ES2284489T3

ES2284489T3 - Inyeccion intramiocardica de medula osea autologa.

Info

Publication number: ES2284489T3
Application number: ES00919831T
Authority: ES
Inventors: Ran Kornowski; Shmuel Fuchs; Stephen E. Epstein; Martin B. Leon
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-03-30
Filing date: 2000-03-30
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2020-03-30
Also published as: AU767402B2; DK1171165T3; EP1171165A4; DE60035035T2; EP1171165A1; CA2368677C; ATE363293T1; EP1171165B1; AU4045200A; CA2368677A1; DE60035035D1; JP2002540176A; WO2000057922A1

Abstract

Uso de aspirado de médula ósea autóloga, en el que la medula ósea no deriva de embrión o feto humano, para la elaboración de una composición farmacéutica para potenciar la formación de vasos sanguíneos colaterales en el tejido isquémico del corazón o extremidad en un sujeto, que se va a: inyectar en sitios en el tejido isquémico del corazón o extremidad del sujeto para inducir la formación de vasos sanguíneos colaterales en el tejido.

Description

Inyección intramiocárdica de médula ósea autóloga.

Campo de la invención

Esta solicitud se dirige al uso de aspirado de médula ósea autóloga para la elaboración de una composición farmacéutica para potenciar la formación de vasos sanguíneos colaterales en el tejido isquémico del corazón o extremidad en un sujeto, que se va a inyectar en sitios en el tejido isquémico del corazón o extremidad para potenciar la formación de vasos sanguíneos colaterales en el tejido, en el que la médula ósea no se obtiene de embrión o feto humano.

Antecedentes de la invención

El uso de genes recombinantes o factores de crecimiento para potenciar la función de los vasos sanguíneos colaterales miocárdicos puede representar un nuevo procedimiento para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular. Kornowski, R., y col., "Delivery strategies for therapeutic myocardial angiogenesis", Circulation 2000; 101:454-458. La comprobación del concepto se ha demostrado en modelos animales de isquemia del miocardio, y se están llevando a cabo ensayos clínicos. Unger, E.F., y col., "Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model", Am. J. Physiol 1994; 266:H1588-1595; Banai, S. y col., "Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs", Circulation 1994; 83-2189; Lazarous, D.F., y col., "Effect of chronic systemic administration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine heart", Circulation 1995; 91:145-153; Lazarous, D.F., y col., "Comparative effects of basic development and the arterial response to injury", Circulation 1996; 94:1074-1082; Giordano, F.J., y col., "Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor-5 increases blood flow and contractile function in an ischemic región of the heart", Nature Med 1996; 2:534-9. La mayoría de las estrategias para el suministro transcatéter de factores angiogénicos han usado una vía intracoronaria que puede tener limitaciones debido a la localización imprecisa de los genes o proteínas y el suministro sistémico a tejido no cardiaco. Por lo tanto, sería deseable tener la capacidad de dirigir el suministro de los factores angiogénicos o genes a regiones del miocardio definidas con precisión más que a todo el corazón y minimizar el potencial de la exposición sistémica. Guzman, R.J., y col., "Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors", Circ. Res. 1993; 73:1202-7; Mack, C.A., y col., "Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for VEGF-121, improves myocardial perfusión and function in the ischemic porcine heart",

\hbox{ J. Thorac. Cardiovasc. Surg.   1998;
115:168-77.}

Se ha estudiado el efecto de la inyección intramiocárdica intraoperativa directa de factores angiogénicos en la función colateral en modelos animales de isquemia miocárdica. La administración transepicárdica a corazón abierto de un vector adenovírico que contiene un transgén que codifica un péptido angiogénico dio como resultado la función colateral potenciada (Mack y col., véase antes). También se ha publicado que se produce angiogénesis con la inyección intramiocárdica de un péptido angiogénico o un vector plásmido durante la cirugía a corazón abierto de pacientes. Schumacher, B., y col., "Induction of neoangiogenesis in ischemic myocardium by human growth factors. First clinical results of a new treatment of coronary heart disease", Circulation 1998; 97:645-650; Losordo, D.W., y col., "Gene therapy for myocardial angiogenesis: initial clinical results with direct myocardial injection of phVEGF165 as sole therapy for myocardial ischemia", Circulation 1998; 98:2800.

A pesar de la esperanza prometedora de la angiogénesis terapéutica como una nueva modalidad para tratar pacientes con enfermedad arterial coronaria, sigue existiendo un gran vacío en relación con qué estrategia específica promoverá de forma óptima una respuesta angiogénica terapéutica clínicamente relevante. Además, no está claro cual (o cuales) de los múltiples factores de crecimiento angiogénicos puede estar asociado con una respuesta angiogénica beneficiosa. Además, el uso de diferentes plataformas de suministro a tejidos, por ejemplo, proteínas, adenovirus o ADN "desnudo", para promover la respuesta angiogénica óptima sigue siendo una cuestión abierta.

Objetos de la invención

Un objeto de esta invención es proporcionar una composición de médula ósea autóloga que comprende un medio de cultivo acondicionado obtenido del cultivo de aspirado de médula ósea autóloga.

También es un objeto de la presente invención proporcionar el uso de aspirado de médula ósea autóloga para la elaboración de una composición farmacéutica para potenciar la formación de vasos sanguíneos colaterales en el tejido isquémico del corazón y extremidad.

Estos y otros objetos de la invención se harán más evidentes en la siguiente discusión.

Tal como se usa en la presente invención, la médula ósea no se obtiene de embrión o feto humano.

Resumen de la invención

Los procedimientos terapéuticos más ensayados actualmente se han centrado en un solo factor de crecimiento angiogénico (por ejemplo, VEGF, FGF, angiopoyetina-1) suministrado al tejido isquémico. Esto se puede llevar a cabo suministrando el producto final (por ejemplo, proteína) o por transferencia génica, usando diversos vectores. Sin embargo, se cree que probablemente son necesarias interacciones complejas entre varios sistemas de factores de crecimiento para el inicio y el mantenimiento de la formación de nuevos vasos sanguíneos. De forma más específica, se cree que es importante inducir un medio angiogénico localizado específico con diferentes citocinas angiogénicas que interaccionan de forma concertada y de una forma adecuada en el tiempo para iniciar y mantener la formación y función de nuevos vasos sanguíneos.

La médula ósea (MO) es una fuente natural de un amplio espectro de citocinas y células que están implicadas en el control de los procesos angiogénicos. Por lo tanto se cree que la inyección intramiocárdica de MO autóloga (A), que se aprovecha de la capacidad natural de estas células para segregar muchos factores angiogénicos de una forma adecuada en el tiempo, proporciona una intervención óptima para lograr el desarrollo colateral terapéutico en el miocardio isquémico.

De acuerdo con la invención se inyecta médula ósea autóloga, como un agente terapéutico "individual" o combinado con cualquier fármaco, proteína o gen farmacológicos o cualquier otro compuesto o intervención que pueda potenciar la producción en la médula ósea de factores de crecimiento angiogénicos y/o promover la proliferación y migración de células endoteliales y formación del tubo de los vasos sanguíneos. El o los agentes "combinados" se pueden administrar directamente al paciente o tejido objetivo, o incubar ex vivo con médula ósea antes de la inyección de la médula ósea al paciente. Son ejemplos no limitantes de estos agentes "combinados" el factor estimulador de las colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF), proteína quimioatractora de monocitos 1 (MCP-1) y factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1). Un ejemplo de una intervención que puede potenciar la producción por la médula ósea de factores angiogénicos es la exposición ex vivo de las células de la médula ósea a hipoxia. La médula ósea autóloga, sola o con agentes "combinados", se puede suministrar al paciente directamente mediante procedimientos transendocárdicos o transepicárdicos en el miocardio isquémico y/o no isquémico, o directamente en cualquier otro órgano isquémico (incluyendo una extremidad periférica) para potenciar y/o promover el desarrollo de la formación de vasos sanguíneos colaterales y por lo tanto el flujo colateral al miocardio o extremidades isquémicos. Este procedimiento también se puede usar para promover el desarrollo de células de miocardio desdiferenciadas y/o diferenciadas implantadas por el procedimiento de la miogénesis cardiaca.

La invención describe diferentes estrategias de trasplante de médula ósea autóloga para potenciar la angiogénesis y/o miogénesis y por lo tanto acelerar el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos en el miocardio o extremidades inferiores isquémicas. Otro aspecto de la invención se refiere a la estrategia de "optimización de la expresión angiogénica de genes". Esta estrategia usa la coadministración de HIF-1 con la médula ósea autóloga. El HIF-1 es un factor de transcripción conocido que es inducido y activado por hipoxia, y se sabe que induce la expresión de múltiples genes implicados en la respuesta a la hipoxia. Un procedimiento similar implica la exposición de la médula ósea autóloga a la proteína endotelial del dominio PAS 1 (EPAS1). EPAS1 comparte una alta homología estructural y funcional con HIF-1. La estrategia también implica la exposición ex vivo de la médula ósea a la hipoxia para aumentar la producción de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) u otras citocinas con probada actividad angiogénica (tal como MCP-1) antes de su inyección directa en el corazón o cualquier tejido periférico isquémico. Por lo tanto, esta invención incluye la inyección intramiocárdica directa (transepicárdica o transendocárdica) o intramuscular periférica de médula ósea autóloga; médula ósea autóloga estimulada, por ejemplo, estimulada por HIF-1, EPAS1, MCP-1, GM-CSF, o exposición transitoria a hipoxia u otras formas de energía, tales como ultrasonidos, RF, energía electromagnética o láser; o producto de médula ósea autóloga obtenido de medio acondicionado (componente o componentes acelulares de la médula ósea cultivada). La estimulación de la médula ósea podría ser por exposición directa de la médula ósea a los factores en forma de proteínas, o las células de la médula ósea se pueden transfectar con vectores que llevan genes relevantes. Por ejemplo, se puede transfectar médula ósea con un vector plásmido, o con un vector adenovírico, que lleva transgenes HIF-1 o EPAS1.

Breve descripción de los dibujos

la fig. 1 es una gráfica de la proliferación de PAEC frente a las cantidades de medio acondicionado;

la fig. 2 es una gráfica de la proliferación de células endoteliales frente a las cantidades de medio acondicionado;

la fig. 3 es una gráfica de la concentración de VEGF en medio acondicionado frente a un periodo de tiempo de 4 semanas; y

la fig. 4 es una gráfica de la concentración de MCP-1 en medio acondicionado frente a un periodo de tiempo de 4 semanas.

Descripción detallada de la invención

La médula ósea es una fuente natural de una amplia variedad de citocinas que están implicadas en el control de procesos angiogénicos e inflamatorios. Las citocinas expresadas comprenden mediadores que se sabe que están implicados en el mantenimiento de la hematopoyesis temprana y tardía (IL-1 alfa y IL-1 beta, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 y IL-13; factores estimuladores de colonias, trombopoyetina, eritropoyetina, factor de células madre, ligando fit-3, factor de crecimiento de células hepatocitos, factor de necrosis tumoral alfa, factor inhibidor de leucemia, factores de crecimiento transformantes beta 1 y beta 3; y proteína inflamatoria de los macrófagos alfa 1), factores angiogénicos (factores de crecimiento de fibroblastos 1 y 2, factor de crecimiento endotelial vascular) y mediadores cuyo objetivo habitual (y fuente) son las células formadoras de tejido conjuntivo (factor de crecimiento derivado de plaquetas A, factor de crecimiento epidérmico, factores de crecimiento transformante alfa y beta 2, oncostatina M y factor de crecimiento de tipo insulina 1), o células neuronales (factor de crecimiento de nervios). Sensebe, L., y col., Stem Cells 1997; 15:133-43. Además, se ha mostrado que los polipéptidos VEGF están presentes en las plaquetas y megacariocitos, y son liberados de plaquetas activadas junto con la liberación de beta-tromboglobulina. Wartiovaara, U., y col., Thromb Haemost 1998; 80:171-5; Mohle, R., Procl Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:663-8.

También hay indicadores que apoyan el concepto de que la angiogénesis es necesaria para mantener la función de la médula ósea y el desarrollo de células hematopoyéticas, incluyendo células madre y células progenitoras, que pueden entrar en la circulación y dirigirse a sitios de heridas que están curando y/o isquemia, contribuyendo finalmente a la formación de nuevos vasos sanguíneos. Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente las células progenitoras mesenquimáticas no diferenciadas aisladas de la médula ósea de ser humano adulto, reconocen los marcadores de la superficie celular de la microvasculatura en desarrollo y las pruebas sugieren que puede tener una función en la angiogénesis embrionaria. Fleming, J.E., Jr., Dev. Dyn. 1998; 212:119-32.

La angiogénesis de la médula ósea puede convertirse en exagerada en estados patológicos en los que la médula ósea está siendo activada por células malignas (tal como en el mieloma múltiple) donde se ha mostrado que la angiogénesis de la médula ósea aumenta simultáneamente con el desarrollo de la células de mieloma múltiple humano. Ribatti, D., y col., Br. J. Cancer 1999; 79:451-5. Además, se ha mostrado que el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) tiene una función importante en el crecimiento de neoplasmas hematopoyéticos tales como el mieloma múltiple, a través de un mecanismo paracrino o uno autocrino. (Bellamy, W.T., Cancer Res. 1999; 59:728-33; Fiedler, W., Blood 1997; 89:1870-5). Se cree que la médula ósea autóloga, con sus propiedades humorales y celulares naturales exclusivas, es una fuente potencial de diferentes compuestos angiogénicos. Esta fuente natural de citocinas angiogénicas "mixtas" se puede usar sorprendentemente como una mezcla de factores de crecimiento interactivos potentes para producir angiogénesis y/o miogénesis terapéutica; el uso de las células por si mismas podría proporcionar una fuente más sostenida de estos agentes angiogénicos naturales.

Uno de los factores que es más probable que participe en el inicio de la angiogénesis como respuesta a la isquemia es HIF-1, un factor de transcripción potente que se une a y estimula el promotor de varios genes implicados en respuestas a la hipoxia. La inducción y activación de HIF-1 está estrechamente controlada por la pO2 del tejido; la expresión de HIF-1 aumenta exponencialmente cuando la pO2 disminuye, proporcionando de esta forma un bucle de retroalimentación positivo mediante el cual una disminución de la pO2 produce un aumento de la expresión de productos génicos que sirven como una respuesta adaptativa a un entorno bajo en oxígeno. La activación de HIF-1 conduce, por ejemplo, a la inducción de la eritropoyetina, los genes implicados en la glicólisis y la expresión del VEGF. Probablemente también modula la expresión de muchos otros genes que participan en la repuesta adaptativa a los niveles bajos de pO2. El mecanismo por el cual el HIF-1 regula los niveles de proteínas implicados en la repuesta a la hipoxia es por la regulación transcripcional de los genes que responden a la pO2 baja. Por lo tanto, dichos genes tienen secuencias de ADN cortas en las regiones del promotor o potenciador que contienen los sitios de unión de HIF-1, designados como elementos de respuesta a la hipoxia (HRE). HIF-1 es un heterodímero con un patrón de hélice-bucle-hélice básico, que consiste en subunidades de HIF-1\alpha y HIF-1\beta. Sus niveles están regulados por la pO2, y la inducción tanto transcripcional como postranscripcional de HIF-1 aumenta con la hipoxia y su semivida se reduce notablemente cuando aumentan los niveles de pO2.

Es importante que mientras que la expresión de HIF-1 (determinado en células HeLa) está relacionada de forma exponencial e inversa con la pO2, el punto de inflexión de la curva se produce con una saturación de oxígeno de 5%, con actividad máxima con 0,5% y ½ de la actividad máxima con 1,5-2%. Estos son niveles relativamente bajos de hipoxia, y no está claro si dichos niveles se encuentren en presencia de niveles leves de isquemia miocárdica o de la extremidad inferior, es decir niveles presentes en ausencia de necrosis de tejido (infarto de miocardio y ulceraciones de la pierna, respectivamente). Por lo tanto, las células de la médula ósea podrían tener la capacidad de segregar factores angiogénicos y de esta forma potenciar el desarrollo colateral. Sin embargo, es posible que dicha actividad no se ponga de manifiesto en entornos de tejidos específicos tratados, salvo que haya presente algún estímulo adicional. Por lo tanto, un aspecto preferido de la invención es coadministrar, si es necesario, implante de médula ósea con HIF-1. Se prevé que HIF-1 proporcionará la expresión óptima de muchos de los genes angiogénicos inducibles por hipoxia presentes en el implante de médula ósea. El HIF-1 se puede inyectar como la proteína o como el gen. Si se hace como este último, se puede inyectar en un vector plásmido o vírico, o de cualquier otra forma que conduzca a niveles de proteína funcionalmente relevantes. Por ejemplo, se puede transfectar la médula ósea, ex vivo, con un vector plásmido, o con un vector adenovírico, que lleva los transgenes de HIF-1 y EPSA1. Sin embargo, hay que hacer hincapié en que HIF-1 se usa en esta sección como un ejemplo de una intervención que podría potenciar la producción de sustancias angiogénicas en la médula ósea. Esta invención también cubre el uso de otros agentes, que mediante potenciación de la actividad de HIF-1 (es decir, prolongación de su semivida) o produciendo efectos análogos a HIF-1, estimulan la médula ósea para aumentar la expresión de factores angiogénicos. Un procedimiento similar implica la exposición de médula ósea autóloga a proteína endotelial del dominio PAS 1 (EPAS1). EPAS1 comparte una alta homología estructural y funcional con HIF-1.

Debido a que la actividad del promotor de VEGF es potenciada por HIF-1, esta invención también incluye la exposición ex vivo de células de la médula ósea en cultivo a hipoxia u otras formas de energía, tales como, por ejemplo, ultrasonidos, RF o energía electromagnética. Esta intervención aumenta el VEGF y otra expresión de genes. Por este efecto puede aumentar la capacidad de la médula ósea para estimular la angiogénesis.

Otro aspecto de la invención implica la estimulación ex vivo de la médula ósea autóloga aspirada por HIF-1 (o productos que aumentan los efectos de HIF-1 o producen efectos similares a HIF-1 en la médula ósea) o la exposición directa de la médula ósea a un entorno hipóxico seguido del suministro de las células de la médula ósea activadas al miocardio u órgano periférico isquémico (por ejemplo, miembro isquémico) para potenciar la perfusión dependiente del flujo colateral en tejido isquémico cardiaco y/o periférico. La estimulación de la médula ósea puede ser por exposición directa de la médula ósea a los factores en forma de proteínas, o se pueden transfectar las células de la médula ósea con vectores que lleven los genes relevantes. Por ejemplo, la médula ósea se puede transfectar con un vector plásmido, o con un vector adenovírico, que lleve transgenes de HIF-1 o EPAS1.

Los datos actuales indican la importancia de citocinas derivadas de monocitos para potenciar la función colateral. Los monocitos son activados durante el crecimiento colateral in vivo, y la expresión de la proteína quimiotáctica para monocitos 1 (MCP-1) es favorecida por la tensión de cizalladura in vitro. Se ha mostrado que los monocitos se adhieren a la pared vascular durante el crecimiento de vasos colaterales (arteriogénesis) y la formación de nuevos capilares (angiogénesis). También se ha mostrado que MCP-1 potencia el crecimiento colateral después de la oclusión de la arteria femoral en el modelo de isquemia crónica de las extremidades inferiores de conejos (Ito y col., Circ. Res. 1997; 80:829-3). Parece que la activación de monocitos tiene una función importante en el crecimiento colateral así como en la formación de nuevos capilares. El mayor reclutamiento de monocitos por los LPS se asocia con una mayor densidad capilar así como una conductancia colateral y periférica potenciada 7 días después de la oclusión arterial experimental (Arras M. y col., J. Clin. Invest. 1998; 101:40-50).

Un aspecto adicional de la invención implica la estimulación ex vivo de médula ósea autóloga aspirada por la MCP-1, seguido del suministro directo de las células de la médula ósea activadas al miocardio u órgano periférico isquémico (por ejemplo, miembro isquémico) para potenciar la perfusión dependiente del flujo colateral y la función muscular en el tejido isquémico cardiaco y/o periférico. La estimulación de la médula ósea podría ser por exposición directa de la médula ósea a la MCP-1 en forma de proteína, o las células de la médula ósea se pueden transfectar con un vector que lleve el gen de MCP-1. Por ejemplo, la médula ósea se puede transfectar con un vector plásmido, o con un vector adenovírico, que lleve el transgén de MCP-1.

El factor estimulador de la colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor estimulador de la colonia de granulocitos (G-CSF) son citocinas estimuladoras para la maduración de los monocitos y factores de crecimiento hematopoyéticos multipotentes, que se usan en la práctica clínica para diferentes patologías hematológicas tales como el recuento reducido de leucocitos (es decir, leucopenia o granulocitopenia o monocitopenia) que se produce normalmente como respuesta al tratamiento inmunosupresor o a la quimioterapia en pacientes con cáncer. El GM-CSF también se ha descrito como un factor de crecimiento de linaje múltiple que induce la formación de colonias in vitro a partir de unidades formadoras de colonias eritroides en ramilletes, unidades formadoras de colonias de eosinófilos (CSF) y multipotenciales (CSF), así como de las CSF de granulocitos y macrófagos y CFU de granulocitos. (Bot F.J., Exp. Hematol. 1989, 17:292-5). Se ha mostrado que la exposición ex vivo a GM-CSF induce la proliferación rápida de células progenitoras CD-34+ (Egeland T. y col., Blood 1991; 78:3192-9). Estas células tienen el potencial de diferenciarse en células endoteliales vasculares y por supuesto pueden estar implicadas en la angiogénesis posnatal. Además, GM-CSF lleva múltiples efectos estimuladores en la proliferación, diferenciación, motilidad y supervivencia (menor tasa apoptótica) de macrófagos/monocitos. Consecuente con los efectos combinados conocidos en las células progenitoras endoteliales derivadas de la médula ósea y los monocitos, otro aspecto de la invención es el uso del GM-CSF como tratamiento complementario a las inyecciones de médula ósea autóloga con el objetivo de inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos y la diferenciación en órganos cardiovasculares isquémicos. Además, el GM-CSF puede potenciar además la angiogénesis miocárdica terapéutica causada por la médula ósea, aumentando el efecto de la médula ósea, o estimulando más la médula ósea administrada in vivo o in vitro, que también es estimulada por agentes tales como HIF-1, EPAS1, hipoxia o MCP-1.

Así pues, la presente invención proporciona las realizaciones definidas en las reivindicaciones.

En los siguientes ejemplos, se exponen algunos aspectos de la invención relacionados con los ensayos. Estos ejemplos no son limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Efecto del medio de cultivo de médula ósea en la proliferación de células endoteliales

Se llevaron a cabo estudios para determinar si las células de la médula ósea autóloga de cerdo aspirada obtenidas segregaban VEGF, un potente factor angiogénico, y MCP-1, que recientemente se ha identificado como un cofactor angiogénico importante. Se cultivó la médula ósea in vitro durante 4 semanas. Se añadió el medio acondicionado a las células endoteliales aórticas de cerdo cultivadas (PAEC) y después de 4 días se evaluó la proliferación. Se ensayaron los niveles de VEGF y MCP-1 en el medio acondicionado usando ELISA. Durante las 4 semanas en cultivo, las células de la MO segregaron VEGF y MCP-1, de modo que sus concentraciones aumentaron de una forma relacionada con el tiempo. El medio acondicionado resultante potenció, de una forma relacionada con la dosis, la proliferación de PAEC. Los resultados indican que las células de la MO son capaces de segregar citocinas angiogénicas potentes tales como VEGF y MCP-1 e inducir la proliferación de células endoteliales vasculares.

Cultivo de médula ósea de cerdo

Se recogieron células de médula ósea (MO) en condiciones estériles de cerdos con isquemia miocárdica crónica en heparina sin conservante (20 unidades/ml de células de MO) y se filtraron secuencialmente usando filtros de acero inoxidable de malla de 300 \mum y 200 \mum. Después las células de la MO se aislaron mediante centrifugación con gradiente Ficoll-Hypaque y se cultivaron en medio de cultivo de largo plazo (LTCM) (Stem Cell Tech, British Columbia, Canadá) a 330ºC con CO_{2} al 5% en matraces de cultivo T-25. La densidad de cultivo de las CMO en cada cultivo era 7 x 10^{6}/ml. Cada semana se separó la mitad del medio y se remplazó por LTCM reciente. El medio separado se filtró (filtro de 0,2 \mum) y se almacenó a -200ºC para los posteriores ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) y ensayos de proliferación celular.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas de cerdo

Se aislaron células endoteliales aórticas de cerdo (PAEC) recién obtenidas usando procedimientos convencionales. El medio de crecimiento de las células endoteliales (medio EGM-2, Clonetics, San Diego, CA) contenía FBS al 2%, hidrocortisona, FGF humano, VEGF, EGF humano, IGF, heparina y antibióticos, a 37ºC con dióxido de carbono al 5%. Cuando las células fueron confluentes, aproximadamente a los 7 días, se escindieron mediante tripsina al 2,5% y después se cultivaron en medio 199 con FBS al 10%. Su identidad se confirmó por morfología celular endotelial típica y por tinción inmunohistoquímica para el factor VIII. Los pasos 3-10 se usaron para el estudio de proliferación.

Efectos del medio acondicionado en las células endoteliales aórticas

Ensayo de proliferación celular: Las PAEC (paso 3-10) se sacaron de los matraces de cultivo mediante tripsinización. Las células desprendidas se transfirieron a placas de cultivo de 96 pocillos y se cultivaron con una densidad de sembrado de 5.000 células/pocillo. Las células se cultivaron durante 2-3 días antes de usarlas en experimentos de proliferación y síntesis de ADN. El medio acondicionado de los cultivos de las células de la MO se recogieron a las 4 semanas; se mezclaron los medios de 7 matraces de cultivo y se usaron en el bioensayo. Se añadieron partes alícuotas (10 \mul, 30 \mul, 100 \mul o 200 \mul) de medio acondicionado mezclado, o LTCM (200 \mul, como control) a las PAEC confluentes en las placas de 96 pocillos por triplicado. Cuatro días después del cultivo con medio acondicionado o medio de control, las PAEC se tripsinizaron y se contaron usando un contador de células (Coulter Counter Beckman Corporation, Miami FL).

Efectos del medio acondicionado en la síntesis de ADN de las PAEC

Se añadieron partes alícuotas (10 \mul, 30 \mul, 100 \mul o 200 \mul) de medio acondicionado de las muestras mezcladas o medio de control (LTCM, 200 \mul) a las PAEC en placas de 96 pocillos (misma densidad de sembrado que antes) por triplicado. Después de 2 días, se añadió timidina tritiada 1 \muCi a cada pocillo. Cuarenta y ocho horas más tarde, se recogió el ADN en las PAEC usando un cosechador de células (Mach III M Tomtec, Hamden, CT) y se contó la radiactividad con un contador de centelleo de líquidos (Multi-detector Liquid Scintillation Luminescence Counter EG&G Wallac, Turku, Finlandia).

Determinación de VEGF y MCP-1 en medio acondicionado por ELISA

Se midió la concentración de VEGF en medio acondicionado usando un kit de ELISA tipo sándwich (Chemicon International Inc., Temecula, CA). Brevemente, se usó una placa previamente recubierta con anticuerpo de VEGF antihumano para unirse a VEGF en el medio acondicionado o a una concentración conocida de VEGF recombinante. El complejo se detectó por el anticuerpo anti-VEGF biotinilado, que se une al VEGF capturado. El anticuerpo de VEGF biotinilado a su vez se detectó con estreptavidina-fosfatasa alcalina y solución generadora de color. El anticuerpo de VEGF antihumano reacciona de forma cruzada con el VEGF porcino.

Determinación de MCP-1 en medio acondicionado por ELISA

Se ensayó la concentración de MCP-1 en medio acondicionado con el kit de inmunoensayo enzimático de tipo sándwich (R & D Systems, Minneapolis, MN): se usó una placa previamente recubierta con anticuerpo de MCP-1 antihumano para unirse a MCP-1 en el medio acondicionado o a una concentración conocida de proteína recombinante. El complejo se detectó mediante el anticuerpo anti-MCP-1 biotinilado, que se une a la MCP-1 capturada. El anticuerpo de MCP-1 biotinilado a su vez se detectó con estreptavidina-fosfatasa alcalina y solución generadora de color. El anticuerpo de MCP-1 antihumano reacciona de forma cruzada con la MCP-1 porcina.

Resultados

El medio acondicionado de MO recogido a las cuatro semanas aumentó de forma relacionada con la dosis la proliferación de PAEC (Fig. 1). Esto se demostró mediante recuento del número de células directamente y midiendo la absorción de timidina tritiada (p<0,001 para ambas mediciones). La respuesta relacionada con la dosis demostró un descenso en la extremidad; la proliferación disminuyo con 200 \mul de medio acondicionado comparado con 30 \mul y 100 \mul (P = 0,003 para ambas comparaciones). Se observaron resultados relacionados con la dosis similares en los estudios de absorción de timidina tritiada (P = 0,03 para 30 \mul y 100 \mul comparado con 200 \mul, respectivamente).

Un número limitado (5 \pm 4%) de células de la MO recién aspiradas dieron tinción positiva para el factor VIII. Los resultados se exponen en la figura 2. Esto contrasta con el 57 \pm 14% de las células de la MO de la capa adherente cultivadas durante 4 semanas, de las cuales 60 \pm 23% eran células de tipo endotelial y 40 \pm 28% resultaron ser megacariocitos.

En un periodo de 4 semanas, las concentraciones de VEGF y MCP-1 en el medio acondicionado de la MO aumentaron gradualmente a 10 y 3 veces el nivel de la 1ª semana, respectivamente (P<0,001 para ambas comparaciones) (Fig. 3). En comparación, los niveles de VEGF y MCP-1 en un medio de cultivo control, no expuesto a MO, fueron 0 y 11 \pm 2 pg/ml, respectivamente, como se muestra en la Fig. 4.

Ejemplo 2

Efectos de la hipoxia en la secreción de VEGF en células de la médula ósea de cerdo cultivadas

Se demostró que la hipoxia aumenta notablemente la expresión de VEGF por las células endoteliales de la médula ósea cultivadas, resultados que indican que la exposición ex vivo a la hipoxia, mediante el aumento de la expresión de factores angiogénicos inducibles por hipoxia, puede aumentar más el efecto de potenciación colateral de las células de la médula ósea y de su medio acondicionado que se va a inyectar en tejido muscular isquémico. La médula ósea de cerdo se recogió y se filtró secuencialmente usando filtros de acero inoxidable de malla 300 \mum y 200 \mum. Las células de la MO después se aislaron por centrifugación con gradiente de Ficoll-Hypaque y se cultivaron a 33ºC con CO2 al 5% en matraces de cultivo T-75. Cuando las células fueron confluentes, aproximadamente a los 7 días, se escindieron 1:3 por tripsinización. Después de 4 semanas de cultivo, las células de la MO se expusieron a condiciones hipóxicas (puestas en una cámara que contenía 1% de oxígeno) durante 24 a 120 h, o se mantuvieron en condiciones normales. El medio acondicionado resultante se recogió y se analizaron el VEGF y MCP-1 por ELISA.

La exposición a la hipoxia aumentó notablemente la secreción de VEGF: A las 24 h la concentración de VEGF aumentó de 106 \pm 13 pg/ml en condiciones normotóxicas a 1.600 \pm 196 pg/ml en condiciones hipóxicas (p= 0,0002); después de 120 h aumentó de 4,163 \pm 62 a 6,028 \pm 167 pg/ml (p<0,0001). Se llevó a cabo un estudio separado en células de MO recién aisladas, y se encontró la misma tendencia. La hipoxia también ralentizó la velocidad de proliferación de las células de la MO. La expresión de MCP-1 no aumentó por la hipoxia, un resultado que no era inesperado puesto que no se sabe que su promotor tenga sitios de unión de HIF.

Ejemplo 3

Efecto del medio de cultivo de la médula ósea en la formación de tubo de células endoteliales

Usando células endoteliales de cerdo y técnica de cocultivo de células de músculo liso vascular, se demostró que el medio acondicionado de las células de la médula ósea inducía la formación de tubos vasculares estructurales in vitro. No se observó un efecto como este en la formación de tubo vascular sin exposición al medio de cultivo de la médula ósea. Los resultados sugieren que las células de la médula ósea y sus factores segregados ejercen efectos proangiogénicos.

Ejemplo 4

Efecto del suministro transendocárdica de médula ósea autóloga en la perfusión colateral y función regional en el modelo de isquemia miocárdica crónica

Se creó la isquemia miocárdica crónica en 14 cerdos por implante de constrictores aneroides alrededor de la arteria coronaria circunfleja izquierda. Cuatro semanas después del implante, 7 animales se sometieron a inyecciones transendocárdicas de MOA recién aspirada en la zona isquémica usando un catéter de inyección transendocárdica (2,4 ml por animal inyectados en 12 sitios) y a 7 animales de control se les inyectó solución salina heparinizada. En el momento inicial y 4 semanas después los animales se sometieron a ecocardiograma en reposo y de paseo para evaluar la contractilidad regional (% de engrosamiento miocárdico), y al estudio con microesferas para evaluar la perfusión colateral dependiente en el reposo y durante la infusión de adenosina. Cuatro semanas después de la inyección de MOA, mejoró el flujo colateral (expresado como la relación de zona isquémica/normal x 100) en los cerdos tratados con MOA pero no en los controles (MOA: 95 \pm 13 frente a 81 \pm 11 en reposo, P=0,017; 85 \pm 19 frente a 72 \pm 10 durante la adenosina, P=0,046; Controles: 86 \pm 14 frente a 86 \pm 14 en reposo, P=NS; 73 \pm 17 frente a 72 \pm 14 durante la adenosina, P=0,63). De la misma forma, la contractilidad aumentó en los cerdos tratados con MOA pero no en los controles (MOA: 83 \pm 21 frente a 60 \pm 32 en reposo, P=0,04; 91 \pm 44 frente a 35 \pm 43 durante el paseo P=0,056, Controles: 69 \pm 48 frente a 64 \pm 46 en reposo, P=0,74; 65 \pm 56 frente a 37 \pm 56 durante el paseo, P=0,23).

Los resultados indican que la inyección transendocárdica basada en catéter de MOA puede aumentar la perfusión colateral y la función miocárdica en el miocardio isquémico, resultados que sugieren que este enfoque puede constituir una nueva estrategia terapéutica para lograr la angiogénesis terapéutica óptima.

Catorce cerdos domésticos sin patógenos específicos que pesaban aproximadamente 70 kg, se anestesiaron, se intubaron y recibieron O_{2} suplementario a 2 l/min así como inhalación de isofluoreno al 1-2% durante todo el procedimiento. El acceso arterial se obtuvo mediante el aislamiento de la arteria femoral derecha e inserción de una vaina de French 8. La arteria circunfleja izquierda se aisló por una toracotomía lateral izquierda y se implantó un constrictor aneroide revestido de metal en la parte más cercana de la arteria. Cuatro semanas después del implante del constrictor aneroide todos los cerdos se sometieron a (1) una angiografía coronaria izquierda y derecha selectiva para verificar la oclusión aneroide y valorar el flujo colateral; (2) estudios de ecocardiografía transtorácica; y (3) valoración del flujo sanguíneo miocárdico regional.

Aspiración de médula ósea y preparación de la inyección intramiocárdica

Inmediatamente después de completar la valoración inicial, se sometió a todos los animales a aspiración de la MO del eje femoral izquierdo usando técnicas estándar. Se aspiró la MO de 2 sitios (3 ml por sitio) usando jeringuillas de vidrio heparinizadas sin conservante (20 unidades de heparina/1 ml de MO reciente). La médula ósea aspirada se macrofiltró inmediatamente usando filtros de acero inoxidable de 300 \mum y 200 \mum, de forma secuencial. Después, la médula ósea se inyectó usando un catéter de inyección transendocárdica en el miocardio en 12 sitios (0,2 ml por sitio de inyección, para un total de 2,4 ml) dirigidos al territorio miocárdico isquémico y su región limitante.

Estudio de ecocardiografía

Se registraron las imágenes de ecocardiografía transtorácica de las vistas del eje corto y largo al nivel del músculo papilar medio de los animales al inicio y durante el paseo, al inicio y durante la evaluación de seguimiento a las 4 semanas después de implante de MOA. Las mediciones de acortamiento fraccional se obtuvieron midiendo el % de engrosamiento de la pared (engrosamiento sistólico final menos engrosamiento diastólico final/engrosamiento diastólico final) x 100. Estas mediciones se tomaron en el territorio isquémico (zona lateral) y territorio remoto (zona septal anterior). Posteriormente, se insertó un marcapasos temporalmente por una vaina venosa femoral derecha y se colocó en el atrio derecho. Los animales se pusieron a andar a 180/minuto durante 2 minutos y se registraron simultáneamente las imágenes ecocardiográficas.

Flujo sanguíneo miocárdico regional

Las mediciones del flujo sanguíneo miocárdico regional se llevaron a cabo en reposo y durante la vasodilatación coronaria máxima usando múltiples microesferas coloreadas fluorescentes (Interactive Medical Technologies, West Los Angels, CA) y se cuantificaron por la técnica de la muestra de referencia (Heymann MA, y col., Prog. Cardiovasc. Dis. 1977;20:55-79). Se inyectaron microesferas fluorescentes (0,8 ml, 5x10^{6} microesferas/ml, 15 \mum de diámetro en una suspensión salina con Tween 80 al 0,01%) en el atrio izquierdo mediante un catéter de diagnóstico 3,5 izquierdo Judkins de 6F. La vasodilatación coronaria máxima se indujo mediante infusión de adenosina a una velocidad constante de 140 \mug/kg/min (Fujisawa USA, Deerfield, IL) en la vena femoral izquierda en un periodo de 6 minutos. Durante los 2 últimos minutos de infusión se llevaron a cabo la inyección de microesferas y la extracción de sangre de referencia de forma idéntica al estudio en reposo.

Tras completarse la evaluación de la perfusión, los animales se sacrificaron con una sobredosis de pentobarbital sódico y KCl. Se recogieron los corazones, se enjuagaron con lactato de Ringer, se fijaron por perfusión durante 10-15 minutos, y posteriormente se fijaron por inmersión con formaldehído tamponado al 10% durante 3 días. Tras completarse la fijación, los corazones se cortaron a lo largo del eje corto en cortes de 7 mm de grosor. Cada uno de los 2 cortes centrales se dividió en 8 trozos del mismo tamaño, que después se cortaron en subsegmentos endocárdicos y epicárdicos. Se usaron las mediciones medias de los subsegmentos de las 8 zonas isquémicas laterales y 8 zonas normales septales para evaluar el flujo sanguíneo miocárdico regional endocárdico y epicárdico. También se computó el flujo colateral relativo como la relación del flujo de sangre de la zona isquémica/zona no isquémica (IZ/NIZ).

Histopatología

Para evaluar si la inyección de aspirado de MO mediante el uso de un catéter de inyección estaba asociada con el daño celular mecánico, se prepararon frotis de MO estándar antes y después de propulsar el aspirado de MOA recién filtrado a través de la aguja, usando una presión de inyección similar a la del estudio in vivo. La evaluación morfológica la llevó a cabo un técnico experimentado independiente que era ciego respecto al protocolo del estudio.

La evaluación histopatológica se llevó a cabo en la muestra de tejido del corazón. En el estudio piloto, se examinaron cortes del eje corto de 7 mm de grosor con luz UV para identificar las zonas marcadas fluorescentes. Cada zona identificada se cortó en 3 bloques adyacentes de grosor máximo (central, derecho e izquierdo) que se fijaron por inmersión en formaldehído tamponado al 10%. Posteriormente cada bloque se cortó en 3 niveles, de los cuales 2 se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E) y uno con PAS. Además, se obtuvo un bloque de tejido con marcaje fluorescente reciente de la región isquémica de cada animal y se insertó en compuesto OCT (Sakura Finetek USA Inc., Torance, CA) y se congeló en nitrógeno líquido. Las fracciones congeladas de ese tejido miocárdico congelado instantáneamente se secaron al aire y se fijaron con acetona. Se llevó a cabo la tinción con inmunoperoxidasa con el dispositivo de inmunotinción de Dako (Dako, Carpenteria, CA). La absorción de peroxidasa intrínseca y no específica se bloqueó con hidrógeno peroxidasa al 0,3% y ovoalbúmina al 10%. Se usó anticuerpo monoclonal de ratón contra CD-34 (Becton Dickinson, San José, CA). El anticuerpo de unión era un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra biotinilado y el anticuerpo terciario era estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Se usó diaminobencidina (DAB) como cromógeno y las secciones se contratiñeron con verde de metilo al 1%. Después de deshidratar y aclarar, los portaobjetos se montaron y se examinaron con un microscopio Nikon Labphot.

En el estudio de eficacia, secciones de 1,5 cm^{2} de grosor entero de las regiones isquémicas y no isquémicas se procesaron en secciones de parafina. Cada una de las muestras se tiñó con H y E, tricromo de Masson y antígeno relacionado con el factor VIII. Se estudió la densidad de la población de células endoteliales y la vascularización en los portaobjetos teñidos con inmunoperoxidasa. Esta última se distinguió de la primera por la presencia de un lumen. La vascularidad se evaluó usando 5 muestras de microfotografías de los portaobjetos teñidos con factor VIII tomadas de la mitad interior del miocardio isquémico y no isquémico. La densidad de las células endoteliales se evaluó usando imágenes digitalizadas de las mismas microfotografías. La densidad de la población endotelial se determinó mediante el software de morfometría Sigma-Scan Pro usando el método del umbral de intensidad. Se obtuvo el área endotelial total para cada muestra así como para cada especie junto con el porcentaje relativo de área endotelial (área endotelial/área del miocardio estudiado). El área endotelial total se calculó como el porcentaje relativo del área no infartada (viable) del miocardio estudiado. Las secciones teñidas con tricromo se digitalizaron y el área ocupada por el colágeno de tinción azul así como el área total de la sección excluyendo el área ocupada por el epicardio (que contenía normalmente colágeno) se midieron usando Sigma-Scan Pro. Después se calculó el área infartada como el área ocupada por la tinción azul.

Datos del procedimiento

Las inyecciones intramiocárdicas con MOA o placebo no se asociaron con ningún cambio agudo en la presión sanguínea media, ritmo cardiaco ni inducción de arritmia. Todos los parámetros hemodinámicos eran comparables entre los dos grupos. La comparación por parejas mostró parámetros hemodinámicos similares en cada grupo en el índice comparado con el procedimiento de seguimiento excepto para la presión sanguínea arterial media inicial más alta en el seguimiento en el grupo de control (P=0,03) sin diferencias posteriores durante el paseo o la infusión de adenosina.

Función miocárdica

La evaluación de la función miocárdica regional se muestra en la siguiente Tabla I. El engrosamiento fraccional relativo de la pared antes de la intervención, expresado como la relación de la zona isquémica a la zona no isquémica (IZ/NIZ) x 100, en reposo y durante el paseo, eran similares entre los grupos (P=0,86 y 0,96, respectivamente). A las 4 semanas de la inyección intramiocárdica de MOA, se produjo una mejora del engrosamiento de la pared regional en reposo y durante el paseo, que se debió a un aumento de \sim50% del engrosamiento de la pared de la pared lateral isquémica dependiente del flujo colateral. No se observaron cambios significativos en los animales de control, aunque se observó una tendencia a la mejora del engrosamiento de la pared en el área isquémica durante el paseo en el seguimiento.

TABLA I Contractilidad regional de la pared isquémica

100

Datos de perfusión miocárdica

La evaluación de la perfusión miocárdica regional se muestra en la siguiente Tabla II. No había diferencias entre los grupos tratados y los de control en la perfusión miocárdica transmural relativa antes de la intervención, IZ/NIZ, en reposo y durante la infusión de adenosina (P=0,42 y 0,96, respectivamente). A las 4 semanas de la inyección de MOA, mejoró significativamente la perfusión miocárdica transmural regional relativa en reposo y durante el paseo. Esto se debió a una mejora absoluta de la perfusión miocárdica tanto en la zona isquémica en reposo (un aumento de 57%, P=0,08) como durante la infusión de adenosina (37%, P= 0,09), mientras que no se observaron cambios significativos en el flujo absoluto a la zona no isquémica sea en reposo (aumento de 35%, P=0,18) o sea durante la infusión de adenosina (aumento de 25%, P=0,26). El aumento del flujo sanguíneo miocárdico regional encontrado en las zonas isquémicas consistió en mejora regional tanto endocárdica (73%) como epicárdica (62%) en reposo, con algo menos de mejora durante la infusión de adenosina (40% en ambas zonas). A las 4 semanas, el grupo de control no mostró diferencias en la perfusión transmural endocárdica o epicárdica en las zonas isquémicas y no isquémicas comparado con los valores antes de la intervención.

TABLA II Perfusión miocárdica regional

101

Evaluación de la histopatología y vascularidad

La evaluación de los frotis de MO antes y después de pasar el aspirado filtrado por el catéter de inyección puso de manifiesto estructura normal, ausencia de macroagregados y no hay pruebas de fragmentos celulares o formas de células distorsionadas. La histología el día 1 después de inyecciones puso de manifiesto lesiones agudas caracterizadas por fibrina y tracto inflamatorio con infiltración celular dispersada. El infiltrado se caracterizó por células mononucleares que morfológicamente no se podían diferenciar de un infiltrado de MO. La celularidad era máxima a los 3 y 7 días y posteriormente disminuyó a lo largo del tiempo. A las 3 semanas, se observó más fibrosis en los sitios de inyección de 0,5 ml comparado con los de 0,2 ml. Se llevó a cabo la inmunotinción de CD-34, destinada a identificar las células progenitoras derivadas de la MO, en secciones que mostraban el infiltrado celular máximo. En conjunto, se calculó que 4-6% del infiltrado celular mostraba inmunorreactividad positiva frente a CD-34.

El territorio isquémico en ambos grupos se caracterizó por pequeñas áreas de necrosis desiguales que ocupaban en conjunto <10% del miocardio isquémico examinado. La zona no isquémica puso de manifiesto la estructura miocárdica normal. Se compararon los cambios en las características histomorfométricas de los dos grupos. No había diferencias en el área total ocupada por cualquier vaso sanguíneo así como en el número de vasos sanguíneos de diámetro > 50 \mum. Sin embargo, la comparación de las áreas totales con tinción positiva para el factor VIII (células endoteliales con o sin lumen) en los territorios isquémicos frente a los no isquémicos puso de manifiesto diferencias entre los 2 grupos. En el grupo de MOA, el área total de células endoteliales en la zona isquémica dependiente del flujo colateral era 100% mayor que la observada en el territorio no isquémico (11,6 \pm 5,0 frente a 5,7 \pm 2,3% de área, P=0,016), mientras que no había una diferencia significativa en el grupo de control (12,3 \pm 5,5 frente a 8,2 \pm 3,1% de área, P=0,11). Sin embargo, otros parámetros de vascularidad, incluyendo el % de área ocupada por cualquier vaso sanguíneo y el número de vasos sanguíneos > 50 \mum eran similares en los territorios isquémicos y no isquémicos en ambos grupos.

Ejemplo 5

El efecto de la médula ósea autóloga estimulada in vivo por preadministración de GM-CSF en el modelo animal de la isquemia miocárdica

Se creó una isquemia miocárdica crónica en 16 cerdos por implantación de constrictores aneroides alrededor de la arteria coronaria circunfleja izquierda. A las 4 semanas menos 3 días después de la implantación aneroide, 8 animales se sometieron a inyección de GM-CSF durante 3 días consecutivos (dosis de 10 \mug/kg por día) seguido (al cuarto día y exactamente 4 semanas después de la implantación aneroide) de inyecciones tansendocárdicas de MOA recién aspirada, en la zona isquémica usando un catéter de inyección transendocárdico (2,4 ml por animal inyectados en 12 sitios) y a 8 animales de control sin estimulación con GM-CSF se les inyectó solución salina heparinizada. Al inicio y 4 semanas después, los animales se sometieron a ecocardiograma en reposo y de paseo para evaluar la contractilidad regional (% de engrosamiento miocárdico), y a estudio con microesferas para evaluar la perfusión dependiente de flujo colateral en reposo y durante la infusión de adenosina. Cuatro semanas después de inyección de MOA, el flujo colateral (expresado como la relación de zona isquémica/normal x 100) mejoró en los cerdos tratados con MOA, pero no en los controles (MOA: 85 \pm 11 frente a 72 \pm 16 en reposo, P=0,026; 83 \pm 18 frente a 64 \pm 19 durante la adenosina, P=0,06; Controles: 93 \pm 10 frente a 89 \pm 9 en reposo, P=0,31; 73 \pm 17 frente a 75 \pm 8 durante la adenosina, P=0,74). Igualmente, la contractilidad aumentó en cerdos tratados con MOA pero no en los controles (MOA: 93 \pm 33 frente a 63 \pm 27 en reposo, P=0,009; 84 \pm 36 frente a 51 \pm 20 durante el paseo, P=0,014, Controles: 72 \pm 45 frente a 66 \pm 43 en reposo, P=0,65; 70 \pm 36 frente a 43 \pm 55 durante el paseo, P=0,18).

Los resultados indican que la inyección transendocárdica basada en catéter, de MOA previamente estimulada in vivo mediante GM-CSF administrado sistemáticamente durante 3 días, puede aumentar la perfusión colateral y la función miocárdica en el miocárdico isquémico, sugiriendo estos resultados que este procedimiento puede constituir una nueva estrategia terapéutica para lograr la angiogénesis terapéutica óptima.

Ejemplo 6

Tratamiento de un paciente humano

La médula ósea (\sim5 ml) se aspirará de la cresta ilíaca aproximadamente 60 minutos antes de iniciar el procedimiento cardiaco usando jeringuillas de vidrio heparinizadas sin conservante (20 unidades de heparina/1 ml de MO reciente). La médula ósea aspirada se macrofiltrará inmediatamente usando filtros de acero inoxidable de 300 \mum y 200 \mum, secuencialmente. Un hematólogo experimentado llevará a cabo el procedimiento en condiciones estériles. El frotis de la médula ósea se evaluará para confirmar una histomorfología normal de la preparación de la médula ósea.

Se puede usar cualquiera de una serie de procedimientos para suministrar un agente en el miocardio. Estos incluyen el suministro transepicárdico directo, que se podría lograr por un procedimiento quirúrgico (por ejemplo, pero no limitado, una incisión transtorácica o inserción transtorácica de una aguja u otro dispositivo de suministro o por toracoscopia), o por cualquiera de varios procedimientos percutáneos. A continuación se da un ejemplo de suministro percutáneo. Hay que hacer hincapié en que el siguiente ejemplo no significa que se limiten las opciones de suministro al sistema de plataforma basada en catéter específico descrito en el ejemplo, se puede usar cualquier sistema de plataforma basado en catéter.

Usando procedimientos estándar para la angioplastia coronaria percutánea, se inserta una vaina introductora de al menos 8F en la arteria femoral derecha o izquierda. Después de inserción de la vaina arterial, se administra heparina y se complementa según se requiera para mantener un TCA durante 200-250 segundos a lo largo de la cartografía VI y la parte de transplante de la MOA del procedimiento. El TCA se controlará durante el procedimiento a intervalos no mayores que 30 minutos, así como al final del procedimiento para verificar la conformidad con este requisito.

La ventriculografía izquierda se lleva a cabo en las vistas OAD y/o OAI estándar para ayudar con la guía de NOGA-STAR^{TM} y catéteres de inyección, y se obtiene un mapa electromecánico VI usando el catéter NOGA-STAR^{TM}. El catéter INJECTION-STAR 8F se pone de una forma retrógrada mediante la vaina femoral a la válvula aórtica. Tras flexionar el extremo completo, el extremo distal redondeado se saca suavemente a través de la válvula aórtica y se endereza adecuadamente una vez dentro de la cavidad VI.

El catéter (que incorpora un sensor electromagnético en el extremo) se orienta a una de las zonas de tratamiento (por ejemplo anterior, lateral, inferior-posterior u otra). Utilizando las características de seguridad del sistema NOGA^{TM}, se permite la inserción de la aguja e inyección sólo cuando la estabilidad de las señales demuestra un valor de LS < 3. Se suministrará una sola inyección de 0,2 cc de MOA recién aspirada mediante procedimiento transendocárdico en los límites de las dos zonas de tratamiento no más cerca de 5 mm entre cada sitio de inyección. La densidad de los sitios de inyección dependerá de la anatomía endomiocárdica VI del sujeto particular y la capacidad para lograr una posición estable en la superficie endocárdica sin desplazamiento del catéter o contracciones ventriculares prematuras (CVP).

La médula ósea autóloga recién aspirada transplantada en el miocardio isquémico se asocia con el flujo colateral mejorado sin efectos adversos, y puede tener importancia clínica por varias razones. La metodología reflejada antes se aprovecha de la capacidad natural de la médula ósea para inducir una respuesta angiogénica localizada de una forma eficaz y aparentemente segura. Dicha estrategia angiogénica probablemente será menos costosa que muchas otras que se están ensayando actualmente. También evitaría las cuestiones relacionadas con la potencial toxicidad que son posibilidades aisladas pero concretas con diferentes procedimientos basados en genes que usan vectores víricos.

La invención se basa en el concepto de que la médula ósea autóloga puede ser una fuente óptima de factores celulares (un ejemplo serían las células progenitoras endoteliales, pero la invención no se limita a dichas células, puesto que muchas otras células en la médula ósea pueden contribuir de forma importante al efecto angiogénico) y segregados, por ejemplo factores de crecimiento angiogénicos, elementos necesarios para promover el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos y restaurar la función cuando se transfiere a otro tejido, tal como el corazón o los miembros periféricos isquémicos. La médula ósea del propio paciente se puede usar como la fuente terapéutica clave para inducir angiogénesis terapéutica y/o miogénesis en tejidos isquémicos, por ejemplo, músculo del corazón y/o miembro isquémico, con perfusión sanguínea comprometida debido a las obstrucciones arteriales. Se aspira la médula ósea del propio paciente, es decir, donación de médula ósea autóloga, se procesa y se inyecta directamente en el tejido isquémico y/o no isquémico adyacente, por ejemplo, músculo cardiaco y/o miembro isquémico, para promover el crecimiento de vasos sanguíneos.

La médula ósea autóloga y/o productos de la médula ósea se inyectan en el músculo cardiaco, por ejemplo, el miocardio, usando un procedimiento de inyección transendocárdica basada en catéter o un procedimiento de quirúrgico de toracotomía transepicárdica (a corazón abierto o mediante toracoscopía). Se pueden usar estas dos estrategias de suministro para lograr el mismo objetivo terapéutico promoviendo la incorporación e integración de los elementos de la médula ósea angiogénica en el tejido del órgano objetivo, por ejemplo, músculo del corazón y/o miembro isquémico.

De acuerdo con la invención, se administran cantidades eficaces de médula ósea autóloga para el tratamiento. Como observarán los médicos experimentados, la cantidad administrada dependerá de muchos factores, incluidos, pero sin limitar, el tratamiento pretendido, la gravedad la afección que se va a tratar, el tamaño y extensión del área que se va a tratar, etc. Con respecto al tratamiento de acuerdo con la invención, un protocolo representativo sería administrar cantidades de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5 ml de médula ósea autóloga en cada una de las aproximadamente 12 a aproximadamente 25 inyecciones, para un total de aproximadamente 2,4 a aproximadamente 6 ml de médula ósea autóloga que se administra. Cada dosis administrada podría comprender preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 por ciento en volumen de heparina u otro anticoagulante sanguíneo, tal como la cumadina. Cuando la médula ósea autóloga se ha cultivado o estimulado y/o se va a administrar combinada con otros productos farmacéuticos o similares, la cantidad de médula ósea autóloga presente debería ser aproximadamente la misma en cada dosis y/o el total de la médula ósea autóloga administrada debería ser aproximadamente la misma descrita antes. Se cree que el número total de células de médula ósea autóloga administradas en cada tratamiento debería ser del orden de aproximadamente 10^{7} a 5x10^{8}.

La optimización de la expresión angiogénica de genes requiere la coadministración de diferentes estimulantes angiogénicos con la médula ósea autóloga. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, el transplante de médula ósea autóloga se inyecta como un agente terapéutico "individual" o combinado con cualquier fármaco farmacológico, proteína o gen o cualquier otro compuesto o intervención que pueda potenciar la producción en la médula ósea de factores de crecimiento angiogénicos y/o promover la proliferación y migración de células endoteliales y formación del tubo de vasos sanguíneos. El o los agentes "combinados" se pueden administrar directamente al paciente o tejido objetivo, o se pueden incubar ex vivo con la médula ósea antes de la inyección de la médula ósea en el paciente. Los ejemplos de estos agentes "combinados" (aunque no se limita a estos agentes) son el factor estimulador de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), proteína quimioatractora para monocitos 1 (MCP-1), EPAS1 o factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1). La estimulación de la médula ósea podría ser por exposición directa de la médula ósea a los factores en forma de proteínas, o las células de la médula ósea se pueden transfectar con vectores que llevan los genes relevantes. Por ejemplo, la médula ósea se puede transfectar con un vector plásmido, o con un vector adenovírico, que lleve los transgenes de HIF-1 o EPAS1. Un ejemplo de una intervención que puede potenciar la producción en la médula ósea de factores angiogénicos es la exposición ex vivo de las células de la médula ósea a la hipoxia. Esta intervención se puede usar solo con médula ósea, o combinada con cualquiera de los factores señalados antes. Estas estrategias de optimización se diseñan para aumentar la producción de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y/u otras citocinas con actividad angiogénica antes de la inyección directa de la médula ósea en el corazón o en cualquier tejido isquémico periférico. En un sentido amplio, la invención comprende la inyección intramiocárdica de médula ósea autóloga con cualquier agente que estuviera disponible para producir la estimulación de la médula ósea y/o la estimulación ex vivo o in vivo de la producción de cualquier factor de crecimiento angiogénico por la médula ósea o su microentorno del estroma.

El suministro a los pacientes variará, dependiendo de la situación clínica. Por ejemplo, pacientes con enfermedad arterial coronaria refractaria o vasculopatía periférica isquémica que serán candidatos para un procedimiento de aspiración de médula ósea seguido de transplante de la médula ósea autóloga al miocardio o miembro, dirigido al tejido isquémico o su zona limitante y/o el tejido normal, que puede servir como fuente para el suministro colateral o celular al tejido enfermo, para el propósito de la angiogénesis y/o miogénesis terapéutica. Por ejemplo, pacientes con enfermedad arterial coronaria refractaria o vasculopatía periférica isquémica que serán candidatos para un procedimiento de aspiración de médula ósea seguido de transplante de la médula ósea autóloga al miocardio o miembro, dirigido al tejido isquémico o su zona limitante y/o el tejido normal, que puede servir como fuente para el suministro colateral o celular al tejido enfermo, para el propósito de la angiogénesis y/o miogénesis terapéutica. Este procedimiento implicará el uso de un procedimiento de aspiración de la médula ósea, recogida y procesamiento de la médula ósea, seguido del uso de la médula ósea autóloga o sus elementos (factores de crecimiento y/o elemento celulares que se aislan de la propia médula ósea del paciente), con o sin ninguna estimulación ex vivo de sus formas de suministro, para ser inyectada en el tejido miocárdico isquémico o no isquémico y/o periférico isquémico (tal como isquemia de miembro). La médula ósea se mantendrá en solución de anticoagulación/antiagregación estándar (que contiene citrato sódico y EDTA) y se mantiene a 4ºC en medio estéril hasta el momento de usarla.

Cuando se use, la médula ósea se filtrará para evitar inyectar coágulos sanguíneos o macroagregados que queden, en el tejido objetivo.

La médula ósea, con o sin un agente de estimulación en cualquiera de sus formas de suministro, o con o sin haber sido transfectada con un vector que lleva un transgén que se diseña para potenciar el efecto de angiogénesis de la médula ósea, se inyectará en el músculo cardiaco, es decir, en la angiogénesis miocárdica terapéutica o miogénesis terapéutica, usando cualquier dispositivo de inyección transendocárdico basado en catéter o mediante un procedimiento quirúrgico (a corazón abierto) de toracotomía transepicárdica, o cualquier otro procedimiento que permita el suministro transepicárdico. En el caso de tratamiento de isquemia de miembro, la médula ósea se transferirá por inyección directa de la médula ósea o sus elementos, con o sin estimulación ex vivo o in vivo en cualquiera de sus formas de suministro, a los músculos de la pierna.

El volumen de inyección por sitio de tratamiento probablemente estará en el intervalo entre 0,1-5,0 cc por sitio de inyección, dependiendo del producto de la médula ósea específico y gravedad de la afección isquémica y sitio de inyección. El número total de inyecciones probablemente estará en el intervalo entre 1-50 sitios de inyección por sesión de tratamiento.

Claims

1. Uso de aspirado de médula ósea autóloga, en el que la medula ósea no deriva de embrión o feto humano, para la elaboración de una composición farmacéutica para potenciar la formación de vasos sanguíneos colaterales en el tejido isquémico del corazón o extremidad en un sujeto, que se va a:

inyectar en sitios en el tejido isquémico del corazón o extremidad del sujeto para inducir la formación de vasos sanguíneos colaterales en el tejido.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el aspirado de médula ósea autóloga se estimula ex vivo antes de la inyección.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que el aspirado de la médula ósea se cultiva ex vivo para producir medio de cultivo acondicionado, antes de la inyección.

4. El uso de la reivindicación 1 ó 2, que además comprende filtrar la composición antes de la inyección.

5. El uso de la reivindicación 3, en el que la citocina angiogénica se selecciona del grupo de citocinas angiogénicas constituido por MCP-1 y GM-CSF.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que las células en el aspirado de médula ósea cultivado se han transfectado con uno o más vectores plásmidos o adenovíricos que comprenden una cantidad eficaz de un gen que expresa la citocina angiogénica seleccionada de HIF1, EPAS1, MCP-1 y GM-CSF, o una de sus combinaciones.

7. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el aspirado de médula ósea se estimula por exposición transitoria a hipoxia o una forma de energía seleccionada de ultrasonidos, radiofrecuencia y ondas electromagnéticas.

8. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que la composición además comprende un anticoagulante.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que el anticoagulante es una heparina.

10. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que el tejido isquémico es el miocardio y la composición se inyecta por vía intramiocárdica.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que la inyección es a través de un catéter.

12. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que la inyección es transepicárdica o transendocárdica.

13. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que de 0,2 a aproximadamente 0,5 ml de la composición se inyecta en de 12 a aproximadamente 25 sitios en el tejido cardiaco isquémico.

14. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que se añade HIF-1 o EPAS1 al aspirado de médula ósea antes de la inyección.

15. Una composición de médula ósea autóloga, en la cual la médula ósea no deriva de embrión o feto humano, que comprende un medio de cultivo acondicionado que comprende un componente o componentes celulares de la médula ósea cultivada, derivados del cultivo del aspirado de la médula ósea autóloga.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que el aspirado de médula ósea se filtra.

17. La composición de la reivindicación 15, que además comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en HIF-1, EPAS1, MCP-1 y GM-CSF.

18. La composición de la reivindicación 17, en la que el medio de cultivo acondicionado comprende el aspirado de la médula ósea con células que comprenden en las mismas uno o más vectores plásmidos o adenovíricos que contienen un gen que expresa HIF-1, EPAS1, MCP-1, GM-CSF.

19. La composición de la reivindicación 15, en la que el aspirado de médula ósea se ha estimulado ex vivo.

20. La composición de la reivindicación 15, en la que el aspirado de médula ósea se expone a hipoxia o a una forma de energía seleccionada de ultrasonidos, radiofrecuencia y ondas electromagnéticas.