KR102535577B1 - 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법 - Google Patents

심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오마커의 사용을 포함하는 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 심혈관 재생에 대한 반응 예측 방법에서 사용하기 위한 바이오마커의 조합, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 장치 및 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 장치에 관한 것이다.

Description

심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법
본 발명은 바이오마커의 사용을 포함하는 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 심혈관 재생에 대한 반응의 예측을 위한 방법에 사용하기 위한 바이오마커의 조합, 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 장치 및 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 장치에 관한 것이다.
심장 조직의 회복을 위한 재생 요법은 지난 16 년 동안 전임상 및 임상 개발의 최전선에 있었다. 다른 접근법들 중에서도 심장 조직에 골수 줄기 세포를 직접 적용하는 것은 2001년 최초의 적용 및 초기 유망 임상 시험 이후 가장 헌신적인 임상 개발 관심을 받고 있다 (Stamm C, Westphal B, Kleine HD, et al. Lancet. 2003; 361(9351):45￢ 46; Tse HF, Kwong YL, Chan JK, Lo G, Ho CL, Lau CP. Lancet 2003; 361(9351):47-9; Stamm C, Kleine HD, Choi YH, et al. J Thorac Cardiovasc Surg 2007;133(3):717-25). 그러나, 이러한 시험에서, 치료 및 위약 그룹 모두에서 LVEF (Left Ventricular Ejection Fraction) 및 비-반응 환자의 임상적으로 관련된 개선이 관찰될 수 있었다 (Timothy D H, Lem M, Jay H T, Circulation Research 2016; 119:404-406; Nasseri B A, Ebell W, Dandel M, et al. Eur Heart J. 2014, 35(19):1263-74; Bartunek J, Terzic A, Davison B A et al. Eur. Heart J. 2016 Dec 23. pii: ehw543. doi: 10.1093/eurheartj/ehw543).
이는 줄기 세포 적용 및 CD34+ 내피 전구 세포 (EPC)와 관련된 결환 회복의 잠재적 억제 인자와 무관한 재생 메커니즘에 대한 유도 문제를 제기하였다 (Werner N, Kosiol S, Schiegl T, et al. N Engl J Med. 2005; 353(10):999-1007). 최근 발표된 가정과 관련하여 CD133/CD34+ 말초 순환 EPC의 중추적인 역할은 심장 재생의 결함과 관련이 있을 수 있다 (Taylor DA, Perin EC, Willerson JT, et al. Cell Transplant 2016;25(9):1675-1687; Bhatnagar A, Bolli R, Johnstone BH, et al. Am Heart J 2016; 179:142-50; Contreras A, Orozco AF, Resende M, et al. Basic Res Cardiol 2017;112(1):3.).
따라서, 심장 재생의 메커니즘 및 골수 줄기 세포-조절된 혈관신생의 역할은 여전히 미해결된 상태로 남아있다.
본 발명자들은 이제 바이오마커의 결정을 포함하는 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법을 확인하였다. 따라서 본 발명은 본 출원의 청구항 1에 따른, 바이오마커의 결정을 포함하는 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 심혈관 재생에 대한 반응의 예측을 위한 방법에 사용하기 위한 바이오마커의 조합, 이러한 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 장치 및 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 장치에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
(i) 개체의 샘플에서 다음의 바이오마커, 상기 바이오마커는 성장 인자(Growth factor), 림프구 어댑터 단백질(Lymphocyte adapter protein), 당단백질(Glycoprotein), 뇌 나트륨이뇨펩타이드(brain natriuretic peptide, BNP), 순환 내피 전구 세포(circulating endothelial progenitor cells, EPC), 순환 내피 세포(circulating endothelial cells, CEC), 순환 혈소판(circulating thrombocytes), 순환 단핵 세포 및 하위집단(circulating mononuclear cells and subpopulations), 및 MNC 하위집단에서의 수용체/리간드 발현(receptor/ligand expression)으로 군으로부터 선택된 바이오마커의 각각의 양을 결정하는 단계,
(ii) 상기 결정된 양을 기준값 및/또는 참조와 비교하는 단계,
(iii) 상기 비교 결과에 기초하여, 상기 개체에서의 심장 회복에 대한 반응이 예상되는지, 예상되지 않는지, 또는 모호한이지(ambivalent)의 여부를 예측하는 단계
를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 생체 외 방법이다. 또한, 그것은 앞서 명시적으로 언급된 단계들 외에 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 샘플 전처리 또는 상기 방법에 의해 얻어진 결과의 추가 평가 또는 사용과 관련될 수 있다. 상기 방법은 수동으로 수행되거나 자동화에 의해 지원될 수 있다. 바람직하게는, 단계 (i)은 전체적으로 또는 부분적으로, 예를 들어 적절한 로봇 및 감각 장비와 같은 자동화에 의해 지원될 수 있다. 단계 (ii) 및/또는 (iii)은 각각의 비교 및/또는 예측을 수행하는 데이터 처리 유닛에 의해 지원될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 방법을 사용함으로써 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 정확도는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상으로 개선될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "예측"은 상기 심장 치료 후 본원에서 상세하게 정의된 바와 같은 심혈관 시스템의 기능적 개선이 있다는 점에서 개체가 심장 줄기 세포 치료로부터 이익을 얻을 것에 따른 확률을 평가하는 것을 의미한다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 이러한 평가는 일반적으로 진단될 개체의 100%에 대해 정확한 것으로 의도되지는 않는다. 그러나, 이 용어는, 개체 (예를 들어 코호트 연구의 코호트)의 통계적으로 중요한 부분에 대해 평가가 정확할 것을 요구한다. 일부가 통계적으로 유의한지 여부는 예를 들어, 신뢰 구간 결정, p-값 결정, Student´s t-test, Mann-Whitney 테스트 등에 의한 공지된 다양한 통게 평가 도구를 사용하여 당업자에 의해 추가 고민 없이 결정될 수 있다. 자세한 내용은 Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983에 나와 있다. 바람직한 신뢰 구간은 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99 %이상이다. p-값은, 바람직하게는, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 또는 0.0001이다.
본원에서 사용된 용어 "심혈관 재생"은 심혈관 시스템과 관련된 질환의 재생 및/또는 치료 및/또는 개선을 포함한다.
"바이오마커"라는 용어는 의학적 상태 또는 소인과 관련 있는 존재, 부재 또는 양의 분자를 지칭한다. 바이오마커는 개체에서 발생하는 임의의 분자 및/또는 세포 또는 이의 하위집단일 수 있다. 전형적으로, 바이오마커는 단백질, 펩티드, 소분자 또는 DNAs, RNAs와 같은 핵산, 또는 세포 및 이의 하위집단이다. 본 발명에 따르면, 상기 용어는, 바람직하게는, 단백질 및 펩티드, 즉 VEGF, FGF 또는 에리스로포이에틴과 같은 성장 호르몬, SH2B3와 같은 림프구 어댑터 단백질, 비트로넥틴 또는 GCSF와 같은 당단백질, NT-proBNP와 같은 뇌 나트륨이뇨펩티드, IL-6, IL-8 또는 IL-10과 같은 인터루킨, 인간 인터페론 감마-유도 단백질 10과 같은 인터페론, 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-2 및/또는 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-3과 같은 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질, 여기서 인슐린-유사 성장 인자는 바람직하게는 IGF2로부터 선택되고, SDF-1와 같은 케모카인 단백질 및 SCF와 같은 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체를 지칭한다.
또한, 본 발명에 따르면, 바이오마커는 세포 및 이의 하위집단, 예를 들어, CD45, CD117, CD184, CD133 및/또는 CD146과 같은 분화 표면 클러스터 (CD)에 보유하거나 보유하지 않는, 즉 순환 내피 전구 세포 (EPC), 이의 표면에 CD31, CD133, CD146, CD105 및/또는 CD34를 보유하거나 보유하지 않는 순환 내피 세포 (CEC), 순환 혈소판, 순환 단핵 세포 (MNC) 및 하위집단, 및 CD184, CD309, 세포 부착 분자 (CAM) 및/또는 인테그린 수용체를 보유하거나 보유하지 않는 MNC 하위집단에서 수용체/리간드 발현을 지칭한다.
본 명세서에서 언급된 마이오마커의 양을 결정하는 단계는 양 또는 농도, 바람직하게는, 반-정량적 또는 정량적으로 측정하는 것과 관련 있다. 측정은 직접 또는 간접적으로 할 수 있다. 직접 측정은 바이오마커 그 자체로부터 수득된 신호 및 샘플에 존재하는 바이오마커의 분자 수와 직접적으로 관련이 있는 강도에 기초하여 바이오마커의 양 또는 농도를 측정하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에서 때때로 신호 강도로 지칭 되는 - 이러한 강도는, 예를 들어 바이오마커의 특정 물리적 또는 화학적 성질의 강도 값을 측정함으로써 얻어질 수 있다. 간접 측정은 2차 성분 (즉 바이오마커 그 자체가 아닌 성분) 또는 생물학적 판독기, 예를 들어 측정 가능한 세포 반응, 리간드, 표지, 또는 효소 반응 생성물로부터 얻어진 신호의 측정을 포함한다.
본 발명에 따르면, 바이오마커의 양을 결정하는 단계는 샘플에서, 펩티드, 단백질, 소분자, DNAs 또는 RNAs와 같은 핵산 또는 세포 또는 이의 하위집단의 양을 결정하기 위한 모든 공지된 수단에 의해 달성될 수 있다. 상기 수단은 다양한 샌드위치, 경쟁, 또는 다른 분석 포맷으로 표지된 분자를 이용할 수 있는 변역분석 및 방법을 포함한다. 이러한 분석은, 바람지갛게는, 결정될 바이오마커를 특이적으로 인식하는 항체와 같은 검출제에 기초한다. 검출제는 바이오마커의 존재 또는 부재를 나타내는 신호를 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있어야 한다. 또한, 신호 강도는, 바람직하게는, 샘플에 존재하는 바이오마커의 양과 직접 또는 간접적으로 (예를 들어 역-비례) 상관될 수 있다. 추가 적합한 방법은 바이오마커에 특이적인 물리적 또는 화학적 성질, 예를 들어 정확한 분자 질량 또는 NMR 스펙트럼을 측정하는 것을 포함한다. 상기 방법은, 바람직하게는, 바이오센서, 면역분석에 커플링된 광학 장치, FACS 분석, 바이오칩, 질량분석계, NMR-분석기, 또는 크로마토그래피 장치와 같은 분석 장치를 포함한다. 또한, 방법은 마이크로-플레이트 ELISA-기반 방법, 완전 자동화 또는 로봇 면역분석, 효소 코발트 결합 분석 및 라텍스 응집 분석을 포함한다.
바람직하게는, 바이오마커의 양을 결정하는 단계는 (a) 바이오마커와 함께 적절한 시간 동안 바이오마커의 양을 나타내는 강도가 세포 반응을 유발할 수 있는 세포와 접촉시키는 단계, (b) 세포 반응을 측정하는 단계의 단계들을 포함한다. 세포 반응을 측정하기 위해, 샘플 또는 처리된 샘플은, 바람직하게는, 세포 배양기에 첨가되고 내부 또는 외부 세포 반응이 측정된다. 세포 반응은 리포터 유전자의 측정 가능한 발현 또는, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 또는 소분자인 물질의 분비를 포함할 수 있다. 발현 또는 물질은 바이오마커의 양과 관련된 강도 신호를 생성해야 한다.
또한 바람직하게는, 바이오마커의 양을 결정하는 단계는 샘플에서 바이오마커로부터 얻을 수 있는 특정 강도 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, 이러한 신호는 질량 스펙트럼에서 관찰된 바이오마커에 특이적인 m/z 변수 또는 바이오마커에 특이적인 NMR 스펙트럼에서 관찰된 신호일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "양"은 바이오마커의 절대량, 상기 바이오마커의 상대적인 양 또는 농도 및 이와 관련이 있거나 이로부터 유도될 수 있는 임의의 값 또는 파라미터를 포함한다. 이러한 값 또는 파라미터는 직접 측정에 의해 상기 펩티드로부터 얻은 모든 특정 물리적 또는 화학적 특성으로부터 강도 신호 값, 예를 들어 질량 스펙트럼 또는 NMR 스펙트럼에서 강도 값을 포함한다. 또한, 본 명세서의 다른 곳에서 특정된 간접 측정에 의해 얻어진 모든 값 또는 파라미터, 예를 들어 펩티드에 대한 반응에서 생물학적 판독 시스템으로부터 결정된 반응 수준 또는특이적으로 결합된 리간드로부터 얻은 강도 신호가 포함된다. 상기 언급된 양 또는 파라미터와 대응하는 값은 또한 모든 표준 수학적 연산에 의해 얻어질 수 있고 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 스코어링 시스템에서, 치수 없이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에서 사용된 용어 "비교"는 분석될 샘플에 포함된 바이오마커의 양을 본 명세서의 다른 곳에서 명시된 적절한 참조 재료의 양과 비교하는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 비교는 상응하는 파라미터의 값, 예를 들어, 절대량은 절대 기준량과 비교되는 반면, 농도는 참조 농도와 비교되는 것이거나 또는 시험 샘플로부터 얻은 신호 강도는 참조 샘플의 신호 강도의 동일한 유형과 비교된다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명에 따르면 바이오마커의 측정량에 기초하여 값을 계산하는 것이 또한 예상된다. 상기 값은 심장 줄기 세포 치료에 대한 미리 정의된 반응자 및 비반응자를 포함하는 개체의 집단으로부터 양에 대해 수행된 다변량 판별 분석으로부터 유도된 참조 간격과 비교된다. 추가 세부 사항은, 아래의 첨부된 예에서 찾을 수 있다.
본 발명의 방법에서 언급된 비교는 수동으로 또는 컴퓨터 지원으로 수행될 수 있다. 컴퓨터 지원 비교를 위해, 결정된 양의 값은 컴퓨터 프로그램에 의해 데이터베이스에 저장된 적절한 참조에 대응하는 값과 비교될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 비교 결과를 추가로 평가할 수 있으며, 즉 원하는 병가를 자동적으로 적절한 출력 형색으로 제공할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 평가를 기계 학습 (ML)에 의해 수행된다. 결정된 양 및 참조의 비교에 기초하여, 심장 재생, 예를 들어 심장 줄기 세포 치료 후 심장의 기능적 개선에 대한 반응을 예측할 수 있다. 구체적으로, 높은 확률 (즉. 개체가 반응자가 될 것), 낮은 확률 (즉 개체가 비-반응자가 될 것) 또는 개체가 모호한이지(ambivalent)를 예측할 수 있어야 한다. 따라서, 비교량에서의 차이 또는 유사성이 허혈성 또는 비-허혈성 뇌 손상을 갖는 급성 염증의 증상을 나타내는 개체 그룹에 속하는 이러한 시험 개체를 식별할 수 있도록 참조량을 선택해야 한다. 상기 방법은 (i) 허혈성 뇌 손상 또는 (ii) 비-허혈성 뇌 손상을 앓고 있는 개체로서 개체를 배제 (rule-out) 또는 식별 (rule-in)할 수 있게 한다.
본원에서 사용된 용어 "참조"는 예상될 수 있는 심장 치료로부터 이익을 기대할 수 있는 개체, 심장 치료로부터 이익을 기대할 수 없거나 모호한 개체의 그룹 중 하나에 개체를 할당할 수 있게 하는 바이오마커의 양에 기초한 값, 역치 또는 간격을 지칭한다.
이러한 참조는 이들 그룹을 서로 분리하는 역치량일 수 있다. 두 그룹을 분리하는 적절한 역치량은 심장 치료로부터 이익을 얻는 것으로 알려진 개체 또는 개체의 그룹 또는 상기 치료로부터 이익을 얻지 않는 것으로 알려진 개체 또는 개체의 그룹 또는 모호한 것으로 알려진 이들로부터의 바이오마커의 양에 기초하여 본원의 다른 곳에서 언급된 통계적 테스트에 의해 추가로 방해받지 않고 계산될 수 있다.
원칙적으로, 표준 통계적 방법을 적용함으로써 주어진 바이오마커에 대한 평균 또는 평균값에 기초하여 상기 명시된 바와 같은 개체의 코호트에 대한 참조를 계산할 수도 있다. 구체적으로, 반응을 진단하기 위한 방법과 같은 시험의 정확성은 수신기-작동 특성 (ROC)에 의해 가장 잘 설명된다 (특히 Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577 참조). 따라서, 전술한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 기준은 전술한 바와 같이 상기 코호트에 대한 ROC를 설정하고 그로부터 역치량을 도출함으로써 생성될 수 있다. 진단 방법에 대한 원하는 민감도 및 특이도에 따라, ROC 플롯은 적절한 역치량을 도출할 수 있다.
용어 "샘플"은 체액 샘플, 바람직하게는, (전혈), 혈장 또는 혈청의 샘플을 지칭한다. 그러나, 상기 용어는, 또한 예를 들어 부분 정제에 의해 수득된, 혈액, 혈장 또는 혈청의 분획과 같은, 예를 들어 전처리 단계에 의한 전술된 전혈, 혈장 또는 혈청으로부터 유래된 모든 샘플을 포함한다.
본원에서 상용된 용어 "개체"는 동물, 바람직하게는, 포유 동물 및, 가장 바람직하게는, 인간을 지칭한다. 개체는 심장 치료가 필요하다. 바람직하게는, 심장 치료가 필요한 개체는 예를 들어, 심근 경색 후, 심부전 또는 관상 동맥 질환과 같은 심장 질환, 및 더 바람직하게는, 심부전을 앓고 있다.
본 발명의 방법에 따라 이루어진 예측은 또한 확률이 높아서, 따라서, 개체에서 심장 시스템의 기능적 개선이 발생할 것이 예상되는지, 또는 상기 확률이 치료 성공이 모호한지 또는 상기 확률이 낮아서, 따라서, 개체의 심장 시스템의 기능적 개선이 발생하지 않을 것으로 예상되는지 여부를 평가할 수 있게 한다.
본 발명은 또한 심혈관 재생에 대한 반응의 예측을 위한 방법에 사용하기 위한 성장 인자(Growth factor), 림프구 어댑터 단백질(Lymphocyte adapter protein), 당단백질(Glycoprotein), 뇌 나트륨이뇨펩티드(brain natriuretic peptide, BNP), 순환 내피 전구 세포(circulating endothelial progenitor cells, EPC), 순환 내피 세포(circulating endothelial cells, CEC), 순환 혈소판(circulating thrombocytes), 순환 단핵 세포 및 하위집단(circulating mononuclear cells and subpopulations), 및 MNC 하위집단의 군으로부터 선택된 바이오마커의 조합에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 프로세서(processor) 및 상기 프로세서에 연결된 하나 이상의 기계 학습(machine learing, ML) 모델을 인코딩하는 메모리를 포함하는 컴퓨터 장치에 관한 것으로, 상기 프로그램은 상기 프로세서가 방법을 수행하도록 하고, 상기 방법은
(i) 본 발명에 따른 바이오마커의 결정된 양을 기준값 및/또는 참조와 비교하는 단계,
(ii) 상기 비교 결과에 기초하여, 상기 개체에서의 심혈관 재생에 대한 반응이 예상되는지, 예상되지 않는지, 또는 모호한지(ambivalent)의 여부를 예측하는 단계
를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 장치에 관한 것으로,
(i) 개체의 샘플에서 본 발명에 따른 바이오마커 각각의 양을 결정하기 위한 분석 유닛, 및
(ii) 제25항에 따른 컴퓨터 장치
를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "장치"는 본 발명의 방법에 따른 진단을 허용하기 위해 서로 작동 가능하게 연결된 상기 언급된 유닛을 포함하는 시스템에 관한 것이다. 분석 유닛에 사용될 수 있는 바람직한 검출제는 본원의 다른 곳에 개시되어 있다. 바람직한 검출제는 바이오마커에 특이적으로 결합하여 검출 복합체를 형성하는 항체 또는 다른 단백질이다. 분석 유닛은, 바람직하게는, 결정될 양의 바이오마커를 포함하는 샘플에 접촉될 고체 지지체 상에 고정된 형태의 상기 검출제를 포함한다. 또한, 분석 유닛은 또한 바이오마커(들)에 특이적으로 결합된 검출제의 양을 결정하는 검출기를 포함할 수 있다. 결정된 양은 평가 유닛으로 전송될 수 있다. 상기 평가 유닛은 결정된 양과 적절한 참조 사이의 비교를 수행하기 위한 구현된 알고리즘을 가진, 컴퓨터와 같은, 데이터 처리 요소를 포함한다. 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 참조량의 생성에 사용되는 개체의 샘플로부터 적절한 참조가 도출될 수 있다. 결과는 파라메트릭 진단 원 데이터의 출력으로, 바람직하게는, 절대 또는 상대량으로 제공될 수 있다. 이러한 데이터는 임상상의 해석이 필요하다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 출력은 처리된 진단 원 데이터를 포함하는 전문 시스템 장치가 또한 예상되며 그 해석은 전문 임상의가 필요하지 않다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예는 다음의 설명과 함께 종속항으로부터 도출되며, 이에 따라 특정 범주의 특허 청??위는 다른 범주의 종속항에 의해 형성될 수 있고, 다른 예의 특징은 새로운 예에 결합될 수 있다. 상기 및 하기에서의 용어의 정의 및 설명은 따라서 본 명세서 및 첨부된 청구항에 기술된 모든 실시예에 따라 적절하게 적용됨을 이해해야 한다. 이하에서, 본 발명의 방법의 특정 실시예가 추가로 특정된다.
유리하게, 본 발명에 따른 방법을 구현함으로써, 예측 정확도의 민감도 및 특이도는 약 80% 초과, 바람직하게는 약 85% 초과, 보다 바람직하게는 약 90% 초과일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 심장 치료와 같은 비싸고 번거로운 치료 수단의 적용 전에 임상의의 의사 결정을 향상시킨다. 올바른 결정을 내리는 것, 즉 치료가 효과적일 경우에만 적용하는 것은, 확실히 개별 환자 및, 비용 결과에 비추어, 공중 보건 시스템에 유리할 것이다.
상기 심장 치료가 필요한 개체, 예를 들어, 심부전을 앓고 있는 개체로부터 심장 치료 전에 얻은 샘플에서, 바이오마커의 조합의 양을 분석하는 것은 상기 개체가 치료 후 심장 재생 또는 심혈관 회복이 개선된다는 점에서 이익을 얻을지 여부를 예측하게 한다는 것이 본 발명의 기초 연구에서 유리하게 발견되었으며, 상기 성장 인자는 바람직하게는 VEGF 및/또는 에리스로포이에틴(Erythropoietin) 및 선택적으로 FGF으로부터 선택되고, 상기 림프구 어댑터 단백질은 바람직하게는 SH2B3로부터 선택되고, 상기 당단백질은 바람직하게는 비트로넥틴(Vitronectin) 및 선택적으로 GCSF로부터 선택되고 및 상기 뇌 나트륨이뇨펩티드는 바람직하게는 NT-proBNP으로부터 선택되고, 상기 순환 내피 전구 세포 (EPC)는 바람직하게는 CD45+, CD117+, CD184+, CD133+, CD146+ 세포로부터 선택되고, 상기 순환 내피 세포 (CEC)는 바람직하게는 CD133+, CD146+, CD105+, CD34+ 세포로부터 선택되고, 순환 혈소판, 순환 단핵 세포 및 하집단, MNC 하위집단에서의 수용체/리간드 발현은 바람직하게는 CD184+ 및/또는 CD309+ 세포, 세포 부착 분자 (CAM) 및/또는 인테그린 수용체로부터 선택된다. 개별 바이오마커의 양을 측정하는 기술은 모두 당업계에 잘 알려져 있다.
기계 학습 (ML)을 사용함으로써, 개별 비교를 수행할 필요가 없기 때문에 상기 방법은 바람직하게는 추가로 지원된다. 또한, 기계 학습은 예측의 신뢰성이 더욱 향상될 수 있도록 파라미터의 균형을 맞추고 가중치를 부여하는 데 유리하게 작용한다. 따라서, 본 발명의 유리한 방법은 바람직하게는 예측 정확도를 용이하게 하고 개선하기 위해 기계 학습에 의해 지원된다. 본 발명에 따르면, 용어 "기계 학습"은 데이터로부터 학습하고 예측하는 알고리즘의 연구 및 구성에 관한 것이고 - 이에 의해 알고리즘은 샘플 입력으로부터 모델을 구축함으로써 데이터 중심 예측 또는 결정을 함으로써 엄격하게 정적인 프로그램 명령을 극복한다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시에에서, 이러한 방법은 추가의 바이오마커를 사용하는데, 추가 바이오마커는 바람직하게는 사이토카인(Cytokine), 인터루킨(Interleukin), 인터페론(Interferon), 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질(Insulin-like-growth-factor-binding protein), 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like Growth factor), 케모카인 단백질(Chemokine protein) 및/또는 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체(Multi-protein E3 ubiquitin ligase complex)의 군으로부터 선택된다.
이러한 방법에 따르면, 상기 사이토카인은 바람직하게는 TNF로부터 선택되고, 상기 인터루킨은 바람직하게는 IL-6, IL-8, 및/또는 IL-10으로부터 선택되고, 상기 인터페론은 인간 인터페론 감마-유도 단백질 10(Human interferon gamma-induced protein 10)으로부터 선택되고, 상기 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질은 바람직하게는 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-2(Insulin-like-growth-factor-binding protein-2) 및/또는 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-3(Insulin-like-growth-factor-binding protein-3)으로부터 선택되고, 상기 인슐린-유사 성장 인자는 바람직하게는 IGF2로부터 선택되고, 상기 케모카인 단백질은 바람직하게는 SDF-1으로부터 선택되고 및/또는 상기 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체는 바람직하게는 SCF로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 심근 경색, 뇌졸중 및 말초 허혈성 혈관 질환, 심장 질환 및/또는 허혈성 질환을 포함하는 심혈관 질환의 맥락에서 줄기 세포 치료 및/또는 혈관신생 반응 및/또는 조직 회복의 유도에 대한 반응 수술 전 예측에 사용된다. 이러한 치료는 심혈관 임플란트 또는 스텐트, 심실 보조 장치 (VAD), 심박 조율기 및/또는 폐쇄기 또는 적절한 폐쇄 장치를 사용하기 위한 치료를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 치료는 진성 당뇨병, 종양 질환, 대장균, 류마티스 질환, 감염성 질환, 패혈증 및/또는 고혈압의 치료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은, 예를 들어 급성 심근 ST-분절 상승 경색 (STEMI) 및 관상 동맥 3-혈관 질환 후 좌심실 분출 분획 (LVEF)의 악화 후 급성 경피 관상 동맥 중재술 (PCI) 및 2차 관상 동맥 우회술 (CABG) 혈관 재생으로 순차적으로 치료한 후, 좌심실 심장 기능의 개선의 수술 전 예측에 사용된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 심장 재생, 특히 심혈관 질환의 맥락에서 줄기 세포 치료 및/또는 혈관신생 반응 및/또는 조직 회복의 유도에 대한 반응의 예측 방법은 심장 질환 및/또는 동맥 경화를 앓고 있는 개체로부터 채취한 샘플을 사용한다. 이러한 샘플은 특히 협심증, 급성 심근 손상, 세포 괴사, 심근 비대, 심부전, 바람직하게는 허혈성 심부전, 비-허혈성 심부전, 심근염, 심방 세동, 심실 세동 및/또는 동맥 경화를 앓는 개체로부터 채취될 수 있다.
바람직한 실시예에 따르면, 상기 방법은 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 시점의 비교 결과를 프로파일링하는 단게를 포함한다. 유리하게는, 이러한 시점은 수술 전 및 수술 후 약 1, 3, 10, 90, 및/또는 180 일에 채취된 샘플을 포함한다. 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 샘플을 분석함으로써, 예측 정확도의 특이도는 90% 이상, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 및 그 이상으로 유리하게 증가될 수 있다.
유리한 방법의 추가 실시예는 임상 진단 파라미터의 사용을 포함한다. 구체적으로, 이러한 파라미터는 콜로니 생성 유닛 (CFU) 힐 검정, Matrigel Plug 분석, 중량, 및/또는 좌심실 수축기 부피 (LVESV)로부터 선택된다.
다음의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 방법은 혈관신생 반응의 프로파일링에 사용된다.
또 다른 바람직한 실시예는 진단 특징(signature)을 포함하는 RNA 및/또는 DNA 및/또는 mRNA 서열 및/또는 마이크로RNA와 같은 기능적 RNA 및/또는 비-코딩 RNA 및/또는 SNP를 분석하는 것을 추가로 포함하는 유리한 방법을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, RNA 및/또는 DNA 및/또는 SNP의 특징(signature) 분석은 기계 학습 및/또는 경로 분석에 의해 수행되거나/또는 지원될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 경로 분석은 관련 RNA, DNA 및/또는 SNP로부터 유래된 경로 또는 구축 경로 내에서 관련 RNA 및/또는 DNA 및/또는 SNP를 확인하기 위해 사용된다.
또한, 추가의 바람직한 실시예에 따르면, 유리한 방법은 RNA 및/또는 DNA 서열 분석 및/또는 네트워크 경로 분석을 포함하는 약동학적(pharmacokinetic) 및 약물유전학적(pharmacogenetics) 데이터의 분석을 포함할 수 있다. 이러한 약동학적 데이터는 구체적으로 스타틴(Statin), 아세틸살리실산(ASS), β-차단제, 안지오텐신-전환-효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신II (ATII) 수용체 길항제, 알도스테론 길항제(Aldosterone antagonist), 이뇨제, Ca-길항제, 항-부정맥제(anti-Arrhythmic agent), Digitalis, Marcumar, 및/또는 질산염(Nitrate)으로부터 선택된 군으로부터 약물을 투여받은 개체로부터 얻을 수 있다.
다음의 바람직한 실시예는 체중 분석과 같은, 개체의 표현형 분석을 추가로 사용할 수 있다.
더욱 바람직한 구체예에 따르면, 심혈관 회복 예측 방법은 CD133 양성 줄기 세포의 이식을 사용하는 줄기 세포 치료를 포함한다. 이러한 줄기 세포 치료는 선택적으로 심장 재생의 유도 및/또는 PCI에 사용되는, CABG 혈관신생과 조합될 수 있다. 그러나, 특히 바람직한 실시예는 심장 줄기 세포 치료가 관상 동맥 우회술을 추가로 포함하는 것을 포함한다.
유리하게는, 심장 줄기 세포 치료 후 심장 재생 및/또는 심장의 기능적 개선은 적어도 5%의 LVEF의 증가를 동반한다.
전술한 본 발명의 방법은 인간 개체에만 적용되도록 제한되지 않으며, 동물을 포함할 수도 있다. 그러나, 방법은 인간 개체에 적용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 이러한 개체의 샘플은 혈액, 구체적으로 말초 혈액, 및/또는 혈청 및/또는 혈장 샘플 및/또는 조직 생검 샘플 및/또는 내피 전구 세포 (EPC)와 같은 순환 (줄기) 세포의 샘플로부터 유래될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법에 사용하기 위한 성장 인자, 림프구 어댑터 단백질, 당단백질, 뇌 나트륨이뇨펩티드, 순환 내피 전구 세포, 순환 내피 세포, 순환 혈소판, 순환 단핵 세포 및 이의 하위집단, 및 MNC 하위집단에서의 수용체/리간드 발현으로 군으로부터 선택된 바이오마커의 조합에 관한 것이다. 유리하게는, 상기 방법은 생체 외 또는 시험관 내 방법이다.
바람직하게는, 바이오마커는 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법에 사용되고, 상기 방법은
(i) 개체의 샘플에서 각각의 바이오마커의 양을 결정하는 단계,
(ii) 상기 결정된 양을 기준값 및/또는 참조와 비교하는 단계,
(iii) 상기 비교 결과에 기초하여, 상기 개체에서의 심장 회복에 대한 반응이 예상되는지, 예상되지 않는지, 또는 모호한지(ambivalent)의 여부를 예측하는 단계
를 포함한다.
바람직한 실시예에 따르면 상기 성장인자는 바람직하게는 VEGF 및/또는 에리스로포이에틴(Erythropoietin) 및 선택적으로 FGF로부터 선택되고, 상기 림프구 어댑터 단백질은 바람직하게는 SH2B3로부터 선택되고, 상기 당단백질은 바람직하게는 비트로넥틴(Vitronectin) 및 선택적으로 GCSF로부터 선택되고, 상기 뇌 나트륨이뇨펩티드는 바람직하게는 NT-proBNP으로부터 선택되된다.
또한, 바이오마커의 조합은 바람직하게는 사이토카인(Cytokine), 인터루킨(Interleukin), 인터페론(Interferon), 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질(Insulin-like-growth-factor-binding protein), 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like Growth factor), 케모카인 단백질(Chemokine protein) 및/또는 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체(Multi-protein E3 ubiquitin ligase complex)의 군으로부터 선택된 추가의 바이오마커를 포함한다. 보다 더 바람직하게는 상기 사이토카인은 TNF로부터 선택되고, 상기 인터루킨은 IL-6, IL-8, 및/또는 IL-10으로부터 선택되고, 상기 인터페론은 인간 인터페론 감마-유도 단백질 10(Human interferon gamma-induced protein 10)으로부터 선택되고, 상기 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질은 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-2(Insulin-like-growth-factor-binding protein-2) 및/또는 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-3(Insulin-like-growth-factor-binding protein-3)으로부터 선택되고, 상기 인슐린-유사 성장 인자는 바람직하게는 IGF2로부터 선택되고, 상기 케모카인 단백질은 SDF-1으로부터 선택되고 및/또는 상기 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체는 SCF로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 바이오마커의 조합은 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법에 사용되고, 상기 방법은 임상 진단 데이터, 및/또는 RNA 및/또는 mRNA 및/또는 마이크로RNA와 같은 기능적 RNA 및/또는 비-코딩 RNA 및/또는 SNP의 분석, 및/또는 약동학적(pharmacokinetic) 데이터의 분석 및/또는 예를 들어, 체중과 같은 표현형(phenotyping)의 분석을 추가로 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 바이오마커의 유리한 방법 및/또는 유리한 조합은 줄기 세포 치료에 대한 반응의 수술 전 예측을 위해 사용되고 상기 줄기 세포 치료는 CABG를 동반한다.
본원에서 사용된 용더 "줄기 세포 치료"는 외인성 심근 세포를 치료 대상의 심장으로 이식하는 것을 포함하는 모든 치료 접근법을 지칭한다. 이러한 심근 세포는 비-심근세포 전구 세포를 심근 세포로 재프로그래밍함으로써 생성될 수 있다. 재프로그래밍되는 세포는 배아 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포, 다능성 심장 전구 세포, 골격근 아세포 또는 골수 유래 줄기 세포일 수 있다. 또한, 성숙한 심근 세포는, 구체적으로, 유사 분혈 세포 순환으로 재진입하도록 자극되는 경우에, 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 심장 줄기 세포 치료는 CD133-양성 세포, 가장 바람직하게는, CD133-양성 골수 단핵 세포의 이식을 포함한다. 세포는 분리된 단일 세포로서 또는 조직 공학 공정에 의해 형성된 조직 블록과 같은 형성된 배열로 이식될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 본 발명에 따라 심근 내 주사에 의해 이식된다. 또한, 용어 심장 줄기 세포 치료는 또한 이식 과정을 수반하는 약물 치료 또는 수술과 다른 다른 치료 수단과 같은 추가 치료 수단을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 심장 줄기 세포 치료는 하기 첨부된 실시예에 기재된 바와 같은 관상 동맥 우회술을 추가로 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "심장의 기능적 개선"은 개체의 치료 전후에 LVEF를 비교할 때 관찰되는 심장의 LVEF의 유의미한 증가를 지칭한다. 바람직하게는, 현저한 증가는 치료 후 관찰되는 LVEF의 5% 이상의 증가이다. 5% 미만의 증가는 무의미한 것으로 간주된다. 기능적 개선을 발견하기 위해 추가로 고려될 수 있는 추가 파라미터는 관류 결함 크기의 10% 이상 감소, MIBI SPECT에 의해 정량화된 좌심실 말단 수축량 (LVESV)의 10% 이상 감소 및 흉부 심장 초음파로 측정한 최고 수축기 속도의 10% 이상의 증가이다.
본원에서 사용된 심부전은 좌측 부전, 우측 부전 또는 심실 부전을 포함하는 심장의 임의의 기능적 장애를 지칭한다. 전형적으로, 본원에서 언급된 용어 심부전은, 예를 들어 크게 감소된 LVEF와 같은 감소된 배출 분율을 초래하는 좌측 부전이다. 심부전의 추가 증상은 임상의에게 잘 알려져 있다. 본원에서 언급된 심부전은 급성 및 만성 형태의 심부전 및 임의의 중증 단계, 예를 들어 뉴욕 심장 협회 (NYHA) 분류 시스템, NYHA I 내지 IV에 따르면 좌측 부전 모든 단계를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "혈관 내피 성장 인자 (VEGF)"는 혈관신생, 혈관 형성 및 혈관 투과성을 자극하는 가용성 폴리펩티드 성장 인자를 지칭한다. 이는 다양한 세포 유형에서 생성된다. 5 종의 다양한 VEGF 폴리펩티드, VEGF-A, 태반 성장 인자 (PGF), VEGF-B, VEGF-C, 및 VEGF-D이 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 바람직하게는, VEGF-A가 예상된다. VEGF-A로 알려진 대안적 스플라이싱으로 인해 다양한 이소형(isoform)이 있다. 가장 두드러진 것은 VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, 및 VEGF206이다.
바람직하게는, VEGF는 Tischer 1991, J. Biol. Chem. 266 (18): 11947-11954에서 기술된 바와 같이 인간 VEGF-A를 지칭한다 (VEGF-A의 가장 긴 이소형이 개시됨). 아미노산 서열에 대해서는, 또한 Genbank accession numbers NP_001020537.2, GI: 76781480을 참조하라 (Genbank는 미국, NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez에서 이용가능하다). 상기 용어는 또한 상기 언급된 인간 VEGF 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 상기 언급된 VEGF 폴리펩티드와 적어도 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 갖는다. 구체적으로, 이들은 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 VEGF 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 이들은 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유한다. 또한, 본 발명에 따라 언급된 변이체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가로 인해 상이한 아미노산 서열을 가져야 하고 상기 변이체의 아미노산 서열은 여전히, 바람직하게는, 특정 VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열, 바람직하게는 인간 VEGF의 전체 서열 각각과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하다. 2 종의 아미노산 서열간의 동일성 정도는 당업계에 공지된 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 동일성 정도는 비교창에 걸쳐 2 종의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 상기 비교창의 아미노산 서열의 단편은 최적의 적렬을 위해 참고 서열과 비교하여 (첨가 또는 결실을 포함하지 않음) 첨가 또는 결실을 포함할 수 있다 (예를 들어, 갭 또는 오버행). 백분율은 두 서열에서 동일한 마이노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교창에서 총 위치의 수로 나누고 결과에 100을 곱함으로써 서열 동일성의 백분율을 산출하여 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith 1981, Add. APL. Math. 2:482에 개시된 국소 상동성 알고리즘, Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson 1988, Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85: 2444의 유사성 방법의 검색, 이러한 알고리즘의 전산화된 구현 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI의 GAP, BESTFIT, BLAST, FAST, PASTA, 및 TFASTA) 또는 시각화 검사에 의해 수행된다. 비교를 위해 2 서열이 확인된 경우, GAP 및 BESTFIT는 바람직하게는 그들의 최적 정렬 및, 따라서, 동일성의 정도를 결정하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 5.00의 갭 웨이트 및 0.30의 갭 웨이트 길이의 기본값이 사용된다. 상기 언급된 변이체는 대립 유전자 변이체 또는 임의의 다른 종 특이적 상동체, 이원체(paralogs), 또는 동원체(orthologs)일 수 있다. 상기 언급된 변이체는 대립 유전자 변이체 또는 임의의 다른 종 특이적 상동체, 이원체(paralogs), 또는 동원체(orthologs)일 수 있다. 또한, 본원에서 언급된 변이체는 단편이 상기 언급된 바와 같은 필수 면역학적 및 생물학적 특성을 갖는 한 특정 VEGF 폴리펩티드의 단편 또는 상기 언급된 바와 같은 변이체의 유형의 단편 또는 하위유닛을 포함한다. 이러한 단편은, 예를 들어 VEGF 폴리펩티드의 분해산물일 수 있다. 변이체는 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 VEGF 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유하는 것으로 간주된다. 바람직한 분석법은 첨부된 실시예에 기재되어 있다. 인산화 또는 미리스틸화와 같은 번역 후 변형으로 인해 상이한 변이체가 추가로 포함된다. VEGF는 샘플에서 결합 또는 자유 형태 또는 총 VEGF 양으로 검출될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "섬유아세포 성장 인자 (FGF)"는 혈관신생, 상처 치유, 배아 발생 및 다양한 내분비 신호전달 경로에 관여하는 구성원과 함께 성장 인자의 패밀리를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "에리스로포이에틴 (EPO)"은 사이토카인인 가용성 폴리펩티드를 지칭한다. 그것은, 일반적으로, 저산소 상태에서 신장 세포에 의해 생성된다.
바람직하게는, EPO는, 예를 들어 Yanagawa 1984, J. Biol. Chem. 259(5): 2707-2710에 기술된 바와 같은 인간 IL-6을 지칭한다. 보다 바람직하게는, 인간 IL-6은 Genbank accession number p01588.1, GI: 119526에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 가진다. 상기 용어는 또한 상기 언급된 인간 EPO 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 상기 언급된 EPO 폴리펩티드와 적어도 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 갖는다. 구체적으로, 이들은 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 EPO 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 이들은 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유한다. 또한, 본 발명에 따라 언급된 변이체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가로 인해 상이한 아미노산 서열을 가져야 하고 상기 변이체의 아미노산 서열은 여전히, 바람직하게는, 특정 IL-6의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하는 것을 이해해야 한다. 변이체는 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체 또는 임의의 다른 종 특이적 상동체, 이원체(paralogs), 또는 동원체(orthologs)일 수 있다. 또한, 본원에서 언급된 변이체는 단편이 상기 언급된 바와 같은 필수 면역학적 및 생물학적 특성을 갖는 한 특정 EPO의 단편 또는 상기 언급된 바와 같은 변이체의 유형의 단편 또는 하위유닛을 포함한다. 이러한 단편은, 예를 들어 EPO의 분해산물일 수 있다. 변이체는 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 EPO 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유하는 것으로 간주된다. 바람직한 분석법은 첨부된 실시예에 기재되어 있다. 인산화 또는 미리스틸화와 같은 번역 후 변형으로 인해 상이한 변이체가 추가로 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "SH2B 어댑더 단백질 3 (SH2B3)"은 림프구 어댑터 단백질 (LNK)을 지칭한다. SH2B3은 인간에서 염색체 12의 SH2B3 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 이는 많은 조직 및 세포 유형에서 편재적으로 발현된다 (Li Y, He X, Schembri-King J, Jakes S, Hayashi J, May 2000. Journal of Immunology. 164(10):5199-206).
본원에서 사용된 용어 "비트로넥틴 (VTN)"은 혈청, 세포외기질 및 뼈에서 풍분하게 발견되는 헤모펙신 패밀리의 당단백질을 지칭한다 (Boron, Walter F. and Boulpaep, Emile L. "Medical Physiology". Saunders, 2012, p.1097). 인간에서 이는 VTN 유전자에 의해 암호화된다. 비트로넥틴은 인테그린 알파-V 베타-3에 결합하여 따라서 세포 부착 및 확산을 촉진한다. 또한 말단 세포 용해 경로의 막-손상 효과를 억제하고 다수의 세르핀 (세린 프로테아제 억제제)에 결합한다. 이는 분비된 단백질이고, 이황화 결합에 의해 함께 유지된 단일 사슬 형태 또는 잘린, 2 개의 사슬 형태로 존재한다. 비트로넥틴은 지혈 및 악성 종양에 관여하는 것으로 추측되었다.
콜로니-자극 인자 3 (CSF3)으로도 알려진, 용어 "과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF 또는 GCSF)"는, 골수를 자극하여 과립구 및 줄기 세포를 생성하여 이들을 혈류로 방출하는 당 단백질이다. 기능적으로, 이는 콜로니-자극 인자의 한 유형인, 사이토카인 및 호르몬이고, 많은 다른 조직에 의해 생성된다. G-CSF는 또한 호중구 전구체 및 성숙한 호중구의 생존, 증식, 분화 및 기능을 자극한다.
심실 나트륨이뇨펩티드 또는 나트륨이뇨펩티드 B라고도 불리는, 용어 "뇌 나트륨이뇨펩티드 또는 B-형 나트륨이뇨펩티드 (BNP)"는, 심장 근육 세포 (심근 세포)의 과도한 신장에 반응하여 심장의 심실에 의해 분비되는 32-아미노산 폴리펩티드이다. BNP의 분비는 칼슘 이온에 의해 조절된다. BNP는 비록 인간에서는 주로 심실에서 생성되지만, 본래 돼지 뇌 추출물에서 식별되었기 때문에 그렇게 명명되었다. BNP는 NT-proBNP라고 불리는 프로호르몬에서 76-아미노산 N-말단 단편에 부착되어 분비된다. 일단 분비되면, BNP는 심방 나트륨이뇨 인자 수용체 (NPRA)에 결합하고 활성화시키고, 심방 나트륨이뇨펩티드(ANP)와 유사하지만 10배 낮은 친화도로 NPRB를 덜 활성화시킨다. 그러나, BNP의 생물학적 반감기는, ANP보다 2배 길고, NT-proBNP는 더 길어서, 이 펩티드는 진단 혈액 검사에 ANP보다 더 좋은 표적이 된다.
본원에서 사용된 용어 "인터루킨-6 (IL-6"은 전-염증성 사이토카인 및 항-염증성 미오킨인 가용성 폴리펩티드를 지칭한다. 이는 T-세포 및 대식세포에 의해 생성된다.
바람직하게는, IL-6은 예를 들어, Wong 1988, Behring Inst. Mitt 83: 40-47에 기술된 바와 같이 인간 IL-6를 지칭한다. 보다 바람직하게는, 인간 Il-6은 Genbank accession number p05231.1, GI: 124347에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 상기 용어는 또한 상기 언급된 인간 IL-6 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 상기 언급된 IL-6 폴리펩티드와 적어도 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 갖는다. 구체적으로, 이들은 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 IL-6 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 이들은 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유한다. 또한, 본 발명에 따라 언급된 변이체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가로 인해 상이한 아미노산 서열을 가져야 하고 상기 변이체의 아미노산 서열은 여전히, 바람직하게는, 특정 IL-6의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하는 것을 이해해야 한다. 변이체는 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체 또는 임의의 다른 종 특이적 상동체, 이원체(paralogs), 또는 동원체(orthologs)일 수 있다. 또한, 본원에서 언급된 변이체는 단편이 상기 언급된 바와 같은 필수 면역학적 및 생물학적 특성을 갖는 한 특정 IL-6의 단편 또는 상기 언급된 바와 같은 변이체의 유형을 포함한다. 이러한 단편은, 예를 들어 IL-6의 분해산물일 수 있다. 변이체는 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 IL-6 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유하는 것으로 간주된다. 바람직한 분석법은 첨부된 실시예에 기재되어 있다. 인산화 또는 미리스틸화와 같은 번역 후 변형으로 인해 상이한 변이체가 추가로 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "인터페론 감마-유도 단백질 10 (IP-10)"은 CXC 케모카인 패밀리에 속하는 사이토카인인 가용성 폴리펩티드를 지칭한다. 이는 단핵구, 내피 세포 및 섬유아세포에 의해 생성된다.
바람직하게는, IP-10은, 예를 들어 Booth 2002, Biochemistry 41(33): 10418-10425에 기술된 바와 같은 인간 IP-10을 지칭한다. 보다 바람직하게는, 인간 IP-10은 Genbank accession number p02778.2, GI: 21542456에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 상기 용어는 또한 상기 언급된 인간 IP-10 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 상기 언급된 IP-10 폴리펩티드와 적어도 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 갖는다. 구체적으로, 이들은 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 IP-10 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 이들은 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유한다. 또한, 본 발명에 따라 언급된 변이체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가로 인해 상이한 아미노산 서열을 가져야 하고 상기 변이체의 아미노산 서열은 여전히, 바람직하게는, 특정 IP-10의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하는 것을 이해해야 한다. 변이체는 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체 또는 임의의 다른 종 특이적 상동체, 이원체(paralogs), 또는 동원체(orthologs)일 수 있다. 또한, 본원에서 언급된 변이체는 단편이 상기 언급된 바와 같은 필수 면역학적 및 생물학적 특성을 갖는 한 특정 IP-10의 단편 또는 상기 언급된 바와 같은 변이체의 유형을 포함한다. 이러한 단편은, 예를 들어 IP-10의 분해산물일 수 있다. 변이체는 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 IP-10 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유하는 것으로 간주된다. 바람직한 분석법은 첨부된 실시예에 기재되어 있다. 인산화 또는 미리스틸화와 같은 번역 후 변형으로 인해 상이한 변이체가 추가로 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 3 (IGFBP-3)"은 인슐린-유사 성장 인자의 패밀리의 성장 인자인 가용성 폴리펩티드를 지칭한다. 이는 다양한 세포에 의해 생성된다.
바람직하게는, IGFBP-3는, 예를 들어 Thweatt 1993, DNA Seq 4(1): 43-46에 기술된 바와 같은 인간 IGFBP-3을 지칭한다. 보다 바람직하게는, 인간 IL-6은 Genbank accession number p17936.1, GI: 146327827에 나타난 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 상기 용어는 또한 상기 언급된 인간 IGFBP-3 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 상기 언급된 IGFBP-3 폴리펩티드와 적어도 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 갖는다. 구체적으로, 이들은 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 IGFBP-3 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 이들은 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유한다. 또한, 본 발명에 따라 언급된 변이체는 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가로 인해 상이한 아미노산 서열을 가져야 하고 상기 변이체의 아미노산 서열은 여전히, 바람직하게는, 특정 IGFBP-3의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일하는 것을 이해해야 한다. 변이체는 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체 또는 임의의 다른 종 특이적 상동체, 이원체(paralogs), 또는 동원체(orthologs)일 수 있다. 또한, 본원에서 언급된 변이체는 단편이 상기 언급된 바와 같은 필수 면역학적 및 생물학적 특성을 갖는 한 특정 IGFBP-3의 단편 또는 상기 언급된 바와 같은 변이체의 유형을 포함한다. 이러한 단편은, 예를 들어 IGFBP-3의 분해산물일 수 있다. 변이체는 본 명세서에 언급된 동일한 특정 분석법, 예를 들어 상기 IGFBP-3 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단일클론 항체를 사용하는 ELISA 분석에 의해 검출되는 경우 동일한 필수 생물학적 및 면역학적 특성을 공유하는 것으로 간주된다. 바람직한 분석법은 첨부된 실시예에 기재되어 있다. 인산화 또는 미리스틸화와 같은 번역 후 변형으로 인해 상이한 변이체가 추가로 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "인슐린-유사 성장 인자 (IGF2)"는 인슐린과 구조적 유사성을 공유하는 3 종의 단백질 호르몬 중 하나를 지칭한다. IGF2는 간에 의해 분비되고 혈액에서 순환하는 것으로 여겨진다. 이는 성장-조절, 인슐린-유사 및 유사 분열 활성을 가진다. 성장 인자는 소마토트로핀(somatotropin)에 주요하지만, 절대적인 것은 아닌 의존성을 가진다. 이는 중요한 태아 성장 인자로 여겨진다.
C-X-C 모티프 케모카인 12 (CXCL12)로도 알려진, 용어 "간질 세포-유래 인자 1 (SDF1)"은 인간에서 염색체 10의 CXCL12 유전자에 의해 암호화되는 케모카인 단백질이다. 이는 많은 조직 및 세포 유행에서 편재적으로 발현된다. 기질 세포-유래 인자 1-알파 및 1-베타는 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인이고, 이들의 구성원은 백혈구를 활성화시키고 종종 지질다당류, TNF, 또는 IL1과 같은 전-염증성 자극에 의해 유도된다. 케모카인은 2개의 이황화 결합을 형성하는 4 개의 보존된 시스테인의 존재를 특징으로 한다.
용어 "skp, 컬린(cullin), f-박스 함유 복합체 (또는 SCF)"는 프로테아좀 분해로 예정된 단백질의 유비퀴틴화를 촉매하는 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체를 지칭한다. 이는 세포 주기에 관여하는 단백질의 유비퀴틴화에 중요한 역할을 하고 분해를 위한 다양한 다른 세포 단백질을 표시한다.
바이오마커의 양을 결정하는 단계는, 바람직하게는, (a) 바이오마커를 특정 리간드와 접촉시키는 단계, (b) (선택적으로) 비-결합 리간드를 제거하는 단계, (c) 결합된 리간드의 양을 측정하는 단계의 단계를 포함할 수 있다. 결합된 리간드는 강도 신호를 발생시킬 것이다. 본 발명에 따른 결합은 공유 및 비공유 결합을 모두 포함한다. 본 발명에 따른 리간드는 본원에서 기술된 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 핵산 또는 세포에 결합하는, 임의의 화합물, 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 또는 소분자일 수 있다. 바람직한 리간드는 예를 들어, 핵산 또는 펩티드 앱타머와 같은 펩티드, 및 앱타머에 대한 결합 도메인을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드 및 이의 단편에 대한 수용체 또는 결합 파트너와 같은 항체, 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 리간드를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있따. 예를 들어, 적절한 항체 또는 앱타머의 식별 및 생산은 또한 상업적 공급자들에 의해 제공된다. 당업자는 높은 친화도 또는 특이도를 가진 이러한 리간드의 유도체를 개발하는 방법에 익숙하다. 예를 들어, 무작위 돌연변이는 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드로 유도될수 있다. 그런 다음 이들의 유도체는 당업계에 알려진 과정을 스크리닝하는 방법, 예를 들어 파지 디스플레이에 따라 결합을 시험할 수 있다. 본원에서 언급된 항체는 다클론 및 단일클론 항체 뿐만 아니라, 항원 또는 합텐에 결합할 수 있는 Fv, Fab 및 F(ab)2 단편과 같은, 이들의 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 단일 사슬 항체 및 인간화된 잡종 항체를 포함하는데 원하는 항원-특이성을 보이는 비-인간 공여 항체는 인간 수용체 항체의 서열에 결합한다. 공여 서열은 일반적으로 적어도 공여자의 항원-결합 아미노산 잔기를 포함할 것이고 공여 항체의 다른 구조적으로 및/또는 기능적으로 관련있는 아미노산 잔기도 포함할 수 있다. 이러한 잡종은 당업계에서 잘 알려진 여러 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 리간드 또는 물질은 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 본 발명에 따른 특이적 결합은 리간드 또는 물질이 분석될 샘플에 존재하는 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 물질과 실질적으로 ("교차-반응")하여 결합해서는 안된다. 바람직하게는, 특이적으로 결합된 펩티드 또는 폴리펩티드는 다른 관련 펩티드 또는 폴리펩티드보다 적어도 3배 이상, 더 바람직하게는 적어도 10배 이상 및 보다 더 바람직하게는 적어도 50배 이상의 친화도로 결합되어야만 한다. 만일 비-특이적 결합이, 예를 들어 웨스턴 블롯에서의 이의 크기에 따라, 또는 샘플에서의 상대적으로 더 높은 풍부도로 여전히 분명하게 구별되고 측정될 수 있다면, 허용 가능할 수 있다. 리간드의 결합은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 반-정량적 또는 정량적이다. 바이오마커의 결정에 대한 추가적인 적절한 기술은 다음과 같다.
첫째, 리간드의 결합은, 예를 들어 NMR 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 직접적ㅇ로 측정될 수 있다. 둘째, 리간드가 또한 관심 바이오마커의 효소 활성의 기질로서 역할을 한다면, 효소 반응 생성물이 측정될 수 있다 (예를 들어 프로테아제의 양은 예를 들어, 웨스턴 블롯에서 절단된 기질의 양을 측정하여 측정될 수 있다). 또는, 리간드는 효소 성질 그 자체를 나타낼 수 있고 바이오마커에 의해 결합되는 "리간드/펩티드 또는 폴리펩티드" 복합체 또는 리간드 각각은 강도 신호의 생성에 의해 검출할 수 있는 적절한 기질과 접촉할 수 있다. 효소 반응 생성물의 측정을 위해, 바람직하게는 기질의 양이 포화된다. 기질은 또한 반응 전 검출 가능한 라벨로 표지될 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 적절한 시간의 기간 동안 기질과 접촉한다. 적절한 시간의 기간은 검출할 수 있는, 바람직하게는 측정할 수 있는, 생성될 생성물의 양을 위한 필수적인 시간을 지칭한다. 생성물의 양을 측정하는 대신에, 생성물의 특정 (예를 들어 검출 가능한) 양의 출현에 필요한 시간이 측정된다. 셋째로, 리간드는 리간드의 검출 및 측정을 가능하게 하는 표지에 공유결합으로 또는 비공유결합으로 결합될 수 있다. 라벨링은 직접적 또는 간접적 방법에 의해 수행될 수 있다. 직접 라벨링은 리간드에 직접 (공유결합적 또는 비공유결합적) 표지의 결합을 포함한다. 간접 라벨링은 1차 리간드에의 2차 리간드의 (공유결합적 또는 비공유결합적) 결합을 포함한다. 2차 리간드는 1차 리간드에 특이적으로 결합해야 한다. 상기 2차 리간드는 2차 리간드에 결합하는 3차 리간드의 적절한 표지에 결합될 수 있고 및/또는 타겟 (수용체)일 수 있다. 2차, 3차 또는 심지어 더 높은 차수의 리간드의 사용은 종종 신호를 증가시키는데 사용된다. 적절한 2차 및 더 높은 차수의 리간드는 항체, 2차 항체, 및 잘-알려진 스트렙타비딘-비오틴 시스템을 포함할 수 있다. 리간드 또는 기질은 또한 당업계에 알려진 하나 이상의 태그로 "태그된 것"일 수 있다. 그런 다음 이러한 태그는 더 높은 차수의 리간드로 타겟이 될 수 있다. 이러한 태그는 비오틴, 디옥시게닌(digoxygenin), His-Tag, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, FLAG, GFP, myc-태그, 인플루엔자 A 바이러스 해마글루티닌 (HA), 단백질에 결합하는 말토스 등을 포함한다. 펩티드 또는 폴리펩티드의 경우에, 태그는 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단에 있다. 적절한 표지는 적절한 검출 방법에 의해 검출될 수 있는 임의의 표지이다. 전형적인 표지는 금 입자, 라텍스 비드, 아크리딘 에스테르, 루미놀, 루테늄, 효소적으로 활성인 표지, 방사성 표지, 자기 표지 (상자성 및 초상자성 표지를 포함하는, "예를 들어 자기 비드"), 및 형광 표지를 포함한다. 효소적으로 활성인 표지는 예를 들어 호세라이쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 인산효소, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 및 이의 유도체를 포함한다. 검출을 위한 적절한 기질은 디-아미노-벤지딘 (DAB), 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘, NBT-BCIP (4-니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-포스페이트가 있다. 적절한 효소-기질 조합은 당업계에 알려진 방법 (예를 들어 광-민감성 필름 또는 적절한 카메라 시스템을 사용하여)에 따라 측정될 수 있는, 유색 반응 생성, 형광 발광 또는 화학 발광을 유발할 수 있따. 효소 반응을 측정에 대해서는 위에서 제시한 기준을 유사하게 적용한다. 전형적인 형광 표지는 (GFP 및 이의 유도체와 같은) 형광 단백질, Cy3, Cy5, 텍사스 레드, Fluorescein, 및 알렉사 레드를 포함한다. 추가적인 형광 표지는 예를 들어 Molecular Probes (Oregon)로부터 이용 가능하다. 또한 형광 표지로서 양자점의 사용은 고려된다. 전형적인 방사성 표지는 35S, 125I, 32P, 33P 등을 포함한다. 방사성 표지는 알려진 임의의 방법 및 적절한 방법, 예를 들어 광-민감성 필름 또는 인광 사진기로 검출될 수 있다.
바이오마커의 양은, 또한 바람직하게는, 다음과 같이 결정될 수 있다: (a) 상기 명시된 바와 같이 바이오마커에 대한 리간드를 포함하는 고체 지지체를 바이오마커를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 지지체에 결합된 바이오마커의 양을 측정하는 단계. 바람직하게는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 항체 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된, 리간드는, 바람직하게는 고정된 형태의 고체 지지체 상에 존재한다. 고체 지지체를 제조하기 위한 재료는 당업계에 잘 알려져 있고, 특히, 시판되는 커럼 재료, 폴리스티렌 비드, 라텍스 비드, 자성 비드, 콜로이드 금속 입자, 유리 및/또는 실리콘 칩 및 표면, 니트로셀룰로스 스트립, 막, 시트, 듀라사이트(duracytes), 벽 및 반응 트레이의 벽, 플라스틱 튜브 등을 포함한다. 리간드 또는 작용제는 많은 다양한 담체(carrier)에 결합될 수 있다. 잘 알려진 담체의 예시는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 및 개질된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 발명의 목적상 가용성 또는 불용성일 수 있다. 상기 리간드를 고정/고정화시키는 적합한 방법은 잘 알려져 있고 이온, 소수성 또는 공유 상호작용 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 따른 적합한 측정 방법은 또한 FACS 분석, 방사성 면역 분석 (RIA), 요소-연관 면역 흡착 분석 (ELISA), 샌드위치 효소 면역 시험, 화학 발광 샌드위치 면역 분석 (ECLIA), 해리-강화된 란타나이드 플루오로 면역 분석 (DELFIA), 섬광 근접 분석 (SPA) 또는 고상 면역 시험을 포함한다. 당업계에 알려진 추가의 방법 (예컨대 겔 전기영동, 2D 겔 전기영동, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 웨스턴 블롯팅 및 질량 분석법 (MS))은 단독으로 또는 상기 기재된 바와 같은 표지 또는 다른 검출 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해, 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 키트가 제공되고, 본 발명에 따른 키트는 상기 바이오마커의 적어도 하나의 양을 상기 개체의 샘플에서 결정하기 위한 검출제를 포함한다. 이러한 키트는 유리하게는 본 발명의 방법의 간단한 수행 및/또는 본 발명에 따른 바이오마커의 측정 및/또는 결정을 가능하게 한다.
본원에서 사용된 용어 "키트"는 상기 언급된 성분의 집합, 바람직하게는, 각 성분이 개별적으로 또는 단일 용기 내에서 제공되는 것을 지칭한다. 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 이러한 설명서는 매뉴얼 형태일 수 있거나 본 발명의 방법에서 언급된 비교를 수행할 수 있고 컴퓨터 또는 데이터 처리 장치에서 구현될 때 그에 따라 진단을 확립할 수 있는 컴퓨터 프로그램 코드에 의해 제공될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 코드는 저장 매체 (예를 들어 콤팩트 디스크, USB 드라이브 또는 외부 하드 디스크)와 같은 데이터 저장 매체 또는 장치 상에 또는 컴퓨터 또는 데이터 처리 장치 상에 직접 제공될 수 있다. 또한, 키트는, 바람직하게는, 본원의 다른 곳에서 상세히 기재된 바와 같이 참조량에 대한 표준을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 특징은 청구범위 및 도면과 함께 실시예로부터 도출된다. 특정 실시예에서, 단일 특징은 다른 특징과 함께 조합하여 실현될 수 있고 본 발명의 보호 범위를 제한하지 않는다. 본 발명에 따른 하기 실시예의 설명은 도면과 관련될 수 있으며,
도 1은 반응자 및 비-반응자의 말초 혈액에서의 SH2B3 발현 분석을 도시한다. 관상 동맥 우회술(CABG) 혈관 재생 전에 21명의 환자로부터 전혈 샘플을 수득하였다. SH2B3의 상대적 발현 (a) 및 상응하는 ΔCT값 (b)은 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 계산되었다. 모든 값은 평균 ± SEM으로 표시되고 GAPDH 및 POLR2A로 정규화된다. n=13 (반응자); n=8 (비-반응자). ΔCT 값: p=0.073.
도 2는 비감독 ML을 나타내는 3차원 분산 확률적 이웃 임베딩(t-SNE) 계산을 보여준다. 이 독립적인 방법론은 예를 들어 바이오마커 프로파일과 같은, 주어진 파라미터의 차원을 줄이고, 따라서 새로 계산된 특징을 참조하는 변수 x, y 및 z를 계산하고, 이는 환자를 별개의 그룹으로 분류하는 데 사용된다. 이후 모델은 z 축을 지리적 프로파일로 시각화하기 위해 다항식 (n3) 방정식으로 적합화되었다. 반응자 (검은 점) 및 비-반응자 (회색 점) 환자의 각 색깔은 이후에 추가되었다. 분류된 그룹은 대략 검은색과 회색 점선으로 요약되어 있다. 3000 회 반복한 후 결과를 얻는다. 반응자 및 비-반응자 사이의 비율 계산은 각 원에 표시된다. 비-반응자 그룹이 더 작은 z-값 (z <20, ratio < 42%)에 있을 가능성이 높다. 반응자는 69% 초과의 비율을 포함하는 밝은 회색 영역 (z >20)에서 풍부해지는 경향이 있다.
도 3은 반응자 및 비-반응자를 구분하기 위해 임상 및 임상 & 실험실 데이터세트의 수술 전후 시점 (0일 내지 180일)에 대한 ML 예측 결과를 도시한다. 그래프는 5개의 독립적인 특징의 참 예측 비율이 ML 모델 (특징 선택을 위한 AdaBoost 및 최종 예측을 위한 Random Forest (RF))을 선택하였음을 보여준다. 오차 막대는 100회 반복 후 얻은 생성된 모델에 대한 해당 정확도 표준 편차를 나타낸다. 100회 모델 반복은 일원 ANOVA에 따라 상당히 다르다 (p<0.001).
도 4는 PERFECT 시험의 결과를 보여준다. 1차 종점의 진단 구별은 골수/혈액 CD133+, CD34+, CD117+, EPC 및 혈관신생 반응에 연결된 특징적인 수술 전 말초 혈액 파라미터 특징에 의해 PERFECT 시험에서의 반응자를 도출한다.
실시예
하기 실시예들은 단지 발명을 예시할 것이다. 그들은, 어떻게든, 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 임상 연구 디자인 및 평가
심근 경색 및 허혈성 심근 병증 후 심부전 환자에서 심장 재생의 유도는 줄기 세포 치료를 포함하는 다중 접근을 사용하여 표적화되었다. 따라서, 효능의 부족 및 반응 예측성 부족은 치료 표준화 및 성공의 주요 장애물이었다.
허혈성 심부전 및 실패한 박출률(failed ejection fraction)을 가진 환자가 줄기 세포 치료에 적합한 후보이고 심장 재생 가능성이 높은 후보로부터 혜택을 받을 수 있는지를 평가하기 위하여 임상 시험을 수행하였다. 상기 임상 시험은 말초 혈액에서 혈관 신생 인자의 특정한 주요 조성과 관련된, 반응자 및 비-반응자 사이의 심장 회복에서 현저한 차이를 나타냈다. 임상 연구의 수행은 하기에서 자세히 설명되어 있다.
로스톡 대학 심장 외과 부서(Rostock University cardiac surgery department)에서 시작된 통제되고, 전향적이고, 무작위적인, 이중 맹검 다기관 시험("Intra-myocardial Transplantation of Bone Marrow Stem Cells in Addition to Coronary Artery Bypass Graft Surgery (PERFECT)"을 동반된 연구를 수행하였다. 이 시험은 감소된 LVEF 및 좌심실의 국소 운동(localized kinetic)/운동 저하(hypokinetic)/관류 저하(hypoperfused) 영역의 존재를 가진 심근 경색 후 관상 동맥 질환 환자에서 심근 내 CD133+ 세포 주사의 효능 및 안정성을 평가하였다. 이전 결과는 일부 재생 인자 및 치료 (CABG 또는 CABG + CD133+ 줄기 세포 주사)에 대한 환자의 반응간의 밀접한 관계를 보여주었다. MRI로 측정한 LVEF에서 최소 5%의 증가가 6-12 개월의 후속 조치에서 기능적 개선을 나타내도록 선택되었다. LVEF를 5% 초과로 증가시킨, 환자는, 반응자, 5% 미만의 향상 또는 감소된 LVEF의 환자는 비-반응자로 정의한다.
바이오마커
사전-지정된: EPC (공동 염색 패널 CD133, 34, 117, 184, 309, 105, 45) 및순환 내피 세포 (CEC) (공동 염색 패널: CD31, 146, 34, 45, 105, 184, 309)의 공동 염색 패널 목록 뿐만 아니라 시험관 내 CFU-EC, CFU-Hill 및 생체 내 Matrigel 플러그 분석법으로 4-레이저 유세포 계측법 (LSR II, Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)을 사용하여 공발현 분석을 이용하여 골수 (BM) 및 말초 혈액 (PB)에서 39명의 환자의 코호트에서 뚜렷한 조혈 및 내피 CD133+ EPC 하위집단 및 혈관신생 능력을 시험하였다. NT-proBNP 및 바이러스 분석은 말초 혈청에서 IgG 및 항원 분석에 의해 Epstein-Barr-Virus (EBV), Cytomegalovirus (CMV), 및 Parvovirus로 수행되었다. 혈청 혈관신생 인자 및 사이토카인에 대해 최종 데이터 종결 전 사후 분석을 수행하였다. 사후 분석: 말초 혈액 (PB)에서 BM 하위집단 분석 및 SH2B3 mRNA RT-PCR: BM CD133+ 및 PBMNC 샘플에서 연구된 바이오마커의 방법 및 분석은 세포계 비드 어레이(cytometric bead array, CBA) 및 효소-연결 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 및 RT-PCR을 이용하였다.
통계 분석
중심별 1차 분석의 계층화는 샘프ㄹ 크기 계산에서 무시되었다. 1차 분석에서 사용된 공분산 분석 (ANCOVA) 대신에, 동일한 분산을 갖는 2-샘플 t-검정 시나리오(two-sample t-test scenario)가 고려되었다. 샘플 크기는 5%의 양면 I형 오류 (α) 및 10%의 II형 오류 (β) (즉, 90%의 검정력)를 가정하여 결정되었다. 수술 후 6개월 째에 4 내지 5%의 두 치료균 사이의 LVEF에서의 차이의 시나리오는 임상적으로 관련된 차이로 간주되었다. 4.5의 차이 및 표준 편차 7.5의 경우, 그룹 당 적어도 n=60 명의 환자가 필요한 것으로 간주되었고, 추가 15%의 탈락율로, 총 142명 이상의 환자가 무작위화되었다. 상용 프로그램 nQuery Advisor 5.0, section 8, table MTT0-1 (Hofmann WK, de Vos S, Elashoff D, et al., Lancet 2002; 359(9305):481-6)을 사용하여 샘플 크기를 계산하였다. 비-중심 파라미터가
Figure 112020012039191-pct00001
n δ/√2 이고 δ 는 효과 크기 |μ1-μ2| / σ 로 정의된 중앙 및 비-중심 t-분포를 사용하여 계산을 실현하였다(O'Brien R G, Muller K E, Signified power analysis for t-tests through multivariate hypothesis. In L K Edward (Ed.) Applied analysis of variance in behavioral science, 1993, New York, Marcel Dekker).
통계 분석, 최종 데이터 세트 계산 및 준비는 Koehler GmbH에 의해 수행되었고, 주요 특징을 식별하는 기계 학습을 통한 데이터 분석 및 종합적인 환자 데이터의 분류는 감독 및 비감독 기계 학습 (ML) 알고리즘을 사용하여 얻었다 (Kuhn M, J Statistical Software, 2008; 28(5):1-26). 모범 실행 권장 사항에 따라 치수 축소에 대해 낮은 분산 및 높은 상관관계를 가진 특징을 제거하면서 데이터를 사전-처리하였다. 표준 데이터 대치 실행에서 자주 사용되는 누락 측정값은 0으로 채워졌다. 다음의 감독된 알고리즘은 비교되었다: AdaBoost, Support Vector Machines (SVM) 및 Random Forest (RF) (Forman G and Cohen I, 2004. "Learning from Little: Comparison of Classifiers Given Little Training" doi: 10.1007/978-3-540-30116-5_17). 소규모 임상 데이터 세트는 종종 과적합하기 쉽다. 트레이닝이 거의 없는 특징을 비교하기 위해 소규모 데이터 세트에 대한 트레이닝에 적합한 분류기를 사용하였으며 과적합에 대한 정확성 및 견고성에 따라 가장 적합한 알고리즘을 선택하였다 (Saeb AT, Al-Naqeb D. Scientifica (Cairo). 2016; 2016:2079704. doi:10.1155/2016/2079704. Epub 2016 May 30). 감독 ML 모델은 10배 교차-검증되었다. 그런 다음 AdaBoost 및 RF에서 특징 선택을 적용하여 특징 수를 20 미만으로 줄였다. 우리는 비감독 기계 학습 분류 및 비선형 차원 축소를 위해 t-분산 확률적 이웃 임베딩(t-distributed stochastic neighbour embedding, t-SNE)을 사용하였다 (Maaten L V D & Hinton G, Visualizing Data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research, 2008; 9:2579-2605. Doi http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html).
결과
안전성 세트 (SAS) 환자 그룹 및 프로토콜 세트 (PPS) 당 환자 그룹의 환자 기준 특성 분석은 사전-지정된 코호트 분석 SAS (n=77) 및 PPS (n=58) 위약 대 CD133+에 대한 설명을 따랐다. 1차 평가 결과에 영향을 미치는 인자를 분석하기 위해 사후 분석이 추가로 수행되었다. 이를 위해, 환자를 반응자 (180일에 LVEF > 5% 증가) 또는 비-반응자 (180일에 LVEF < 5% 증가)로 분류하였다. 이 사후 분석에 따르면 35/58 (60.3%) 환자는 치료 반응자였고 23/58 (39.7%) 는 LVEF에서 개선되지 않았다. 이 반응자/비-반응자 (NR) 비율은 위약 그룹 57/43% (R/NR: 17/13 patients (pt.)) 및 CD133+ 그룹 64/36% (R/NR: 18/10 pt.) 각각에서 비슷하였다 (위약 대 CD133+: p= 0.373).
효능 결과 분석
PPS 효능 분석 그룹 (n=58)은 기준선 LVEF 33.5%, SD ±6.26% [Min-Max 25-49], n=58로 감소된 펌프 기능 후 MI로 특징지어졌다 (움직이지 않은 상태에서 MRI에서 측정됨). 사전-지정된 1차 종점: 치료 6개월 후 좌심실 기능은 LVEF가 +9.6% ± SD 11.3% [Min-Max -13 - 42], p<0.001 (n=58) 로 상당한 증가를 보여주었다. CABG 혈관재건술(revascularization) 및 후기 심근 역 리모델링에 의한 좌심실 기능의 조기 개선을 식별하기 위해, 병원 퇴원 시 추가적인 중간 MRI 분석이 소그룹의 환자에서 이용 가능하였다 (n=29). 이는 주로 후기에 (10-180일) ΔLVEF의 +6.5% 증가를 나타냈다, SD ± 7.92% [Min-Max -11-23], p=0.007 (n=29). 1차 종점의 ANCOVA 분석에서 위약 그룹은 180 일에 기준선 LVEF 33.5 %에서 42.3 %까지 개선되었고 (ΔLVEF +8.8%, SE ± 2.17% [CI 38.0, 46.6], p<0.001;n=30), CD133+ 그룹 LVEF은 33.5%에서 43.9%까지 증가하였다 (ΔLVEF +10.4%, SE ± 2.33% [CI 39.0, 48.5], p<0.001; n=28). Treatment group difference CD133+ versus placebo with +2.58± SE 3.13% [CI -3.7 - 8.9], p =0.414의 위약과 CD133+ 의 치료 그룹 차이는 ANCOVA 분석에서 통계적으로 유의하지 않았다. CD133+ 줄기 세포 그룹은 +8.8%, SD ± 6.38% [Min-Max 4 - 10], p=0.001 (n=14) 대 위약 대조군 (10-180일 ΔLVEF) +4.3%, SD ± 8.8% [Min-Max -11 - 23], p=0.077 (n=15)에서 주로 후기에서 ΔLVEF 개선을 나타냈다.
반응자 (R) / 비-반응자 (NR)
사후 1차 종점 분석에서 치료 반응자는 기준선에 대해 180일에 5%보다 높은 ΔLVEF를 갖는 것으로 정의되었다. 58명의 환자의 코호트에서 35 명의 반응자의 전파(dissemination) 결과는 ANCOVA에서 180d/0에 +17.1%의 ΔLVEF의 전체적인 증가를 특징으로 한다; SE ±2.08% [CI 12.9.; 21.3], R vs. NR, p< 0.0001 (180d/0), n=58. LVEF 증가는 CD133+에서 +19.1% 대 위약에서 +13.9%, p=0.099, n=35 였다(데이터는 나타내지 않음). 대조적으로, 비-반응자는 180d/0에서 0%의 ΔLVEF를 보여주었다, SE ±5.73% [CI 22.3; 44.8] p=0.287 (위약/NR +3.3%, CD133+/NR-2.4%).
사후 2차 종점: 반응자는 비-반응자와 비교할 때 LV-치수 (LVEDV p=0.008, LVESV p=0.0001) 에서 상당한 감소 및 NT-pro-BNP, p=0.0002 에서 감소를 보여주었다. 이것은 6MWT의 유사한 개선에 의해 반영되지 않았다 (p=0.811). 심근 내 조직 회복은 흉터 크기 R 대 NR - 8.19g 가 개선된 반응자에서 발견되었다, SE ±3.5g, p=0.0238. CD133+ 치료된 NR은 또한 흉터 크기 감소 (CD133+NR Δscar size 180d/0: -13.9g, SD ±20.9 g 위약 NR +11.9, SD ±16.7g, p=0.008, n=20) 및 생존 불가능한 조직을 보여주었다 (Δ생존 불가능한 조직 180d/0: CD133+ NR -12.4g, SD ±19.3g 대 위약 NR +11.5g, SD ±12.0g, p=0.004, n=19) (데이터는 제시되지 않음). 이러한 경향은 반응자에서 관잘되지 않았다: 흉터 크기 (CD133+ NR 대 위약 NR -1.9, SD ±16.0 g 대 위약 +2.5, SD ±13.2g, p=0.398, n=33) 및 생존 불가능한 조직 (CD133+ NR 대 위약 NR -1.4, SD ±16.7 g 대 위약 +1.8, SD ±12.3 g, p=0.544, n=32). 장기 생존: 중간 생존은 76.9± 3.32 개월 (R) 대 + 72.3 ± 5.0 개월 (NR), HR 0.3 [Cl 0.07-1.2]; p=0.067.
말초 혈액에서 순환 EPC (CD133+/CD34+/CD117+)는 치료 전 NR 대 R 에서 2배 감소한 것으로 밝혀졌다. CD34+ MNC 하위집단의 경우 수술 전 혈액 수준은 (R): CD34+ 0.072%, SD±0.05% 대 (NR) 0.039%, SD ±0.017, R 대 NR p=0.027 이었다. CD133+, CD133+ and CD117+ 하위집단에 대해 수술 전 유사한 차이가 발견되었다 (수술 전. R 대 NR: CD133+ 0.048%, SD ±0.031% 대 0.021%, SD ±0.011%, p=0.005; CD133+CD117+ 0.019%, SD ±0.016% 대 0.007%, SD±0.008%, p=0.024, n=23) (참조. 표 1). 이러한 차이는 위약 및 CD133+의 비교에서 발견되지 않았다 (위약 대 CD133+ 그룹: CD34+ p=0.975; CD133+ p=0.995; CD133+CD117+ p=0.892; n=24) (표 1). 대조적으로, CD146+ CEC는 비-반응자 대 반응자에서 더 높은 수술 전 수준을 나타냈다 (p=0.053) (표 1).
수술 후, NR의 EPC의 감소는 퇴원 전까지 현저하게 유지되었다: 수술 후 EPO에도 수준의 증가 (NR: 수술전. 16.9 U/ml, SD ±14.1 U/ml; NR 10일: 42.1 U/ml, SD ±23.9 U/ml; p=0.006 수술전/10일) 및 IP10/CXCL10의 감소 (NR 수술 전: 157.6 pg/ml, SD ± 94.5pg/ml; NR 10일: 95.8 pg/ml, SD ±85.2pg/ml; p=0.01 수술 전/10일)에도 불구하고 말초 혈액 CD34+ (NR 대 R p= 0.026 수술 전 및 10일) 및 CD133+ CD117+ (NR 대 R p=0.024 수술 전 및 10일).
치료 반응자는 수술 전 VEGF (p=0.056 R/NR), EPO (p=0.023 R/NR), CXCL10/IP10 (p=0.076 R/NR)과 같은 전-혈관신생 인자의 낮은 혈청 수준 및, IGFBP-3의 더 높은 수준 (p=0.089 R/NR)(표 1), 뿐만 아니라 개입 후 10일에 비-빈응자 (+1.2pg/ml, p=0.913 수술 전/10일)에 대해 VEGF (+26.6pg/ml, p=0.015 수술 전/10일)의 강한 유도로 특징지어졌다 (표 1). 분리된 골수 CD133+ 세포는 모두 CFU-EC에 의해 시험관 내에서 및 Matrigel plug에 의해 생체 내에서 그들의 혈관신생 잠재력에 대해 양성으로 테스트되었다 (데이터는 나타내지 않음).
혈소판 수는 치료 전 NR (208 x109/L, SD±51.2 109/L [CI 73-311], n=23) 대 R (257 x109/L, SD±81.5 109/L [CI 123-620], n=35) (NR vs R: p=0.004, n=58)에서 수술 전에 감소되었다. 감소된 PB 혈소판 및 CD133+ CD34+ EPC 수를 발견함으로써 골수 줄기세포 억제를 의심하면서, 우리는 즉시 냉동된 혈액 샘플에서 EPC 및 거핵세포에 대한 조혈 줄기 세포 반응의 억제와 관련된 LNK 어댑터 단백질 SH2B3를 코딩하는 SH2B3 mRNA의 RT-PCT 유전자 발현 분석을 테스트하였다. 21명의 환자를 대상으로 한 첫 번째 분석에서 비-반응자의 말초 혈액에서 증가된 mRNA 발현의 경향을 밝혔다 (p=0.073) (참조. 표 1, 도 1).
표 1: 혈액 내 혈관신생 관련 바이오마커 분석. 반응자 대 비-반응자 및 위약 대 CD133+ 그룹을 수술 전 (평가 I) 및 수술 후 10일 (퇴원) 사이의 말초 혈액 샘플의 바이오마커 변화에 대해 분석하였다. 데이터는 완전한 분석을 통해 환자 그룹 (코호트)로부터 도출된다 (프로토콜 임상 데이터세트 및 바이오마커에 따라). 이 코호트에서 모든 샘플은 저장 또는 운반으로 인한 샘플의 변화를 피하기 위해 즉시 처리되었다. 데이터는 평균값 ± 표준 편차, 시점 0 및 10일 사이의 P-값, 각 시점에 대한 반응자/비-반응자, 줄기세포/대조군 사이의 PA-값으로 표현된다 (PB - 말초 혈액, EPO - 에리스로포이에틴).
Figure 112020012039191-pct00002
Figure 112020012039191-pct00003
R/NR에 대한 진단 반응 특징을 식별하기 위해 심장 줄기 세포 치료 및 CABG 수술 후 기능 개선의 예측을 위한 도구로 기계 학습 방법을 사용하였다. 구체적으로 작은 집단의 과적합을 배제하기 위해 첫번째 분석을 수행하였다. 그런 다음, PERFECT 임상 데이터베이스로부터 맹검 환자 데이터를, 가까운 근접함에서 유사한 환자를 모으고 별개의 그룹을 밝혀낼 수 있는, 비감독 ML로, 조사하였다. 기초 세분화를 조사하여, 환자 특성을 두 개의 별개의 그룹으로 배치하기 위해 모든 시점에 대해 1차 감독 ML 분석을 수행하였다. 180일의 ΔLVEF에 따라 환자 특성을 독립적으로 할당한 계산은 사전-선택 기준이 > 5% 임을 확인하였다 (참조. 표 2, 도 2).
그런 다음 기계 학습 알고리즘을 사용하여 반응자 특징에 대한 결정적인 파라미터를 조사하였다. 이를 위해 기본 PERFECT 임상 데이터세트 및 바이오마커 실험실 측정을 결합하고 분석하여 CABG 절차 전후에 반응자 및 비-반응자에 대한 파라미터 프로파일의 분류 특이성을 검증하였다. 특히, 우리는 혈소판 및 백혈구 수뿐만 아니라 차별절인 1차 및 2차 종점 매개변수를 사요하였다. 임상 파라미터 (n=160) 분류만을 사용하면 63.35% (180 일)의 평균 정확도를 가정하는 반응자의 특이성이 발생하였다 (표 2). 그러나, 수술 전 임상 데이터 (n=49) 및 바이오마커 실험실 파라미터 (n=142)의 조합은, 최대 정확도 81.64% ± SE 0.51% [CI 80.65 - 82.65] (n=31)를 가정할 때 이미 수술 수술 전 말초 혈액에서 혈관신생/EPC/CEC 관련 파라미터의 높은 민감도를 나타냈다. 흥미롭게도, 17/20 관련 파라미터는 말초 혈액에서의 혈관신생 파라미터, 골수 EPC/CEC 반응, NTproBNP, 및 SH2B3 유전자 발현과 관련이 있었다 (표 2). 임상 및 바이오마커 파라미터 모두를 사용 시 반응자의 수술 전 예측 정확도는 79.35% ± SE 0.24% [CI 78.87-79.84] (n=31) 이었고 비-반응자는 83.95% ± SE 0.93% [CI 82.10-85.80] (n=31) 이었다. 0-180 일 째 조합된 임상 및 바이오마커 분석은 (n=522) 94.77% ± SE 0.43% [CI 93.92 - 95.63] (n=31) (R) 및 92.44% ± SE 0.60% [CI 91.24 - 93.64] (n=31) (NR)의 예측 정확도를 허용한 한편, 10일 째 수술 후 평가 결과는 82.12% ± SE 0.28% [CI 81.56 - 82.67] (n=31) (R) 및 85.89% ± SE 0.67% [CI 84.56 - 87.22] (n=31) (NR)의 예측 정확도를 보였다 (참조. 도 3).
기계 학습 접근 방식을 기반으로 하는 특징 선택은 반응자 부족 및 심장 재생 유도에 대한 결정적인 인자를 식별을 이끌었으며, 이는 치료 전의 진단 R/NR 선택 및 치료 중의 모니터링에 사용될 수 있다. 말초 혈액에서 실험실 진단의 핵심 인자는 NT-proBNP, VEGF, 에리스로포이에틴, 비트로넥틴, 순환 EPC/CEC/혈소판, SH2B3 mRNA 발현, 말초 혈액에 대한 CFU-Hill 분석/Matrigel plug, 무게 및 LVESV 지수였다. 우리는 확인된 인자의 통계적 상관 관계를 발견하고 반복 교차-검증을 사용하여 반응자 및 비-반응자 환자의 선택에 대한 진단적 용도를 계산하였다 (참조. 도 4).
실험실 바이오마커 서브세트는 ML에 의한 임상 시험의 특정 특징과 함께 선택되었다. 계산적으로 선택된 특징 및 바이오마커는 하기 표 2에 도시되어 있다. 예측 정확도는 80% 이상으로 결정되었다.
표 2: 반응자 및 비-반응자의 진단 구별을 위한 기계 학습 선택 파라미터
Figure 112020012039191-pct00004
본 명세서에 예시적으로 설명된 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 구성 또는 구성들, 제한 또는 제한들이 없는 상태에서 적절하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 각각의 예에서 임의의 용어 "포함하는", "필수적으로 구성되는" 및 "구성되는" 이라는 용어는 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다. 포함된 용어 및 표현은 기재의 용어로 사용되고 이에 제한되지 않고, 그러한 용어 및 표현의 사용에서 도시되고 설명된 특징 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배체하려는 의도는 없지만, 청구된 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식하였다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시예에 의해 구체적으로 개시되고 여기에서 개시된 개념의 선택적 특징, 수정 및 변형은 당업자에 의해 이루어질 수 있으며, 그러한 수정 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 이의 전체 개시 내용 및 본 명세서에 구체적으로 언급된 개시 내용과 관련하여 본원에 참조로 포함된다.
약어 코드
AE = 이상 반응(Adverse Event)
AESI = 특별한 관심의 이상 반응(Adverse Event of Special Interest)
AHA = 미국 심장 ㅎ협회(American Heart Association)
ANCOVA = 공분산 분석(Analysis of covariance)
BM = 골수(Bone marrow)
BMSC = 골수 줄기세포(Bone marrow stem cells)
CABG = 관상 동맥 우회술(Coronary Artery Bypass Graft)
CAP-EPC = 농축된 주변 입자 - 내피 전구 세포(Concentrated Ambient Particles - Endothelial Progenitor Cells)
CBA = 세포계 비드 어레이(Cytometric Bead Array)
CCS = 캐나다 심혈관 학회(Canadian Cardiovascular Society)
CCTRN = 심혈관 세포 치료 연구 네트워크(Cardiovascular Cell Therapy Research Network)
CD = 분화 클러스터(Cluster of Differentiation)
CEC = 순환 내피세포(Circulating endothelial cells), CEC 패널(CEC panel), PB에서 측정한 CD(CDs measured in PB)
CFU = 콜로니-형성 유닛(Colony-forming unit)
CI = 신뢰 구간(Confidence interval)
CMV = 사이트메갈로바이러스(Cytomegalovirus)
EA = 초기 항원(Early Antigen)
EBNA1 = EBF-핵 항원 1(EBV-Nuclear Antigen 1)
EBV = 엡스타인-바-바이러스(Epstein-Barr-Virus)
EC = 내피세포(Endothelial Cells)
ECG = 심전도(Echocardiography)
ELISA = 효소-연결 면역흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
EPC = 태피 전구 세포(Endothelial Progenitor Cells), EPC 패널(EPC panel), PB에서 측정한 CD(CDs measured in PB)
EPO = 에리스로포이에틴(Erythropoietin)
GMP = 우수 제조 실습(Good Manufacturing Practice)
HR = 위험 비율(Hazard ratio)
HIF = 저산소증-유도 인자(Hypoxia-Inducible Factor), 전사인자(transcription factor)
ICH GCP = 우수한 임상 실습을 위한 3자간 지침(Tripartite Guidelines Guideline for Good Clinical Practice)
IGF-1 = 인슐린-유사 성장 인자 1(Insulin-like Growth Factor 1)
IGFBP2/3 = 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 2/3(Insulin-like Growth Factor-Binding Protein 2/3)
IHG = ISHAGE 지침에 따라 수행된 분석(Analysis performed in accordance with ISHAGE guidelines)
IL = 인터루킨(Interleukin)
IP-10 = C-X-C 모티프 케모카인 10 (CXCL10)으로도 알려진 인터페론 감마-유도 단백질 10(Interferon Gamma-induced Protein 10 also known as C-X-C motif chemokine 10 (CXCL10))
LMCA = 왼쪽 관상 동맥(Left Main Coronary Artery_
LVEDV = 좌심실 이완기 용적(Left Ventricular End Diastolic Volume)
LVEF = 좌심실 배출 분획(Left Ventricular Ejection Fraction)
LVESD = 좌심실 수축기 치수(Left Ventricular End Systolic Dimension)
MACE = 주요 이상 심혈관 반응(Major Adverse Cardiovascular Events)
ML = 기계 학습(Machine learning)
MNC = 단핵 세포(Mononuclear cells)
MRI = 자기 공명 이미지(Magentic Resonance Imaging)
6MWT = 6-분 도보 테스트(6-Minute Walk Test)
NT-proBNP = B-형 뇌 자연 펩티드(B-type Brain Natruretic Peptide)
PB = 말초 혈액(Peripheral blood)
PBMNC = 말초 혈액으로부터 분리된 단핵 세포(mononuclear cells isolated from peripheral blood)
PCI = 경피 관상 동맥 중재술(Percutaneous Coronary Intervention)
PEI = Paul-Ehrlich Institute
PPS = 프로토콜 세트 당 환자 그룹(Group of patients for per-protocol set)
SAE = 심각한 이상 반응(Serious adverse event)
SAS = 안전 세트의 환자 그룹(Group of patients for safety set)
SDF-1 = 기질 세포-유래 인자 1(Stromal Cell-derived Factor 1)
SH2B3 = Lnk [Src homology 2-B3 (SH2B3)]는 중요한 어댑터 기능을 가진 SH2-함유 단백질 군에 속한다(Lnk [Src homology 2-B3 (SH2B3)] belongs to a family of SH2-containing proteins with important adaptor functions)
SCF = 줄기 세포 인자(Stem Cell Factor)
STEMI = ST-분절 상승 경색(ST- segment Elevation Infarction)
SUSAR = 예상차지 못한 심각한 부작용(Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction)
TNF = 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor)
t-SNE = t-분산 확률론적 이웃 임베딩(t-distributed stochastic neighbour embedding)
VCA = 바이러스-캡시드-항원(Virus-Capsid-Antigen)
VEGF = 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor)
VEGF rec = 혈관 내피 성장 인자 수용체(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor)
VEGFR2 / KDR = 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 / 키나아제 삽입 도메인Vascular 수용체(Endothelial Growth Factor Receptor 2 / Kinase Insert Domain Receptor)

Claims (26)

  1. (i) 개체의 샘플에서 성장 인자(Growth factor), 림프구 어댑터 단백질(Lymphocyte adapter protein), 당단백질(Glycoprotein), 뇌 나트륨이뇨펩티드(brain natriuretic peptide, BNP), 순환 내피 전구 세포(circulating endothelial progenitor cells, EPC), 순환 내피 세포(circulating endothelial cells, CEC), 순환 혈소판(circulating thrombocytes), 순환 단핵 세포 및 하위집단(circulating mononuclear cells and subpopulations), 및 MNC 하위집단에서의 수용체/리간드 발현(receptor/ligand expression)의 군으로부터 선택된 9개의 바이오마커의 각각의 양을 결정하는 단계,
    (ii) 상기 결정된 양을 기준값 또는 참조와 비교하는 단계,
    (iii) 상기 비교 결과에 기초하여, 상기 개체에서의 심장 회복에 대한 반응이 예상되는지, 예상되지 않는지, 또는 모호한지(ambivalent)의 여부를 예측하는 단계
    를 포함하는 심혈관 재생에 대한 반응의 예측 방법으로서,
    상기 성장 인자는 VEGF 또는 에리스로포이에틴(Erythropoietin)으로부터 선택되고, 상기 림프구 어댑터 단백질은 SH2B3로부터 선택되고, 상기 당단백질은 비트로넥틴(Vitronectin)으로부터 선택되고 및 상기 뇌 나트륨이뇨펩티드는 NT-proBNP으로부터 선택되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    예측 정확도의 민감도 및 특이도는 80% 초과인, 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 사이토카인(Cytokine), 인터루킨(Interleukin), 인터페론(Interferon), 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질(Insulin-like-growth-factor-binding protein), 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like Growth factor), 케모카인 단백질(Chemokine protein) 또는 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체(Multi-protein E3 ubiquitin ligase complex)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 바이오마커를 사용하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 사이토카인은 TNF로부터 선택되고, 상기 인터루킨은 IL-6, IL-8, 또는 IL-10으로부터 선택되고, 상기 인터페론은 인간 인터페론 감마-유도 단백질 10(Human interferon gamma-induced protein 10)으로부터 선택되고, 상기 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질은 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-2 또는 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-3(Insulin-like-growth-factor-binding protein-3)으로부터 선택되고, 상기 인슐린-유사 성장 인자는 IGF2로부터 선택되고, 상기 케모카인 단백질은 SDF-1으로부터 선택되고, 또는 상기 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체는 SCF로부터 선택되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 줄기세포 치료, 혈관신생(angiogenesis) 반응의 유도, 심근 경색, 뇌졸중 및 말초 허혈성 혈관 질환을 포함하는 심장혈관 질환의 조직 회복, 심장 질환 또는 허혈성 전처리(ischemic preconditioning)의 수술 전 예측에 사용되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 심장 질환 또는 동맥 경화증(arteriosclerosis)을 앓고 있는 개체로부터 채취된 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 적어도 2, 3, 4, 5, 6 이상의 시점의 비교 결과를 프로파일링(profiling)하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    예측 정확도의 민감도 및 특이도는 90% 초과인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 임상 진단 파라미터의 사용을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 혈관 신생 방법의 프로파일링에 사용되는 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 RNA, mRNA 서열, 마이크로RNA와 같은 기능적 RNA, 비-코딩 RNA 또는 진단 특징(diagnostic signature)을 포함하는 SNP를 분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 RNA, DNA 서열 분석 또는 네트워크 경로 분석을 사용하는 약동학적(pharmacokinetic) 및 약물유전학적(pharmacogenetics) 데이터의 분석을 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 표현형(phenotyping) 분석을 추가로 포함하는. 방법.
  15. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포 치료가 CD133 양성 줄기 세포의 이식을 포함하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 개체는 인간인, 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 샘플은 혈액, 혈청, 혈장 샘플, 조직 생검 샘플 또는 EPC와 같은 순환 줄기 세포의 샘플인, 방법.
  18. 심혈관 재생에 대한 반응의 예측을 위한 방법에 사용하기 위한 성장 인자(Growth factor), 림프구 어댑터 단백질(Lymphocyte adapter protein), 당단백질(Glycoprotein), 순환 내피 전구 세포(circulating endothelial progenitor cells, EPC), 순환 내피 세포(circulating endothelial cells, CEC), 순환 혈소판(circulating thrombocytes), 순환 단핵 세포 및 하위집단(circulating mononuclear cells(MNC) and subpopulations), MNC 하위집단에서의 수용체/리간드 발현(receptor/ligand expression) 및 뇌 나트륨이뇨펩티드(brain natriuretic peptide, BNP)의 군으로부터 선택된 9개의 바이오마커의 조합으로서,
    상기 성장 인자는 VEGF 또는 에리스로포이에틴(Erythropoietin)으로부터 선택되고, 상기 림프구 어댑터 단백질은 SH2B3로부터 선택되고, 상기 당단백질은 비트로넥틴(Vitronectin)으로부터 선택되고 및 상기 뇌 나트륨이뇨펩티드는 NT-proBNP으로부터 선택되는, 바이오마커의 조합.
  19. 삭제
  20. 제18항에 있어서,
    상기 조합은 사이토카인(Cytokine), 인터루킨(Interleukin), 인터페론(Interferon), 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질(Insulin-like-growth-factor-binding protein), 인슐린-유사 성장 인자(Insulin-like Growth factor), 케모카인 단백질(Chemokine protein) 또는 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체(Multi-protein E3 ubiquitin ligase complex)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커를 추가로 포함하는, 바이오마커의 조합.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 사이토카인은 TNF로부터 선택되고, 상기 인터루킨은 IL-6, IL-8, 또는 IL-10으로부터 선택되고, 상기 인터페론은 인간 인터페론 감마-유도 단백질 10(Human interferon gamma-induced protein 10)으로부터 선택되고, 상기 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질은 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-2(Insulin-like-growth-factor-binding protein-2) 또는 인슐린-유사-성장-인자-결합 단백질-3(Insulin-like-growth-factor-binding protein-3)으로부터 선택되고, 상기 인슐린-유사 성장 인자는 IGF2로부터 선택되고, 상기 케모카인 단백질은 SDF-1으로부터 선택되고, 또는 상기 다-단백질 E3 유비퀴틴 리가아제 복합체는 SCF로부터 선택되는, 바이오마커의 조합.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 방법은 임상 진단 데이터, RNA, mRNA, 마이크로RNA와 같은 기능적 RNA, 비-코딩 RNA, SNP의 분석, 약동학적(pharmacokinetic) 데이터의 분석 또는 표현형(phenotyping)의 분석을 추가로 포함하는, 심혈관 재생에 대한 반응의 예측을 위한 방법에 사용하기 위한 바이오마커의 조합.
  23. 제6항에 있어서,
    상기 방법 또는 바이오마커는 줄기세포 치료에 대한 반응의 수술 전 예측에 사용하기 위한 것이고, 상기 줄기세포 치료는 관상 동맥 우회술(coronary artery bypass graft, CABG)이 동반되는, 방법.
  24. 제1항의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
    상기 개체의 샘플에서 제1항의 바이오마커 각각의 양을 결정하기 위한 검출제를 포함하는 키트.
  25. (i) 제1항에 따른 바이오마커의 결정된 양을 기준값 또는 참조와 비교하는 단계,
    (ii) 상기 비교 결과에 기초하여, 상기 개체에서의 심혈관 재생에 대한 반응이 예상되는지, 예상되지 않는지, 또는 모호한지(ambivalent)의 여부를 예측하는 단계
    를 포함하는, 프로세서(processor) 및 상기 프로세서에 연결된 하나 이상의 기계 학습(machine learing, ML) 모델을 인코딩하는 메모리를 포함하는, 컴퓨터 장치.
  26. (i) 개체의 샘플에서 제1항에 따른 바이오마커 각각의 양을 결정하기 위한 분석 유닛, 및
    (ii) 제25항에 따른 컴퓨터 장치
    를 포함하는, 제1항에 따른 방법을 수행하기 위한 장치.
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