CN105087796A - Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用 - Google Patents

Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用 Download PDF

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CN105087796A CN201510506001.8A CN201510506001A CN105087796A CN 105087796 A CN105087796 A CN 105087796A CN 201510506001 A CN201510506001 A CN 201510506001A CN 105087796 A CN105087796 A CN 105087796A
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朱垒
徐宏博
黄为
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Third Xiangya Hospital of Central South University
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Abstract

本发明属于癌症预后技术领域,具体涉及一种Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用。通过设计一系列预实验,收集了175例不同年龄、不同性别和不同肿瘤分级患者的ICC组织样本、15例癌旁组织样本以及15例正常肝内胆管组织样本。从Sall4表达水平与ICC临床病理特征的相关性方面,对Sall4在ICC中的作用做了初步探讨。

Description

Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用
技术领域
本发明属于癌症预后技术领域,具体涉及一种Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用。
背景技术
肝内胆管细胞癌(intrahepaticcholangiocarcinoma,ICC)也称周围型肝内胆管癌或胆管细胞癌,原发于肝内二级以上胆管黏膜上皮细胞,是胆道系统最常见的恶性肿瘤之一。近几年ICC发病率在全球范围内仍呈增长趋势。其中我国胆管癌患病人数占全球胆管癌患者的55%。ICC恶性程度高,具有极强的侵袭和淋巴结转移特性,通常预后非常差,平均5年生存率为30%。相关研究显示,对于不可行手术切除的患者5年生存率<5%。当前手术切除是肝内胆管细胞癌早期最主要的治疗方式,也是唯一可能的治愈方式,然而其术后复发率也高达50%。化疗(如顺铂+吉西他滨)通常不理想,以5-FU和吉西他滨为主的治疗方式部分缓解率仅为20~30%。尽管已有研究发现ICC中可见某些基因如KRAS、PIK3CA、MET、EGFR、BRAF、NRAS和IDH等的异常表达,但ICC的发生发展、侵袭转移和血管生成等分子机制仍未十分明确。更好的了解ICC生物学行为的分子机制对于改善ICC患者的预后至关重要。
Sall4是一个与多种肿瘤发病密切相关的原癌基因:Sall4基因最早在胚胎干细胞发现存在中高表达,对维持胚胎干细胞的多能性和自我更新具有重要作用,而且表达水平与细胞周期的进程显著相关。近年又有多项研究表明,Sall4可能与多种肿瘤(如肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌和淋巴瘤)的发生发展有着密切的关系[11,14-22]。尽管目前已有人研究过Sall4与肝细胞性肝癌的相关性,10%~20%的肝癌患者表达高水平的SALL4,但是50%的患者表达低水平的SALL4。但迄今为止,对Sall4与ICC的相关性还所知甚少。肝细胞性肝癌和肝内胆管细胞癌同属于原发性肝癌,但是二者无论在细胞起源、组织学发生和生物学行为方面,还是在临床病理学特点、治疗策略以及临床预后等方面均不相同。那么,Sall4是否可能也参与了ICC的发生和发展,并有可能与患者的预后存在一定的相关性呢?为此,本发明设计了一系列预实验,收集了175例不同年龄、不同性别和不同肿瘤分级患者的ICC组织样本、15例癌旁组织样本以及15例正常肝内胆管组织样本。从Sall4表达水平与ICC临床病理特征的相关性方面,对Sall4在ICC中的作用做了初步探讨。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝内胆管细胞癌预后的标志物,以及该标志物在制备该种癌症预后和干扰制剂中的应用。
Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用,所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。
Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的淋巴转移、血管浸润和神经浸润方面预后的制剂。通过Sall4的表达控制PTEN和Bmi-1信号途径调控肝内胆管细胞癌的侵袭和转移。
Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移预后的制剂。通过Sall4的表达控制E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白的表达,从而调控肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移。
预后制剂包括:划痕实验检测、Transwell实验检测、Westernblot检测、石蜡组织芯片检测、PCR检测、原位杂交检测制剂。
PCR检测试剂引物序列如下:
正向引物:AGCACATCAACTCGGAGGAG
逆向引物:CATTCCCTGGGTGGTTCACTG。
Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌复发和转移的制剂的应用,通过Sall4基因序列设计用于下调肝内胆管细胞癌的癌细胞中Sall4表达的干扰RNA,所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。
Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌淋巴转移、血管浸润和神经浸润的制剂。
Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移的制剂。
本发明的有益效果:
1、为临床判断肝内胆管癌的预后提供基因分型基础;
2、改善肝内胆管癌患者的预后。
附图说明
图1:Sall4在癌组织、癌旁组织和正常肝内胆管组织中的表达;
ICC表示ICC病灶组织样本,Per表示与之前ICC病灶组织相对应的癌旁组织样本,Con表示正常肝内胆管组织样本;
图2:Kaplan-Meier总体生存分析结果;
图3:划痕实验结果;
图4:Transwell实验结果;
图5:E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白表达的Westernblot结果;
图6:PTEN和Bim-1蛋白表达的Westernblot结果。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明,而非限制本发明。
实施例
(一)PCR检测
正向引物:AGCACATCAACTCGGAGGAG
逆向引物:CATTCCCTGGGTGGTTCACTG。
操作步骤
1.提取细胞DNA
2.反应程序:
试剂 浓度 加入量
10倍浓度PCR缓冲液 2.5ul
氯化镁溶液 2.5mmol/L 2.5ul
dNTP混合液 各2.5mmol/L 2.5ul
上游引物 2.5umol/L 2.5ul
下游引物 2.5umol/L 2.5ul
TsgDNA聚合酶 2.5U
细胞DNA 25-50ng 2.5ul
超纯水 10ul
总体积 25ul
将反应试剂加入EP管中
轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上,防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸
发,盖好盖子
打开PCR反应仪输入以下反应数据
●94℃预变性5min
●94℃变性40s
●40℃退火40s
●72℃延伸1min
将EP管放入仪器开始扩增,循环35次;72摄氏度延伸10min
(二)划痕实验:在6孔板种入大约5×105个细胞(以过夜能铺满为宜),第二天用枪头比直横线划痕。PBS洗细胞3次去除划下的细胞。加入无血清DMEM高糖培养基,于37℃5%CO2培养箱培养。按0,6,12,24小时取样拍照;
(三)侵袭实验:用融化的Matrigel原液和预冷无血清DMEM高糖培养液配制0.8μg/μlTranswellchamber上室凝胶液,以每孔100μl包被Transwell上室,37℃培养箱中放置2小时使其成固化胶,制成侵袭小室。胰酶消化实验细胞并收集计数,用无血清DMEM高糖培养基稀释成1×106/ml细胞悬液,每孔Transwell上室加入100μl细胞悬液,下室加入600μl含10%FBS的完全DMEM培养基,置于培养箱培养36h~48h。从双室培养板中取出Transwell小室,吸弃液体,用棉签檫净基底膜胶,PBS漂洗后立即4%甲醛固定15分钟,PBS漂洗2~3次后用Giemsa染色30分钟,清水洗去染液后于200倍镜下观察,选取上中下左右5个视野计数并拍照;
(四)Westernblot实验
1.设备和试剂
1)设备:电泳电源(BIO-RAD,#165-3323)、电泳仪及附件(BIO-RAD,)、电转仪及附件(BIO-RAD,#170-3930)、NC膜(PIERCE,)、滤纸(Whatman,3MMCHR)
2)凝胶试剂组成:30%丙烯酰胺溶液、10%过硫酸铵、TEMED(上海生工)、Tris-Base、10%SDS(SIGMA)
3)蛋白提取配制试剂:
总蛋白提取试剂(组织/细胞裂解试剂,RIPA裂解液)组成:1%NP-40、0.1%SDS、50mMDTT,使用前加入蛋白酶抑制剂2ug/mlAprotinin、2ug/mlLeupeptin和1mMPMSF。
4)常用溶液及缓冲液
A.5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml:
ddH2O:1.7ml
30%丙烯酰胺溶液:0.42ml
1.0mol/LTris(PH=6.8):0.315ml
10%SDS:25ul
10%过硫酸铵:25ul
TEMED:3ul
B.电泳缓冲液,1L
3gTris-Base、14.4g甘氨酸、1gSDS,加蒸馏水至IL,pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液,在室温下长期保存。
C.电泳转移缓冲液,1L
3gTris-Base、14.4g甘氨酸、甲醇200ml,加蒸馏水至1L,也可以制成10×的储存液,在湿温下长期保存。
D.5×样品缓冲液,10ml
0.6ml1mol/L的Tris-HCl(Ph6.8)、5ml50%的甘油、2ml10%的SDS、0.5ml2-巯基乙醇、1ml1%溴酚蓝,0.9ml的蒸馏水,可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。
2.蛋白提取(根据样品及检测要求选取以下适当提取方法)
B-1.细胞裂解提取总蛋白(采用RIPA裂解液)
1).细胞收集好,加入1ml总蛋白提取液,充分吹打,然后冰上放置10~20minmin后,再吹5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2).超声3次,每次3s。
3).9000rpm,离心10min,取适量上清置于新的1.5ml离心管中。
4).-20℃冻存。
A-1.组织裂解提取总蛋白(采用TotalproteinExtractionKit,ProMab,Cat.No:SJ-200501)
1).用剪刀剪取约0.5mg组织,置于组织匀浆器中,加入1ml总蛋白提取液,匀浆5min~20min直到组织充分破碎,然后冰上放置10~20min后,再匀浆5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2).超声3次,每次3s。
3).9000rpm,离心10min,取适量上清置于新的1.5ml离心管中
4).-20℃冻存。
3.SDS-PAGE电泳
1).将抗原(组织/细胞裂解液)样品体积:5×loadingbuffer体积=5:1,混匀,在100℃加热三分钟以使蛋白质变性。
2).设计加样顺序,作好实验记录,按预定顺序加样,每个电泳道加样体积为10-20μl;电压200V开始电泳,待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处,关闭电源。
3).从电泳装置上卸下凝胶玻璃板,用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。
4.免疫印迹操作-转膜
1).将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中,浸泡15-20min.。
2).带上手套,裁剪好滤纸(Whatman,3MMCHR)和电转膜,滤纸和膜大小为83mm×75mm,尽量避免污染滤纸和膜,将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中,驱除留于膜上的气泡。
3).打开转移盒并放置浅盘中,用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上,海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。
4).小心将凝胶放置于滤纸上,避免气泡。
5).用去离子水清洗缓冲液槽,在缓冲液槽中放入搅拌子,将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上,关上转移盒并插入转移槽。
6).将冰盒装入缓冲液槽,注满4℃预冷的转移缓冲液。
7).将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌,连接好转移电极恒流300mA转移70min。
8).电转完毕后,将电转膜置于5%的脱脂奶粉(PBS配制)中封闭,37℃2小时。
5.免疫检测
1).封闭的膜用PBST漂洗2-3次。
2).将加样槽洗涤干净,用蒸馏水润洗,晾干,将膜用一次性手套覆盖好,按标记和实验设计切下膜条(3-5mm宽左右)按顺序置于加样槽中,作好实验记录,加入相应的一抗约1ml,注意保证膜的所有部分同溶液接触。
3).室温下于摇床孵育2h,弃去一抗,每个加样槽加2-3mlPBST,上摇床洗涤洗涤5-10min,反复4次。
每个加样槽中加入酶标二抗1ml左右4℃过夜,注意保证膜的所有部分同溶液接触。
4).弃去二抗,膜条仍置于加样槽,每个槽加2-3mlPBST,上摇床洗涤洗涤10min,反复4次。
6.化学发光
每条膜加入适量的发光底物试剂,以浸润膜条为宜,尽快行化学发光,得到胶片。
(五)石蜡组织芯片的制备步骤如下:
1、定制石蜡模:按横向多排孔、纵向二排孔形式制作石蜡模,外形呈矩形多孔立方体,石蜡模外壁上设有与组织阵列孔板匹配的凹形吻合口。
2、定制组织阵列孔板:板体一端呈喙样凸与石蜡模凹形吻合口相互凸凹匹配,其另一端设有将阵列孔板与石蜡模吻合的固定螺丝。阵列孔板纵向设有上下分隔的二组阵列,每组阵列排列方式不同,每组阵列的面积与石蜡模的孔匹配。
3、定制芯棒:呈多节状直径不等的实心圆柱体,插在阵列孔板上的孔中,与阵列孔板和石蜡模联合匹配使用制作石蜡组织芯片受体石蜡块。
4、定制采样针:采样针采用针管中穿装活动式针芯的形式。
5、制作受体组织芯片阵列石蜡块:
1)、将组织阵列孔板安装在石蜡模上并将固定螺丝旋紧,石蜡模的两端下方用木条垫高,以便芯棒伸入。
2)、向组织阵列孔板上的孔依次插入与其孔径匹配的芯棒,插满或按预设二维阵列排布表按序插入。
3)、用一平板压在芯棒粗端形成的平面,组成含芯棒的从下到上的石蜡模+组织阵列孔板+平板的“三明治”样结构。然后,将其倒置,此时最上方为石蜡模的正面和从其孔中伸出的芯棒细端平面。
4)、临注蜡时用电吹风吹拂芯棒细端平面进行预加热,然后,再向芯棒平面注入85℃左右的液态石蜡,使其充盈每根芯棒杆的周围,连续注蜡直至需要的厚度即可。
5)、在石蜡刚呈固态时,倒翻恢复到原来的石蜡模+组织阵列孔板+平板“三明治”样结构,而此时最下面是芯棒细端阵列平面。
6)、将平板从芯棒粗端平面取下转移到芯棒细端阵列平面,即“三明治”样结构最下方,形成含芯棒的由下到上的平板+石蜡模+组织阵列孔板的结构,其最上面是芯棒粗端横截面形成的平面。
7)、双手握牢石蜡模+组织阵列孔板组合结构,轻轻用力向下压,使石蜡模的最下面的平面达到平板,而顶在平板上的芯棒细端平面受其反作用力使芯棒的阵列向上运动,此时芯棒的芯棒粗端平面突出于组织阵列孔板上方的平面,形成芯棒粗端平面与组织阵列孔板上方平面间的间隙,因此,暴露出芯棒粗端平面下方的芯棒杆。
8)、用镊子快速伸向芯棒粗端平面的下方,向上稍用力依次将芯棒全部拨出,旋松固定螺丝,拿开组织阵列孔板,退出石蜡块,再用医用缝合线按芯棒节段的距离,在绕线的启始端缠绕一周。
9)、线的一端固定不动,把握另一端并将着力点稳定在绕线的启始端,稍用力将绕线全部拉出,可获取所需芯穴直径的石蜡块,即受体石蜡组织芯片阵列蜡块。
6、供体石蜡块的采样及其组织芯片石蜡块的制备:
1)、将供体石蜡块常规切片和HE染色,阅片确定有典型ICC病变的石蜡块并拟定可采样部位或区域,最后记录存档。
2)、取一块石蜡模放在玻璃平板上,然后,将制成的受体组织芯片石蜡块放入石蜡模的孔中待用。
3)、采样和植入:取采样针,先拨出针芯并用采样针管对供体石蜡块的拟定采样部位进行采样,即将采样针管压入供体石蜡块中,使供体组织蜡芯进入针管内。将采样针针管插进采样针管,再均匀用力推动针芯柄将供体组织蜡芯从针管中推出,依次插入受体石蜡块的芯片穴位中,直到完成预设的二维组织芯片阵列。植入时选取待用组织蜡芯用镊子放入受体石蜡块的芯片穴位中,直到完成预设的二维组织芯片阵列。此时,石蜡组织芯片蜡块芯片种植完成,即可进入待熔合阶段。
4)、熔合:轻轻震动“石蜡模+石蜡组织芯片蜡块+玻璃板”组合结构,使种植的全部组织蜡芯片在同一平面,再放到约50~55℃烘箱中,使组织蜡芯与受体石蜡块互相融合。
5)、修整:取出石蜡块,用玻璃片轻压含有组织蜡芯柱的一面,尽量使所有组织芯片的组织蜡芯的横截面保持在一个平面上,放冰箱待用。
结果:
(1)本发明目前已对收集到的ICC(肝内胆管癌)患者中的癌组织及癌旁组织样本进行了预实验。利用免疫组织化学技术检测样本中Sall4蛋白表达水平和分布情况,发现Sall4在ICC癌旁组织和正常肝内胆管组织中的表达无明显差异,但在ICC病灶组织中却为明显的高表达(图1)。
(2)本发明已经在征得患者书面同意后,完成了不同年龄、不同性别和不同肿瘤分级患者的ICC组织样本,癌旁组织样本及正常肝内胆管组织样本的收集,并针对这些样本设计出了相应的组织芯片,完成了结果的初步统计分析。目前的统计结果显示:58%的ICC患者标本中Sall4呈阳性表达,42%的ICC患者标本中Sall4呈阴性表达。而在癌旁或正常肝组织中,Sall4不表达(10%~20%的肝癌患者表达高水平的SALL4,但是50%的患者表达低水平的SALL4)。Sall4表达呈强阳性的ICC病例无论是在淋巴转移((P=0.046)、血管浸润(P<0.0001)和神经浸润(P<0.0001)方面均高于Sall4表达呈阴性的病例;此外,Sall4的表达与其他临床因素(年龄,性别,肿块直径,肿块部位,组织分型,HBV感染与否和临床分期)均无关(表1)。
表1Sall4的表达与ICC患者临床病理指标之间的关系
年龄 NS
均值±标准差 55±13.58
性别% NS
53(93/175)
47(82/175)
肿瘤大小(cm) NS
均值±标准差 5.08±3.27
病理分级% NS
高度分化 7(13/175)
中度分化 68(120/175)
低分化 25(42/175)
淋巴结浸润% P=0.046
19(34/175)
81(141/175)
血管浸润% P<0.0001
39(68/175)
61(107/175)
神经浸润% P<0.0001
30(53/175)
70(122/175)
HBV感染% NS
12(21/175)
88(153/175)
临床T段% NS
T1 16(28/175)
T2 42(74/175)
T3 30(52/175)
T4 12(21/175)
(3)Kaplan-Meier总体生存分析结果(图2)显示病灶呈Sall4强阳性表达(+++)的ICC患者相较于病灶呈Sall4中度表达(++)(P=0.0471)、轻度表达(+)(P=0.014)和无表达(-)(P=0.0055)的ICC患者具有更差的预后。病灶中无Sall4表达的患者平均生存期为7个月,Sall4轻度和中度表达的患者平均生存期分别为7个月和9个月,但Sall4强阳性表达的患者平均生存期仅为5个月。
(4)划痕实验和Transwell实验的结果(图3-4)均显示,通过RNA干扰技术(干扰RNA序列由SantaCruz公司提供,其商品名称为Sall4siRNA(h))下调体外培养的人ICC细胞中Sall4的表达可以明显减弱ICC细胞的迁移和浸润能力。这一结果说明Sall4的表达下调能抑制ICC细胞的相关恶性临床表型。
(5)Westernblot结果(图5)显示,借助RNA干扰技术下调体外培养的人ICC细胞中Sall4的表达导致E-钙黏连蛋白表达的显著增加和N-钙黏连蛋白表达的显著降低。而这两种蛋白又是上皮间质转化中的关键蛋白,由此说明Sall4在ICC的远处转移中也起到了重要作用。
(6)Westernblot结果同时还显示Sall4表达上调时,其下游的PTEN的表达会下调,而Bmi-1的表达会上调;Sall4表达下调时,PTEN表达上调,Bmi-1表达下调。提示Sall4可能通过PTEN和Bmi-1的下游信号途径影响ICC细胞的迁移和浸润(图6)。
以上这些预实验的证据充分说明Sall4与ICC细胞的侵袭转移能力密切相关;Sall4可能通过PTEN和Bmi-1信号途径调控ICC的侵袭和转移。

Claims (10)

1.Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用,其特征在于,所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的淋巴转移、血管浸润和神经浸润方面预后的制剂。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,通过Sall4的表达控制PTEN和Bmi-1信号途径调控肝内胆管细胞癌的侵袭和转移。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移预后的制剂。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,通过Sall4的表达控制E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白的表达,从而调控肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用,其特征在于,预后制剂包括:划痕实验检测、Transwell实验检测、Westernblot检测、石蜡组织芯片检测、PCR检测、原位杂交检测制剂。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,PCR检测试剂引物序列如下:
正向引物:AGCACATCAACTCGGAGGAG
逆向引物:CATTCCCTGGGTGGTTCACTG。
8.Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌复发和转移的制剂的应用,其特征在于,通过Sall4基因序列设计用于下调肝内胆管细胞癌的癌细胞中Sall4表达的干扰RNA,所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌淋巴转移、血管浸润和神经浸润的制剂。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移的制剂。
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