TW201315479A - 可促進動脈新生之醫藥組成物、及其製備方法與應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種可促進動脈新生之醫藥組成物、及其製備方法與應用，其中前述醫藥組成物包含一有效量之藥物以及一胜肽水膠，且係用於形成一可吸引自體細胞進駐而進行組織再生的微環境。

Description

可促進動脈新生之醫藥組成物、及其製備方法與應用
本發明係關於一種可促進動脈新生之醫藥組成物、及其製備方法與應用。
心血管疾病是全世界先進國家排名第一的死因1，在台灣每年約有200萬名心臟疾病患者，有40萬人因心臟衰竭死亡，其中大多是冠狀動脈硬化栓塞造成不可逆的傷害如心肌壞死(myocardial loss)、病理性重構(pathological remodeling)、心功能障礙(cardiac dysfunction)及心衰竭2,3。
血管新生療法是一種極具潛力的治療方式，可用於組織修復及再生。然而，近年來使用蛋白傳遞(protein delivery)或基因療法來促進血管新生作用的臨床研究都無法產生治療效果。有效血管再生(revascularization)的關鍵在於微脈管系統(microvasculature)的持久性及動脈新生作用(arteriogenesis)。而血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管新生作用及血管生成作用(vasculogenesis)中都扮演重要角色4-6，因此，其於缺血性心臟病治療方面的應用相當受到矚目。目前的研究多將VEGF直接打入血管或心肌來促進血管新生作用。然而，VEGF會提升患者身上多種器官的血管滲漏性(vascular permeability)，造成蛋白滲漏(protein leakage)，引發全身性水腫及立即性低血壓，破壞組織，甚至致癌或使癌症轉移。目前的技術尚無法控制於心肌患部作局部釋放，故侷限了利用VEGF來進行心血管再生的發展性；因此，目前多數的以VEGF治療缺血性心臟病治療臨床研究結果都未能得到成功的結果。日前有研究指出，以VEGF治療的失敗原因可能來自(1)無法維持患部的VEGF有效濃度7-11，以及(2)微血管生成會因缺乏調控而在投藥後兩週內萎縮7,12-14。為避免這種情形，必須提供細胞外基質來吸引壁內細胞(mural cells)(例如周細胞(pericyte)或平滑肌細胞)，以包封或穩定脆弱的新生內皮管(endothelial tube)，進而使微血管穩定，持續進行血管新生作用12-15。
近來奈米科技及生物材料的發展已可能開發出活體外的仿生環境(biomimetic milieu in vitro)16-19。然而，如何活體內成功建立具有治療效果的組織微環境20-22，進而以接近自然的方式來刺激修復程序，則是再生醫學領域的重要課題。因此，若能創造出一個能夠保有VEGF療效又不致發生副作用、且能支持動脈新生作用的心肌內微環境，相信必定能夠提供一有效治療缺血性心臟病的新穎方式。
在此，發明人開發了一種結合胜肽奈米纖維水膠與血管內皮生長因子(VEGF)進行心肌內注射的新方法，能夠在心肌梗塞大鼠模型身上顯著地改善心肌梗塞後的血管新生作用(angiogenesis)、動脈新生作用及心臟功能。這個方法不但可使VEGF在心肌內控制釋出、延緩VEGF的藥效，同時又不會造成全身性的損害，進而創造出一個優良的心肌內微環境，使肌纖維母細胞及骨髓細胞等在此浸潤、成熟，更驚人的是，這個微環境還會進一步吸引類心肌細胞等進駐到注射部位，亦即會引發潛在的心肌再生作用。
本發明之目的係提供一種可促進動脈新生之醫藥組成物、及其製備方法與應用，其係將血管內皮生長因子(VEGF)與自組性胜肽奈米纖維(self-assembling peptide nanofibers，NFs)結合成一種可促進動脈新生之醫藥組成物，將之注射至心肌梗塞缺氧患部後，可達到局部、緩慢、漸進、低劑量的藥物釋放，增加心肌微血管密度與動脈新生，並促進潛在的心肌新生，又不會引起全身性水腫以及蛋白尿等副作用，極具臨床應用潛力。
為達上述目的，本發明提供一種自組性胜肽，其係由疏水性與親水性胺基酸交雜的重複序列，長度為12-200個胺基酸不等，較佳為12-32個胺基酸，特別是16個胺基酸。這些胜肽係為互補(彼此可形成離子鍵及氫鍵)且在結構上可相容(胜肽鏈彼此之間會保持一定的距離)，其實例如下：AcN-AKAKAEAEAKAKAEAE-NH2(SEQ ID NO: 1)；AcN-AKAEAKAEAKAEAKAE-NH2(SEQ ID NO: 2)；AcN-EAKAEAKAEAKAEAKA-NH2(SEQ ID NO: 3)；AcN-KAEAKAEAKAEAKAEA-NH2(SEQ ID NO: 4)；AcN-AEAKAEAKAEAKAEAK-NH2(SEQ ID NO: 5)；AcN-ADADARARADADARAR-NH2(SEQ ID NO: 6)；AcN-ARADARADARADARAD-NH2(SEQ ID NO: 7)；AcN-DARADARADARADARA-NH2(SEQ ID NO: 8)；AcN-RADARADARADARADA-NH2(SEQ ID NO: 9)；AcN-ADARADARADARADAR-NH2(SEQ ID NO: 10)；AcN-ARADAKAEARADAKAE-NH2(SEQ ID NO: 11)；AcN-AKAEARADAKAEARAD-NH2(SEQ ID NO: 12)；AcN-ARAKADAEARAKADAE-NH2(SEQ ID NO: 13)；AcN-AKARAEADAKARADAE-NH2(SEQ ID NO: 14)；AcN-AQAQAQAQAQAQAQAQ-NH2(SEQ ID NO: 15)；AcN-VQVQVQVQVQVQVQVQ-NH2(SEQ ID NO: 16)；AcN-YQYQYQYQYQYQYQYQ-NH2(SEQ ID NO: 17)；AcN-HQHQHQHQHQHQHQHQ-NH2(SEQ ID NO: 18)；AcN-ANANANANANANANAN-NH2(SEQ ID NO: 19)；AcN-VNVNVNVNVNVNVNVN-NH2(SEQ ID NO: 20)；AcN-YNYNYNYNYNYNYNYN-NH2(SEQ ID NO: 21)；AcN-HNHNHNHNHNHNHNHN-NH2(SEQ ID NO: 22)；AcN-ANAQANAQANAQANAQ-NH2(SEQ ID NO: 23)；AcN-AQANAQANAQANAQAN-NH2(SEQ ID NO: 24)；AcN-VNVQVNVQVNVQVNVQ-NH2(SEQ ID NO: 25)；AcN-VQVNVQVNVQVNVQVN-NH2(SEQ ID NO: 26)；AcN-YNYQYNYQYNYQYNYQ-NH2(SEQ ID NO: 27)；AcN-YQYNYQYNYQYNYQYN-NH2(SEQ ID NO: 28)；AcN-HNHQHNHQHNHQHNHQ-NH2(SEQ ID NO: 29)；AcN-HQHNHQHNHQHNHQHN-NH2(SEQ ID NO: 30)；AcN-AKAQADAKAQADAKAQAD-NH2(SEQ ID NO: 31)；AcN-VKVQVDVKVQVDVKVQVD-NH2(SEQ ID NO: 32)；AcN-YKYQYDYKYQYDYKYQYD-NH2(SEQ ID NO: 33)；AcN-HKHQHDHKHQHDHKHQHD-NH2(SEQ ID NO: 34)；AcN-RARADADARARADADA-NH2(SEQ ID NO: 35)；AcN-RADARGDARADARGDA-NH2(SEQ ID NO: 36)；AcN-RAEARAEARAEARAEA-NH2(SEQ ID NO: 37)；AcN-KADAKADAKADAKADA-NH2(SEQ ID NO: 38)；AcN-AEAEAHAHAEAEAHAH-NH2(SEQ ID NO: 39)；AcN-FEFEFKFKFEFEFKFK-NH2(SEQ ID NO: 40)；AcN-LELELKLKLELELKLK-NH2(SEQ ID NO: 41)；AcN-AEAEAKAKAEAEAKAK-NH2(SEQ ID NO: 42)；AcN-AEAEAEAEAKAK-NH2(SEQ ID NO: 43)；AcN-KAKAKAKAEAEAEAEA-NH2(SEQ ID NO: 44)；AcN-AEAEAEAEAKAKAKAK-NH2(SEQ ID NO: 45)；AcN-RARARARADADADADA-NH2(SEQ ID NO: 46)；AcN-ADADADADARARARAR-NH2(SEQ ID NO: 47)；AcN-DADADADARARARARA-NH2(SEQ ID NO: 48)；AcN-HEHEHKHKHEHEHKHK-NH2(SEQ ID NO: 49)；AcN-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE-NH2(SEQ ID NO: 50)；及AcN-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-NH2(SEQ ID NO: 51)；以上胜肽序列包含以2-16個胺基酸為單位之重複模組序列，相同的模組序列可再重複，而得出高達200個胺基酸的序列，其右端均不為-CNH2。
本發明提供一種可促進動脈新生之醫藥組成物，其包含：(1)一有效量之可促進動脈新生的藥物，其係選自下列各項所組成之群組：血管內皮生長因子(VEGF)、纖維組織母細胞生長因子(FGF)、白血球生長激素(GCSF)、粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)、血管生成素(angiopoietin)、表皮細胞生長因子(EGF)、神經生長因子(NGF)、轉化生長因子(TGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、類胰島素成長因子(IGF)、腦源神經營養因子(BDNF)、角化細胞生長因子(KGF)、骨形成蛋白(BMP)、紅血球生成激素(EPO)及胎盤生長因子(PIGF)；以及(2)一胜肽水膠，其包含一自組性胜肽，該自組性胜肽係選自如前文所述之自組性胜肽：其中前述醫藥組成物係用於形成一可吸引自體細胞進駐而進行組織再生的微環境。
在本發明之較佳實施態樣中，前述自組性胜肽係為AcN-RARADADARARADADA-NH2(SEQ ID NO: 35)，其可以下列結構式表示：
在本發明之較佳實施態樣中，前述胜肽水膠係作為承載前述藥物之載體使用。
在本發明之較佳實施態樣中，前述胜肽水膠係由前述自組性胜肽與一緩衝溶液組合而成。更佳者，前述胜肽水膠係含有0.1至10重量%之前述自組性胜肽；又更佳者，係含有0.5至5重量%之前述自組性胜肽；最佳者，係含有約1重量%之前述自組性胜肽。
在本發明之較佳實施態樣中，前述緩衝溶液係為水、食鹽水或含有胜肽奈米纖維自組裝所需元素之緩衝液；更佳為磷酸鹽緩衝溶液。
在本發明之較佳實施態樣中，前述藥物與前述胜肽水膠之間係為物理性結合。
在本發明之較佳實施態樣中，前述藥物為血管內皮生長因子(VEGF)；較佳者，係為VEGF121、VEGF145、VEGF165；最佳者，係為VEGF165。
在本發明之較佳實施態樣中，前述組織再生係為心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉之組織再生。
在本發明之較佳實施態樣中，前述醫藥組成物係用於心臟疾病的治療；較佳者，前述心臟疾病係包含心肌梗塞、心衰竭、缺血性疾病；更佳者，前述缺血性疾病為阻塞性周邊血管疾病。
在本發明之較佳實施態樣中，前述醫藥組成物係直接開胸、心導管、超音波導引注射至心肌來投藥，或其他注射於患部之方法。
在本發明之較佳實施態樣中，前述自體細胞係為肌纖維母細胞、骨髓細胞、類心肌細胞、前驅細胞及/或幹細胞；更佳者，前述前驅細胞係為血管前驅細胞、心肌前驅細胞，而前述幹細胞係為血管幹細胞、心肌幹細胞。
本發明另提供一種製備如前文所述之醫藥組成物的方法，其包含下列步驟：
(1)　將一自組性胜肽與一緩衝溶液配製為一胜肽水膠，其中該自組性胜肽係如前文所述之自組性胜肽；以及
(2)　將一有效量之可促進動脈新生的藥物與前述胜肽水膠混合，得出如前文所述之醫藥組成物，其中該可促進動脈新生的藥物係如前文所述之可促進動脈新生的藥物。
在本發明之較佳實施態樣中，前述方法之自組性胜肽係為AcN-RARADADARARADADA-NH2(SEQ ID NO: 35)；其可以下列結構式表示：
在本發明之較佳實施態樣中，前述方法之胜肽水膠係含有0.1至10重量%之前述自組性胜肽；又更佳者，係含有0.5至5重量%之前述自組性胜肽；最佳者，係含有約1重量%之前述自組性胜肽。
在本發明之較佳實施態樣中，前述方法之緩衝溶液係為水、食鹽水或含有胜肽奈米纖維自組裝所需元素之緩衝液；更佳為磷酸鹽緩衝溶液。
在本發明之較佳實施態樣中，前述方法之步驟(1)係藉由超音波震盪或其他可幫助水膠混合之方法來配製該胜肽水膠。
在本發明之較佳實施態樣中，前述方法之藥物係為血管內皮生長因子(VEGF)；較佳者，係為VEGF121、VEGF145、VEGF165；最佳者，係為VEGF165。
本發明又提供一種前文所述之醫藥組成物的用途，其係用於治療心臟疾病；更佳者，前述心臟疾病係包含心肌梗塞、心衰竭、缺血性疾病。
由上可知，本發明所提供之醫藥組成物能使VEGF在心肌內局部釋出，不會造成全身性血管滲漏增加的問題，大大降低了副作用；此外並可促進心肌血管新生作用，進而改善心肌在梗塞後的功能並縮小梗塞區域。而本發明所提供之製備方法則是以簡單的步驟製備出一種緩釋型醫藥可接受載體，可用以控制，VEGF在心肌內局部釋出。
本研究係首度利用自組裝胜肽奈米纖維(NFs)來作為心臟內控制型VEGF藥物釋放的載體。此外，並證實本發明之NFs/VEGF組合物可產生一個心肌內合適血管生長的微環境，並吸引內生性的肌纖維母細胞進駐，幫助梗塞後心肌微血管之血管新生及動脈再生作用。因此，本發明之NFs/VEGF組合物可增加梗塞後之心臟功能並減少梗塞面積，具有臨床應用的巨大潛力。
以下實施例係用於進一步了解本發明之優點，並非用於限制本發明之申請專利範圍。
實施例 實施例1，本發明之NFs/VEGF組合物的製備
在本發明之實施例中，係以SEQ ID NO: 35作為代表胜肽，其係由SynBioSci,Livermore,CA代為合成。
將SEQ ID NO: 35的自組性胜肽粉末以pH 7.4之磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline，PBS)配製成1重量%之胜肽溶液，之後以超音波功率100W震盪10分鐘，製成1重量%之胜肽水膠(peptide hydrogel)。
生物體內在合成血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的過程中，會因mRNA不同的剪切方式而分別產生VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等多種VEGF蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用於血管內皮細胞促進血管內皮細胞增殖，增加血管通透性。以下實施例所用的VEGF溶液係將VEGF165以pH 7.4之PBS配製成濃度為1000 ng/mL的VEGF165溶液，亦可使用其他形式的VEGF。
最後，將前述VEGF溶液與前述胜肽水膠以1：9體積比例加以混合。製得本發明之NFs/VEGF混合物，如第一圖所示，其包含自組性胜肽(1)及VEGF(3)。
實施例2，VEGF血管滲漏實驗
將約6週大實驗室等級的雄性SD大鼠(體重約為250g)分為4組(每組4隻以上)來進行VEGF血管滲漏實驗。
利用針筒，分別將80 μL之(a) pH 7.4之PBS(PBS組)、(b)實施例一之VEGF溶液(VEGF組)、(c)實施例一之1重量%之胜肽水膠(NFs組)或(d)實施例一之NFs/VEGF混合物(NFs/VEGF組)分6個點均勻注射於大鼠心臟(2)之可能梗塞受損區(21)中的注射位置(211)(參見第一圖的注射示意圖，其中第一圖的注射位置(211)係示意點，非實際注射點)。注射後45分鐘，再於大鼠頸靜脈打入150 μL螢光奈米粒子(Invitrogen)來評估血管滲漏情形，經過30分鐘循環之後，採集大鼠尿液樣本。之後進行全身性灌流，將大鼠血液中的螢光奈米粒子洗除後，採集腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等器官之冷凍切片樣本，以NanoDrop 2000(Thermo)進行血管滲漏分析。前述器官冷凍切片樣本先以螢光顯微鏡與影像分析軟體量化視野下之螢光強度，螢光強度越高，表示該器官的血管滲漏情形越嚴重。而後以控制組(PBS組)作為基準線(1倍)，計算出各組相對於控制組之螢光強度的相對倍數，結果如表1所示。以腦組織為例，其VEGF組的螢光強度即為控制組的約239倍。
尿液樣本則是以樣本內含的蛋白量來評估其血管滲漏情形，同樣是以控制組(PBS組)作為基準線(1倍)，並計算出各組相對於控制組之蛋白量的相對倍數。
由表1可知，當單獨心肌內注射VEGF(VEGF組)時，大鼠身上除了心臟以外之其他器官(腦、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟)相對於控制組(PBS組)有明顯的血管滲漏情形，可達控制組之6至240倍，且其尿液樣本中的蛋白濃度也是控制組的近2倍。而注射本發明之NFs/VEGF組成物(NFs/VEGF組)可顯著降低上述器官的血管滲漏情形，約可將VEGF所造成的血管滲漏情形抑制為控制組之1至5倍左右。
相反地，注射本發明之NFs/VEGF組成物(NFs/VEGF組)會增加大鼠心臟的血管滲漏程度，可達控制組之7倍，這代表NFs/VEGF組中VEGF作用於心臟的效益較其他器官來得高。易言之，本發明之NFs/VEGF組成物確實具有在目標器官心臟局部控制釋放VEGF的能力，顯示本發明之NFs/VEGF組成物的高安全性以及高效益性。
實施例3，心肌梗塞大鼠之VEGF心肌緩釋實驗
將約6週大的雄性SD大鼠(體重約為250g)分為下列7組，來進行VEGF心肌緩釋實驗：第1組係假手術(sham operation)組，其沒有結紮冠狀動脈即予以縫合(動物數n=8)；第2-4組係先進行中左半部冠狀動脈永久性結紮(以模擬心肌梗塞，MI)，接著立刻注射磷酸鹽緩衝液(PBS)、或100 ng/mL或1000 ng/mL溶於PBS之VEGF溶液(MI+PBS組、MI+V100組、MI+V1000組，動物數n8)；第5-7組係先進行中左半部冠狀動脈永久性結紮(以模擬心肌梗塞，MI)，接著立刻注射1重量%之胜肽水膠、或100 ng/mL或1000 ng/mL本發明之NFs/VEGF組成物(MI+NFs組，MI+NFs/V100組，MI+NFs/V1000組，動物數n8)，其係在大鼠梗塞受損區域中的6個注射位置進行注射，注射總量均為80 μL。
在模擬心肌梗塞並注射前述第1-7組溶液或組成物後，於術後1天及28天對實驗大鼠進行心臟超音波掃描(echocardiography)，係採用M模式(M-mode)來評估大鼠的左心室之收縮功能，並以左心室之射出率(ejection fraction，EF%)來作為評估指標，結果如表2所示。
於術後28天犧牲大鼠，取其心臟石蠟切片樣本，並測量其左心室壁之全週長與其梗塞區域之心室壁長度，之後以下列公式計算梗塞區域大小，結果如表2所示。梗塞區域越大，則表示心肌受損程度越大。
28天後，MI+V100組及MI+V1000組在心臟收縮功能方面相對於控制組(MI+PBS組)僅有輕微改善，而其梗塞區域大小相對於控制組(MI+PBS組)則無明顯差異。此外，由表2數據可知，僅注射VEGF並不足以改善心臟收縮功能或減少心肌細胞死亡。
同樣地，若僅注射本發明之胜肽水膠(MI+NFs組)，28天後的心臟功能亦未見改善；而在注射本發明之NFs/VEGF組成物後(MI+NFs/V100組及MI+NFs/V1000組)，即可有效改善心臟收縮功能，並減少心肌細胞死亡，縮小梗塞區域。
另外，以膠質纖維染色法(Trichrome staining)針對前述心臟冷凍切片的梗塞區域進行特異性染色，來測量各組在28天後的微血管及小動脈/動脈密度。其係以異凝集素(isolectin)之抗體針對心臟冷凍切片中的內皮細胞進行特異性染色(Invitrogen)，並以平滑肌22α(smooth muscle 22α，SM22α)之抗體針對心臟冷凍切片中的平滑肌細胞進行特異性染色(Abcam)，之後分別計算心臟冷凍切片中的梗塞區周圍之微血管密度及動脈密度，其中動脈直徑小於75 μm者為小動脈，動脈直徑大於75 μm者則為動脈。結果如表3所示。
在進行心肌梗塞實驗28天後，微血管密度在施打VEGF、NFs或本發明之NFs/VEGF組成物的組別相對於控制組(MI+PBS組)均有顯著改善；然而唯有注射本發明之NFs/VEGF組成物的組別(MI+NFs/V100組及MI+NFs/V1000組)才能有效改善小動脈新生，動脈新生的部分亦高於其他組別。
實施例4，本發明之載體NFs吸引肌纖維母細胞植入
接著，在NF/VEGF注射後進行下列研究，以探討動脈新生作用的機制。
使用與前述實施例相同品系的大鼠進行下列實驗。在引發MI後，即對大鼠心肌內注射PBS、V100、NFs或NF/V100，之後於MI後3、7或14天犧牲大鼠，並進行平滑肌α-肌動蛋白(α-actin，α-SMA+)抗體染色(Sigma-Aldrich)，結果如第二圖A所示。
在MI後3天時，所有組別之梗塞後的心肌都有平滑肌α-肌動蛋白(α-actin，α-SMA+)陽性之肌纖維母細胞群聚。在注射NFs(MI+NFs)或VEGF+NFs(MI+NFs/V100)後7天時，心肌中仍保有肌纖維母細胞，這表示這些肌纖維母細胞主要是因為NFs所建造的優良微環境而聚集，而不是因為VEGF的緣故。有趣的是，在MI後14天時，NF/VEGF組也會保留了更多可進行血管結合(vessel integration)的α-SMA+細胞，這表示肌纖維母細胞會分化成壁內細胞，而包封初生的微血管，這對動脈新生作用來說是必要的。而這項結果說明：功能性動脈新生作用會需要VEGF依變性血管新生作用及隨後因被NF吸引過來的壁內細胞，因此，本發明之NFs/VEGF組成物除了能夠促進動脈新生作用外，更能建立一個適合肌纖維母細胞植入的心肌內微環境。
之後進一步測試本發明之自組性胜肽NFs捕捉血液中骨髓細胞(BMC)的能力。BMC細胞是肌纖維母細胞的主要來源，且會被吸引至受傷的區域。以與前述實驗條件相同的大鼠進行下列實驗，在MI後7天心肌內注射PBS、V100、NFs或NF/V100時，同時對大鼠靜脈注射1×107個以DiI螢光染劑標示之異體(allogeneic)BMC細胞，並在BMC注射後1天犧牲大鼠，取得心臟後作石蠟切片與螢光免疫染色觀察，結果如第二圖B所示。
在注射NFs之大鼠的心肌中，會有較多的DiI+ BMC細胞。而心肌DiI+ BMC細胞的浸潤在NF/VEGF注射組又特別明顯，說明本發明之NF/VEGF注射能夠結合VEGF所提供的趨化性(chemotactic)或促進血管生成的效果與NF所提供適合留置血液中BMC細胞的微環境，而促成動脈新生作用。
實施例5，本發明之NFs/VEGF組成物會吸引類心肌細胞植入
另外，在MI後28天並注射NF/V100後，偵測經注射之心肌內的心肌鈣蛋白-I(cardiac troponin-I)陽性(cTnI+)細胞或推定已更新的類心肌細胞(putative renewed cardiomyocyte-like cell)。為確認這些類心肌細胞是衍生自非心肌之幹細胞/前驅細胞(non-myogenic stem/progenitor cells)、或僅心肌細胞的碎片，使用基因譜系示蹤(genetic fate-mapping)技術及心肌特異表達Mer-Cre-Mer之基因轉殖鼠與ZEG轉殖鼠雜交後得到的的Mer-Cre-Mer/ZEG小鼠進行實驗。透過泰莫西芬(Tomaxcifen)的誘導，可以特異地對心肌標定綠色螢光蛋白(GFP)；相反地，若是在標定後才由幹細胞衍生而來的心肌細胞則不會表達GFP。對Mer-Cre-Mer/ZEG小鼠引發MI後注射15 μl的PBS、V100、NFs或NF/V100，在MI後28天時，犧牲大鼠並取得心臟切片，進行cTnI之抗體染色，之後在螢光顯微鏡下觀察GFP(綠色)及cTnI(紅色)的螢光訊號。(GFP: Abcam、cTnI: DSHB)其中GFP為陰性且及cTnI為陽性的細胞即來自幹細胞/前驅細胞，結果如第三圖所示。
由圖中數據可知，NF/VEGF組所吸引到的GFP-/cTnI+類心肌細胞比其他組別更多。MI+NF/V100組也有一些GFP為陰性的成熟心肌細胞，但與對照組並無顯著差異。這項結果顯示，NF/VEGF組提供了一個可引發內源性心肌細胞再生的心肌內微環境。
由上可知，本發明之NFs/VEGF組成物可在心臟局部控制釋放VEGF，不會在其他器官造成血管滲漏，具有高安全性以及高效益性；此外，本發明之NFs/VEGF組成物可有效改善心臟收縮功能、減少心肌細胞死亡，縮小梗塞區域，同時能夠吸引肌纖維母細胞及類心肌細胞進駐梗塞區域，促進動脈新生作用，進而確實具有臨床潛力。
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1．．．自組性胜肽
2．．．心臟
21．．．梗塞受損區
211．．．注射位置
3．．．血管內皮生長因子
第一圖，本發明之NFs/VEGF組成物及注射位置示意圖。
第二圖，本發明之NFs/VEGF組成物會促進肌纖維母細胞衍生之壁內細胞及經DiI標示之外源性骨髓細胞在梗塞後再次長滿。(A)係顯示在MI後3、7或14天各組於周邊區域中的肌纖維母細胞(α-SMA+)。(B)係顯示各組於周邊區域中的骨髓細胞(DiI+)。
第三圖，本發明之NFs/VEGF組成物會在MI後28天增加類心肌細胞的數量(GFP-/cTnI+)。
1．．．自組性胜肽
2．．．心臟
21．．．梗塞受損區
211．．．注射位置
3．．．血管內皮生長因子

Claims (21)

  1. 一種可促進動脈新生之醫藥組成物，其包含：(1)　一有效量之可促進動脈新生的藥物，其係選自下列各項所組成之群組：血管內皮生長因子(VEGF)、纖維組織母細胞生長因子(FGF)、白血球生長激素(GCSF)、粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)、血管生成素(angiopoietin)、表皮細胞生長因子(EGF)、神經生長因子(NGF)、轉化生長因子(TGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、類胰島素成長因子(IGF)、腦源神經營養因子(BDNF)、角化細胞生長因子(KGF)、骨形成蛋白(BMP)、紅血球生成激素(EPO)及胎盤生長因子(PIGF)；以及(2)　一胜肽水膠，其包含一自組性胜肽，該自組性胜肽係選自下列各項所組成之群組：AcN-AKAKAEAEAKAKAEAE-NH2(SEQ ID NO: 1)；AcN-AKAEAKAEAKAEAKAE-NH2(SEQ ID NO: 2)；AcN-EAKAEAKAEAKAEAKA-NH2(SEQ ID NO: 3)；AcN-KAEAKAEAKAEAKAEA-NH2(SEQ ID NO: 4)；AcN-AEAKAEAKAEAKAEAK-NH2(SEQ ID NO: 5)；AcN-ADADARARADADARAR-NH2(SEQ ID NO: 6)；AcN-ARADARADARADARAD-NH2(SEQ ID NO: 7)；AcN-DARADARADARADARA-NH2(SEQ ID NO: 8)；AcN-RADARADARADARADA-NH2(SEQ ID NO: 9)；AcN-ADARADARADARADAR-NH2(SEQ ID NO: 10)；AcN-ARADAKAEARADAKAE-NH2(SEQ ID NO: 11)；AcN-AKAEARADAKAEARAD-NH2(SEQ ID NO: 12)；AcN-ARAKADAEARAKADAE-NH2(SEQ ID NO: 13)；AcN-AKARAEADAKARADAE-NH2(SEQ ID NO: 14)；AcN-AQAQAQAQAQAQAQAQ-NH2(SEQ ID NO: 15)；AcN-VQVQVQVQVQVQVQVQ-NH2(SEQ ID NO: 16)；AcN-YQYQYQYQYQYQYQYQ-NH2(SEQ ID NO: 17)；AcN-HQHQHQHQHQHQHQHQ-NH2(SEQ ID NO: 18)；AcN-ANANANANANANANAN-NH2(SEQ ID NO: 19)；AcN-VNVNVNVNVNVNVNVN-NH2(SEQ ID NO: 20)；AcN-YNYNYNYNYNYNYNYN-NH2(SEQ ID NO: 21)；AcN-HNHNHNHNHNHNHNHN-NH2(SEQ ID NO: 22)AcN-ANAQANAQANAQANAQ-NH2(SEQ ID NO: 23)；AcN-AQANAQANAQANAQAN-NH2(SEQ ID NO: 24)；AcN-VNVQVNVQVNVQVNVQ-NH2(SEQ ID NO: 25)；AcN-VQVNVQVNVQVNVQVN-NH2(SEQ ID NO: 26)；AcN-YNYQYNYQYNYQYNYQ-NH2(SEQ ID NO: 27)；AcN-YQYNYQYNYQYNYQYN-NH2(SEQ ID NO: 28)；AcN-HNHQHNHQHNHQHNHQ-NH2(SEQ ID NO: 29)；AcN-HQHNHQHNHQHNHQHN-NH2(SEQ ID NO: 30)；AcN-AKAQADAKAQADAKAQAD-NH2(SEQ ID NO: 31)；AcN-VKVQVDVKVQVDVKVQVD-NH2(SEQ ID NO: 32)；AcN-YKYQYDYKYQYDYKYQYD-NH2(SEQ ID NO: 33)；AcN-HKHQHDHKHQHDHKHQHD-NH2(SEQ ID NO: 34)；AcN-RARADADARARADADA-NH2(SEQ ID NO: 35)；AcN-RADARGDARADARGDA-NH2(SEQ ID NO: 36)；AcN-RAEARAEARAEARAEA-NH2(SEQ ID NO: 37)；AcN-KADAKADAKADAKADA-NH2(SEQ ID NO: 38)；AcN-AEAEAHAHAEAEAHAH-NH2(SEQ ID NO: 39)；AcN-FEFEFKFKFEFEFKFK-NH2(SEQ ID NO: 40)；AcN-LELELKLKLELELKLK-NH2(SEQ ID NO: 41)；AcN-AEAEAKAKAEAEAKAK-NH2(SEQ ID NO: 42)；AcN-AEAEAEAEAKAK-NH2(SEQ ID NO: 43)；AcN-KAKAKAKAEAEAEAEA-NH2(SEQ ID NO: 44)；AcN-AEAEAEAEAKAKAKAK-NH2(SEQ ID NO: 45)；AcN-RARARARADADADADA-NH2(SEQ ID NO: 46)；AcN-ADADADADARARARAR-NH2(SEQ ID NO: 47)；AcN-DADADADARARARARA-NH2(SEQ ID NO:48)；AcN-HEHEHKHKHEHEHKHK-NH2(SEQ ID NO: 49)；AcN-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE-NH2(SEQ ID NO: 50)；及AcN-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-NH2(SEQ ID NO: 51)；且前述序列之右端不為-CNH2；其中前述醫藥組成物係用於形成一可吸引自體細胞進駐而進行組織再生的微環境。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中前述自組性胜肽係為AcN-RARADADARARADADA-NH2(SEQ ID NO: 35)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中前述胜肽水膠係作為承載前述藥物之載體使用。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中前述胜肽水膠係由前述自組性胜肽與一緩衝溶液組合而成。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之醫藥組成物，其中前述胜肽水膠係含有0.1至10重量%之前述自組性胜肽。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之醫藥組成物，其中前述緩衝溶液係為水、食鹽水或含有胜肽奈米纖維自組裝所需元素之緩衝液，特別是磷酸鹽緩衝溶液。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中前述藥物與前述胜肽水膠之間係為物理性結合。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之醫藥組成物，其中前述藥物為血管內皮生長因子(VEGF)。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中前述組織再生係為心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉之組織再生。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，係用以治療心臟疾病。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其中前述心臟疾病係包含心肌梗塞、心衰竭、缺血性疾病。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其係直接開胸、心導管、超音波導引注射至心肌來投藥，或其他注射於患部之方法。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中前述自體細胞係為肌纖維母細胞、骨髓細胞、類心肌細胞、前驅細胞及/或幹細胞。
  14. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物的方法，其包含下列步驟：(1)　將一自組性胜肽與一緩衝溶液配製為一胜肽水膠，其中該自組性胜肽係如申請專利範圍第1項所述之自組性胜肽；以及(2)　一有效量之可促進動脈新生的藥物與前述胜肽水膠混合，得出如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該可促進動脈新生的藥物係如申請專利範圍第1項所述之可促進動脈新生的藥物。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述自組性胜肽係為AcN-RARADADARARADADA-NH2(SEQ ID NO: 35)。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述胜肽水膠係含有0.1至10重量%之前述自組性胜肽。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述緩衝溶液係為水、食鹽水或含有胜肽奈米纖維自組裝所需元素之緩衝液。
  18. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述步驟(1)係藉由超音波震盪或其他可幫助水膠混合之方法來配製該胜肽水膠。
  19. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述藥物係為血管內皮生長因子(VEGF)。
  20. 一種如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物的用途，其係用於治療心臟疾病。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之用途，其中前述心臟疾病係包含心肌梗塞、心衰竭、缺血性疾病。
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