ES2263382B1 - Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogenicos. - Google Patents
Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogenicos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2263382B1 ES2263382B1 ES200501182A ES200501182A ES2263382B1 ES 2263382 B1 ES2263382 B1 ES 2263382B1 ES 200501182 A ES200501182 A ES 200501182A ES 200501182 A ES200501182 A ES 200501182A ES 2263382 B1 ES2263382 B1 ES 2263382B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- matrix
- fibrin
- endothelial cells
- endothelized
- flap
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 title claims abstract description 95
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims abstract description 81
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 81
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims abstract description 81
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 49
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 27
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 23
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 23
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 23
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 14
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 5
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims description 4
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 3
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 4
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 abstract description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 101150104383 ALOX5AP gene Proteins 0.000 description 56
- 101100236114 Mus musculus Lrrfip1 gene Proteins 0.000 description 56
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 28
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 10
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 9
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 6
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 5
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 5
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 2
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].[NH2+]1C=CN=C1 JDIIGWSSTNUWGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100008049 Caenorhabditis elegans cut-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000009521 Vascular Endothelial Growth Factor B Human genes 0.000 description 1
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 1
- 244000105017 Vicia sativa Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003260 anti-sepsis Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 101150071577 chi2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005356 container glass Substances 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000009297 electrocoagulation Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010062198 microangiopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 230000006884 regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229940063122 sandimmune Drugs 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002341 stratified epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- AWLILQARPMWUHA-UHFFFAOYSA-M thiopental sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC([S-])=NC1=O AWLILQARPMWUHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000006384 traumatic process Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/10—Hair or skin implants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/225—Fibrin; Fibrinogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3808—Endothelial cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/60—Materials for use in artificial skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/75—Fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/56—Fibrin; Thrombin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogénicos. La matriz comprende un gel de fibrina en el que se encuentran embebidas células endoteliales que han sido transfectadas in vitro con al menos un vector adenoviral que contiene la secuencia codificante de al menos un factor proangiogénico insertada de manera que puede sobreexpresarse en dichas células endoteliales. La inserción de dicha matriz entre un colgajo y su lecho receptor en un proceso de trasplante mejora las posibilidades de supervivencia de dicho colgajo, por ser capaz la matriz endotelizada de inducir la angiogénesis tanto en el colgajo como en el lecho receptor y mejorar así la vascularización de la zona transplantada.
Description
Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada
superproductora de factores proangiogénicos.
La presente invención se adscribe al campo de
las matrices artificiales preparadas a partir de sustancias
poliméricas presentes en la naturaleza, en las que se siembran y
hacen crecer células, para su posterior utilización en
intervenciones de cirugía plástica y reparadora.
En los últimos años, el desarrollo de las
técnicas microquirúrgicas, complementadas con mejores conocimientos
de anatomía, ha supuesto uno de los grandes avances de los que se
ha beneficiado la Cirugía Plástica y Reparadora. A pesar de ello,
cuando se realizan reconstrucciones con colgajos existe un riesgo
variable de necrosis de los mismos, en muchos casos por alteraciones
de la vascularización. Los colgajos son tejidos propios
(constituidos por piel, músculos, huesos o una combinación de los
mismos) que pueden ser aportados a zonas de la anatomía en las que,
por procesos oncológicos o traumáticos entre otros, se ha producido
un defecto que precisa ser reconstruido. Resulta necesario utilizar
colgajos cuando las pérdidas de sustancia cutánea o de tejido
subcutáneo no son suturables o no pueden cicatrizar
espontáneamente. El objetivo del colgajo es cerrar una pérdida de
sustancia o reconstruir una estructura amputada. Un colgajo cutáneo
es un segmento de piel y de tejido celular subcutáneo que conserva
una vascularización autónoma a través del pedículo, con el que
permanece en contacto con las estructuras profundas. El pedículo del
colgajo es el puente cutáneo que irriga directamente el mismo; a
veces es reducido y puede estar representado por una arteria y una o
dos venas. El colgajo se denomina local cuando el tejido que lo
forma se obtiene de un zona cercana al defecto que se quiere
reparar, denominándose colgajo a distancia cuando los tejidos se
obtienen de zonas alejadas del defecto. En este último caso, el
colgajo tiene una arteria y una vena que han de ser anastomosadas a
otra vena y arteria, respectivamente, de la zona anatómica donde va
a ser ubicado.
Los fenómenos trombóticos, tanto en el
territorio venoso como en el arterial, e incluso en la
microvasculatura, son los mayores problemas a los que hay que
enfrentarse a la hora de realizar una reconstrucción con colgajos,
siendo su índice de aparición mayor en los colgajos a distancia,
porque dependen de microsuturas de vasos de unos 2 mm a 5 mm de
diámetro. En estos casos el pedículo ha de ser trasladado de su
lugar de origen, y tiene que ser resuturado a unos vasos localizados
cerca de la zona que se quiere reconstruir, lo cual aumenta la
morbilidad del proceso. Por ello, se han buscado diversos métodos
para disminuir el índice de trombosis. Existen trabajos clínicos y
de investigación con fármacos que reducen el potencial
trombogénico, como son los antiagregantes plaquetarios, los
anticoagulantes o los agentes trombolíticos.
La angiogénesis es la formación de nuevos
capilares a partir de otros ya existentes. Se trata de un proceso
complejo, que puede activarse en respuesta a un daño tisular. Los
factores implicados en su estimulación reciben el nombre de
factores proangiogénicos; juegan un papel clave en el proceso de
cicatrización de una herida, orquestando de forma decisiva la fase
de neovascularización dérmica. De ellos, una parte parecen ser
factores de crecimiento que tienen la capacidad de estimular in
vivo la proliferación y migración de las células que intervienen
en la formación de los capilares sanguíneos y en su estabilización.
En el terreno de la práctica clínica en cirugía reparadora, los
factores de crecimiento tienen un papel destacado a la hora de
promover también la cicatrización en estados deficitarios o
complicados, como ocurre en pacientes diabéticos, oncológicos,
malnutridos o que han sufrido graves traumatidos, en los que el
estrés conlleva la falta de todos los factores que influyen en la
cicatrización y, además, suele aumentar el índice de trombosis
tanto por su mal estado general como por las medicaciones, el
encamamiento prolongado... En los pacientes diabéticos en
particular, se produce tanto una neuropatía, que altera la función
de los vasos sanguíneos, como una microangiopatía, que obstruye los
capilares sanguíneos, traduciéndose esto en un déficit de perfusión
tisular que conduce a una destrucción del tejido que se nutre por
esos vasos, por lo que la aportación local de factores que aceleren
la incorporación de, por ejemplo, un colgajo al lecho donde va a
ser transplantado ayudaría a aumentar los nexos vasculares entre
lecho y colgajo y a aumentar un ello el índice de supervivencia.
También es importante el papel de los factores de crecimiento en la
regeneración tisular, como, por ejemplo, cuando se trabaja con
colgajos prefabricados.
Entre los factores de crecimiento que parecen
estar implicados en la regulación de la angiogénesis pueden citarse
factores de crecimiento derivados de fibroblastos (FGF), de
plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante alfa
(TFG-alfa) y el factor de crecimiento de hepatocitos
(HGF). Además, se ha sugerido que un factor de crecimiento
específico de células endoteliales, el factor de crecimiento del
endotelio vascular (VEGF) es responsable de la estimulación del
crecimiento y la diferenciación de las células endoteliales, y de
ciertas funciones de las células diferenciadas.
La existencia del FGF (Fibrobast growth
factor) fue establecida por Gospodarowicz en 1974, en el
cerebro y en la pituitaria. Hoy se sabe que los FGF representan un
grupo de proteínas similares que actúan como potentes mitógenos
para algunas células mesodérmicas y ectodérmicas.
Los fibroblastos son las células más frecuentes
del tejido conectivo y son las células de adherencia que juegan un
papel importante en la ayuda del proceso de cicatrización. La
estabilización del colágeno en la cicatrización está promovida por
la introducción del FGF en el lecho de las heridas, lo cual parece
ayudar en la viabilidad de los vasos sanguíneos y promover la
actividad de los fibroblastos.
El efecto angiogénico del FGF también ha sido
puesto en evidencia en otros estudios. Lu y sus colaboradores (Lu
WW et al., Br J Plast Surg, 53: 225-229,
2000) observaron que en heridas tratadas con FGF hay menos isquemia
y menos alteraciones en la distribución del colágeno, lo cual
contribuye a una mayor capacidad de soportar tensiones y a una
mayor elasticidad de los tejidos.
Se conocen las funciones y las estructuras de
los FGF ácido y básico. El FGF básico se localiza en el cerebro,
hipófisis, retina, riñones, cuerpo lúteo, placenta, próstata,
células adrenales y macrófagos. El FGF ácido se localiza en el
cerebro y en la retina. Ambos estimulan la migración y la
proliferación de las células endoteliales. Hay estudios que ponen
de manifiesto la capacidad angiogénica y la mejoría en la
viabilidad de los colgajos tratados con FGF, tanto si el mismo se
inyecta subcutáneamente (Im MJ et al., Ann Plast Surg, 28:
242-245, 1992) como si se aplica de forma repetida
mediante pellets de liberación retardada (Less VC et al., Br
J Plast Surg 47: 349-359, 1994). En los melanomas
es capaz de producir angiogénesis junto a otros factores de
crecimiento (Rofstad EK et al, Cancer Res, 60:
4719-4724, 2000) y parece que podría activar la
supervivencia y la ramificación de las arterias miocárdicas
(Carmeliet P, Cir Res, 87: 176.178, 2000).
El VEGF, por su parte, fue descrito inicialmente
como una proteína secretada por células tumorales, que incrementaba
la permeabilidad de los vasos locales a las macromoléculas
circulantes. Es producido por distintas células del cuerpo, entre
ellas las células endoteliales, sobre las cuales actúa
específicamente. Las acciones directas del VEGF son numerosas e
incluyen, entre otras, un aumento de la permeabilidad de las células
endoteliales. En comparación con la histamina, el VEGF es 50.000
veces más potente en cuanto a la permeabilidad vascular se refiere.
La administración tópica del VEGF produce fenestraciones en el
endotelio de los microvasos y capilares (Roberts WG et al.,
J Cell Sci, 108: 2369-2379, 1995).
Durante el proceso de cicatrización, la
producción de VEGF a partir de los queratinocitos está
incrementada. Esto ocurre también en las células mononucleares de
la región donde se está produciendo la cicatrización (Tabú PJ et
al, Plas Reconst Surg, 105: 1034-1041, 2000).
En condiciones fisiológicas, su producción se induce por la
disminución de la tensión tisular de oxígeno. La vida media del VEGF
en condiciones normales es de 30 a 45 minutos, pero en condiciones
de hipoxia su producción se prolonga durante 6-8
horas, dependiendo su nivel de producción del tejido que esté
sometido a isquemia y de la extensión de tejido afectado. Su
producción puede estar aumentada también en diversas patologías
(Akagi K et al., Br J Can, 83: 887-891,
2000; Philipp W et al., Invest Ophtalmol Vis Sci, 41:
2514-2522, 2000).
En territorios isquémicos, las células
endoteliales son capaces, en respuesta a VEGF (liberado
inicialmente por células inflamatorias), de sintetizar más VEGF, así
como de aumentar la densidad de receptores para este factor en sus
membranas. De esta manera, en una situación de emergencia como es
una isquemia, las células endoteliales se comportan a la vez como
productoras y dianas de VEGF, generando así una respuesta en cadena
y amplificada al factor.
En cirugía plástica se han realizado distintos
experimentos con el VEGF, con el fin de mejorar la perfusión
tisular. Padubiri y sus colaboradores (Padubiri A et al.,
Ann Plast Surg, 37: 604-611, 1996) inyectaron VEGF
(como proteína recombinante) en el pedículo de un colgajo abdominal
y produjeron posteriormente una isquemia del mismo. Tras 7 días,
los sujetos tratados con VEGF presentaban una supervivencia de los
colgajos superior a los no tratados. De forma similar, Banbury y
sus colaboradores (Banbury J et al., Plast Reconstr Surg,
106: 1541-1546, 2000) demostraron que era posible
mejorar la perfusión de colgajos musculares (músculo cremáster, en
ratas) sometidos a isquemia, cuando en la fase subcritica se
realizaba un tratamiento de los mismos con una perfusión de
VEGF.
VEGF.
Se han realizado también trabajos en los que se
intenta buscar la mejor vía de aplicación de los factores de
crecimiento. El equipo de Kryger (Kryger Z et al., Br J Plast
Surg, 53: 234-239, 2000) diseñó un trabajo en ratas,
con el fin de comparar distintas vías del aplicación del VEGF en
colgajos. Diseñaron seis grupos de tratamiento, que se distinguían
por ser tratados de la siguiente manera: una única dosis sistémica
VEGF, múltiples dosis por vía sistémica, subcutánea, subfascial,
tópica y un último grupo control, tratado con suero salino. Los
mejores resultados se obtuvieron con el grupo tratado con múltiples
dosis de VEGF por vía sistémica, a lo largo de 72 horas. El peor
resultado se obtuvo con el grupo tratado con VEGF de forma tópica.
También se ha empleado VEGF en colgajos prefabricados. Este factor
parece acelerar la maduración de estos colgajos cuando se aplica en
ratas mediante un gel de alcohol de polivinilo (Li QF et
al., J Reconst Microsurg, 16: 45-50, 2000).
Aunque los resultados son prometedores, el uso
de factores de crecimiento como proteínas recombinantes tiene una
clara limitación, que es su corta vida media in vivo. Si
bien los factores de crecimiento se necesitan sólo de forma
transitoria, hasta la resolución del defecto, es fundamental para
obtener un efecto terapéutico que durante dicho período la
biodisponibilidad del factor esté asegurada. Una de las estrategias
empleadas para vencer este obstáculo ha sido recurrir a dosis
repetidas del factor en un lapso acotado (Kryger Z et al., Br
J Plast Surg, 53: 234-239, 2000). Una alternativa
probablemente mucho más eficaz sería aplicar el factor de
crecimiento no como proteína, sino como un gen que se exprese de
forma sostenida hasta que culmine el proceso.
Para ello, la introducción de las técnicas de
terapia génica en el terreno de la cirugía reparadora y en la
cicatrización de las heridas es de gran utilidad. Aunque las
técnicas para la aplicación de la terapia génica son diversas y
avanzan rápidamente, fundamentalmente se emplean vectores virales y
complejos liposómicos o plásmidos (Patterson C et al.,
Circulation, 102: 940-942, 2000). Entre los virus
con los que se está trabajando para utilizarlos en terapia génica
se encuentran los adenovirus. Estos forman parte de un grupo de
virus similares, de los que se conocen 47 serotipos. Los serotipos
2 y 5 son los más utilizados en terapia génica. Se trata de virus
ADN de doble cadena, con cápside icosaédrica. En su ciclo, el
genoma viral reside en el núcleo, como un elemento episomal. Tienen
la capacidad de infectar a una amplia variedad de células.
Según Oligino (Oligino TJ et al. Clin
Orth, 379S: S17-30, 2000), la eficiencia de la
infección de los adenovirus es alta, en comparación con los
lentinivirus o los virus adenoasociados, aunque es menor que la de
los virus herpes. Los adenovirus no se integran en el genoma de las
células transducidas y la duración de la expresión del transgén es
transitoria, aunque muy alta. La producción a gran escala es
relativamente fácil. Adenovirus portadores del gen de VEGF se han
utilizado para tratar pacientes con isquemia de extremidades
(Laitinen M et al., Hum Gene Ther, 9:
1481-86, 1998; Isner JM et al., Lancet, 348:
370-374, 1996), con una tolerancia buena por parte
de los pacientes y sin inflamación local ni efectos adversos. La vía
de aplicación fue intraarterial, aunque la presencia de barreras
anatómicas, como la lámina interna o la arteriosclerosis suelen
reducir su eficacia. La producción de los factores de crecimiento
con esta técnica alcanza generalmente un pico a la semana de
tratamiento y el efecto suele desaparecer a las cuatro semanas
(Ylä-Hettuala S, Curr Opin Lipidol, 8: 72-76,
1997).
Otra estrategia para utilizar los adenovirus
como vectores para suministrar material genético a células
promotoras de la angiogénesis se describe en el documento WO
02/36131, en el que se promueve la transfección de dos vectores
adenovirales, que contienen cada uno de ellos una forma diferente
del VEFG (VEGF-B_{167} y VEGF-A),
mediante su inyección en orejas de ratones. Como en los casos de
utilización de adenovirus portadores de VEGF mencionados en el
párrafo anterior, la transfección se produce in vivo, por lo
que la acción promotora de la angiogénesis, aunque se supone en
células endoteliales, es realmente inespecífica; se realizan
inyecciones de los adenovirus en los vasos sanguíneos de la zona a
tratar, por lo que se puede producir una diseminación sistémica,
con posibles efectos adversos; además, aunque se produce una
síntesis de VEGF elevada en las primeras horas (24- 48 horas), el
efecto no es mantenido, para lo cual se requerirían inoculaciones
repetidas de los adenovirus a lo largo de varios días, con la
consiguiente incomodidad para el hipotético paciente.
Sería importante disponer de un método de
administración de factores angiogénicos codificados por virus
portadores en el que la transfección se produjera in vitro,
con lo que se conseguiría que dicha transfección fuera específica
para células endoteliales y se evitaría la inyección de los virus en
los vasos sanguíneos. Además, sería muy conveniente que ese método
permitiera que la liberación del VEGF (u otro factor proangiogénico)
se mantuviera a lo largo de días con una única inoculación de los
vectores virales, posibilitando que el factor proangiogénico
estuviera disponible en cantidades suficiente durante todo el
período de tiempo que se necesitara promover la angiogénesis, pero
sin requerir incómodas dosis repetidas de dicho vector. Para ello,
las matrices de geles de fibrina en las que se hacen crecer células
representan un vehículo muy adecuado. La fibrina proporciona, una
buena base para el crecimiento de las células tanto dérmicas como
epidérmicas, por lo que esta proteína ha sido bastante utilizada
como soporte sobre el cual cultivar queratinocitos (Ronfard et
al. Burns 17:181-184, 1991). Como la fibrina no
interfiere con el posterior desarrollo de la correcta unión
dermo/epidérmica entre el lecho de una herida y los queratinocitos
cultivados, ha sido ampliamente utilizada como sistema de
transporte para los mencionados queratinocitos con el objeto de
reparar lesiones cutáneas (Pellegrini et al.,
Transplantation 68: 868-879, 1999; Kaiser y Stark,
Burns 20: 23-29, 1994).
La fibrina ha sido utilizada también como base
dérmica destinada a la producción de grandes superficies de piel
cultivada (Meana et al., Burns 24: 621-630,
1998). En el interior de los geles de fibrina, los fibroblastos
sembrados son capaces de crecer. Al mismo tiempo, estos
fibroblastos se comportan como inductores del crecimiento de los
queratinocitos, de forma que, sembrando fibroblastos y un número
muy limitado de queratinocitos cultivados sobre un gel de fibrina,
se obtienen en pocos días epitelios confluentes estratificados muy
similares a los epitelios humanos normales (Patente española
ES2132027). Tal como se describe en la solicitud de patente europea
EP1375647, el resultado puede mejorarse utilizando plasma humano
como base fundamental de la matriz extracelular, que incluye en su
composición plaquetas, resuspendiendo en el mismo fibroblastos
dérmicos para obtener una dermis artificial tras la coagulación del
plasma, dermis sobre la cual se siembran queratinocitos que se
adhieren, migran y crecen de forma que, en unos días, se obtiene un
tejido constituido por dos partes, una superior, constituida por
células epiteliales estratificadas, y una inferior, constituida por
una matriz extracelular densamente poblada de fibro-
blastos.
blastos.
Con el fin de utilizar análogos de piel
similares a los anteriormente descritos en procesos de trasplante
en los que se intenta reemplazar con dichos análogos secciones de
piel dañadas, se ha probado con distintas estrategias en las que se
intenta incrementar la presencia de sustancias que intervienen en la
angiogénesis con el propósito de mejorar las posibilidades de éxito
del trasplante de piel artificial. Así, por ejemplo, se ha descrito
la introducción en dermis artificiales de microesferas recubiertas
del factor de crecimiento FGF (Kawai K et al., Biomaterials
21: 489-499, 2000) o la inducción de la producción
de proteínas recombinantes implicadas en la angiogénesis mediante
la modificación genética de queratinocitos con vectores
retrovirales portadores de genes de, por ejemplo, la hormona leptina
(WO 03/002154), VEGF (Supp et al., J Invest Dermatol 114:
5-13, 2000; Del Río M et al., Gene Therapy
6: 1734-1741, 1999) o FGF (Erdag G et al.,
Molecular Therapy, 10: 76-85, 2004) o mediante la
modificación genética de fibroblastos con vectores portadores de
genes que expresan TGF (WO 02/030443) u otros factores angiogénicos
(WO 03/095630). Sin embargo, no hay descritos casos en los que la
modificación de células incluidas o crecidas sobre una matriz de
fibrina se haya producido con adenovirus ni casos en los que las
células modificadas genéticamente y que se hacen crecer en una
matriz de fibrina sean células endoteliales. Lo más próximo a este
último caso sería la estrategia descrita en el documento US5674722,
en el que se describe la transfección de células endoteliales para
que sinteticen alguna proteína sin especificar, utilizando como
vectores, no adenovirus, sino retrovirus; la finalidad descrita
para las células transfectadas, además, no es su cultivo en una
matriz de fibrina, sino recubrir con ella un material sintético al
que se le ha dado forma de vaso sanguíneo. Salvo en este último
caso, en todos los demás trabajos citados el propósito final de la
matriz con células generada es la obtención de un análogo de piel
que sea trasplantado como tal a pacientes con lesiones, sin
describir en ningún caso su inserción conjuntamente con un colgajo
obtenido directamente de la anatomía del paciente a tratar.
La presente invención, sin embargo, propone una
estrategia distinta: el desarrollo de puentes vascularizados
constituidos por matrices de geles de fibrina invadidas por células
endoteliales, superproductoras de factores proangiogénicos por
haber sido transfectadas in vitro con vectores adenovirales
que contienen genes que los codifican, con el propósito de que la
matriz de fibrina que contiene células endoteliales actúe como un
puente que se insertaría entre colgajos de cualquier composición
(piel, músculos, huesos o una combinación de los mismos) y la parte
anatómica necesitada de reconstrucción, para facilitar el éxito del
proceso de implante. Gracias a la utilización de dicha matriz
endotelizada como puente vascularizado, se acelera la incorporación
del colgajo cutáneo, muscular u óseo al lecho receptor, por
aumentar la angiogénesis tanto en los tejidos trasplantados, como
en el propio lecho receptor, ventaja esta última que es
especialmente importante en sujetos diabéticos, malnutridos, que
han sufrido graves traumatismos o que han sido tratados con
radioterapia (por ejemplo, mujeres mastectomizadas, con tratamiento
de radioterapia, que van a ser reconstruidas con un colgajo libre
musculocutáneo); sujetos en los que los índices de fallos en los
colgajos suele ser mayor, porque los tejidos están peor irrigados,
tal como se explicó anteriormente, siendo de especial importancia
en estos casos un medio como la matriz de fibrina endotelizada de la
invención que facilite la formación de puentes vasculares entre un
colgajo y el lecho receptor. Al colocar entre el colgajo y el lecho
radiado la matriz del gel de fibrina con las células endoteliales,
la angiogénesis producida por el gel afectaría a ambos por igual y
se establecerían puentes vasculares entre los dos tejidos en las
primeras horas tras la intervención. Además, el efecto angiogénico
es un efecto local y más específico que el obtenido al realizar
inyecciones en los vasos sanguíneos de adenovirus portadores de
genes codificantes de factores de crecimiento, evitando el riesgo
de diseminaciones sistémicas, por haberse realizado la transfección
específicamente de células endoteliales con los vectores
adenovirales in vitro, previamente a la obtención y
colocación del puente vascularizado. La liberación del factor de
crecimiento, por otro lado, se mantiene a lo largo de días, y no son
necesarias repeticiones de dosis, lo cual resulta más cómodo para el
paciente. Además, a diferencia de lo que sucedería si los vectores
utilizados derivaran de retrovirus, la utilización de vectores
adenovirales elimina el riesgo de que, conjuntamente con los
retrovirus inactivados generados para actuar como portadores de las
secuencias codificantes de interés, se empaquete material genético
de retrovirus sin inactivar y, por tanto, con potencial para
integrarse en la célula hospedadora de forma estable interrumpiendo
genes de interés o cuya interrupción podría dar lugar a un proceso
oncogénico.
La invención se refiere a una matriz
endotelizada destinada a ser utilizada como puente vascularizado,
compuesta por un gel de fibrina, que mantiene en su interior
células endoteliales capaces de sintetizar VEGF y/o FGF en
condiciones en las que no estaría inducida su síntesis en
condiciones normales, por haber sido transfectadas in vitro
con vectores adenovirales portadores de genes que codifican dichas
proteínas. Gracias a esos genes transfectados, estas células
endoteliales expresarán cantidades de VEGF superiores a las que se
producirían en el proceso angiogénico normal que se desarrollaría
en un individuo receptor de un colgajo en un proceso normal de
trasplante, por lo que han sido calificadas como
"superproductoras" de factores angiogénicos en la presente
memoria.
El objeto de su desarrollo es recrear en el
laboratorio, de un modo altamente eficiente, una situación similar
a la que ocurre in vivo en un territorio isquémico, pues
dicha matriz invadida por células endoteliales mimetizaría las
primeras etapas de migración y proliferación que ocurren in
vivo en una zona isquémica. Una vez obtenida, el objetivo final
de la matriz endotelizada en su inserción como elemento intermedio
entre un colgajo utilizado en un proceso de reconstrucción y el
lecho receptor que lo recibe, de forma que, tras el trasplante, la
matriz insertada a modo de puente vascularizado actúe en el
individuo receptor como un fuerte inductor de la angiogénesis. Para
aumentar el rendimiento del sistema, las células endoteliales,
antes de ser ensambladas en la matriz, se convierten en
superproductoras de factores proangiogénicos (VEGF y/o FGF)
mediante un protocolo de transferencia génica con vectores
adenovirales portadores de su secuencia codificante y elementos de
control que permiten su expresión en células endoteliales. La
matriz empleada, un gel de fibrina, se comportan como un soporte
óptimo tanto para la proliferación y la migración celular como para
la producción de los factores.
Este sistema, que conjuga la introducción de
células endoteliales en la matriz con la producción in situ
sostenida (pero por un tiempo acotado) de factores proangiogénicos,
representa una clara ventaja frente a la administración tópica o
sistémica de factores de crecimiento como proteínas recombinantes o
la inyección de vectores adenovirales que contienen genes que
codifican dichas proteínas recombinantes con el propósito de lograr
un proceso de transfección in vivo.
También es un objeto de la presente invención un
método para la producción de dicha matriz de fibrina endotelizada
superproductora de al menos un factor proangiogénico por haber sido
parte o la totalidad de sus células endoteliales transfectada in
vitro con uno o más vectores adenovirales que comprenden en su
secuencia al menos un gen correspondiente a un factor
proangiogénico, que comprende las etapas de:
- a)
- obtener células endoteliales individualizadas tras haber sido aisladas de un mamífero y cultivadas in vitro;
- b)
- transfectar in vitro parte o la totalidad de dichas células endoteliales con uno o más vectores adenovirales distintos que comprenden en su secuencia al menos un gen correspondiente a un factor proangiogénico insertado de tal forma que el gen es capaz de expresarse en células endoteliales;
- c)
- mezclar el medio que contiene las células endoteliales transfectadas en la etapa anterior con una solución que contenga fibrinógeno y provocar la gelificación del fibrinógeno por formación de fibrina;
- d)
- dejar reposar la mezcla de la etapa anterior en un recipiente adecuado para que se produzca la formación de la matriz de gel de fibrina en la que hayan quedado embebidas las células endoteliales transfectadas con los vectores adenovirales.
Es igualmente objeto de la invención el utilizar
la matriz endotelizada superproductora de factores proangiogénicos
como puente vascularizado a insertar entre un colgajo y un lecho
receptor del mismo, para mejorar la supervivencia de dicho
colgajo.
En una realización preferida de la invención, la
matriz de fibrina endotelizada superproductora de factores
angiogénicos se diseñaría con el propósito de que el individuo
receptor para el que está prevista fuera un ser humano.
En una realización de la invención, el individuo
del que proceden tanto las células endoteliales como el fibrinógeno
a partir del cual se origina la fibrina es el mismo que aquel que
está previsto como individuo receptor de la matriz endotelizada,
siendo la matriz totalmente autóloga.
En otra realización de la invención, la matriz
no es autóloga, siendo posibles individuos diferentes al previsto
como receptor de la matriz como donantes de las células
endoteliales y/o del fibrinógeno. Incluso los individuos donante y
receptor pueden llegar a pertenecer a especies distintas.
La Figura 1 presenta una representación
esquemática de un colgajo disecado. (1): colgajo; (2): lecho
avascular; (3): arteria; (4): vena.
La Figura 2 presenta una representación
esquemática de la forma en la que se colocarían el colgajo (1) y la
matriz endotelizada (5) que actuaría como puente vascularizado con
respecto al lecho receptor (2). Se representan de nuevo en el
colgajo una arteria (3) y una vena (4).
La Figura 3 es una fotografía en la que se
muestra el diseño del colgajo, en la cara dorsal de la oreja de un
conejo y con el eje centrado en los vasos caudales intermedios. La
matriz endotelizada se está distribuyendo sobre el cartílago situado
bajo el colgajo.
La Figura 4 muestra tinciones inmunohistoquímica
de CD32 en sujetos tratados (parte a) y sujetos control (b) a 500
aumentos.
La Figura 5 muestra una fotografía de vasos de
un individuo receptor de un colgajo, tratado con la matriz de gel
de fibrina endotelizada de la invención, con una reacción positiva
respecto al VEGF en sus células endoteliales.
La presente invención, por tanto, proporciona
una matriz de fibrina que mantiene en su interior células
endoteliales transfectadas con vectores adenovirales y
superproductoras por ello de VEGF y/o FGF, matriz que se prepara con
la finalidad de ser utilizada como puente vascularizado de conexión
entre el lecho receptor y un colgajo.
Las células endoteliales se han extraído
previamente de venas periféricas de un individuo de la misma
especie, que puede ser el propio sujeto a tratar, y se cultivan y
modifican genéticamente para finalmente embeberlas en una matriz de
gel de fibrina obtenido a partir de plasma, habitualmente también
del propio paciente. La modificación genética de las células
endoteliales se produce con adenovirus portadores de los genes VEGF
y/o FGF, de tal manera que in vivo se comportan como
biorreactores de dichos factores sólo por un tiempo limitado,
mientras sobrevivan en el gel de fibrina dichas células
transfectadas con el vector derivado de adenovirus. Esta matriz
endotelizada y superproductora de factores proangiogénicos tiene la
misión de actuar como puente vascularizado para inducir el
desarrollo de un plexo vascular funcional entre el colgajo y el
lecho receptor, con el fin de acelerar la adaptación entre ambos.
La matriz de gel de fibrina proporciona el ambiente adecuado para
que en ella se generen y acumulen los factores de crecimiento.
Las ventajas de la utilización como puente
vascularizado de una matriz endotelizada compuesta por una matriz
de gel de fibrina en la que están embebidas células endoteliales
que son superproductoras de factores proangiogénicos por haber sido
transfectadas in vitro con vectores adenovirales que
contienen genes que codifican dichos factores proangiogénicos son
las siguientes:
- -
- La matriz de gel de fibrina permite el crecimiento y migración de células endoteliales en su interior. Dentro de esta matriz, las células endoteliales modificadas genéticamente son capaces, in vitro, de secretar factores de crecimiento proangiogénicos (VEGF y FGF) y de organizarse formando microcapilares antes de ser trasplantadas.
- -
- Después del trasplante de este puente vascularizado, colocado entre el lecho receptor y el colgajo, los factores de crecimiento producidos por las células modificadas genéticamente son capaces de inducir además la proliferación y migración de neovasos tanto en el lecho receptor como en el propio colgajo. Las células endoteliales de la matriz vascularizada actuarían como puente entre ambos, acabando muchas de ellas por ser incluidas como parte del estroma vascular que unirá el tejido trasplantado al lecho receptor, lo que, en su conjunto, incrementa las posibilidades de éxito en la reconexión del colgajo.
- -
- El aumento de la angiogénesis en los tejidos trasplantados permite la aceleración de la incorporación al lecho receptor de un colgajo cutáneo, muscular, óseo o de combinaciones de estos tejidos.
- -
- La utilización de esta matriz endotelizada a modo de puente vascularizado es de gran utilidad no sólo para la atenuación de fenómenos trombóticos que puedan poner en peligro la supervivencia de los colgajos, sino también para el tratamiento de colgajos que tuvieran que ser utilizados para reconstruir zonas tratadas con radioterapia, colgajos en pacientes diabéticos o fumadores (que suelen presentar problemas micro y/o macrovasculares) e incluso para elaborar colgajos prefabricados.
- -
- El hecho de que la modificación genética de las células endoteliales se produzca mediante una transfección in vitro, previa al trasplante de la matriz, asegura que la incorporación del material genético se produce específicamente en las células que se desea y supone una clara ventaja respecto a la inyección de vectores virales in vivo, porque disminuye el riesgo de diseminaciones sistémicas, permite un efecto de liberación de factores de crecimiento mantenido durante días y no requiere repeticiones de dosis.
- -
- La utilización de adenovirus como vectores portadores supone también una ventaja respecto al uso de retrovirus, pues se elimina el riesgo de un posible empaquetamiento conjuntamente con los vectores inactivados de material genético con potencial oncogénico y su posible integración en la célula hospedadora de forma estable e interrumpiendo otros genes.
- -
- La posibilidad de que todos los componentes de la matriz endotelizada sean de origen autólogo permite que, en esos casos, la inserción de la matriz a modo de puente endotelizado y del correspondiente colgajo pueda realizarse sin ser necesaria la inmunosupresión de los sujetos tratados.
- -
- Por otro lado, la flexiblidad dentro del método de obtención de la matriz endotelizada permite que tanto el suero utilizado para formar el gel de fibrina como las células endotelizadas que son transfectadas y embebidas en la matriz puedan proceder de un individuo diferente a aquel al que se le va a insertar el colgajo. Incluso la especie de la cual procede el fibrinógeno origen de la matriz de fibrina puede ser diferente. Esto abre la posibilidad de que las matrices estén preparadas de antemano cuando se necesiten con urgencia, aunque en estos casos si sería recomendable proceder a la inmunosupresión de los sujetos en los que se coloque la matriz endotelizada a modo de puente vascularizado.
Para conseguir esto, es necesario producir
células endoteliales, transfectadas in vitro con un vector
adenoviral que permite la expresión de VEGF y/o FGF. Dichas células
endoteliales se extraen del sistema nervioso periférico,
preferiblemente de la vena safena, del donante. Si se desea que la
matriz endotelizada sea totalmente autóloga, el donante tendrá que
ser el propio individuo que necesita el colgajo. Los vasos
extraídos son enviados en un frasco de transporte con DMEM y
solución antiséptica al laboratorio para su cultivo y preparación,
utilizando, por ejemplo, el método descrito por Del Río et
al., Br J Pharmacol, 120:1360-1366, 1997.
Siguiendo este método, las células endoteliales son cultivadas en
un medio adecuado, como puede ser medio modificado de
Dulbecco:Ham's F 12 (1:1) que contiene FCS al 10% suplementado con
glutamax I, 100 UI/ml de penicilina G, 100 \mug/ml de
estreptomicina y 0,25 \mug/ml de amfotericina B.
La transferencia genética in vitro se
realiza con cultivos confluyentes mediante incubación con el/los
vectores adenovíricos que portan los genes que codifican los
factores de crecimiento (VEGF, FGF) en un medio pobre en suero.
Después de dos lavados con PBS, las células son incubadas en un
medio de cultivo adecuado, como puede ser Dulbecco:Ham's F 12
(1:1), durante un tiempo conveniente que, en el caso de seres
humanos, sería de aproximadamente 24 horas. Posteriormente, para
obtener las células individuales que van a formar parte de la matriz
endotelizada, se las trata con tripsina/EDTA.
Para preparar la matriz endotelizada, puede
utilizarse el método descrito previamente en la solicitud de
patente internacional WO 02/072800. En él, se parte de plasma, con
plaquetas y fibroblastos, que gelifica mediante la adición de
Ca^{2+}. A diferencia del caso del documento citado, en la
presente invención no se resuspenden fibroblastos en la matriz de
fibrina, ni se siembran en ella queratinocitos, sino que el tipo
celular que se resuspende en la matriz son las células endoteliales
cuya obtención se describe en el párrafo anterior, que están
modificadas genéticamente. De esta manera, la matriz de gel de
fibrina de la presente invención no actúa sólo como soporte
celular, sino que sirve también como vehículo de factores
terapéuticos producidos por las células.
La matriz de fibrina se puede obtener también a
partir de su precursor sanguíneo, el fibrinógeno, de
crioprecipitados de plasma. Los crioprecipitados se obtienen de
acuerdo con los estándares de la Asociación Americana de Bancos de
Sangre (Walker RH (ed) Technical Manual, American Association of
Blood Banks, Bethesda, MD; 1993; pags.
728-730).
El individuo del que se extrae el plasma puede o
no ser aquel en el que se va a insertar el colgajo y, con él, la
matriz endotelizada superproductora de factores proangiogénicos. Se
prefiere que el individuo sea el mismo si se quiere evitar la
necesidad de someter al receptor del colgajo a un tratamiento
inmunosupresor. En caso de no ser este un factor primordial, el
plasma puede proceder no sólo de un individuo distinto, sino
también de una especie diferente. Así, la fuente de fibrinógeno
pueden ser, por ejemplo, crioprecipitados de plasma porcino.
En cualquiera de los casos, para producir el gel
de fibrina, a la solución con fibrinógeno se le añade DMEM que
contiene FCS al 1% y las células endoteliales ya transfectadas.
Posteriormente se induce la gelificación mediante la adición de
CaCl_{2} y trombina. Finalmente, se vierte la mezcla sobre una
placa de cultivo u otro recipiente adecuado y se deja solidificar a
la temperatura adecuada, que será de 37ºC para el caso de geles de
fibrina procedentes de seres humanos. El gel formado se cubre con
medio de cultivo adecuado, (por ejemplo, Dulbecco: Ham's F 12 (1:1)
y se trasplanta entre 24-48 horas después sobre el
lecho receptor del colgajo, para que actúe como puente
vascularizado entre ambos. Una vez colocado el colgajo sobre la
matriz endotelizada, se suturan los bordes del mismo al propio
lecho, de manera que la matriz endotelizada quede homogéneamente
distribuida entre
ambos.
ambos.
Tal como se describe con más detalle a
continuación en el correspondiente ejemplo, los experimentos
quirúrgicos realizados en animales, concretamente en conejos,
verifican la validez del método y su utilidad para aumentar la
supervivencia de colgajos insertados. Además, el análisis
estadístico reveló que la densidad capilar y la expresión de VEGF
fueron significativamente mejores en los sujetos tratados al
realizar un análisis estadístico.
Las células endoteliales utilizadas para quedar
albergadas en la matriz de fibrina fueron células endoteliales de
aorta de conejo albino neozelandés. El cultivo de las mismas se
efectuó tras hacer una extracción de la arteria aorta de estos
conejos en condiciones estériles y dentro de un medio de cultivo
(DMEM al 5%, con antibiótico y antifúngico). Las células fueron
cultivadas en un medio modificado de Dulbecco: Ham's F 12 (1:1),
que contiene FCS al 10%, suplementado con glutamax I, 100 UI/ml de
penicilina G, 100 \mug/ml de estreptomicina y 0.25 \mug/ml de
amfotericina B.
En el estudio se utilizaron células que había
sido sometidas como máximo a tres pases durante su cultivo. La
transferencia genética in vitro se realizó en cultivos
confluentes, mediante incubación durante 3 horas a 37ºC con un
vector adenovírico del grupo C, que incluía un gen del VEGF A165,
capaz de expresarse en células endoteliales en un medio pobre en
suero. Después de dos lavados con PBS, las células fueron incubadas
en un medio de crecimiento durante 24 horas y posteriormente
tratadas con tripsina/EDTA, para obtener células individuales.
Los geles de fibrina que contenían las células
transfectadas se prepararon según el protocolo para geles de
fibrina-fibroblastos descrito en la solicitud de
patente internacional WO 02/072800, con modificaciones. En primer
lugar, como recurso para obtener la fibrina se utilizó fibrinógeno
de crioprecipitados de plasma porcino. Los crioprecipitados fueron
obtenidos de acuerdo a los estándares de la Asociación Americana de
bancos de sangre. Para producir el gel de fibrina, 3 ml de la
solución de fibrinógeno se añadieron a 12 ml de DMEM al 10% FCS, con
5 x 10^{5} células endoteliales transfectadas. Posteriormente se
añadió 1 ml de Cl_{2}Ca (0,025 mM, Sigma) con 11 UI de trombina
bovina (Sigma). Finalmente, se vertió la mezcla en un recipiente de
cultivo de 75 cm^{2} y se dejó que solidificara a 37ºC. El gel se
cubrió con medio de cultivo para ser utilizado a las 24 horas,
manteniéndolo durante ese intervalo de tiempo en un frigorífico a
4ºC.
Los animales en los que se insertaron colgajos
fueron también conejos albinos neozelandeses, aunque no se
utilizaron aquellos individuos de los que se habían obtenido las
células endoteliales. Tanto por esta razón, como por la utilización
de plasma porcino como fuente de fibrina, fue necesario provocar
inmunosupresión en los sujetos tratados, que en este caso se llevó
a cabo con Sandimmune® (Novartis Pharmaceuticals), mediante una
dosis intraperitoneal el día previo a la intervención, de 25 mg/kg.
Esta dosis fue repetida a diario en todos los sujetos del estudio,
hasta el día del sacrificio.
En cuanto a la obtención de los colgajos, se
diseñaron colgajos axiales de la región dorsal de la oreja de cada
conejo, basándose en la rama intermedia de la arteria y vena
auricular caudal. El borde proximal de cada colgajo quedó situado
unos 4 cm distal a la confluencia de la vena intermedia caudal
auricular con la propia vena caudal de la oreja. En condiciones de
asepsia y antisepsia, se infiltraron los bordes con anestésico
local y se realizó una incisión de los bordes con bisturí,
procurando no seccionar el pedículo vascular. En el borde distal del
colgajo, tras aislar los vasos centrales, se efectuó una
electrocoagulación de los mismos. Con ayuda de unas tijeras romas,
se separó el colgajo del tejido cartilaginoso, respetando las
inserciones de los vasos centrales al pericondrio. Posteriormente,
con la ayuda de bisturí, se levantó todo el colgajo en dirección
proximal. Con una incisión con bisturí, se accedió a los vasos del
colgajo axial en la zona proximal, hasta la confluencia de la vena
intermedia caudal con la propia vena caudal. En ese momento se
procedió a coagular la vena caudal, para evitar que hubiera alguna
interferencia de este vaso con el vaso axial del colgajo. Se
efectuó acto seguido la despericondrización del cartílago en la
zona expuesta. Con la ayuda de gafas lupa e instrumental
microquirúrgico, se aislaron los vasos sanguíneos y se seccionaron
los filetes nerviosos que acompañan a los vasos centrales, porque
éstos poseen pequeños vasos acompañantes, que podrían nutrir por sí
solos al propio colgajo.
La matriz de fibrina endotelizada se manipuló en
una campana de flujo laminar, para despegarlo del recipiente de
cristal que lo contenía, con la ayuda de una espátula.
Posteriormente se cubrió la cápsula con papel estéril y se
transportó al quirófano para su colocación sobre el cartílago
desprovisto de pericondrio. Se procuró que la distribución de la
matriz fuese lo más homogénea posible. Sobre ella se colocó el
colgajo. Con la ayuda de una sutura de seda (4/0), se procedió a
suturar los bordes del mismo y la incisión realizada para exponer
los vasos. Un ejemplo de disposición final se muestra en la Figura
3.
Una vez operados, los animales fueron devueltos
a sus jaulas.
El último tiempo quirúrgico consistió en
seccionar los vasos del colgajo axial. Para ello, se realizó de
nuevo el mismo procedimiento anestésico, aunque en este caso, la
infiltración con lidocaína al 2% se practicaba a 1/2 cm del borde
proximal del colgajo. Con un bisturí se hizo una incisión sobre la
propia cicatriz quirúrgica y con la ayuda de un clamp de
microcirugía se cortó el flujo arterial y venoso. A continuación,
se seccionaron y ligaron los vasos. En los grupos I (control) y II
(tratados con la matriz productora de VEGF), este procedimiento se
llevó a cabo a los 5 días de la fecha de levantamiento del colgajo.
En los grupos III (control) y IV (tratados con la matriz productora
de VEGF), la sección se efectuaba a las 48 horas de realizarse la
cirugía inicial.
Una vez devueltos los animales a sus jaulas tras
la primera intervención, se procedió a realizar una evaluación
diaria de cada sujeto, anotando datos sobre del color de los
colgajos y su consistencia al tacto.
Transcurridos 4 días tras realizarse la sección
de los vasos, se tomaron fotografías de los mismos y, a los 6 días,
se procedió a sacrificar a los animales con una sobredosis de
pentotal sódico, por vía endovenosa.
En ese momento se extrajeron los colgajos y se
introdujeron en recipientes con formol tamponado al 10%. A las 48
horas, se seleccionaron tres porciones de cada colgajo, de las
zonas proximal, medial y distal respectivamente, orientadas de
forma que los vasos centrales ocupasen el centro de la pieza
histológica, y se incluyeron en parafina.
La superficie del colgajo que era viable se
evaluó por planimetría, expresando los valores obtenidos en cifras
porcentuales. Dicha planimetría se efectuó el día anterior al
sacrificio del animal.
De los bloques de parafina se realizaron cortes
de 3-4 \mum, que se montaron en portaobjetos
silanizados, con carga positiva superficial y gap capilaridad de 75
\mum (ProbeOn^{TM} Plus Slides. Catálogo nº
15-188-52. Fischer Biotech^{c} y
ChemMate^{TM} Capillary Gap Plus Slides. Código S2024. DAKO A/S
Biotek Solutions). Taras desparafinización e hidratación, los cortes
se lavaron en tampón Tris salino (TBS) (Tris-HCl
0,05 M; NaCl 0,5 M; pH 7,36). La actividad peroxidasa endógena se
bloqueó mediante peróxido de hidrógeno al 3% en alcohol metílico
durante 30 minutos.
Con la intención de exponer el mayor número de
epítopos posibles, desplegando las proteínas por desnaturalización,
las secciones se sometieron a un pretratamiento con calor en horno
microondas a 750 watios, sumergidos en tampón citrato (ácido
cítrico 0,01 M, pH 7), durante cuatro períodos de cinco minutos,
dejando enfriar posteriormente a temperatura ambiente.
El bloque de la tinción inespecífica de fondo se
realizó mediante la incubación en suero normal de cabra
no-inmune (código NGS-1, Universidad
de Navarra, Pamplona), diluido a 1:20, durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
Los cortes se incubaron con los anticuerpos
anti-CD31 (anticuerpo monoclonal de ratón anti
CD31. Código M 0823. DAKO) con una dilución 1/100, y anti VEGF
(VEGF(C-1): SC-7269. Santa
Cruz Biotechnology, Inc). La proteína CD31 es específica de las
membranas de las células endoteliales; por tanto, las tinciones que
permitan detectar aquellos lugares a los que se unan los anticuerpos
anti-CD31 muestran la visualización de las paredes
de vasos sanguíneos y, por tanto, la presencia de éstos.
Tras lavar en TBS (Tris-HCL 0,05
M; NaCl 0,5 M; pH 7,36) se incubó durante 30 minutos a temperatura
ambiente, con el producto EnVision^{TM}, peroxidasa (DAKO
EnVision^{TM}. Código Nº: K4003 anti-conejo;
Código Nº: K4001 anti-ratón) prediluido.
Después de un lavado final en TBS
(Tris-HCl 0,05 M; NaCl 0,5 M; pH 7,36), el producto
de la reacción de la peroxidasa se visualizó utilizando una solución
de 3,3'-diaminobencidina (DAB) preparada
comercialmente en una solución cromógena, con un tampón de
imidazol-HCl a pH 7,5 y peróxido de hidrógeno
(DAKO^{c} Liquid DAB+Large Volume
Substrate-Chromogen Solution. Código Nº: K3468),
incubándolo durante cinco a treinta minutos, a temperatura ambiente
y prediluido.
Un patólogo se encargó de realizar la valoración
de las preparaciones histológicas que estaban teñidas con
hematoxilina-eosina y tinciones de
inmunohistoquímica (CD31 y VEGF).
En las tinciones de CD31, se efectuó un recuento
de vasos, a 500 aumentos, en 6 campos distintos y se expresó el
valor medio de los mismos. Se descartaron aquellas zonas en las que
había un foco inflamatorio y se valoraron las zonas en las que no
había una distorsión del tejido subcutáneo entre los propios anejos
cutáneos y el cartílago. La Figura 4 muestra ejemplos de estas
tinciones inmunohistoquímicas de CD31 en sujetos tratados (a) y
sujetos control (b). Los resultados de los recuentos se muestran
posteriormente en la Tabla 1, que corroboran que se da una mayor
formación de vasos sanguíneos en los sujetos tratados con la matriz
de la invención con respecto a los sujetos de los grupos controles.
Los parámetros estadísticos relacionados se muestran en las Tablas
2 y 3.
En cuanto al VEGF, se consideraron como
positivos aquellos vasos en los que se teñía el citoplasma de las
células endoteliales. El recuento se hizo dándole un valor numérico
al total de vasos que se teñían con el anticuerpo en cada
preparación. Un ejemplo de tinción de vasos con una reacción
positiva respecto al VEGF en células endoteliales de un individuo
tratado con la matriz de gel de fibrina endotelizada de la
invención se muestra en la Figura 5, donde la aparición de células
teñidas demuestra la presencia de VEGF y, por tanto, que está siendo
efectivamente sintetizado. Los resultados de los recuentos de
células endoteliales teñidas se muestran posteriormente en la Tabla
1. Los parámetros estadísticos relacionados aparecen en las Tablas
2 y 3.
La Tabla 1 presentada a continuación indica los
datos de las medias y desviaciones estándar correspondientes a los
datos de supervivencia, tinciones de CD31 y tinciones de VEGF.
Media/Desviación estándar | ||||
Supervivencia | CD31 | VEGF | ||
(%) | Vasos/campo* | Células | ||
500 | endoteliales/corte | |||
Sección a los 5 Días | Grupo I (control) | 51,25/45,88 | 5,56/3,18 | 0,87/1,12 |
Grupo II (tratamiento) | 95,62/4,95 | 13,20/4,54 | 5,62/3,73 | |
Sección a las 48 Horas | Grupo III (Control) | 2,50/7,07 | 2,34/4,56 | 0,37/1,06 |
Grupo IV (tratamiento) | 55,62/38,95 | 5,56/3,18 | 3,06/2,95 |
A continuación, en las Tablas 2 y 3, se indican
los datos correspondientes a los parámetros estadísticos
relacionados con los resultados anteriores, concretamente los
relativos al análisis de Kruskal Wallis (Tabla 2) y al de U Mann
Whitney (Tabla 3).
El análisis de la varianza (ANOVA) es una
técnica de análisis de datos para examinar la significación de los
factores (variables independientes) en un modelo multifactorial. El
modelo unifactorial puede ser obtenido desde una generalización de
un test de dos muestras. Es decir, un test de dos muestras es aquel
que parte desde la hipótesis de que las medias de dos poblaciones
son equitativas. El test de ANOVA valora la hipótesis que defiende
que las medias de un número "x" de poblaciones son iguales.
El test de Kruskal Wallis puede ser utilizado
como ANOVA. Se trata de un test no paramétrico que se emplea cuando
las condiciones para asumir el test de ANOVA no pueden ser
aplicadas, por tanto, para contrastar la hipótesis de que un número
de muestras de diferente tamaño tienen origen en la misma
población. En resumen, el test de Kruskal-Wallis es
un método no paramétrico para evaluar la hipótesis de que varias
poblaciones tienen la misma distribución continua versus la
alternativa de que los resultados tienden a ser distintos en una o
más de las poblaciones.
Kruskal Wallis | Supervivencia | CD31 | VEGF |
\chi^{2} | 15,50 | 17,11 | 16,38 |
p | 0,001 | 0,001 | 0,001 |
En el caso de la Tabla 3, la prueba de la
"U" de Mann-Whitney es una prueba estadística
no paramétrica que se usa cuando la muestra es pequeña o la
distribución de los datos en la población es libre (los datos no
proceden de poblaciones normales y con igualdad de varianzas). Esta
prueba contrasta si dos muestras de dos subpoblaciones tienen la
misma distribución. Las observaciones de ambos grupos se combinan y
clasifican con respecto al rango promedio asignado en caso de
producirse empates. Si la posición de las poblaciones es idéntica,
deberán mezclarse aleatoriamente los rangos en ambas muestras.
Por tanto, según estos datos, en los sujetos
tratados se encontró una supervivencia de los colgajos cercana al
50% a pesar de prescindir del pedículo a las 48 horas de ser
intervenidos (Grupo IV), hecho que facilita que el colgajo se
necrose, porque el flujo sanguíneo del colgajo depende del
pedículo. La supervivencia aumentaba hasta el 95% si se realizaba
la sección del pedículo a los 5 días (protocolo A). En los sujetos
no tratados, la supervivencia no llegaba al 3% tras seccionar el
pedículo a las 48 horas.
Los resultados que reflejan la densidad capilar
y la expresión de VEGF fueron también significativamente mejores en
los sujetos tratados.
Claims (35)
1. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada en cuyo interior se encuentran embebidas células
endoteliales que, en parte o en su totalidad, han sido transfectadas
in vitro con uno o más vectores adenovirales que comprenden
en su secuencia al menos un gen correspondiente a un factor
proangiogénico capaz de superexpresarse en dichas células
endoteliales transfectadas.
2. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según la reivindicación 1, en la que las células endoteliales
proceden del sistema venoso de un mamífero.
3. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según la reivindicación 2, en la que las células endoteliales
proceden concretamente de la vena safena.
4. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según la reivindicación 1, en la que las células endoteliales
proceden del sistema arterial de un mamífero.
5. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según la reivindicación 4, en la que las células endoteliales
proceden concretamente de la arteria aorta.
6. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gel de
fibrina se ha formado a partir de fibrinógeno presente en plasma
sanguíneo de un mamífero.
7. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gel de
fibrina se ha formado a partir de fibrinógeno de crioprecipitados de
plasma de un mamífero.
8. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que al menos
un vector adenoviral utilizado para transfectar las células
endoteliales comprende en su secuencia nucleotídica la secuencia
codificante del factor de crecimiento VEGF capaz de superexpresarse
en dichas células endoteliales.
9. Una matriz artificial de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que al menos
un vector adenoviral utilizado para transfectar las células
endoteliales comprende en su secuencia nucleotídica la secuencia
codificante del factor de crecimiento FGF capaz de expresarse en
dichas células endoteliales.
10. Un método para obtener una matriz artificial
de gel de fibrina endotelizada superproductora de al menos un
factor proangiogénico, caracterizado porque comprende las
etapas de:
- a)
- obtener células endoteliales individualizadas tras haber sido aisladas de un mamífero y cultivadas in vitro;
- b)
- transfectar in vitro parte o la totalidad de dichas células endoteliales con uno a más vectores adenovirales distintos que comprenden en su secuencia al menos un gen correspondiente a un factor proangiogénico capaz de sobreexpresarse en dichas células endoteliales;
- c)
- mezclar el medio que contiene las células endoteliales transfectadas en la etapa anterior con una solución que contenga fibrinógeno y provocar la gelificación del fibrinógeno por formación de fibrina;
- d)
- dejar reposar la mezcla de la etapa anterior en un recipiente adecuado para que se produzca la formación de la matriz de gel de fibrina en la que hayan quedado embebidas las células endoteliales transfectadas con los vectores adenovirales.
11. Un método para obtener una matriz artificial
de gel de fibrina endotelizada superproducta de al menos un factor
proangiogénico según la reivindicación 10, en el que la
gelificación del fibrinógeno por formación de fibrina se provoca
mediante la adición de CaCl_{2} y trombina.
12. Un método para obtener una matriz de gel de
fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor
proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11, en
el que las células endoteliales proceden del sistema venoso de un
mamífero.
13. Un método para obtener una matriz de gel de
fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor
proan-
giogénico según la reivindicación 12, en el que las células endoteliales proceden concretamente de la vena safena.
giogénico según la reivindicación 12, en el que las células endoteliales proceden concretamente de la vena safena.
14. Un método para obtener una matriz de gel de
fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor
proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11, en
el que las células endoteliales proceden del sistema arterial de un
mamífero.
15. Un método para obtener una matriz de gel de
fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor
proan-
giogénico según la reivindicación 14, en el que las células endoteliales proceden concretamente de la arteria aorta.
giogénico según la reivindicación 14, en el que las células endoteliales proceden concretamente de la arteria aorta.
16. Un método para obtener una matriz de gel de
fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor
proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en
el que el gel de fibrina se ha formado a partir de fibrinógeno
presente en plasma sanguíneo de un mamífero.
17. Un método para obtener una matriz de gel de
fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor
proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en
el que el gel de fibrina se ha formado a partir de fibrinógeno de
crioprecipitados de plasma de un mamífero.
18. Un método para obtener una matriz de gel de
fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor
proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en
el que al menos un vector adenoviral utilizado para transfectar las
células endoteliales comprende en su secuencia nucleotídica la
secuencia codificante del factor de crecimiento VEGF capaz de
superexpresarse en dichas células endoteliales.
19. Un método para obtener una matriz de gel de
fibrina endotelizada superproductora de al menos un factor
proangiogénico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en
el que al menos un vector adenoviral utilizado para transfectar las
células endoteliales comprende en su secuencia nucleotídica la
secuencia codificante del factor de crecimiento FGF capaz de
expresarse en dichas células endoteliales.
20. Uso de una matriz de gel de fibrina
endotelizada superproductora de al menos un factor proangiogénico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como puente
vascularizado que se inserta entre un colgajo y el lecho receptor
del mismo en un proceso de trasplante entre mamíferos, con el fin
de mejorar la supervivencia de dicho colgajo.
21. Uso según la reivindicación 20 en que las
células endoteliales presentes en la matriz del gel de fibrina
proceden de un individuo distinto al que recibe el colgajo.
22. Uso según la reivindicación 20 en que las
células endoteliales presentes en la matriz de gel de fibrina
proceden del mismo individuo que recibe el colgajo.
23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
20 a 22 en que el individuo del que proceden las células
endoteliales presentes en la matriz del gel de fibrina es un
mamífero no humano.
24. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
20 a 23 en que el individuo que recibe el colgajo es un ser
humano.
25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
20 a 23 en que el individuo que recibe el colgajo es un mamífero no
humano.
26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
20 a 25 en que el gel de fibrina de la matriz artificial se ha
formado a partir del fibrinógeno presente en plasma sanguíneo de un
individuo distinto al que recibe el colgajo.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
20 a 25 en que el gel de fibrina se ha formado a partir del
fibrinógeno presente en plasma sanguíneo del mismo individuo que
recibe el colgajo.
28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
26 ó 27 en que el individuo del que procede el plasma sanguíneo del
que se obtiene el fibrinógeno que forma el gel de fibrina de la
matriz artificial es un mamífero no humano.
29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
26 a 28 en que el individuo que recibe el colgajo es un ser
humano.
30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
26 a 28 en que el individuo que recibe el colgajo es un mamífero no
humano.
31. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
20 a 25 en, que el gel de fibrina de la matriz artificial se ha
formado a partir del fibrinógeno presente en crioprecipitados de
plasma sanguíneo de un individuo distinto al que recibe el
colgajo.
32. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
20 a 25 en que el gel de fibrina se ha formado a partir del
fibrinógeno presente en crioprecipitados de plasma sanguíneo del
mismo individuo que recibe el colgajo.
33. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
31 ó 32 en que el individuo del que procede el crioprecipiado de
plasma sanguíneo del que se obtiene el fibrinógeno que forma el gel
de fibrina de la matriz artificial es un mamífero no humano.
34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
31 a 33 en que el individuo que recibe el colgajo es un ser
humano.
35. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
31 a 33 en que el individuo que recibe el colgajo es un mamífero no
humano.
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200501182A ES2263382B1 (es) | 2005-05-16 | 2005-05-16 | Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogenicos. |
CA002608712A CA2608712A1 (en) | 2005-05-16 | 2006-05-12 | Endothelized artificial matrix comprising a fibrin gel, which is a superproducer of proangiogenic factors |
PCT/ES2006/070059 WO2006123004A1 (es) | 2005-05-16 | 2006-05-12 | Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogénicos |
US11/920,472 US20090214613A1 (en) | 2005-05-16 | 2006-05-12 | Endothelized Artificial Matrix Comprising a Fibrin Gel, Which Is a Superproducer of Proangiogenic Factors |
EP06743497A EP1887080A4 (en) | 2005-05-16 | 2006-05-12 | ENDOTHELIZED ARTIFICIAL MATRIX WITH FIBRINGEL AS SUPERPRODUCENT PROANGIOGENIC FACTORS |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200501182A ES2263382B1 (es) | 2005-05-16 | 2005-05-16 | Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogenicos. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2263382A1 ES2263382A1 (es) | 2006-12-01 |
ES2263382B1 true ES2263382B1 (es) | 2007-11-16 |
Family
ID=37430957
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200501182A Active ES2263382B1 (es) | 2005-05-16 | 2005-05-16 | Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogenicos. |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090214613A1 (es) |
EP (1) | EP1887080A4 (es) |
CA (1) | CA2608712A1 (es) |
ES (1) | ES2263382B1 (es) |
WO (1) | WO2006123004A1 (es) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9204959B2 (en) | 2012-02-02 | 2015-12-08 | Smith & Nephew, Inc. | Implantable biologic holder |
WO2016069897A1 (en) * | 2014-10-30 | 2016-05-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Materials and methods for rescue of ischemic tissue and regeneration of tissue integrity during restriction, engraftment and transplantation |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5674722A (en) * | 1987-12-11 | 1997-10-07 | Somatix Therapy Corporation | Genetic modification of endothelial cells |
ES2132027B1 (es) | 1997-07-04 | 2000-04-01 | Comunitario De Transfusion Del | Desarrollo de una piel artificial mediante cultivo de queratinocitos sobre una base de fibrina y fibroblastos humanos y metodo de preparacion de esta piel para trasplante. |
ATE362382T1 (de) * | 2000-03-15 | 2007-06-15 | Orbusneich Medical Inc | Beschichtung welche ein anhaften von endothelzellen stimuliert |
WO2002030443A2 (en) | 2000-10-11 | 2002-04-18 | The Wistar Institute | Regulation of human skin healing |
US6793918B2 (en) * | 2000-11-01 | 2004-09-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | In vivo stimulation of angiogenic activity |
ES2173812B1 (es) | 2001-03-01 | 2003-12-16 | Ct Investig Energeticas Ciemat | Dermis artificial y metodo de obtencion. |
WO2002083185A1 (fr) * | 2001-04-06 | 2002-10-24 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de transfert genique via le systeme vasculaire ou l'uretere |
ES2184623B1 (es) * | 2001-06-29 | 2004-09-16 | Centro De Investigaciones Energeticas, Medioambientales Y Tecnologicas (C.I.E.M.A.T.) | Piel artificial autologa secretora de leptina y metodo de obtencion. |
WO2003078586A2 (en) * | 2002-03-12 | 2003-09-25 | The Regents Of The University Of California | Vascularized tissue for transplantation |
DE10220472A1 (de) | 2002-05-07 | 2003-11-27 | Hans-Guenther Machens | Bioartifizielle Haut |
US7285130B2 (en) * | 2004-04-27 | 2007-10-23 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Stent delivery system |
-
2005
- 2005-05-16 ES ES200501182A patent/ES2263382B1/es active Active
-
2006
- 2006-05-12 EP EP06743497A patent/EP1887080A4/en not_active Withdrawn
- 2006-05-12 WO PCT/ES2006/070059 patent/WO2006123004A1/es active Application Filing
- 2006-05-12 CA CA002608712A patent/CA2608712A1/en not_active Abandoned
- 2006-05-12 US US11/920,472 patent/US20090214613A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HAMOEN, K.E. et al.: "Transient Hyperproliferation of a Transgenic Human Epidermis Expressing Hepatocyte Growth Factor", Cell Transplantation (2002), vol. 11, nº 4, pp.: 385-395, todo el documento. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20090214613A1 (en) | 2009-08-27 |
WO2006123004A1 (es) | 2006-11-23 |
CA2608712A1 (en) | 2006-11-23 |
EP1887080A1 (en) | 2008-02-13 |
EP1887080A4 (en) | 2010-02-24 |
ES2263382A1 (es) | 2006-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lokmic et al. | Engineering the microcirculation | |
Kim et al. | Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization | |
Ohashi et al. | Liver tissue engineering at extrahepatic sites in mice as a potential new therapy for genetic liver diseases | |
Cho et al. | Regulation of endothelial cell activation and angiogenesis by injectable peptide nanofibers | |
ES2511791T3 (es) | Células madre mesenquimales positivas para ABCB5 como moduladoras de inmunidad | |
Yang et al. | Delivery of basic fibroblast growth factor using heparin-conjugated fibrin for therapeutic angiogenesis | |
Chen et al. | Three-dimensional cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs for therapeutic neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia | |
US9730959B2 (en) | Biocomposite for regeneration of injured tissue and organs, a kit for making the biocomposite, a method of making the biocomposite and a method of treating injuries | |
CN109641013A (zh) | 包含凝血酶处理干细胞来源的外泌体的皮肤创伤的治疗用组合物 | |
KR102597594B1 (ko) | 오가노이드의 생체 이식용 조성물 | |
Boccardo et al. | Engineered mesenchymal cell-based patches as controlled VEGF delivery systems to induce extrinsic angiogenesis | |
CN104768567A (zh) | 用于伤口愈合的联合治疗和组合物 | |
ES2284489T3 (es) | Inyeccion intramiocardica de medula osea autologa. | |
Zhou et al. | Angiogenic gene‐modified myoblasts promote vascularization during repair of skeletal muscle defects | |
US20080102059A1 (en) | Treatment for arthritis | |
Hwang et al. | VEGF-encoding, gene-activated collagen-based matrices promote blood vessel formation and improved wound repair | |
JPH03503167A (ja) | 部位指定血管形成素子とその使用法 | |
US8852936B2 (en) | Autologous lymph node transfer in combination with VEGF-C or VEGF-D growth factor therapy to treat lymphedema and to improve reconstructive surgery | |
Choi et al. | Functional recovery of urethra by plasmid DNA-loaded injectable agent for the treatment of urinary incontinence | |
ES2263382B1 (es) | Matriz artificial de gel de fibrina endotelizada superproductora de factores proangiogenicos. | |
KR20030043937A (ko) | 혈관분포된 조직 이식편 | |
WO2018106536A1 (en) | Methods for making and using dedifferentiated and stem-like human cells | |
US9446031B2 (en) | Compositions and methods for neovascularization | |
Tanaka et al. | Effects of platelet-rich plasma on tissue-engineered vascularized flaps in an in vivo chamber | |
Lasso et al. | Improving flap survival by transplantation of a VEGF-secreting endothelised scaffold during distal pedicle flap creation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20061201 Kind code of ref document: A1 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2263382B1 Country of ref document: ES |