IT202100011327A1 - Metodo prognostico - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Della Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal Titolo:
?Metodo prognostico?
La presente invenzione si riferisce ad un metodo per valutare la risposta di un soggetto che ha subito un evento ischemico ad un trattamento farmacologico.
STATO DELL?ARTE
L?alta incidenza di patologie cardiovascolari nella popolazione e la disponibilit? di farmaci per gestire i fenomeni che ne seguono, ha spinto la ricerca verso l?identificazione di marcatori che ne potessero prevedere l?efficacia. Detta esigenza ? particolarmente avvertita laddove i farmaci disponibili sono farmaci particolarmente costosi, ad esempio anticorpi monoclonali, e il cui effetto ? fortemente soggettivo.
Le analisi del sangue vengono generalmente effettuate a partire da un campione di sangue liquido, siero o plasma, conservato in opportuni tubi che possono contenere o meno un anticoagulante in funzione della tipologia di analisi che si deve poi eseguire.
E? fortemente avvertita l?esigenza di disporre di una metodica atta a rendere disponibile un campione di sangue per analisi successive, che superi i limiti della conservazione, del trasporto e dei rischi di infezione derivante da campioni contaminati, tipicamente associati a campioni di sangue liquido. In un ulteriore aspetto, l?esigenza ? quella di disporre di analisi di detto campione che siano immediate.
DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE
Descrizione delle figure
Figura 1: grafico a violino che mostra la distribuzione dei valori di BAFF misurati nella coorte. In ordinate ? espressa la concentrazione di BAFF (ng/ml). La larghezza del violino ? indicativa della numerosit? del valore misurato. Le linee indentificano la mediana, il 25? e il 75? percentile. La linea punteggiata ? il cut-off secondo l?invenzione.
Figura 2: grafico a violino che mostra la distribuzione dei valori di MGO misurati nella coorte. In ordinate ? espressa la concentrazione di MGO (?g/ml). La larghezza del violino ? indicativa della numerosit? del valore misurato. Le linee indentificano la mediana, il 25? e il 75? percentile. La linea punteggiata ? il cut-off secondo l?invenzione.
Forma oggetto della presente invenzione un metodo in vitro predittivo della risposta farmacologica in soggetti che hanno subito un evento ischemico cardiaco (primo o successivo al primo). Detto metodo comprende la determinazione dei livelli di espressione di BAFF e/o Metilgliossale e, opzionalmente, ulteriori marcatori, in un campione di fluido biologico di un soggetto.
Detto fluido biologico ? selezionato nel gruppo che comprende saliva, urina, sangue. In una forma di realizzazione, ? sangue.
In una forma preferita di realizzazione, detta determinazione ? effettuata su sangue secco.
Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente dimostrato la possibilit? di selezionare tra i soggetti nei quali si ? verificato un episodio cardiaco, una sottopopolazione idonea a trattamento con antiCD20, dove detta sottopopolazione corrisponde al sottoinsieme di soggetti infartuati che mostra valori di BAFF pi? alti rispetto al valore medio misurato nella coorte di soggetti a seguito di episodio cardiaco, definito sottoinsieme BAFF.
In una forma preferita, detta misurazione avviene in acuto, in fase di decisione della ottimale strategia di riperfusione.
In una forma preferita, valori di BAFF misurati nel sangue secco superiori a 0,300 ng/ml sono classificati in detto sottoinsieme BAFF .
In un?ulteriore forma di realizzazione, gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente dimostrato la possibilit? di selezionare tra i soggetti nei quali si ? verificato un episodio cardiaco, una sottopopolazione idonea a trattamento con antidiabetici, dove detta sottopopolazione corrisponde al sottoinsieme di soggetti infartuati che mostra valori di MGO legto agli amminoacidi delle proteine pi? alti rispetto al valore medio misurato nella coorte di soggetti a seguito di episodio cardiaco, definito sottoinsieme MGO.
In una forma preferita, detta misurazione avviene in acuto, in fase di decisione della ottimale strategia di riperfusione.
In una forma preferita, valori di MGO misurati nel sangue secco superiori a 0,200 ?g/ml sono classificati in detto sottoinsieme MGO.
In una forma preferita, si rivendica qui un metodo per la definizione di un approccio terapeutico in soggetti a seguito di episodio cardiovascolare che comprende:
- Misurare, in un fluido biologico ottenuto da un soggetto a seguito di un episodio cardiovascolare, i livelli di almeno un marcatore selezionato nel gruppo che comprende BAFF, MGO legato agli aminoacidi delle proteine;
- Laddove detto metodo comprende la creazione di almeno un sottoinsieme, detti sottoinsiemi essendo:
o Sottoinsieme definito BAFF, al quale vengono assegnati soggetti in cui i livelli di BAFF sono superiori a 0,300 ng/ml;
o Sottoinsieme definito MGO, al quale vengono assegnati soggetti in cui i livelli di MGO sono superiori a 0,200 ?g/ml; - Laddove detti uno o pi? sottoinsiemi sono sottoinsiemi propri o impropri;
- Laddove detti sottoinsiemi, se almeno due, sono sovrapposti oppure disgiunti;
- Detto sottoinsieme BAFF, corrisponde alla sottopopolazione idonea a trattamento con antiCD20;
- Detto sottoinsieme MGO, corrisponde alla sottopopolazione idonea a trattamento con antidiabetici.
In una forma preferita, detto fluido biologico ? sangue secco.
In una forma preferita, detta misurazione viene effettuata tramite saggio immunochimico, ad esempio mediante saggio immunoenzimatico (saggio ELISA) oppure mediante immunocromatografia, ad esempio per immunocromatografia su card (lateral flow), con lettura ottica o fluorimetrica. In un?ulteriore forma di realizzazione, detto metodo comprende la misurazione di ulteriori marcatori, cos? da ottenere ulteriori sottoinsiemi.
A titolo esemplificativo, l?esperto del settore conosce che la presenza di MRP4 ? indicativa di una mancata responsivit? al trattamento con salicilati (Floyd CN. Pharmacol Ther 2014;141:69-78). Pertanto, il metodo secondo la presente invenzione pu? altres? comprendere la misurazione di MRP4, comprendendo la creazione di un ulteriore sottoinsieme, sottoinsieme definito MRP4, al quale vengono assegnati soggetti in cui i livelli di MRP4 sono uguali a 0. Detto sottoinsieme comprende i soggetti responsivi a trattamento con salicilati.
L?esperto del settore conosce quindi il farmaco da somministrare a soggetti non appartenenti a detto sottoinsieme MRP4, ad esempio una molecola antagonista di MRP4 oppure anticoagulanti e/o antiaggreganti diversi dai salicilati.
Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo per la raccolta in remoto di un fluido biologico e la successiva analisi in laboratorio di almeno un analita contenuto in detto fluido, dove detto metodo, metodo sangue secco, comprende:
a) Mettere a disposizione un supporto per la raccolta di un fluido biologico, dove detto supporto ? in materiale sintetico;
b) Imbibire detto supporto con un fluido biologico di interesse;
c) Trasportare e/o conservare detto supporto fino al momento dell?analisi;
d) Eluire detto campione;
e) Analizzare il materiale eluito.
Le misurazioni effettuate su sangue secco sono misurazioni effettuate su materiale ottenuto come da metodica di cui sopra.
Gli esempi che seguono hanno il solo scopo di meglio illustrare l?invenzione, non sono da intendersi in alcun modo limitativi della stessa, la cui portata ? definita dalle rivendicazioni.
Esempio 1 _Definizione della coorte e ottenimento dei campioni di sangue Una coorte di 38 soggetti a seguito di infarto ? stata selezionata random, omogenea per etnia caucasica e con caratteristiche di et? e co-morbidit? rappresentative della popolazione a maggior rischio cardiovascolare.
Da detti soggetti, ? stato ottenuto un campione di sangue arterioso in corso di procedura di riperfusione. Detto sangue ? stato raccolto e conservato su tampone sintetico secondo la metodica sangue secco.
Esempio 2 sottoinsieme BAFF.
Sui campioni ottenuti e conservati come da esempio 1 sono stati misurati i valori di BAFF.
L?estrazione preanalitica da tampone sintetico di sangue secco avviene con il seguente protocollo: il tampone Copan 552C viene ricostituito con 150 ?l di PBS e agitato con vortex per 10 secondi. Il campione liquido viene trasferito in un nuovo tubo da 1,5 ml, centrifugato per 8 minuti a 3200 rpm alla temperatura di 4?C. Il supernatante viene trasferito in un nuovo tubo da 1,5 ml ed immediatamente congelato alla temperatura di -20?C. In seguito il campione viene scongelato a temperatura ambiente e caricato sulla specifica piastra ELISA, secondo le istruzioni del protocollo ELISA indicate dal produttore. I kit ELISA utilizzati si basano sulla metodologia a sandwich che prevede l'utilizzo di coppie di anticorpi mono e/o policlonali. In particolare, i livelli di BAFF sono state misurati con anticorpi specifici utilizzando il kit commerciale hBAFF ELISA R&D Systems (Minneapolis, USA).
I dati ottenuti, riportati in figura 1, mostrano in ordinate i valori ottenuti, espressi in ng/ml. I dati si distribuiscono tra i valori di 0.177 e 1.18 ng/ml. La mediana ? 0,375 ng/ml, il 25? percentile a 0,257 ng/ml ed il 75? a 0,491.
In detta coorte viene quindi identificato un sottoinsieme, definito sottoinsieme BAFF. In detto sottoinsieme ricadano i soggetti con valori di BAFF superiori a 0,300 ng/ml. Detto valore ? indicato dal tratteggio in figura 1.
Il 68% della coorte testata ricade in detto sottoinsieme.
Esempio 3 sottoinsieme MGO
Sui campioni ottenuti e conservati come da esempio 1 sono stati misurati i valori di MGO legato agli amminoacidi delle proteine. Al momento dell?analisi il campione ? stato eluito dal tampone sintetico, seguendo la procedura descritta per l?esempio 2.
MGO ? stato misurato con OxiSelect? Methylglyoxal Competitive ELISA Kit - un test immunoenzimatico sviluppato per l?individuazione e la quantizzazione degli addotti proteici di MGO-H1 (metil-gliossal-idro-imidazolone). Un anticorpo anti MGO riveste la superficie del pozzetto della piastra ELISA. I campioni contenenti gli addotti proteici di MGO o MGO-BSA standard vengono aggiunti alla piastra preassorbita del coniugato MGO. Dopo una breve incubazione, viene aggiunto un anticorpo anti MGO, seguito da un anticorpo secondario coniugato con HRP. Il contenuto degli addotti proteici di MGO nei campioni incogniti sono determinati confrontando le assorbanze relative ai campioni con quelle della curva standard di MGO-BSA a concentrazione nota.
I dati ottenuti, riportati in figura 2, mostrano in ordinate i valori ottenuti, espressi in ?g /ml. I dati si distribuiscono tra i valori 0,135 a 0,919 ?g/ml. La mediana ? 0,264, il 25? percentile a 0.217 ed il 75? a 0,369 ?g /ml.
In detta coorte viene quindi identificato un sottoinsieme, definito sottoinsieme MGO. In detto sottoinsieme ricadano i soggetti con valori di MGO superiori a 0,200 ?g /ml. Detto valore ? indicato dal tratteggio in figura 2.
L?81% della coorte testata ricade in detto sottoinsieme.
Claims (5)
1. Un metodo per la definizione di un approccio terapeutico in soggetti a seguito di episodio cardiovascolare, detto metodo comprendendo:
- mettere a disposizione un fluido biologico;
- misurare in detto fluido i livelli di almeno un marcatore selezionato nel gruppo che comprende BAFF, MGO legato agli aminoacidi delle proteine;
- laddove detto metodo comprende la creazione di almeno un sottoinsieme, detti sottoinsiemi essendo:
o Sottoinsieme definito BAFF, al quale vengono assegnati soggetti in cui i livelli di BAFF sono superiori a 0,300 ng/ml; o Sottoinsieme definito MGO, al quale vengono assegnati soggetti in cui i livelli di MGO sono superiori a 0,200 ?g /ml; - Laddove detti uno o pi? sottoinsiemi sono sottoinsiemi propri o impropri;
- Laddove detti sottoinsiemi, se almeno due, sono sovrapposti oppure disgiunti;
- Detto sottoinsieme BAFF, corrisponde alla sottopopolazione idonea a trattamento con antiCD20;
- Detto sottoinsieme MGO, corrisponde alla sottopopolazione idonea a trattamento con antidiabetici.
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1 che comprende altres? la misurazione di ulteriori marcatori, cos? da ottenere ulteriori sottoinsiemi.
3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, dove uno di detti ulteriori marcatori ? MRP4, a detto sottoinsieme MRP4 vengono assegnati soggetti in cui i livelli di MRP4 sono uguali a 0 e detto sottoinsieme MRP4 corrisponde alla sottopopolazione responsiva a trattamento con salicilati.
4. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, dove detto fluido biologico ? sangue arterioso, venoso o sangue secco.
5. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, dove detti livelli vengono misurati tramite saggio immunochimico, ad esempio mediante saggio immunoenzimatico (saggio ELISA) oppure mediante immunocromatografia, ad esempio per immunocromatografia su card (lateral flow), con lettura ottica o fluorimetrica.
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