersage der Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration, wobei das Verfahren ferner die Analyse von klinischen diagnostischen Daten und/oder RNA und/oder mRNA und/oder funktionale RNA wie mikroRNA und/oder nicht-kodierende RNA und/oder SNP und/oder die Analyse von pharmakokinetischen Daten und/oder Phänotypisierung umfasst.
  23. Verfahren nach Anspruch 6 oder 17 oder eine Kombination von Biomarkern nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das Verfahren und/oder die Biomarker für die präoperative Vorhersage der Antwort auf Stammzelltherapie verwendet werden und wobei die Stammzelltherapie begleitet ist von Koronararterien-Bypass-Chirurgie (CABG).
  24. Kit für die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Kit Nachweisagenzien für die Bestimmung der Menge jedes der Biomarker der Ansprüchen 1 bis 5 in einer Probe des Patienten umfasst.
  25. Computergerät, umfassend einen Prozessor und einen Speicher, der ein oder mehrere mit dem Prozessor gekoppelte Machine-Learning-Modelle kodiert, wobei besagte Programme den Prozessor ein Verfahren ausführen lassen, das besagte Verfahren umfasst (i) Vergleichen der bestimmten Mengen des/der Biomarker(s) nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem Ausgangswert und/oder einer Referenz, (ii) Vorhersagen, auf Basis der Ergebnisse des Vergleichs, ob eine Antwort auf die kardiovaskuläre Regeneration beim Patienten zu erwarten ist, nicht zu erwarten ist oder ambivalent ist.
  26. Gerät, das geeignet ist, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 auszuführen, umfassend (i) eine Analyseeinheit für die Bestimmung der Menge von jedem der Biomarker in der Probe eines Patienten nach einem der Ansprüche 1 bis 5, und (ii) ein Computergerät gemäß Anspruch 25.
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