KR20220155178A

KR20220155178A - 방사선 치료 예후 예측용 또는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물

Info

Publication number: KR20220155178A
Application number: KR1020210140942A
Authority: KR
Inventors: 권준혜; 김연주; 김은주; 배인화; 신의섭; 이지용; 김광석
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2022-11-22

Abstract

본 발명은 CTSE 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 및 방사선 저항성 암 바이오마커 조성물에 관한 것으로서, 상기 CTSE가 상향 조절되는 경우, 방사선 처리 시 암세포의 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, CTSE를 이용하면 암 환자의 방사선 치료에 대한 예후를 미리 평가함으로써 환자 맞춤형 치료법을 결정할 수 있다.

Description

방사선 치료 예후 예측용 또는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for predicting prognosis of radiation therapy or diagnosing radiation resistant cancer}

본 발명은 카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 환자의 방사선 치료 예후 예측 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 방사선 저항성 암 진단 방법에 관한 것이다.

대장암(Colorectal cancer: CRC)은 전세계에서 세 번째로 빈번하게 발병하는 암종으로, 전체 암의 약 10%를 차지한다. 암 치료에 있어서 수술, 방사선 요법, 화학 요법 등의 발전으로 대장암 환자의 5년 생존율이 증가하여 왔음에도 불구하고, 대장암은 진행되는 동안 증상이 거의 없어 사망률이 높은 편이다.

대장암은 직장암과 결장암으로 분류할 수 있으며, 직장암과 결장암은 여러 측면에서 유사하지만 치료 방법에 있어서 다소 차이를 보인다. 직장암의 경우, 공간이 좁고 다른 기관과 인접하여 직장암을 제거하는 수술은 매우 복잡하고 고도의 기술을 요한다.

대장암 표준 치료로서 선행 화학 방사선 요법(neoadjuvant chemo-radiation therapy: NCRT), 근치적적 수술(radical surgery)과 전직장간막 절제술(total mesorectal excision: TME)이 권장되며, NCRT의 경우 국소 재발율을 감소시키고 생존율을 높이는 것으로 알려져 있다. 일부 환자의 경우 근치적 수술 전에 병리학적으로 완전 반응(pathologically complete response: pCR)을 보이나, 근치적 수술은 여전히 실시되고 있다. 또한 NCRT에 대한 반응 촉진제로 전통적으로 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)을 사용하여 왔으나 근래에는 반응율을 올리기 위해 보다 강한 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 이리노테칸(irinotecan)과 같은 세포독성 치료제 및 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 억제제 (세툭시맙(cetuximab) 및 파니투무맙(panitumumab)), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF) 억제제(베바시주맙(bevacizumab) 및 애플리버셉트(aflibercept)) 등의 표적치료제가 방사선 치료에 병행하여 투여되고 있으나 이의 과잉치료에 대한 논란은 지속되고 있다.

환자의 질병 상태나 치료 반응성을 예측할 수 있다면 위와 같은 외과적인 수술이나 화학 요법을 선택적으로 시행할 수 있으며, 필요 이상의 수술로 인한 사망이나 삶의 질이 저하되는 것을 막을 수 있다.

의학계에서는 정밀의학이 대두되면서 방사선 반응성에 따른 맞춤형 치료에 대한 수요가 증가하고 있으며, 직장암 측면에서는 이를 위하여 방사선 반응성 여부를 식별하는 것이 선행되어야 한다. 즉, 방사선 치료 반응성 및 이의 예후를 예측할 수 있는 마커의 개발이 요구되고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0094767호 (2014.07.31. 공개)

본 발명의 목적은 카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 이용한 대장암 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 이용한 방사선 저항성 대장암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 통한 대장암 세포에 대한 방사선 반응성 증진제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 키트를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 키트를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 개체에서 분리된 시료로부터 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 방사선 치료 예후가 좋지 않다고 판단하는 단계;를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 개체에서 분리된 시료로부터 카뎁신 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 방사선 저항성 대장암이라고 판단하는 단계;를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 대장암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질을 접촉한 대장암 세포에서 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 시료와 비교하여 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 감소한 시험물질 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 증가한 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 대장암 세포에 대한 방사선 반응성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물 또는 방사선 저항성 대장암 진단용 바이오마커에 관한 것으로, 임상 데이터 분석을 통하여, CTSE가 방사선 저항성에 유의미한 영향을 미침을 확인하였는 바, 대장암 환자의 방사선 치료에 대한 예후를 미리 평가함으로써 환자 맞춤형 치료법을 결정하고 과잉 치료에 따른 부작용을 최소화할 수 있다.

도 1은 방사선 반응성군 및 방사선 저항성군에 속하는 환자의 선행 화학 방사선 요법(neoadjuvant chemo-radiation therapy: NCRT) 치료 전과 후, 내시경 이미지와 골반 MRI을 나타낸 것이다.
도 2a는 검체에서 오르가노이드를 구축하는 과정을 나타낸 것이고, 도 2b는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드의 H&E 염색 이미지를 나타낸 것이다.
도 3a는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 0Gy 및 5Gy 방사선 조사 후 이미지 변화를 나타낸 것이고, 도 3b는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 0Gy, 2Gy, 4Gy 및 6Gy 방사선 조사 후 크기 변화를 나타낸 것이고, 도 3c는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 방사선량을 달리하여 방사선 조사하였을 때 생존율 커브(survival fraction curves)를 나타낸 것이고, 도 3d는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 0Gy, 2Gy, 4Gy 및 6Gy 방사선 조사 후 생존율을 MTT 분석으로 확인 것이다.
도 4는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에서 유의미한 DEGs를 도출한 결과이다. 도 4a는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에서 유의미한 DEGs를 발견하여 볼케이노 플롯으로 나타낸 것이다. 도 4b는 발현정도 차이를 이용하여 DNA 복구 관련 유전자의 농축 정도를 GSEA 농축 플롯으로 나타낸 것이다. 도 4c는 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드와 방사선 저항성 환자 유래 오르가노이드에서 DEGs의 수를 나타낸 것이다. 도 4d는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드 간의 중요한 DEGs를 히트맵 분석으로 나타낸 것이다.
도 5는 DEGs에서 PPI 네트워크와 서브 네트워크를 생성한 결과로, 원형(노드)은 유전자, 원형 연결(엣지)은 직간접적인 상호작용을 나타낸다. 도 5a는 PPI 네트워크를 도식화한 것이고, 도 5b, 5c 및 5d는 허브 네트워크를 도식화한 것이다. 허브 유전자는 붉은색, 함께 발현되는 유전자는 중요도에 따라 주황색, 노란색 또는 파란색으로 나타내었다.
도 6은 DEGs와 관련된 GO 용어에서 파생된 CluGo 분석 기반 농축 맵에 관한 것으로, 상호 연관성이 높은 GO 용어를 제공한다(볼드체: 상위 GO 용어).
도 7a는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에서 pRT-PCR을 통해 차별적으로 발현되는 후보 유전자들의 mRNA 수준을 나타낸 것이고, 도 7b는 cBioPortal 분석을 통하여 대장 선암종 임상 발현 데이터 세트에서 추출한 데이터 세트를 나타낸 것이다.
도 8은 방사선 반응성 환자 및 방사선 저항성 환자 유래 오르가노이드에서 CTSE 유전자의 메틸화 수준을 비교한 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 ANO1(anoctamin 1), MEGF6(multiple EGF like domains 6), PSCA(prostate stem cell antigen), GPSM1(G protein signaling modulator 1), S100A4(S100 calcium binding protein A4), PRKAR2B(protein kinase cAMP-dependent type II regulatory subunit beta), PDZRN3(PDZ domain containing ring finger 3), EFR3B(EFR3 homolog B), CAMK1D(calcium/calmodulin dependent protein kinase ID), FREM2(FRAS1 related extracellular matrix 2), BACE1(beta-secretase 1), IGFL2-AS1(GFL2 antisense RNA 1), AXL(AXL receptor tyrosine kinase), AMIGO2(adhesion molecule with Ig like domain 2), FAM178B(family with sequence similarity 178 member B), IL1RN(interleukin 1 receptor antagonist), NKD2(NKD inhibitor of WNT signaling pathway 2), NMU(neuromedin U), RSAD2(radical S-adenosyl methionine domain containing 2), RUNX3(RUNX family transcription factor 3), SIM2(SIM bHLH transcription factor 2), TMEM25(transmembrane protein 25), TMEM154(transmembrane protein 154), TNNT1(troponin T1, slow skeletal type), TRIM7(tripartite motif containing 7), TTC9(tetratricopeptide repeat domain 9), UNC13D(unc-13 homolog D), WNT10A(Wnt family member 10A), PLSCR4(phospholipid scramblase 4), CBR3(carbonyl reductase 3), CXorf57(RPA1 related single stranded DNA binding protein), ALS2CL(ALS2 C-terminal like), LGMN(legumain), SLC39A10(solute carrier family 39 member 10), ANXA3(annexin A3), ANXA2(annexin A2), FUT8(fucosyltransferase 8), ADAM9(ADAM metallopeptidase domain 9), NPC1(NPC intracellular cholesterol transporter 1), S100A16(S100 calcium binding protein A16), NRCAM(neuronal cell adhesion molecule), LIPH(lipase H), CD55(CD55 molecule (Cromer blood group)), KIZ(kizuna centrosomal protein), IL18(interleukin 18) 및 APOE(apolipoprotein E)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "방사선 치료(Radiation therapy)"는 치료 부위에 방사선을 조사하여 암세포의 크기를 줄여주거나 제거하고 주변으로 증식하는 것을 막기 위한 암 치료방법을 의미한다. 방사선 치료는 암세포 주변에 인접한 건강한 정상 세포들을 손상시키기도 하지만, 건강한 세포의 대부분은 방사선 치료가 끝난 후 서서히 회복한다.

본 명세서에서 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로)을 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방 모두를 가리킨다. 상기 치료는 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "예후 예측"은 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 "예후 예측"이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 "예후 예측"은 암 환자의 방사선 치료 후, 질환의 경과 및 완치 여부를 미리 예상하여 암 환자의 무병 생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 방사선 치료 후 암 환자의 무병 생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 방사선 치료 후 암 환자의 무병 생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 암 환자로부터 암이 재발하거나 또는 암으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 종양 퇴행 등급(tumor regression grade: TRG) 시스템의 정의에 의할 때 등급 0, 완전 반응, 완전 관해 또는 잔류 종양 세포가 확인되지 않다는 것일 수 있고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 치료에 대한 반응이 낮거나 거의 없는 상태, 또는 TRG 등급 3일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "바이오마커"는 대장암 방사선 치료 예후가 좋은 상태와 예후가 나쁜 상태를 구분할 수 있는 생체 분자 또는 방사선 치료 반응성이 있는 대장암과 방사선 치료 저항성이 있는 대장암을 구분할 수 있는 생체 분자를 의미한다.

통상의 기술자라면 UCSC genome browser 또는 GenBank를 이용하여 유전자 및 단백질, 이들의 서열을 확인할 수 있다. 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

상기 대장암은 대장에서 발생하는 종양을 모두 포함할 수 있고, 주위 조직에 침윤하면서 성장하는 직장암, 결장암 또는 이의 조합일 수 있으며, 구체적으로 국소 진행성 직장암(locally advanced rectal cancer: LARC)일 수 있다.

또한, 본 발명은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 조성물은 ADAM9, ALS2CL, ANO1, ANXA2, ANXA3, APOE, AXL, CD55, FUT8, GPSM1, IL18, KIZ, LGMN, LIPH, NKD2, NMU, NPC1, NRCAM, PRKAR2B, PSCA, RUNX3, S100A16, S100A4, SIM2, SLC39A10, TMEM154, TMEM25, TNNT1 및 TRIM7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함할 수 있다.

상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이 항체, 펩타이드, 앱타머, 화합물 등일 수 있으며, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하거나 상기 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자 DNA, RNA, mRNA 등에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리포터, 펩타이드 등일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자 발현을 조절하는 프로모터 부위에 메틸화된 영역과 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리포터, 펩타이드 등일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3'-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"는 상보적인 핵산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무, 발현량 등을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 CTSE 등에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지 용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 또는 본 발명의 키트는 표적 영역의 핵산 서열을 특이적으로 증폭하고, 증폭 산물의 존재, 양 등을 확인하기 위하여, 완충액, DNA 중합 효소, DNA 중합효소보조인자 및 dNTPs 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 상기 키트는, RT-PCR 키트, DNA 분석용 키트(예를 들어, DNA 칩), 단백질 칩 키트 등 일 수 있다.

더불어, 본 발명은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "방사선 저항성"은 표준 치료인 방사선 치료 후 암세포의 반응이 낮거나 거의 없는 상태, 또는 TRG 등급 3을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.

상기 대장암은 상술한 바와 같고, 직장암, 결장암 또는 이의 조합일 수 있으며, 구체적으로 LARC 일 수 있다.

또한, 본 발명은 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 조성물은 ADAM9, ALS2CL, ANO1, ANXA2, ANXA3, APOE, AXL, CD55, FUT8, GPSM1, IL18, KIZ, LGMN, LIPH, NKD2, NMU, NPC1, NRCAM, PRKAR2B, PSCA, RUNX3, S100A16, S100A4, SIM2, SLC39A10, TMEM154, TMEM25, TNNT1 및 TRIM7로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

상기 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제, 및 상기 유전자의 발현 수준을 측정하거나 상기 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는 상술한 바와 같다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 키트을 제공한다.

본 발명의 키트는 상술한 바와 같이 RT-PCR 키트, DNA 분석용 키트(예를 들어, DNA 칩), 단백질 칩 키트 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

더불어, 본 발명은 (a) 개체에서 분리된 시료로부터 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 방사선 치료 예후가 좋지 않다고 판단하는 단계;를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고, 상기 (b) 단계는 측정된 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 더 포함하고, 상기 (c) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 방사선 치료 예후가 좋지 않다고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 개체는 대장암 방사선 치료 예후를 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 인간(Homo sapiens), 마우스, 래트, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 개체는 아시아계 인, 구체적으로 한국인일 수 있다.

상기 시료는 개체로부터 수득된 시료로서, 조직, 개체 유래 오르가노이드, 세포, 세포 집합체, 혈액, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 등을 포함할 수 있다. 상기 시료는 순수하게 분리된 핵산, 조 분리된 핵산, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물, 세포 유리 핵산 등을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함할 수 있고, 구체적으로 CpG 함유 핵산일 수 있다.

상기 단백질 발현 수준을 측정하는 것은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머, 화합물 등을 이용할 수 있고, 이는 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩 등의 분석법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 것은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 이용할 수 있고, 이는 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, 실시간 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이드 시퀀싱 등의 분석법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 것은 상기 유전자 프로모터 부위에 메틸화된 영역과 특이적으로 결하는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리포터, 펩타이드 등을 이용할 수 있고, 이는 정량적 중합효소연쇄반응, 메틸화 특이 중합효소연쇄반응, 메틸화 특이 경쟁적 중합효소연쇄반응, 실시간 메틸화 특이 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩, 파이로 시퀀싱 및 바이설파이드 시퀀싱 등의 분석법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 대조군은 방사선 치료 예후가 좋은 개체 또는 정상인 개체일 수 있다.

더불어, 본 발명은 (a) 개체에서 분리된 시료로부터 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (c) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 방사선 저항성 대장암이라고 판단하는 단계;를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고, 상기 (b) 단계는 측정된 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 더 포함하고, 상기 (c) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 방사선 저항성 대장암이라고 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 개체, 시료, 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 방법 등에 대하여는 상술한 바와 같다.

상기 대조군은 방사선 반응성 또는 민감성 양성 종양, 암, 대장암 등일 수 있다.

더불어, 본 발명은 (a) 대장암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 시험물질을 접촉한 대장암 세포에서 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 시료와 비교하여 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 감소한 시험물질 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 증가한 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 대장암 세포에 대한 방사선 반응성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 (b) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고, 상기 (c) 단계는 측정된 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "방사선 반응성 증진제"는 대장암 세포에 대한 방사선 치료의 효능을 증진시킬 수 있는 모든 물질, 예를 들어, 핵산, 단백질, 추출물, 천연물, 화합물 등을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "시험물질"은 통상적인 선정 방식에 따라 방사선 반응성을 증진시킬 수 있는 가능성을 가진 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 모든 물질, 예를 들어, 핵산, 단백질, 추출물, 천연물, 화합물 등을 의미한다. 구체적으로 상기 "시험물질"은 저분자 화합물, 유기합성물질, 천연물질, microRNA, siRNA, shRNA, 항체, 앱타머 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "방사선 반응성 증진제 스크리닝 방법"은 대장암 방사선 반응성을 증진시킬 수 있는 시험물질 또는 후보물질의 부재 하에서 세포에서의 상기 CTSE 등의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하고, 상기 시험물질 또는 후보물질의 존재 하에서 상기 CTSE 등의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 시험물질 또는 후보물질이 존재할 때의 상기 CTSE 등 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 상기 시험물질 또는 후보물질 부재 하에서의 수준보다 감소하는 경우, 또는 상기 시험물질 또는 후보물질이 존재할 때의 상기 CTSE 등 프로모터 메틸화 수준이 상기 시험물질 또는 후보물질 부재 하에서의 수준보다 증가하는 경우, 그러한 시험물질 또는 후보물질을 방사선 방응성 증진제로 예측할 수 있다. 이러한 스크리닝 방법에 의하여 얻어진 물질은 이후 방사선 반응성 증진제에서 선도 물질(leading compound)로서 작용할 수 있다.

상기 대장암 세포는 개체, 대장 조직 또는 대장 조직 유래 오르가노이드로부터 수득한 세포 또는 세포 집합체를 의미한다. 상기 대장암 세포는 1차, 배양 세포, 세포주 등일 수 있다.

상기 대조군은 시험물질을 접촉시키지 않은 세포, 조직 또는 이의 오르가노이드로, 상기 시험물질을 처리한 군과 병렬관계에 있는 세포, 조직 또는 이의 오르가노이드일 수 있다. 구체적으로, 상기 대조군은 대장암 세포, 대장암 조직 또는 대장암 환자 유래 오르가노이드일 수 있다.

상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 방법 등에 대하여는 상술한 바와 같다.

이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<실시예 1> 방사선 치료 반응성 여부에 따른 직장암 환자 분류 및 임상적 특성 확인

원자력병원에 방문한 국소 진행성 직장암(locally advanced rectal cancer: LARC) 환자 6인을 2018년 4월부터 2019년 5월까지 선행 화학 방사선 요법(neoadjuvant chemo-radiation therapy: NCRT)으로 치료한 후, 전직장간막 절제술(total mesorectal excision: TME)로 적출된 시료를 분석하여, 완전 반응(complete response)군과 저반응(poor response)군으로 분류하였다.

구체적으로, 병기는 NCRT 치료 전과 후에 골반 자기공명영상(magnetic resonance imaging: MRI), 흉부, 복부 및 골반 컴퓨터 단층 촬영(computerized tomography: CT), 및 18-플루오로-2-데옥시-글루코스 양전자 단층 활영(18-fluoro-2-deoxy-glucose positron emission tomography: PET)/컴퓨터 단층 촬영(computerized tomography: CT) 스캔으로 판단하였다.

상기 NCRT 요법은 방사선 치료를 28일 동안 50.4Gy 조사하였으며, 화학 요법은 수술전 매 4주, 5일 동안 단일 제제의 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)을 425mg/m² 주입하였다. 이어서, 방사선 치료 6주 내지 8주 후에, TME에 따라 근치적 수술(radical surgery)을 실시하였다.

NCRT 요법 후, 암의 병리학적 반응 여부는 대한병리학회 소화기병리연구회가 제안한 종양 퇴행 등급(tumor regression grade: TRG) 시스템의 정의에 따라 평가하였다. 등급 0 - 완전 반응(완전 관해), 확인 된 잔류 종양 세포 없음; 1 등급 - 거의 완전 반응, 종양상(tumor bed)에 종양 세포 거의 없거나 흩어진 상태로 섬유화(fibrosis)를 보임; 2 등급 - 부분 반응, 잔류 종양선이 종양상에서 쉽게 관찰됨; 3 등급 - 저반응 또는 반응 없음.

환자들은 TRG에 따라 완전 반응군(방사선 반응성군, radio-sensitive 또는 RS로 표기)(3인)과 저반응군(방사선 저항성군, radio-resistant 또는 RR로 표기)(3인) 두 군으로 분류하였다. 완전 반응군과 저반응군에 속하는 환자들의 NCRT 치료 전과 후 임상적인 특징들을 표 1에 나타내었다. 모든 환자들은 NCTR 요법 전 어느 정도의 림프절 침윤을 보였다. 도 1은 방사선 반응성군 및 방사선 저항성군에 속하는 환자의 내시경 이미지와 골반 MRI을 나타낸 것이다. 도 1 및 표 1에 나타낸 바와 같이, 방사선 반응성 환자는 치료 후 TRG가 0 등급을 나타내었다(즉, pCR).

시료 번호	RR-1	RR-2	RR-3	RS-1	RS-2	RS-3
성별	남성	남성	여성	남성	남성	여성
연령	77	71	76	49	64	62
BMI(Kg/m²)	16.5	22.7	24.3	17.7	24.6	17.3
임상 병기	T3N+	T3N+	T3N+	T3N+	T2N+	T3N+
종양 크기 preRT MRI (cm)	4.2	5.4	6.5	6.5	3.8	3.5
종양 크기 postRT MRI (cm)	2.3	5.3	2.5	4	1.6	2.5
종양 크기 병리학(cm)	2.5	7.5	3.5	3.8	1	1.2
퇴행/반응 등급	최소	최소	최소	완전	완전	완전
수술 후 병기 (ypStage)	T3N1M0	T3N1M0	T3N0M0	T0N0M0	T0N0M0	T0N0M0
재발 여부	폐전이	국소재발	없음	없음	없음	없음
수술 후 경과 (월)	19	17	18	27	23	24
마지막 방문시 상태	폐전이 사망	재발 생존	재발없이 생존	재발없이 생존	재발없이 생존	재발없이 생존

* RT: 방사선 요법, ypStage: 수술 시료에서 선행 치료 후 병리학적 단계

<실시예 2> 방사선 반응성 / 저항성 환자 유래 오르가노이드 구축

방사선 반응성군 및 방사선 저항성군 환자 유래 오르가노이드를 아래와 같이 구축하고 분석에 사용하였다.

NCRT 요법 전 환자 직장에서 생검 시료를 수득하였다. 수집된 시료는 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin: H&E) 염색 방법으로 선암종(adenocarcinoma) 또는 정상 크립트(crypt)인지 확인하였다.

방사선 반응성군 및 방사선 저항성군 환자 유래 오르가노이드는 도 2a와 같은 방법으로 분리하였다(Park, M. Butyrate enhances the efficacy of radiotherapy via FOXO3A in colorectal cancer patientderived organoids. Int J Oncol 2020, 57, 1307-1318). 처음 2 내지 3일 동안 배양 배지에 10μM의 Y-27632를 가하여 아노이키스(Anoikis)를 방지하였다. 크기가 200μm가 되면 오르가노이드를 Gentle 세포 분리 시약(STEMCELL Technologies)을 사용하고 파이펫팅하여 계대하였다. 오르가노이드의 이미지는 IX73 도입현미경(Olympus Corporation, 배율, x40)과 EVOS FL 세포 이미징 시스템 형광 현미경 (Thermo Fisher Scientific, Inc., 배율, x200)을 사용하여 분석하였다.

도 2b는 환자 오르가노이드의 H&E 염색 이미지를 나타내는 것으로, 환자 유래 오르가노이드는 환자의 조직 구조와 유사한 형태를 보였다.

<실시예 3> 방사선 반응성 / 저항성 환자 유래 오르가노이드의 방사선 반응성 확인

방사선 반응성군 및 방사선 저항성군 환자 유래 오르가노이드에 방사선을 조사하고 크기와 생존율을 아래와 같이 확인하였다.

종양 생존율 분석을 위해, 환자 유래 오르가노이드를 TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)로 다시 현탁하였다. 이어서, 수일동안 오르가노이드를 3.81 Gy/분의 선량률, ¹³⁷Cs γ-선 소스(Atomic Energy of Canada Ltd.)의 이온화 방사선으로 처리하였다.

오르가노이드를 네오 세포³ 이미저(Screen)로 분석하여 크기 변화를 확인하였다. 또한, CellTiter 96 AQUEOUS 원 솔루션(Promega)를 사용하여 생존율을 확인하였다. 광학 밀도는 마이크로플레이트 흡광도 리더기(BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)로 490nm에서 측정하였다.

도 3a는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 0Gy 및 5Gy 방사선 조사 후 이미지 변화를 나타낸 것이고, 도 3b는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 0Gy, 2Gy, 4Gy 및 6Gy 방사선 조사 후 크기 변화를 나타낸 것이고, 도 3c는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 방사선량을 달리하여 방사선 조사하였을 때 생존율 커브(survival fraction curves)를 나타낸 것이고, 도 3d는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 0Gy, 2Gy, 4Gy 및 6Gy 방사선 조사 후 생존율을 MTT 분석으로 확인 것이다. 각 데이터는 대조군 오르가노이드 데이터로 정규화하고 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드의 크기는 방사선 조사에 의하여 현저하게 감소하였으나, 방사선 저항성 환자 유래 오르가노이드의 크기는 방사선 조사에 의하여 유의미한 크기 변화를 보이지 않았다. 도 3b, 3c 및 3d에 나타낸 바와 같이, 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드는 크기, 수 및 생존율 측면에서 방사선 조사에 의하여 현저하게 감소하였으며, 이는 방사선 저항성 환자 유래 오르가노이드에 비하여 유의미한 차이를 보였다.

<실시예 4> 방사선 반응성 / 저항성 환자 유래 오르가노이드에서 차별적으로 발현되는 유전자 선별

방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에서 RNA 시퀀싱을 통하여 차별적으로 발현되는 유전자(differentially expressed genes: DEGs, 차별 발현 유전자, 차등 발현 유전자)를 선별하였다.

먼저, QIAzol 시약(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 오르가노이드에서 RNA를 분리하였다. 이 후, 품질은 RNA 6000 나노 칩 (Agilent Technologies, Amstelveen, Netherlands)을 사용하여 Agilent 2100 분석기로 분석하였으며, 정량은 나노드롭 2000 분광 광도계(ND-2000; Thermo Fisher Scientific Inc., DE, USA)를 사용하여 분석하였다.

RNA 시퀀싱(RNA-seq)은 환자 6인 유래 오르가노이드(방사성 저항성군 - RR1, RR2, RR3, 방사선 반응성군 - RS1, RS2, RS3)에서 순도와 완전성이 높은 RNA 시료 (RNA integrity number:RIN > 7)를 대상으로 수행하였다. 6개의 시료를 HiSeq 4000 시스템 (Illumina, CA, USA)에서 멀티플렉스 시퀀싱하였다. 시퀀싱 라이브러리는 HISAT v2.1.0 및 UCSC 게놈 브라우저(https://genome.ucsc.edu)를 사용하여 인간 게놈(hg 19) 참조 서열에 정렬시키고 주석달기(annotation)하였다.

QuantSeq 3 'mRNA-Seq 리드를 Bowtie2를 사용하여 정렬하였다. 게놈 및 전사체에 정렬하기 위해 게놈 어셈블리 서열 및 대표 전사체 서열로부터 Bowtie2 인덱스를 생성하였다. 정렬 파일을 사용하여, 전사체를 어셈블링하고 전사체의 양/수(abundances)를 추정하고 차별적으로 발현되는 DEGs를 도출하였다. DEGs는 고유 및 다중 정렬을 카운팅하여 결정하였다. 리드 카운팅 데이터는 Bioconductor 소프트웨어 패키지 edgeR를 사용하여 분위수 정규화 방법으로 처리하였다. 이어서, 엑셀 기반 차별적으로 발현되는 유전자 분석법(Excel-based Differentially Expressed Gene Analysis: ExDEGA, Ebiogen Inc., Korea)을 사용하여 데이터를 마이닝(mining)하고 그래픽으로 나타내었다. 상응하는 유전자가 없는 프로브 세트는 제외시켰다. P-값이 0.05 미만이고 절대 log₂(배수 변화)가 1 이상인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

DEGs의 경로 농축 분석을 위하여 온라인 생물학 정보 데이터베이스 다비드 (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery: DAVID, https://david.ncifcrf.gov/)를 사용하였다. DAVID로 어노테이션된 유전자 온톨로지(Gene Ontology: GO) 용어 농축 분석은 3가지 속성(분자 기능(molecular function: MF), 생물학적 프로세스(biological process: BP), 세포 구성요소(cellular component: CC)으로 구성하였다. 경로 농축 분석은 DAVID 웹사이트의 툴인 교토 유전자 및 게놈 백과사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes: KEGG)와 REACTOME을 사용하여 수행하였다. P-값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

도 4는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에서 유의미한 DEGs를 도출한 결과이다. 도 4a는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에서 1,741개의 유의미한 DEGs를 발견하고 볼케이노 플롯으로 나타낸 것이다. RNA 시퀀싱 과정에서 총 27,685 유전자를 분석하였으며, 그 가운데 1,741개가 DEGs에 해당하였다(|FC|≥2 및 Raw.p<0.05). 이어서, 단백질, RNA 및 DNA 경로 등과 관련된 유전자 세트 농축 분석(gene set enrichment analysis: GSEA)을 수행하였다(표 2). 도 4b는 발현정도 차이를 이용하여 DNA 복구 관련 유전자의 농축 정도를 GSEA 농축 플롯으로 나타낸 것이다. 도 4c는 방사선 반응성군(RS-1, RS-2 및 RS-3) 유래 오르가노이드와 방사선 저항성군(RR-1, RR-2 및 RR-3) 유래 오르가노이드 간의 DEGs의 수를 나타낸 것이다.

방사선 반응성 환자 2인 이상에서 공통적으로 나타나는 약 230개의 DEGs를 선별하였다. 도 4d는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드 간의 중요한 DEGs를 히트맵 분석으로 나타낸 것으로, 선별된 DEGs를 확인하였다.

유전자 세트 세부사항	크기	ES	NES	NOM P-값	FDR q -값
KEGG_프로테아좀	44	0.51	1.71	0.000	0.073
KEGG_세포 주기	125	0.48	1.61	0.000	0.104
KEGG_스플라이소좀	126	0.50	1.53	0.000	0.203
KEGG_RNA_폴리머라아제	29	0.59	1.52	0.000	0.198
KEGG_피리미딘 메타볼리즘	98	0.46	1.49	0.000	0.242
KEGG_미스매치 복구	23	0.60	1.49	0.000	0.209
KEGG_염기 절단 복구	33	0.53	1.49	0.000	0.185

* ES : 농축 점수, NES: 정규화 농축 점수, NOM P-값: 정규화된 P-값, FDR: 오류 발견율

농축 유전자들을 대상으로 GO 분석을 수행하여 DEGs 단백질 산물의 기능에 대한 정보를 수득하였다(표 3). GO 특성 중에서 세포주기 및 증식 경로(생물학적 프로세스), 세포외 및 원형질막(세포 구획), 및 수용체 및 스캐폴드 단백질(분자 기능)은 DEGs와 연관성이 높은 것으로 나타났다.

	용어	설명	Count	P-값
생물학적 프로세스 (BP)	GO:0050680	Negative regulation of epithelial cell proliferation	8	4.E-05
	GO:0045786	Negative regulation of cell cycle	6	4.E-04
	GO:0001525	Angiogenesis	11	5.E-03
	GO:0001934	Positive regulation of protein phosphorylation	8	6.E-03
	GO:0001937	Negative regulation of endothelial cell proliferation	4	1.E-02
	GO:0098609	Cell-cell adhesion	11	2.E-02
	GO:0007179	Transforming growth factor beta receptor signaling pathway	6	2.E-02
	GO:0042632	Cholesterol homeostasis	5	2.E-02
	GO:0051044	Positive regulation of membrane protein ectodomain proteolysis	3	3.E-02
	GO:0016477	Cell migration	8	3.E-02
세포 구성요소 (CC)	GO:0070062	Extracellular exosome	79	2.E-06
	GO:0005886	Plasma membrane	98	1.E-04
	GO:0005615	Extracellular space	42	1.E-04
	GO:0000139	Golgi membrane	22	1.E-03
	GO:0045121	Membrane raft	11	2.E-03
	GO:0031225	Anchored component of membrane	8	3.E-03
	GO:0005913	Cell-cell adherens junction	13	8.E-03
	GO:0005737	Cytoplasm	107	1.E-02
	GO:0048471	Perinuclear region of cytoplasm	19	2.E-02
	GO:0005576	Extracellular region	38	3.E-02
분자기능 (MF)	GO:0001618	Virus receptor activity	6	7.E-03
	GO:0097110	Scaffold protein binding	5	9.E-03
	GO:0005509	Calcium ion binding	22	1.E-02
	GO:0004861	Cyclin-dependent protein serine/threonine kinase inhibitor activity	3	1.E-02
	GO:0004859	Phospholipase inhibitor activity	3	1.E-02
	GO:0098641	Cadherin binding involved in cell-cell adhesion	11	3.E-02
	GO:0015485	Cholesterol binding	4	3.E-02
	GO:0004872	Receptor activity	9	3.E-02
	GO:0005528	FK506 binding	3	5.E-02
	GO:0030506	Ankyrin binding	3	5.E-02

단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction: PPI) 네트워크를 통하여 단백질간 물리적인 상호작용을 밝히고 세부적인 생물학적 경로의 선별하였다.

PPI 네트워크는 사이토스케이프(Cytoscape 버전 3.8.2; https://cytoscape.org/)를 사용하여 매핑하였다. PPI 네트워크에서 유의미한 모듈은 네트워크를 클러스터링하여 조밀하게 연결된 영역을 분석하는 사이토스케이프의 플러그인 앱인 분자 컴플렉스 검출(Molecular Complex DetectionL: MCODE)를 사용하여 식별하였다. 허브 유전자와 네트워크는 사이토스케이프의 사이토허바(cytoHubba) 분석을 사용하여 확인하였다. 사이토스케이프의 플러그인, ClueGo 분석은 2020년 현행화된 데이터베이스를 사용하였다.

도 5는 DEGs에서 PPI 네트워크와 서브 네트워크를 생성한 결과이다. 도 5a는 PPI 네트워크를 도식화한 것이고, 도 5b, 5c 및 5d는 허브 네트워크를 도식화한 것이다. 231개의 DEGs에서 130개의 노드와 289개의 엣지를 포함하는 PPI 네트워크를 생성하였다. 허브 유전자는 네트워크 분석을 통하여 종양 성장 인자-베타(tumor growth factor-β:TGF-β), 베타-세크레타제(β-secretase 1: BACE1), 아포지방단백질(apolipoprotein E: APOE) 및 아넥신(annexin A2: ANXA2)으로 확인되었다.

생물학적 해석은 ClueGo 및 모듈 분석을 사용하여 별도의 GO/경로 용어 네트워크를 구성함으로써 개선되었다. 도 6은 DEGs와 관련된 GO 용어에서 파생된 CluGo 분석 기반 농축 맵에 관한 것으로, 상호 연관성이 높은 GO 용어를 제공한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 칼슘 의존적 상호작용, 면역세포 활성화, 수용체 대사 과정 및 원형질막 단백질 분해 등은 방사선 반응성과 관련된 프로세스인 것을 알 수 있다.

<실시예 5> 방사선 반응성과 연관도가 높은 유전자 선별

서브 네트워크 및 허브 유전자에서 방사선 반응성과 연관성이 보다 높은 유전자를 선별하였다.

QIAzol시약(Qiagen)을 사용하여 오르가노이드에서 RNA를 추출하고, amfiRivert 역전사 효소(GenDEPOT, Katy, TX, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 표적 유전자에 특이적인 프라이머 47 쌍(표 4) 및 LunaUniversal qPCR 마스터 믹스(New England Biolabs Inc., MA, USA)을 사용하여 Mic 실시간 PCR 시스템(Bio Molecular Systems, QLD, Australia)에서 증폭하였다.

유전자	접근 번호	서열(5' >3')		bp
CTSE	NM_001317331.2	F	TCATTGGAGCCGACCAAGTC	198
		R	GCAAGTCCACCAGGTTCTGA
ANO1	NM_018043.6	F	GAAGCGGAAACAGATGCGACTC	102
		R	CTGGCTTCGTATTCAGCTCTAGG
MEGF6	NM_001409.4	F	CGCAACTCTTCCAGGATGACGA	137
		R	GCAGTCATCACAGGTCAAGCTG
PSCA	NM_005672.5	F	TGCTGTGCTACTCCTGCAAAGC	160
		R	GAGTCATCCACGCAGTTCAAGC
GPSM1	NM_001145638.3	F	AGGCGCCTCTACTCCAGGAT	233
		R	AGCAGGAGGTCATGCTTGTG
S100A4	NM_002961.3	F	CAGAACTAAAGGAGCTGCTGACC	126
		R	CTTGGAAGTCCACCTCGTTGTC
PRKAR2B	NM_002736.3	F	AACCGATTCACAAGGCGTGCCT	144
		R	CAGCAGGATGTCTTTGCAAGCC
PDZRN3	NM_015009	F	TCTGGATGACCTGCACATGGAC	149
		R	TGTCCTTCTCGTGCTGGTTGGA
EFR3B	NM_014971	F	GAACTTGCCTGTCTACAACCGC	139
		R	TGGAGCCTCTTTCTTCCTGGTC
CAMK1D	NM_020397	F	TGAGCAGATCCTCAAGGCGGAA	100
		R	GTCCTTCTCCATCAGGTTCCGA
FREM2	NM_207361	F	GGAGATGTGAGCCAGGAGTTGA	143
		R	GTCAAAGCGGACAACACTGGTG
BACE1	NM_012104	F	GTGAGGTTACCAACCAGTCCTTC	122
		R	CGTGGATGACTGTGAGATGGCA
IGFL2-AS1	NR_135234.1	F	TTGGAGGGTGAGAGACCACA	289
		R	TGCTGCAGAATCAACGACCT
AXL	NM_021913.5	F	GTTTGGAGCTGTGATGGAAGGC	121
		R	CGCTTCACTCAGGAAATCCTCC
AMIGO2	NM_181847.4	F	GGTACTTCTGCTCCAGGATAGC	129
		R	GTCTTGCTGTCACAGTGGACCA
FAM178B	NM_001122646.3	F	CAGGCAATACCTGGACTCTGTG	107
		R	TCAGCAAGCTGTGGCACAGGTA
IL1RN	NM_173841.3	F	ATGGAGGGAAGATGTGCCTGTC	104
		R	GTCCTGCTTTCTGTTCTCGCTC
NKD2	NM_033120.4	F	GACAACTCCTCAGCGCAGATGA	152
		R	GTCATAGAGCGTGAACGTCCAC
NMU	NM_006681.4	F	AGCTCGTTCCTCACCTGCATGA	129
		R	CTGCTGACCTTCTTCCATTCCG
RSAD2	NM_080657.5	F	CCAGTGCAACTACAAATGCGGC	153
		R	CGGTCTTGAAGAAATGGCTCTCC
RUNX3	NM_004350.3	F	GGCAATGACGAGAACTACTCCG	129
		R	GATGGTCAGGGTGAAACTCTTCC
SIM2	NM_005069.6	F	TGTCTTGGCGAAAAGGAACGCG	128
		R	CCACAATCTGGTAGCAGGAGTC
TMEM25	NM_032780.4	F	GTCCAACCTTCAGCTCAATGACC	154
		R	CAGCACTGGGAGGCGGATGAA
TMEM154	NM_152680.3	F	CTAGCCAAGGATCTCAGAGTGC	96
		R	CCATAACAGAGGGTGTATCTTCC
TNNT1	NM_003283.6	F	AACGCGAACGTCAGGCTAAGCT	140
		R	CTTGACCAGGTAGCCGCCAAAA
TRIM7	NM_033342.4	F	GCCATCTGCGTGGTGTGCGAC	144
		R	GAACACCTCACAGTCCTCCAGT
TTC9	NM_015351.2	F	GGGAGAACTTCAAGGCCCTTTAC	158
		R	TCGGCTGAGTTTCATCTCCGTC
UNC13D	NM_199242.3	F	CTACATCAGCCTCAAGGAGCTC	135
		R	GCCTCGTTGTACGTCTTCTGCA
WNT10A	NM_025216.3	F	GTGCTCCTGTTCTTCCTACTGC	128
		R	CCTGGCAATGTTAGGCACACTG
PLSCR4	NM_001128304	F	CCTTCAGATGCACCTGCTGTTG	96
		R	CCGCAACAAAGCCAATGGTGAC
CBR3	NM_001236	F	CATGTGCAACGAGTTACTGCCG	151
		R	ATCCACCAGGTCTCCTTCTGTG
CXorf57	NM_018015	F	CCAGAATGGAGACTGCCAAAGC	128
		R	TTTGACCGCTGGACCCTTCCTA
ALS2CL	NM_001190707	F	TGAGCGCTACATTGGCATGTGG	152
		R	CCTCATACAGGGAGTCGTCTTC
LGMN	NM_005606	F	CCTGAAGATGGAGGCAAGCACT	127
		R	GTTCGTCAGGAATCCCATTGCG
SLC39A10	NM_020342	F	AACCTGGTTCCTGAAGATGAGGC	102
		R	GATCACGCCTAGCAAGGAAAGC
ANXA3	NM_005139	F	CTCCACCAGCAGTCTTTGATGC	114
		R	CCTTCATTTGCCTGCTTGTCCTG
ANXA2	NM_004039	F	TCGGACACATCTGGTGACTTCC	135
		R	CCTCTTCACTCCAGCGTCATAG
FUT8	NM_004480	F	GACAGAACTGGTTCAGCGGAGA	130
		R	GCAGTAGACCACATGATGGAGC
ADAM9	NM_003816	F	CTTGCTGCGAAGGAAGTACCTG	121
		R	CACTCACTGGTTTTTCCTCGGC
NPC1	NM_000271	F	TCTCTTTGCGGGATTGGCAGTC	146
		R	CGCTTGTTCCATCTTCAGCACC
S100A16	NM_001317007	F	GCTCCAGAAAGAGCTGAACCAC	135
		R	ATGCCGCCTATCAAGGTCCAGT
NRCAM	NM_001037132.4	F	TGTGGCTGAAGGACAACAGGGA	138
		R	AGACGCTGTCCAGAGTGGTGTT
LIPH	NM_139248.3	F	CAACGGGAAACCTCACCAAGAC	146
		R	AGCCAGGTTGATCCAATCCTCC
CD55	NM_000574.5	F	CACGGAGTACACCTGTTTCCAG	134
		R	CCCAAGCAAACCTGTCAACGTG
KIZ	NM_001163022.3	F	GGTCAGCATGTTGCCACCTTGA	113
		R	CTGTGAATAGCTGACCTACGGC
IL18	NM_001243211.2	F	GATAGCCAGCCTAGAGGTATGG	121
		R	CCTTGATGTTATCAGGAGGATTCA
APOE	NM_000041.4	F	GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG	124
		R	CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC

qRT-PCR을 수행하여 유전자 발현 프로파일을 확인하고, 변화(fold-change) 순으로 30종의 유전자를 선별하였다. 선별된 30종의 유전자는 칼슘 의존적 상호작용(ANXA2, S100A4 등), 면역세포 활성화(CD55, IL18, RUNX3 등), 수용체 대사 과정(NPC1, APOE, LGMN 등), 원형질막 단백질 분해(ADAM9, BACE1, CTSE 등)와 관련된 것으로 나타났다. 상기 유전자들을 표 5에 나타내었다.

유전자명	데이터베이스 식별자
ADAM9	ENSP00000419446
ALS2CL	ENSP00000313670
ANO1	ENSP00000347454
ANXA2	ENSP00000346032
ANXA3	ENSP00000264908
APOE	ENSP00000252486
AXL	ENSP00000301178
CD55	ENSP00000356030
CTSE	ENSP00000350911
FUT8	ENSP00000353910
GPSM1	ENSP00000392828
IL18	ENSP00000280357
KIZ	ENSP00000479542
LGMN	ENSP00000376911
LIPH	ENSP00000296252
NKD2	ENSP00000296849
NMU	ENSP00000264218
NPC1	ENSP00000269228
NRCAM	ENSP00000368314
PRKAR2B	ENSP00000265717
PSCA	ENSP00000301258
RUNX3	ENSP00000382800
S100A16	ENSP00000357693
S100A4	ENSP00000357705
SIM2	ENSP00000290399
SLC39A10	ENSP00000352655
TMEM154	ENSP00000302144
TMEM25	ENSP00000315635
TNNT1	ENSP00000467176
TRIM7	ENSP00000274773

도 7a는 방사선 저항성 환자 및 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에서 pRT-PCR을 통해 차별적으로 발현되는 후보 유전자들의 mRNA 수준을 나타낸 것으로, 모든 후보 유전자들은 방사선 저항성 환자 유래 오르가노이드에서 상향 조절되었다. 도 7b는 cBioPortal 분석을 통하여 10개의 연구, 3,953명의 환자 시료를 확보한 대장 선암종 임상 발현 데이터 세트에서 추출한 데이터 세트로서, 상향 조절된 유전자들 대다수가 추출된 데이터 세트에서 재확인되었다.

<실시예 6> 방사선 반응성 조절 후성유전체적 바이오마커 확인

유전자가 상향 조절되는 것은, 전사인자에서 유전적으로 조절되거나 또는 후성적으로 디메틸라아제 또는 아세틸라제에 의한 것일 수 있다. DNA 메틸화 수준이 환자 유래 오르가노이드의 방사선 반응성에 영향을 미치는지 확인하였다.

DNA 바이설파이드 변형은 다음과 같이 유도하였다. 게놈 DNA(gDNA)는 QIAamp DNA 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 환자 유래 오르가노이드에서 추출하였다. gDNA 2㎍에 증류수를 첨가하여 50 ㎕로 만들고 CT 변환 시약 130㎕를 첨가하였다. 이어서, 시료 튜브를 열 순환기(MJ Research, Waltham, MA, USA)에 넣고 37℃에서 15분 동안 1차로 배양하고, 50℃에서 16분 동안 배양한 후, 4℃에 보관하였다.

바이설파이드 변형된 DNA는 EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research, Orange, CA, USA)를 사용하여 정제하고 M-용출 버퍼 40㎕로 용출하였다. 여기에서 1㎕는 PCR 주형으로 사용하였다. 각각의 표적 유전자 프로모터에서 1 내지 6개의 CpG 디뉴클레오타이드(dinucleotide)를 증폭하도록 1개는 바이오틴화되고 1개는 바이오틴화되지 않은 파이로시퀀싱 프라이머 쌍(표 6)을 제작하였다. PCR은 변환된 gDNA 10ng, 파이로마크 PCR 키트마스터 믹스(Qiagen), 10 pmol/㎕의 바이오티닐화되지 않은 프라이머 1㎕ 및 10 pmol/㎕의 바이오티닐화된 프라이머 1㎕를 사용하여 25㎕로 수행하였다. PCR의 온도와 시간 조건은 (변성) 95℃에서 5분, (45 사이클) 95℃에서 30초, 53℃에서 30초, 72℃에서 30초, (신장) 72℃에서 10분으로 설정하였다. PCR 산물의 품질과 순도는 3% 아가로스 젤 전기영동 및 탑레드 핵산 젤 염색(TopRed Nucleic Acid Gel stain, BioPure, Canada) 방법으로 확인하였다.

유전자	접근번호	시작 (유전자)	가닥	서열 (5'-3')	Tm (℃)	산물 (bp)
CTSE	NG_029664.1	4833	Sense	GAGGAGGTGTTAAAGTTTTGAGAGA	61	202
CTSE	NG_029664.1	5012	Anti-Sense	AAACCTACCCAACCCAATCTAAA	61	202

파이로시퀀싱은 파이로마크 Q48 마그네틱 비드(Qiagen) 및 파이로마크 Q48 어드밴스 CpT 시약(Qiagen)을 사용하여 수행하였다. 메틸화 비율은 CpG 영역 메틸화의 평균값으로 계산하였으며, 모든 과정은 세 번 반복 실시하였다. 통계적 유의성은 Student's t-테스트로 분석하였으며, P-값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

도 8은 방사선 반응성 환자 및 방사선 저항성 환자 유래 오르가노이드에서 CTSE 유전자의 DNA 메틸화 수준을 바이설파이드 시퀀싱으로 비교한 것이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 방사선 저항성 환자 유래 오르가노이드는 CTSE 유전자 메틸화가 방사선 반응성 환자 유래 오르가노이드에 비하여 낮은 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서, 상기 대장암은 직장암인 것을 특징으로 하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물.
카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 대장암은 직장암인 것을 특징으로 하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 조성물.
제4항, 제5항 또는 제6항의 조성물을 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측용 키트.
카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 바이오마커 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 대장암 진단용 바이오마커 조성물.
제8항에 있어서, 상기 대장암은 직장암인 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 대장암 진단용 바이오마커 조성물.
카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 조성물은 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 대장암 진단용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 대장암은 직장암인 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 대장암 진단용 조성물.
제11항, 제12항 또는 제13항의 조성물을 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단용 키트.
(a) 개체에서 분리된 시료로부터 카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 방사선 치료 예후가 좋지 않다고 판단하는 단계;를 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
제15항에 있어서,
상기 (a) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고,
상기 (b) 단계는 측정된 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 더 포함하고,
상기 (c) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 방사선 치료 예후가 좋지 않다고 판단하는 단계를 더 포함하는 대장암 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
제15항에 있어서, 상기 대장암은 직장암인 것을 특징으로 하는 대장암 방사선 치료 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
(a) 개체에서 분리된 시료로부터 카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 방사선 저항성 대장암이라고 판단하는 단계;를 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단을 위한 정보 제공 방법.
제18항에 있어서,
상기 (a) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고,
상기 (b) 단계는 측정된 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 더 포함하고,
상기 (c) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 방사선 저항성 대장암이라고 판단하는 단계를 더 포함하는 방사선 저항성 대장암 진단을 위한 정보 제공 방법.
제18항에 있어서, 상기 대장암은 직장암인 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 대장암 진단을 위한 정보 제공 방법.
(a) 대장암 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시험물질을 접촉한 대장암 세포에서 카뎁신 E(cathepsin E: CTSE) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준, 또는 프로모터 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 시료와 비교하여 상기 CTSE 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 감소한 시험물질 또는 상기 CTSE 프로모터 메틸화 수준이 증가한 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 대장암 세포에 대한 방사선 반응성 증진제 스크리닝 방법.
제21항에 있어서,
상기 (b) 단계는 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하고,
상기 (c) 단계는 측정된 ANO1, MEGF6, PSCA, GPSM1, S100A4, PRKAR2B, PDZRN3, EFR3B, CAMK1D, FREM2, BACE1, IGFL2-AS1, AXL, AMIGO2, FAM178B, IL1RN, NKD2, NMU, RSAD2, RUNX3, SIM2, TMEM25, TMEM154, TNNT1, TRIM7, TTC9, UNC13D, WNT10A, PLSCR4, CBR3, CXorf57, ALS2CL, LGMN, SLC39A10, ANXA3, ANXA2, FUT8, ADAM9, NPC1, S100A16, NRCAM, LIPH, CD55, KIZ, IL18 및 APOE로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 더 포함하는 대장암 세포에 대한 방사선 반응성 증진제 스크리닝 방법.
제21항에 있어서, 상기 대장암은 직장암인 것을 특징으로 하는 대장암 세포에 대한 방사선 반응성 증진제 스크리닝 방법.