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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur diagnostischen Differenzierung zwischen einem akuten Koronarsyndrom und einer stabilen Angina pectoris bei einem Lebewesen.
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Das akute Koronarsyndrom (englisch: ”acute coronary syndrom”, ACS) ist in der Humanmedizin ein Sammelbegriff für verschiedene Phasen von akuten Durchblutungsstörungen der Herzkranzgefäße, die unmittelbar lebensbedrohlich sein können. ACS umfasst üblicherweise drei verschiedene Krankheitsbilder, die die Koronararterien betreffen, nämlich den ST-Hebungsinfarkt (englisch: ”ST-elevation myocardial infarction”, STEMI), der etwa 30% aller ACS-Fälle ausmacht, der Nicht-ST-Hebungsinfarkt (englisch: ”Non-ST-elevation myocardial infarction” NSTEMI), der etwa 25% der ACS-Fälle ausmacht, und die instabile Angina pectoris (IAP), die etwa 38% der ACS-Fälle ausmacht.
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ACS ist von einer stabilen Angina pectoris (SAP) zu unterscheiden, die sich im Wesentlichen nur bei körperlicher Aktivität bemerkbar macht und deshalb deutlich unkritischer ist als das ACS.
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Aus diesen Gründen ist es erforderlich, das Vorliegen des ACS zuverlässig zu diagnostizieren und insbesondere gegenüber einer SAP abzugrenzen.
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Derzeit erfolgt die Diagnose von ACS vorwiegend über die Erstellung eines Elektrokardiogramms, in dem bspw. eine Erhöhung des ST-Abschnittes erkannt werden soll. In Abwesenheit einer solchen Veränderung ist es jedoch nicht möglich, zwischen einer IAP und einer NSTEMI zu unterscheiden. Auch ist die Unterscheidung gegenüber einer SAP nicht immer zuverlässig möglich.
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Ferner kann die Diagnose eines ACS über den Nachweis bestimmter Blutmarker erfolgen. Einer dieser Marker ist das plättchengebundene Glykoprotein VI (pGPVI). pGPVI ist der Schlüsselregulator der Plättchenaktivierung und -aggregation an Stellen der Gefäßschädigung, an denen es zur Exposition von Kollagen kommt. Es konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Oberflächenexpression von pGPVI bei Patienten mit ACS zu finden ist. Auch konnte gezeigt werden, dass die Spiegel von pGPVI in ACS-Patienten im Vergleich zu Patienten mit SAP signifikant erhöht sind. Allerdings hat sich herausgestellt, dass die Sensitivität und Spezifität einer Diagnose von ACS über pGPVI, bspw. im Rahmen von durchflusszytometrischen Untersuchungen, zu gering sind, um eine adäquate klinische Entscheidung zu erlauben. Ferner sind nur wenige Kliniken technisch in der Lage pGPVI als diagnostischen Marker des ACS zu bestimmen.
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Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren bereitzustellen, bei dem die Probleme aus dem Stand der Technik reduziert und ggf. vermieden werden. Insbesondere soll ein solches Verfahren bereitgestellt werden, mit dem auf zuverlässige Art und Weise eine diagnostische Differenzierung zwischen einem akuten Koronarsyndrom (ACS) und einer stabilen Angina pectoris (SAP) bei einem Lebewesen vorgenommen werden kann.
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Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen einer Blutprobe des Lebewesens; (2) Bestimmen der Konzentration von löslichem Glykoprotein VI (sGPVI) in der Blutprobe zum Erhalt des Wertes A1; (3) Vergleichen von A1 mit der Konzentration von sGPVI im Blut eines SAP-Patienten (A2), und (4) Feststellen des Vorliegens eines ACS wenn A1 < A2.
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Die Aufgabe wird ferner durch die Verwendung der Konzentration von löslichem Glykoprotein VI (sGPVI) im Blut eines Lebewesens zur diagnostischen Differenzierung zwischen ACS und SAP gelöst.
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Diese Erkenntnis der Erfinder war überraschend. So weisen nämlich Arbeiten aus dem Stand der Technik in die gegenteilige Richtung. Bigalke et al. (2009), Regulation of platelet glycoprotein VI (GPVI) surface expression and of soluble GPVI in patients with atrial fibrillation (AF) and acute coronary syndrome (ACS), Basic Res. Cardiol. 104, Seiten 352–357, beschreiben erhöhte Plasmaspiegel von sGPVI in Patienten mit ACS bzw. im Vergleich zu Patienten mit SAP; vgl. S. 355, rechte Spalte, 1. Absatz und Fig. 1b. Ähnliche Daten finden sich in Bigalke et al. (2009), Influence of Platelet Countonthe Expression of Platelet Collagen Receptor Glycoprotein VI (GPVI) in Patients with Acute Coronary Syndrome, Thromb. Haemost. 101, Seiten 911–915, vgl. insbesondere Seite 913, rechte Spalte, 1. Absatz und Fig. 1B.
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Die Erkenntnisse der Erfinder waren deshalb so nicht zu erwarten gewesen.
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Erfindungsgemäß ist es dabei bevorzugt, wenn die Blutprobe eine Blutplasmaprobe und A2 die Konzentration von sGPVI im Blutplasma eines SAP-Patienten ist.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass aufgrund der Abtrennung der zellulären Blutbestandteile aus der Blutprobe eine einfachere und genauere Bestimmung der Konzentration von sGPVI möglich ist und insbesondere verhindert wird, dass durch ein evtl. Vorhandensein von plättchengebundenem GPVI (pGPVI) die Messung verfälscht wird.
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Dabei ist es weiter bevorzugt, wenn es sich bei dem Lebewesen um ein menschliches Lebewesen mit kardialbedingtem Brustschmerz handelt.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits eine Vorselektion des zu untersuchenden Lebewesens getroffen wird, so dass das erfindungsgemäße Verfahren eine noch zuverlässigere Differenzierung zwischen ACS und SAP ermöglicht. Durch das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich auf zuverlässige Art und Weise bei Personen mit kardialbedingtem Brustschmerz feststellen, ob ein ACS vorliegt und eine sofortige therapeutische und/oder pharmakologische Behandlung notwendig ist oder aber aufgrund einer weit weniger kritischen SAP ggf. keinerlei oder lediglich schmerzlindernde Maßnahmen durchzuführen sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht deshalb eine gezielte therapeutische Entscheidung zu einem frühen Zeitpunkt, so dass eventuelle Fehlbehandlungen und unnötige Belastungen des Patienten weitgehend vermieden werden können.
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Nach einer bevorzugten Weiterentwicklung handelt es sich bei dem Lebewesen um ein menschliches Lebewesen mit koronarer Arterienerkrankung (CAD).
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Auch diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits eine Vorselektion der zu untersuchenden Lebewesen auf eine solche Patientenpopulation vorgenommen wird, die nachweislich bereits an einer Erkrankung der Herzkranzgefäße leiden. Bei derart gefährdeten Patienten ist es besonders wichtig, eine Differenzierung zwischen ACS und SAP vorzunehmen und daraufhin die richtigen therapeutischen Maßnahmen zu ergreifen. Dies wird mit dieser Weiterentwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht.
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Nach einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung umfasst das ACS einen ST-Hebungsinfarkt (STEMI) und einen Nicht-ST-Hebungsinfarkt (NSTEMI).
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass über das erfindungsgemäße Verfahren der größte Teil der ACS-Patienten erfasst wird. So konnten die Erfinder feststellen, dass gerade bei STEMI- und NSTEMI-Patienten die Plasmaspiegel von sGPVI signifikant niedriger sind als bei SAP-Patienten.
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Nach einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt Schritt 2 unter Verwendung eines gegen sGPVI gerichteten Antiköpers.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mit Mitteln der immunologischen Diagnostik das erfindungsgemäße Verfahren zu besonders zuverlässigen Ergebnissen führt. Die Erfinder haben eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern gegen sGPVI im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens getestet und konnten überzeugende Ergebnisse erzielen. Diese monoklonalen Antikörper sind zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders geeignet.
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Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses unter Verwendung eines Sandwich-Immunassays, vorzugsweise eines Bead-basierenden Sandwich-Immunassays durchgeführt.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit etablierten Techniken der Bioanalytik umgesetzt wird, so dass eine Routineanwendung in Kliniken und selbst eine großmaßstabliche Anwendung ermöglicht wird. Die besondere Ausgestaltung als Bead-basierenden Sandwich-Immunassay hat den Vorteil einer erleichterten Herstellung und Handhabung sowie erhöhten Flexibilität des Assays.
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Ein weiterer Gegenstand des vorliegenden Verfahrens betrifft ein Kit, das Reagenzien und Einrichtungen sowie eine Beschreibung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufweist.
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Die Vorteile und Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten für die erfindungsgemäße Verwendung und das Kit entsprechend.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
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1 zeigt Ergebnisse zu dem Bead-basierenden Sandwich-Immunassay zum Nachweis von löslichem Glykoprotein VI (sGPVI). (A) 7 monoklonale Antikörper wurden gegeneinander in Bezug auf deren Fähigkeit gescreent, als Fänger- bzw. Detektormoleküle zu fungieren. Das beste Antikörperpaar wurde gemäß dem besten Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) ausgewählt, indem das Fluoreszenzsignal, das bei einem Standard vom 125 ng/l sGPVI erhalten wurde, durch das Fluoreszenzsignal von phosphatgepufferter Saline (PBS) ohne Standard geteilt wurde. S/N-Verhältnisse der Antikörperpaare sind in einer Blasengrafik dargestellt. Die Größe der Blasen wird durch die S/N-Werte bestimmt. (B) Dosis-Wirkungs-Kurve des Sandwich-Immunassays zur Bestimmung von sGPVI. Gezeigt ist eine typische Kalibrierungskurve unter Verwendung des sGPVI-Standards im Bereich von 8 bis 050 ng/l. (C) Die Analytrückgewinnung von sGPVI wurde unter Bezugnahme auf eine vierparametrische logarithmische Anpassung der Standardfluoreszenz kalkuliert;
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2 zeigt die Spiegel von löslichem Glykoprotein VI (sGPVI) und plättchengebundenem GPVI (pGPVI) in Patienten mit symptomatischer koronarer Arterienerkrankung. (A) Patienten mit Nicht-ST-Hebungsinfarkt (NSTEMI) und ST-Hebungsinfarkt (STEMI) zeigten signifikant niedrigere sGPVI-Spiegel als Patienten mit stabiler Angina pectoris (SAP) (μg/l ± Standardabweichung: 8,4 ± 3,6 und 8,6 ± 4,1 vs. 9,8 ± 4,8; P = 0,002. (B) Eine Subgruppenanalyse zeigte eine signifikant erhöhte Oberflächenexpression von pGPVI in NSTEMI und STEMI im Vergleich zu SAP (mittlere Fluoreszenzintensität ± Standardabweichung: 21,2 ± 8,1 und 19,8 ± 6,8 vs. 18,5 ± 7,7; P = 0,002 und P = 0,018). (C) Es zeigte sich eine schwache, inverse Korrelation zwischen pGPVI und sGPVI (r = –0,076; P = 0,023). (D) Die Fläche unter der Kurve (englisch: ”area under the curve”; AUC) in der Receiver-Operating-Charakteristik-Analyse betrug 0,716; 95% CI: 0,681–0,751 für sGPVI, wodurch Patienten mit SAP gegenüber solchen mit ACS verbessert (P = 0,044) gegenüber der Kurve der Subgruppenanalyse für Plättchen-GPVI (AUC: 0,624; 95% CI: 0,586–0,662) unterschieden werden können.
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Ausführungsbeispiele
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2. Material und Methoden
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2.1 Studienpopulation
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Die Erfinder evaluierten die Konzentration von sGPVI in insgesamt 2.438 konsekutiven Patienten mit einer symptomatischen koronaren Arterienerkrankung (CAD), die sich einer koronaren Angiographie unterzogen. 1.371 Patienten zeigten eine SAP, 724 einen Nicht-ST-Hebungsinfarkt (NSTEMI) und 343 einen ST-Hebungsinfarkt (STEMI). Die Kategorisierung des akuten Koronarsyndroms (ACS) erfolgte gemäß den AHA/ACC-Richtlinien; Braunwald et al. (2000), ACC/AHA guidelines for the management of patients with unstable angina and non-ST-segment elevation myocardial infarction: executive summary and recommendations. A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association task force on practice guidelines (committee on the management of patients with unstable angina), Circulation 102, Seiten 1193–1209. In einer Untergruppe von 1.011 Patienten wurde die Oberflächenexpression von pGPVI durch Durchflusszytometrie in 655 Patienten mit SAP, in 276 Patienten mit NSTEMI und in 80 Patienten mit STEMI bestimmt. Die Studie wurde vom lokalen Ethikkomitee des Universitätsklinikums Tübingen genehmigt und in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki durchgeführt.
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Die Ausschlusskriterien waren ein Alter unter 18 Jahren, Unvermögen und Fehlen einer Einverständniserklärung, Patienten mit nicht-kardialbedingtem Brustschmerz.
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2.2 Probennahme und Plasmapräparation
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Blutproben wurden zum Zeitpunkt des Krankenhausaufenthalts aus der Antikubitalvene entnommen. Troponin-I wurde sofort bestimmt, indem der Troponin-I-Ultraassay auf einem Advia-Centaur-System (beides von Siemens Healthcare Diagnostics, München, Deutschland) durchgeführt wurde. Das C-reaktive Protein (CRP) wurde unter Verwendung eines Siemens hsCRP Advia2120 (Siemens Medical, Solutions Diagnostics GmbH, Fernwald, Deutschland) bestimmt. Das Blut zur Bestimmung des Plättchen-Biomarkers wurde in 5 ml heparinisierte Vials (zur Bestimmung von sGPVI) und in 5 ml Vials mit Citrat, Phosphat, Dextrose und Adenin (für die Bestimmung von pGPVI) gefüllt, verarbeitet und unmittelbar über Durchflusszytometrie analysiert, um die Oberflächenexpression der Plättchen-Rezeptoren (pGPVI und GPIb) zu bestimmen, wie zuvor beschrieben in Bigalke et al. (2006), Expression of platelet collagen receptor VI is associated with acute coronary syndrom, Eur. Heart J. 27, Seiten 2165–2169, und Bigalke et al. (2008), Platelet Collagen Receptor Glycoprotein VI as a Possible Novel Indicator for the Acute Coronary Syndrome, Am. Heart J. 156, Seiten 193–200. Für die Analyse von sGPVI wurde Heparin-anticoaguliertes Blut bei 3000 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Zwei Drittel des Überstandes wurden aliquotiert und unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden bei –78°C bis zur Analyse gelagert. Nach dem Auftauen der Proben wurden diese bei 13000 rcf für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die Heparin-Plasmaproben wurden während der gesamten Assay-Entwicklung und Studie für die Messungen von sGPVI verwendet.
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2.3 Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes GPVI
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Monoklonale Rattenantikörper (mAB) gegen humanes GPVI wurden entwickelt und hergestellt, wie zuvor beschrieben; vgl. Massberg et al. (2004), Soluble glycoprotein VI dimer inhibits platelet adhesion and aggregation to the injured vessel Wall in vivo, FASEB J. 18, Seiten 397–399. Sieben positive Klone von Antikörpern gegen sGPVI wurden identifiziert (5C4, 5D4, 6C2, 7E11, 8A2, 8C3, 8E9).
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2.4 Präparation von sGPVI-freiem Plasma
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Eine NHS-aktivierte HP-Säule HiTrap von 1 ml (GE Healthcare, USA) wurde nach den Angaben des Herstellers präpariert, indem 1 mg mAB (5C4) verwendet wurde, der reaktiv mit humanem sGPVI ist. 800 μl Plasma wurden auf die Säule gegeben und in Bezug auf sGPVI deplettiert. sGPVI-deplettiertes Plasma wurde als Matrix für die Bestimmung der Assay-Präzision, Assay-Genauigkeit und Analytstabilität verwendet.
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2.5 Bead-basierender Sandwich-Immunassay für sGPV
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Die Plasmakonzentration von sGPVI wurde unter Verwendung eines Bead-basierenden Sandwich-Immunassay bestimmt. Als Fängerantikörper wurde der monoklonale Antikörper 8E9 verwendet, der mit humanem GPVI reaktiv ist. Der Antikörper wurde kovalent an farbkodierte magnetische Polystyrenmikrokugeln (Luminex, Austin, TX, USA) gekoppelt, wie beschrieben in Carson und Vignali (1999) Simultaneous quantitation of 15 Cytokines using a multiplexed flow cytometric assay, J. Immunol. Methods 227, S. 41–52. Verdünnungen des Plasmas oder der Standards wurden zusammen mit 2000 antikörperbeschichteten Mikrokugeln in einer PCR-Platte mit 96 Vertiefungen (ThermoFisher, Waltham, MA, USA) in einem magnetischen Partikelhalter (KingFisher 96, ThermoFisher, Waltham, MA, USA) für eine Stunde bei 25°C und durch Mischen bei einer mittleren Frequenz inkubiert. Mikrokugeln, die mit Rinderserumalbumin beschichtet waren, wurden als Negativkontrolle verwendet. Nach dem Fängerschritt wurden die Mikrokugeln in eine andere PCR-Platte überführt, die einen biotinylierten, für GPVI spezifischen Detektionsantikörper (1 mg/l, mAB 8A2) enthielt, unter Verwendung eines magnetischen Partikelhalters (KingFisher 96, ThermoFisher, Waltham, MA, USA). Es erfolgte eine Inkubation mit dem Detektionsantikörper für eine Stunde bei 25°C. Der finale Detektionsschritt erfolgte durch Überführen der Mikrokugeln in eine dritte PCR-Platte, die eine Lösung eines Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugates (2,5 mg/l, Prozyme, Hayward, CA, USA) enthielt, für 45 Minuten bei 25°C. Die Mikrotiterplatte wurde in ein Luminex 100 Instrument (Luminex, Austin, TX, USA) überführt und die Daten wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers erhalten. Die Hintergrunddaten des Assays wurden unter Verwendung von Mikrokugeln erhalten, die mit 10% Mausplasma in Blockierpuffer von Roche für ELISA (Roche, Mannheim, Deutschland), enthaltend 0,1% Tween, inkubiert wurden. Rekombinantes sGPVI wurde hergestellt, wie im Stand der Technik beschrieben und als Referenz verwendet; vgl. Massberg et al. (a. a. O.). Der GDVI-Standard wurde in Blockierpuffer von Roche für ELISA zuzüglich 10% Mausserum (Sigma, St. Louis, MO, USA) verdünnt. Plasmakonzentrationen von sGPVI wurden kalkuliert, indem auf eine vierparametrische logarithmische Anpassung der Standardfluoreszenz Bezug genommen wurde.
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Die Präzision und Genauigkeit wurden durch die Analyse von drei Proben bestimmt, die drei verschiedene Konzentrationen von rekombinantem sGPVI enthielten. Das sGPVI wurde in 2%iges, sGPVI-deplettiertes, humanes Plasma in hoher, mittlerer und niedriger Konzentration (25, 6,25 und 1,55 μg/l) hinzugegeben. Aliquote der Proben wurden präpariert, eingefroren und in 5 Replikaten an fünf Tagen analysiert.
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2.6 Durchflusszytometrie
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Die Oberflächenexpression von pGPVI und GPIb wurde durch eine Zwei-Farben-Gesamtblutdurchflusszytometrie bestimmt, wie zuvor beschrieben; vgl. Bigalke et al. (2006; a. a. O.) und Bigalke et al. (2008; a. a. O.). Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde als Index der Rezeptorexpression verwendet. Der gegen GPVI gerichtete, mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) konjugierte mAB 4C9 wurde hergestellt und charakterisiert, wie zuvor beschrieben; vgl. Bigalke et al. (2006; a. a. O.) und Bigalke et al. (2008; a. a. O.). Ein gegen CD42b gerichteter, mit Phycoerythrin (PE) konjugierter mAB (Klon SZ2) wurde von Immunotec (Beckman, Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) erworben.
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2.7 Statistische Analyse
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Ein Wahrscheinlichkeitswert von kleiner als 0,05 wurde als statistisch signifikant gewertet und mit geeigneten nicht-parametrischen Tests evaluiert. Die Werte sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Folglich wurde für die paarweisen Vergleiche von SAP, NSTEMI und STEMI ein Kruskall-Wallis-Test angewendet. Zur Korrektur des multiplen Testens der paarweisen Vergleiche wurde eine Bonferroni-Holm-Korrektur durchgeführt. Eine Anpassung durch mögliche Störgrößen wie bspw. eine medizinische Behandlung zum Zeitpunkt der Aufnahme, klassische kardiovaskuläre Risikofaktoren und Labormarker, erfolgte durch die multifaktorielle Analyse der Kovarianz für den dekadischen Logarithmus von sGPVI. Prädiktive Werte von sGPVI und pGPVI für die Entwicklung von ACS wurden durch Anwendung der binären logistischen Regressionsanalyse bewertet. Unter Verwendung von ROC-Kurven wurde der optimale Cutoff-Wert von sGPVI und pGPVI für ein ACS bestimmt. Um eine statistische Differenz zwischen der Fläche unter den Kurven (AUC) von sGPVI und pGPVI in der ROC-Analyse, wurde ein DeLong-Test unter Verwendung von Analyse-it für Excel von Microsoft (Version 2.20) Analyse-it Software, Ltd., http://www.analyse-it.com/; 2009 verwendet. Alle anderen statistischen Analysen wurden unter Verwendung der Software PASW Statistics für Windows Version 18.0, 2009 (IBM SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt.
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3. Ergebnisse
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Die Studienpopulation umfasste 2.438 konsekutive Patienten mit einer symptomatischen CAD, die einer koronaren Angiographie unterzogen wurden. Die Patienten zeigten entweder eine SAP (n = 1.371) oder ACS (n = 1.067). Von den ACS-Patienten zeigten 724 Patienten ein NSTEMI und 343 Patienten einen STEMI. Details der demographischen Daten sind in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
| Charakteristiken | Insgesamt | ACS | SAP |
| | (n = 2.438) | (n = 1.067) | (n = 1.371) |
| Alter – Jahre | 67,4 ± 11,2 | 67,6 ± 11 | 67,3 ± 11,4 |
| Geschlecht – Anzahl (%) | | | |
| Weiblich | 787 (28,2) | 277 (26) | 410 (29,9) |
| Männlich | 1751 (71,8) | 790 (74) | 961 (70,1) |
| Kardiovaskuläre Risikofaktoren – Anzahl (%) | | | |
| Arterielle Hypertension | 1921 (78,8) | 822 (77) | 1099 (80,2) |
| Hyperlipidämie | 1705 (69,9) | 770 (72,2) | 935 (68,2) |
| Diabetes | 781 (32) | 325 (30,5) | 456 (33,3) |
| Familiärer Hintergrund von CAD | 469 (19,2) | 196 (18,4) | 273 (19,9) |
| Rauchen | 998 (40,9) | 448 (42) | 550 (40,1) |
| Koronare Arterienerkrankung – Anzahl (%) | | | |
| 1 Gefäß | 783 (32,1) | 366 (34,3) | 417 (30,4) |
| 2 Gefäße | 802 (32,9) | 303 (28,4) | 499 (36,4) |
| 3 Gefäße | 853 (35) | 398 (37,3) | 455 (33,2) |
| LV-Auswurf-Fraktion – Anzahl % | | | |
| Normal | 1287 (52,8) | 565 (53) | 722 (52.7) |
| Leicht reduziert | 552 (22,7) | 239 (22,4) | 313 (22,8) |
| Moderat | 323 (13,2) | 132 (12,4) | 191 (13,9) |
| Gering | 276 (11,3) | 131 (12,2) | 145 (10,6) |
| Medikation – Anzahl (%) | | | |
| ACE-Inhibitoren | 1372 (56,3) | 654 (61,3) | 718 (52,4) |
| Angiotensin-Rezeptorblocker | 284 (11,7) | 114 (10,7) | 170 (12,4) |
| Betablocker | 1609 (66) | 687 (64,4) | 922 (67,3) |
| Statine | 1299 (53,3) | 596 (55,9) | 703 (51,3) |
| Aspirin | 1270 (52,1) | 545 (51,1) | 725 (52,9) |
| Clopidogrel | 215 (8,8) | 62 (5,8) | 153 (11,2) |
| Vitamin K Antagonist | 236 (9,7) | 97 (9,1) | 139 (10,1) |
Tabelle 1: Charakteristika der Patienten und medizinische Behandlung während des Klinikaufenthalts. *Mittelwert ± Standardabweichung. LV = linksventrikulär, ACE = angiotensinkonvertierendes Enzym.
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Um einen Sandwich-Immunassay zur Bestimmung von sGPVI im Plasma zu etablieren, wurden sieben eigenentwickelte monoklonale Antikörper gegeneinander in Bezug auf deren Fähigkeit gescreent, als Fänger- oder Detektionsmoleküle zu fungieren. Der Assay wurde auf einer Arrayplattform für eine magnetische Bead-Suspension entwickelt (Luminex, L100); Carson und Vignali (a. a. O.). Das beste Antikörperpaar wurde gemäß dem besten Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) ausgewählt, indem das Fluoreszenzsignal bei 125 ng/l sGPVI-Standard durch das ohne Standard geteilt wurde (1A). Zusätzlich wurden die Antikörper auf Kreuzreaktivität mit Maus-sGPVI getestet, um eine geeignete Verdünnungsmatrix für rekombinantes sGPVI zu identifizieren (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse zeigten keine Kreuzreaktivität der Antikörper für Maus-sGPVI. Deshalb wurde kommerziell erhältliches Mausserum als Matrix zur Herstellung von Standardverdünnungen verwendet. Eine typische Kalibrierungskurve in 10% Mausserum ist in 1B gezeigt. Die Rückgewinnung von rekombinantem sGPVI lag zwischen 80 bis 120% über den gesamten Bereich der Dosiswirkungskurve von 8 bis 500 ng/l (1C). Zur Präzisionsanalyse wurden drei verschiedene Mengen von rekombinantem sGPVI in bezüglich sGPVI deplettiertes humanes Plasma hinzugegeben (25, 6,25 und 1,55 μg/l), wodurch hohe, mittlere und niedrige Plasmakonzentrationen reflektiert wurden. Diese drei verschiedenen Proben wurden 50fach verdünnt, um den Arbeitsbereich des Sandwich-Immunassays herzustellen. Die Intra-Assay-Präzision wurde durch fünf Bestimmungen pro Konzentration gemessen. Die Inter-Assay-Präzision wurde aus fünf unabhängigen Assays berechnet. Die Koeffizienz der Intra-Assay-Variabilität überschritt nicht 7% und die Inter-Assay-Werte lagen nicht höher als bei 14% (Tabelle 2). Die Werte für die Assay-Genauigkeit sind identisch mit der Intra-Assay-Präzision, da kein zertifizierter Standard zur Verfügung steht.
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Die gleichen Proben wurden zur Untersuchung der Stabilität des Analyten verwendet. Dazu wurden Aliquote keinem, einem, zwei, drei oder vier Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Für jeden Zyklus wurden Proben in flüssigem Stickstoff einfroren und bei 37°C aufgetaut. Die Ergebnisse zeigten keine Auswirkungen des Einfrier- und Auftauvorgangs, was auf eine hohe Stabilität des Analyten hindeutet (Tabelle 3). Die Variation dieser Ergebnisse lag nahe bei der bestimmten Intra-Assay-Präzision (Tabellen 2 und 3).
| | Intra-Assay-Variabilität (n = 5) | Inter-Assay-Variabilität (n = 5) |
| Erwarteter Wert [ng/l] | sGPVI [ng/l] | SD [ng/l] | CV [%] | sGPVI [ng/l] | SD [ng/l] | CV [%] |
| 500 | 438 | 4 | 1 | 462 | 51 | 11 |
| 125 | 108 | 3 | 3 | 118 | 16 | 14 |
| 31 | 34 | 2 | 7 | 34 | 5 | 14 |
Tabelle 2: Assay-Präzision
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Die Intra- und Inter-Assay-Präzision wurde bestimmt, indem drei Proben enthaltend hohe, mittlere und niedrige Mengen von rekombinantem löslichem Glykoprotein VI (sGPVI) getestet wurden. sGPVI wurde in 2%igem humanem Plasma, das bezüglich GPVI-deplettiert war, hinzugegeben, eingefroren und bei –20°C gelagert. Die Proben wurden unabhängig fünf Mal in fünf Replikaten gemessen.
| | Stabilität des Analyten (Fünf Zyklen des Einfrieren und Auftauens) |
| Erwarteter Wert [ng/l] | sGPVI [ng/l] | SD [ng/l] | CV [%] |
| 500 | 516 | 43 | 8 |
| 125 | 118 | 7 | 6 |
| 31 | 33 | 2 | 6 |
Tabelle 3: Stabilität des Analyten
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Die Stabilität des Analyten wurde bestimmt, indem drei Proben enthaltend hohe, mittlere und niedrige Mengen von rekombinantem löslichen Glykoprotein VI (sGPVI) nach keinem Zyklus, einem, zwei, drei oder vier Zyklen des Einfrierens und Auftauens getestet wurden.
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Patienten mit NSTEMI und STEMI wiesen deutlich niedrigere sGPVI-Spiegel als Patienten mit SAP auf (μg/l ± SD: 8,4 ± 3,6 und 8,6 ± 4,1 vs. 9,8 ± 4,8; P = 0,002) (2A), während die Untergruppenanalyse eine signifikant erhöhte Oberflächenexpression von pGPVI in NSTEMI (n = 276) und STEMI (n = 80) im Vergleich mit SAP (n = 655) ergab (MFI ± SD: 21,2 ± 8,1 und 19,8 ± 6,8 vs. 18,5 ± 7,7; P = 0,02 und P = 0,018) (2B). Bei einem Vergleich der aufgeschlüsselten ACS-Gruppen NSTEMI und STEMI zeigten weder sGPVI (P = 0,424) noch pGPVI einen signifikanten Unterschied bei diesen Gruppen (P = 0,652).
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Außerdem wurde eine schwache inverse Korrelation von pGPVI und sGPVI gefunden (r = –0,076; P = 0,023) (2C). Die AUC in der ROC-Analyse betrug 0,716; 95% Konfidenzintervall (CI): 0,681–0,751 für sGPVI, was eine Unterscheidung von Patienten mit SAP von jenen mit ACS ermöglicht, die der Kurve der Untergruppenanalyse für pGPVI überlegen war (DeLong-Test: p = 0,044; AUC: 0,624; 95% CI: 0,586–0,662) (2D). Unter Anwendung von ROC-Kurven wurden Cutoff-Werte für die Identifizierung eines ACS bestimmt, die bei 8,75 μg/l für sGPVI bzw. 18,6 MFI für pGPVI betrugen. Der Cutoff-Wert von 8,75 μg/l resultierte in einer Sensitivität von 72,6% und einer Spezifität von 61,4%.
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Um zu testen, ob sGPVI durch Störgrößen beeinflusst wird, wurde der dekadische Logarithmus von GPVI zwischen ACS und SAP durch mögliche Störgrößen angepasst, wie bspw. Alter, Geschlecht, kardiovaskuläre Risikofaktoren und medizinische Behandlung. Eine multifaktorielle Analyse der Kovarianz ergab eine unabhängige sGPVI-Konzentration zwischen ACS und SAP (P = 0,040).
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sGPVI (P = 0,023) ist negativ und pGPVI (P = 0,028) positiv mit der Entwicklung von ACS assoziiert, und zwar auf eine Art und Weise, die anderen konventionellen Labormarkern, wie bspw. Troponin-I (p = 0,055), in einem sehr frühen Stadium der Erkrankung während des Klinikaufenthalts gemäß der binären logistischen Regressionsanalyse überlegen ist (Tabelle 4).
| | P-Wert | Odds Ratio (OR) | 95% Konfidenzintervall (CI) von OR |
| | | | Unterhalb | Oberhalb |
| Lösliches GPVI (μg/l) | 0,023 | 0,959 | 0,925 | 0,994 |
| Plättchen-GPVI (MFI) | 0,028 | 1,083 | 1,008 | 1,163 |
| Troponin-I (μg/l) | 0,055 | 1,075 | 0,998 | 1,158 |
| Kreatinkinase (U/l) | 0,377 | 1,001 | 0,999 | 1,002 |
| C-reaktives Protein (mg/dl) | 0,586 | 1,063 | 0,853 | 1,324 |
Tabelle 4: Assoziationen von löslichem und Plättchen-GPVI mit der Entwicklung von ACS
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3. Fazit
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Die Erfinder stellen erstmals ein Verfahren bereit, mit dem zuverlässig zwischen ACS und SAP unterschieden werden kann. Das Verfahren ist in Bezug auf Sensitivität und Genauigkeit den bisherigen Verfahren aus dem Stand der Technik überlegen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Bigalke et al. (2009), Influence of Platelet Countonthe Expression of Platelet Collagen Receptor Glycoprotein VI (GPVI) in Patients with Acute Coronary Syndrome, Thromb. Haemost. 101, Seiten 911–915, vgl. insbesondere Seite 913, rechte Spalte, 1. Absatz und Fig. 1B [0010]
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- Bigalke et al. (2006; a. a. O.) [0037]
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