CN105087796A - Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用 - Google Patents

Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105087796A
CN105087796A CN201510506001.8A CN201510506001A CN105087796A CN 105087796 A CN105087796 A CN 105087796A CN 201510506001 A CN201510506001 A CN 201510506001A CN 105087796 A CN105087796 A CN 105087796A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sall4
preparation
icc
cholangiocellular carcinoma
prognosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510506001.8A
Other languages
English (en)
Inventor
邓刚
黄飞舟
朱垒
徐宏博
黄为
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Third Xiangya Hospital of Central South University
Original Assignee
Third Xiangya Hospital of Central South University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Third Xiangya Hospital of Central South University filed Critical Third Xiangya Hospital of Central South University
Priority to CN201510506001.8A priority Critical patent/CN105087796A/zh
Publication of CN105087796A publication Critical patent/CN105087796A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于癌症预后技术领域，具体涉及一种Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用。通过设计一系列预实验，收集了175例不同年龄、不同性别和不同肿瘤分级患者的ICC组织样本、15例癌旁组织样本以及15例正常肝内胆管组织样本。从Sall4表达水平与ICC临床病理特征的相关性方面，对Sall4在ICC中的作用做了初步探讨。

Description

Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用
技术领域
本发明属于癌症预后技术领域，具体涉及一种Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用。
背景技术
肝内胆管细胞癌(intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC)也称周围型肝内胆管癌或胆管细胞癌，原发于肝内二级以上胆管黏膜上皮细胞，是胆道系统最常见的恶性肿瘤之一。近几年ICC发病率在全球范围内仍呈增长趋势。其中我国胆管癌患病人数占全球胆管癌患者的55％。ICC恶性程度高，具有极强的侵袭和淋巴结转移特性，通常预后非常差，平均5年生存率为30％。相关研究显示，对于不可行手术切除的患者5年生存率<5％。当前手术切除是肝内胆管细胞癌早期最主要的治疗方式，也是唯一可能的治愈方式，然而其术后复发率也高达50％。化疗(如顺铂+吉西他滨)通常不理想，以5-FU和吉西他滨为主的治疗方式部分缓解率仅为20～30％。尽管已有研究发现ICC中可见某些基因如KRAS、PIK3CA、MET、EGFR、BRAF、NRAS和IDH等的异常表达，但ICC的发生发展、侵袭转移和血管生成等分子机制仍未十分明确。更好的了解ICC生物学行为的分子机制对于改善ICC患者的预后至关重要。
Sall4是一个与多种肿瘤发病密切相关的原癌基因：Sall4基因最早在胚胎干细胞发现存在中高表达，对维持胚胎干细胞的多能性和自我更新具有重要作用，而且表达水平与细胞周期的进程显著相关。近年又有多项研究表明，Sall4可能与多种肿瘤(如肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌和淋巴瘤)的发生发展有着密切的关系[11,14-22]。尽管目前已有人研究过Sall4与肝细胞性肝癌的相关性，10％～20％的肝癌患者表达高水平的SALL4，但是50％的患者表达低水平的SALL4。但迄今为止，对Sall4与ICC的相关性还所知甚少。肝细胞性肝癌和肝内胆管细胞癌同属于原发性肝癌，但是二者无论在细胞起源、组织学发生和生物学行为方面，还是在临床病理学特点、治疗策略以及临床预后等方面均不相同。那么，Sall4是否可能也参与了ICC的发生和发展，并有可能与患者的预后存在一定的相关性呢？为此，本发明设计了一系列预实验，收集了175例不同年龄、不同性别和不同肿瘤分级患者的ICC组织样本、15例癌旁组织样本以及15例正常肝内胆管组织样本。从Sall4表达水平与ICC临床病理特征的相关性方面，对Sall4在ICC中的作用做了初步探讨。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝内胆管细胞癌预后的标志物，以及该标志物在制备该种癌症预后和干扰制剂中的应用。
Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用，所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。
Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的淋巴转移、血管浸润和神经浸润方面预后的制剂。通过Sall4的表达控制PTEN和Bmi-1信号途径调控肝内胆管细胞癌的侵袭和转移。
Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移预后的制剂。通过Sall4的表达控制E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白的表达，从而调控肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移。
预后制剂包括：划痕实验检测、Transwell实验检测、Westernblot检测、石蜡组织芯片检测、PCR检测、原位杂交检测制剂。
PCR检测试剂引物序列如下：
正向引物：AGCACATCAACTCGGAGGAG
逆向引物：CATTCCCTGGGTGGTTCACTG。
Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌复发和转移的制剂的应用，通过Sall4基因序列设计用于下调肝内胆管细胞癌的癌细胞中Sall4表达的干扰RNA，所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。
Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌淋巴转移、血管浸润和神经浸润的制剂。
Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移的制剂。
本发明的有益效果：
1、为临床判断肝内胆管癌的预后提供基因分型基础；
2、改善肝内胆管癌患者的预后。
附图说明
图1：Sall4在癌组织、癌旁组织和正常肝内胆管组织中的表达；
ICC表示ICC病灶组织样本，Per表示与之前ICC病灶组织相对应的癌旁组织样本，Con表示正常肝内胆管组织样本；
图2：Kaplan-Meier总体生存分析结果；
图3：划痕实验结果；
图4：Transwell实验结果；
图5：E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白表达的Westernblot结果；
图6：PTEN和Bim-1蛋白表达的Westernblot结果。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例
(一)PCR检测
正向引物：AGCACATCAACTCGGAGGAG
逆向引物：CATTCCCTGGGTGGTTCACTG。
操作步骤
1.提取细胞DNA
2.反应程序：
试剂 浓度 加入量
10倍浓度PCR缓冲液 2.5ul
氯化镁溶液 2.5mmol/L 2.5ul
dNTP混合液 各2.5mmol/L 2.5ul
上游引物 2.5umol/L 2.5ul
下游引物 2.5umol/L 2.5ul
TsgDNA聚合酶 2.5U
细胞DNA 25-50ng 2.5ul
超纯水 10ul
总体积 25ul
将反应试剂加入EP管中
轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸
发，盖好盖子
打开PCR反应仪输入以下反应数据
●94℃预变性5min
●94℃变性40s
●40℃退火40s
●72℃延伸1min
将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min
(二)划痕实验：在6孔板种入大约5×105个细胞(以过夜能铺满为宜)，第二天用枪头比直横线划痕。PBS洗细胞3次去除划下的细胞。加入无血清DMEM高糖培养基,于37℃5％CO2培养箱培养。按0，6，12，24小时取样拍照；
(三)侵袭实验：用融化的Matrigel原液和预冷无血清DMEM高糖培养液配制0.8μg/μlTranswellchamber上室凝胶液，以每孔100μl包被Transwell上室，37℃培养箱中放置2小时使其成固化胶，制成侵袭小室。胰酶消化实验细胞并收集计数，用无血清DMEM高糖培养基稀释成1×106/ml细胞悬液，每孔Transwell上室加入100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％FBS的完全DMEM培养基，置于培养箱培养36h～48h。从双室培养板中取出Transwell小室，吸弃液体，用棉签檫净基底膜胶，PBS漂洗后立即4％甲醛固定15分钟，PBS漂洗2～3次后用Giemsa染色30分钟，清水洗去染液后于200倍镜下观察，选取上中下左右5个视野计数并拍照；
(四)Westernblot实验
1.设备和试剂
1)设备：电泳电源(BIO-RAD,#165-3323)、电泳仪及附件(BIO-RAD,)、电转仪及附件(BIO-RAD,#170-3930)、NC膜(PIERCE，)、滤纸(Whatman,3MMCHR)
2)凝胶试剂组成：30％丙烯酰胺溶液、10％过硫酸铵、TEMED(上海生工)、Tris-Base、10％SDS(SIGMA)
3)蛋白提取配制试剂：
总蛋白提取试剂(组织/细胞裂解试剂，RIPA裂解液)组成：1％NP-40、0.1％SDS、50mMDTT，使用前加入蛋白酶抑制剂2ug/mlAprotinin、2ug/mlLeupeptin和1mMPMSF。
4)常用溶液及缓冲液
A.5％积层胶所用溶液
按总体积2.5ml：
ddH2O：1.7ml
30％丙烯酰胺溶液：0.42ml
1.0mol/LTris(PH＝6.8)：0.315ml
10％SDS：25ul
10％过硫酸铵：25ul
TEMED：3ul
B.电泳缓冲液，1L
3gTris-Base、14.4g甘氨酸、1gSDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。
C.电泳转移缓冲液,1L
3gTris-Base、14.4g甘氨酸、甲醇200ml,加蒸馏水至1L,也可以制成10×的储存液，在湿温下长期保存。
D.5×样品缓冲液,10ml
0.6ml1mol/L的Tris-HCl(Ph6.8)、5ml50％的甘油、2ml10％的SDS、0.5ml2-巯基乙醇、1ml1％溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。
2.蛋白提取(根据样品及检测要求选取以下适当提取方法)
B-1.细胞裂解提取总蛋白(采用RIPA裂解液)
1).细胞收集好，加入1ml总蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置10～20minmin后，再吹5min～20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2).超声3次，每次3s。
3).9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中。
4).-20℃冻存。
A-1.组织裂解提取总蛋白(采用TotalproteinExtractionKit，ProMab,Cat.No：SJ-200501)
1).用剪刀剪取约0.5mg组织，置于组织匀浆器中，加入1ml总蛋白提取液，匀浆5min～20min直到组织充分破碎,然后冰上放置10～20min后，再匀浆5min～20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2).超声3次，每次3s。
3).9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中
4).-20℃冻存。
3.SDS-PAGE电泳
1).将抗原(组织/细胞裂解液)样品体积：5×loadingbuffer体积＝5：1，混匀，在100℃加热三分钟以使蛋白质变性。
2).设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样，每个电泳道加样体积为10-20μl；电压200V开始电泳，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。
3).从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净。准备进行免疫印操作。
4.免疫印迹操作-转膜
1).将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡15-20min.。
2).带上手套，裁剪好滤纸(Whatman,3MMCHR)和电转膜，滤纸和膜大小为83mm×75mm，尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。
3).打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的Whatman,3MM滤纸。
4).小心将凝胶放置于滤纸上，避免气泡。
5).用去离子水清洗缓冲液槽，在缓冲液槽中放入搅拌子，将另一块海绵用转移缓冲液浸透后放在凝胶-膜“三明治”上，关上转移盒并插入转移槽。
6).将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。
7).将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移70min。
8).电转完毕后，将电转膜置于5％的脱脂奶粉(PBS配制)中封闭，37℃2小时。
5.免疫检测
1).封闭的膜用PBST漂洗2-3次。
2).将加样槽洗涤干净，用蒸馏水润洗，晾干，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条(3-5mm宽左右)按顺序置于加样槽中，作好实验记录，加入相应的一抗约1ml，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
3).室温下于摇床孵育2h，弃去一抗，每个加样槽加2-3mlPBST，上摇床洗涤洗涤5-10min，反复4次。
每个加样槽中加入酶标二抗1ml左右4℃过夜，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
4).弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加2-3mlPBST，上摇床洗涤洗涤10min，反复4次。
6.化学发光
每条膜加入适量的发光底物试剂，以浸润膜条为宜，尽快行化学发光，得到胶片。
(五)石蜡组织芯片的制备步骤如下：
1、定制石蜡模：按横向多排孔、纵向二排孔形式制作石蜡模，外形呈矩形多孔立方体，石蜡模外壁上设有与组织阵列孔板匹配的凹形吻合口。
2、定制组织阵列孔板：板体一端呈喙样凸与石蜡模凹形吻合口相互凸凹匹配，其另一端设有将阵列孔板与石蜡模吻合的固定螺丝。阵列孔板纵向设有上下分隔的二组阵列，每组阵列排列方式不同，每组阵列的面积与石蜡模的孔匹配。
3、定制芯棒：呈多节状直径不等的实心圆柱体，插在阵列孔板上的孔中，与阵列孔板和石蜡模联合匹配使用制作石蜡组织芯片受体石蜡块。
4、定制采样针：采样针采用针管中穿装活动式针芯的形式。
5、制作受体组织芯片阵列石蜡块：
1)、将组织阵列孔板安装在石蜡模上并将固定螺丝旋紧，石蜡模的两端下方用木条垫高，以便芯棒伸入。
2)、向组织阵列孔板上的孔依次插入与其孔径匹配的芯棒，插满或按预设二维阵列排布表按序插入。
3)、用一平板压在芯棒粗端形成的平面，组成含芯棒的从下到上的石蜡模+组织阵列孔板+平板的“三明治”样结构。然后，将其倒置，此时最上方为石蜡模的正面和从其孔中伸出的芯棒细端平面。
4)、临注蜡时用电吹风吹拂芯棒细端平面进行预加热，然后，再向芯棒平面注入85℃左右的液态石蜡，使其充盈每根芯棒杆的周围，连续注蜡直至需要的厚度即可。
5)、在石蜡刚呈固态时，倒翻恢复到原来的石蜡模+组织阵列孔板+平板“三明治”样结构，而此时最下面是芯棒细端阵列平面。
6)、将平板从芯棒粗端平面取下转移到芯棒细端阵列平面，即“三明治”样结构最下方，形成含芯棒的由下到上的平板+石蜡模+组织阵列孔板的结构，其最上面是芯棒粗端横截面形成的平面。
7)、双手握牢石蜡模+组织阵列孔板组合结构，轻轻用力向下压，使石蜡模的最下面的平面达到平板，而顶在平板上的芯棒细端平面受其反作用力使芯棒的阵列向上运动，此时芯棒的芯棒粗端平面突出于组织阵列孔板上方的平面，形成芯棒粗端平面与组织阵列孔板上方平面间的间隙，因此，暴露出芯棒粗端平面下方的芯棒杆。
8)、用镊子快速伸向芯棒粗端平面的下方，向上稍用力依次将芯棒全部拨出，旋松固定螺丝，拿开组织阵列孔板，退出石蜡块，再用医用缝合线按芯棒节段的距离，在绕线的启始端缠绕一周。
9)、线的一端固定不动，把握另一端并将着力点稳定在绕线的启始端，稍用力将绕线全部拉出，可获取所需芯穴直径的石蜡块，即受体石蜡组织芯片阵列蜡块。
6、供体石蜡块的采样及其组织芯片石蜡块的制备：
1)、将供体石蜡块常规切片和HE染色，阅片确定有典型ICC病变的石蜡块并拟定可采样部位或区域，最后记录存档。
2)、取一块石蜡模放在玻璃平板上，然后，将制成的受体组织芯片石蜡块放入石蜡模的孔中待用。
3)、采样和植入：取采样针，先拨出针芯并用采样针管对供体石蜡块的拟定采样部位进行采样，即将采样针管压入供体石蜡块中，使供体组织蜡芯进入针管内。将采样针针管插进采样针管，再均匀用力推动针芯柄将供体组织蜡芯从针管中推出，依次插入受体石蜡块的芯片穴位中，直到完成预设的二维组织芯片阵列。植入时选取待用组织蜡芯用镊子放入受体石蜡块的芯片穴位中，直到完成预设的二维组织芯片阵列。此时，石蜡组织芯片蜡块芯片种植完成，即可进入待熔合阶段。
4)、熔合：轻轻震动“石蜡模+石蜡组织芯片蜡块+玻璃板”组合结构，使种植的全部组织蜡芯片在同一平面，再放到约50～55℃烘箱中，使组织蜡芯与受体石蜡块互相融合。
5)、修整：取出石蜡块，用玻璃片轻压含有组织蜡芯柱的一面，尽量使所有组织芯片的组织蜡芯的横截面保持在一个平面上，放冰箱待用。
结果：
(1)本发明目前已对收集到的ICC(肝内胆管癌)患者中的癌组织及癌旁组织样本进行了预实验。利用免疫组织化学技术检测样本中Sall4蛋白表达水平和分布情况，发现Sall4在ICC癌旁组织和正常肝内胆管组织中的表达无明显差异，但在ICC病灶组织中却为明显的高表达(图1)。
(2)本发明已经在征得患者书面同意后，完成了不同年龄、不同性别和不同肿瘤分级患者的ICC组织样本，癌旁组织样本及正常肝内胆管组织样本的收集，并针对这些样本设计出了相应的组织芯片，完成了结果的初步统计分析。目前的统计结果显示：58％的ICC患者标本中Sall4呈阳性表达，42％的ICC患者标本中Sall4呈阴性表达。而在癌旁或正常肝组织中，Sall4不表达(10％～20％的肝癌患者表达高水平的SALL4，但是50％的患者表达低水平的SALL4)。Sall4表达呈强阳性的ICC病例无论是在淋巴转移((P＝0.046)、血管浸润(P<0.0001)和神经浸润(P<0.0001)方面均高于Sall4表达呈阴性的病例；此外，Sall4的表达与其他临床因素(年龄，性别，肿块直径，肿块部位，组织分型，HBV感染与否和临床分期)均无关(表1)。
表1Sall4的表达与ICC患者临床病理指标之间的关系
年龄 NS
均值±标准差 55±13.58
性别％ NS
男 53(93/175)
女 47(82/175)
肿瘤大小(cm) NS
均值±标准差 5.08±3.27
病理分级％ NS
高度分化 7(13/175)
中度分化 68(120/175)
低分化 25(42/175)
淋巴结浸润％ P＝0.046
有 19(34/175)
无 81(141/175)
血管浸润％ P<0.0001
有 39(68/175)
无 61(107/175)
神经浸润％ P<0.0001
有 30(53/175)
无 70(122/175)
HBV感染％ NS
有 12(21/175)
无 88(153/175)
临床T段％ NS
T1 16(28/175)
T2 42(74/175)
T3 30(52/175)
T4 12(21/175)
(3)Kaplan-Meier总体生存分析结果(图2)显示病灶呈Sall4强阳性表达(+++)的ICC患者相较于病灶呈Sall4中度表达(++)(P＝0.0471)、轻度表达(+)(P＝0.014)和无表达(-)(P＝0.0055)的ICC患者具有更差的预后。病灶中无Sall4表达的患者平均生存期为7个月，Sall4轻度和中度表达的患者平均生存期分别为7个月和9个月，但Sall4强阳性表达的患者平均生存期仅为5个月。
(4)划痕实验和Transwell实验的结果(图3-4)均显示，通过RNA干扰技术(干扰RNA序列由SantaCruz公司提供，其商品名称为Sall4siRNA(h))下调体外培养的人ICC细胞中Sall4的表达可以明显减弱ICC细胞的迁移和浸润能力。这一结果说明Sall4的表达下调能抑制ICC细胞的相关恶性临床表型。
(5)Westernblot结果(图5)显示，借助RNA干扰技术下调体外培养的人ICC细胞中Sall4的表达导致E-钙黏连蛋白表达的显著增加和N-钙黏连蛋白表达的显著降低。而这两种蛋白又是上皮间质转化中的关键蛋白，由此说明Sall4在ICC的远处转移中也起到了重要作用。
(6)Westernblot结果同时还显示Sall4表达上调时，其下游的PTEN的表达会下调，而Bmi-1的表达会上调；Sall4表达下调时，PTEN表达上调，Bmi-1表达下调。提示Sall4可能通过PTEN和Bmi-1的下游信号途径影响ICC细胞的迁移和浸润(图6)。
以上这些预实验的证据充分说明Sall4与ICC细胞的侵袭转移能力密切相关；Sall4可能通过PTEN和Bmi-1信号途径调控ICC的侵袭和转移。

Claims (10)

1.Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用，其特征在于，所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的淋巴转移、血管浸润和神经浸润方面预后的制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过Sall4的表达控制PTEN和Bmi-1信号途径调控肝内胆管细胞癌的侵袭和转移。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Sall4基因应用于制备肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移预后的制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过Sall4的表达控制E-钙黏连蛋白和N-钙黏连蛋白的表达，从而调控肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，预后制剂包括：划痕实验检测、Transwell实验检测、Westernblot检测、石蜡组织芯片检测、PCR检测、原位杂交检测制剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，PCR检测试剂引物序列如下：
正向引物：AGCACATCAACTCGGAGGAG
逆向引物：CATTCCCTGGGTGGTTCACTG。
8.Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌复发和转移的制剂的应用，其特征在于，通过Sall4基因序列设计用于下调肝内胆管细胞癌的癌细胞中Sall4表达的干扰RNA，所述的Sall4基因序列如SEQ:NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌淋巴转移、血管浸润和神经浸润的制剂。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，Sall4基因用于制备防治肝内胆管细胞癌的癌细胞的远处转移的制剂。
CN201510506001.8A 2015-08-17 2015-08-17 Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用 Pending CN105087796A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510506001.8A CN105087796A (zh) 2015-08-17 2015-08-17 Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510506001.8A CN105087796A (zh) 2015-08-17 2015-08-17 Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105087796A true CN105087796A (zh) 2015-11-25

Family

ID=54569122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510506001.8A Pending CN105087796A (zh) 2015-08-17 2015-08-17 Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105087796A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103945860A (zh) * 2011-09-20 2014-07-23 布莱根妇女医院 Sall4和其用途
CN104278008A (zh) * 2013-07-12 2015-01-14 北京大学科技开发部 一种通过小分子化合物处理来制备多潜能干细胞的方法、试剂盒和用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103945860A (zh) * 2011-09-20 2014-07-23 布莱根妇女医院 Sall4和其用途
CN104278008A (zh) * 2013-07-12 2015-01-14 北京大学科技开发部 一种通过小分子化合物处理来制备多潜能干细胞的方法、试剂盒和用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GANG DENG ET AL.: "SALL4 is a novel therapeutic target in intrahepatic cholangiocarcinoma", 《ONCOTARGET》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108486159A (zh) 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
Oh et al. Telomere shortening and telomerase reactivation in dysplastic nodules of human hepatocarcinogenesis
CN103881975B (zh) 人前列腺癌细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途
CN111718995B (zh) 一种鼻咽癌转移诊断和/或预后评估的生物标记
CN103667441B (zh) 一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用
CN109825587B (zh) 一种胶质瘤预后标志物cpvl及其应用
CN108823315A (zh) 检测fen1基因表达水平的试剂在制备用于诊断及预测肝癌侵袭转移的试剂中的应用
CN105087796A (zh) Sall4基因在制备肝内胆管细胞癌预后制剂中的应用
CN103333893B (zh) 一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用
CN103911343B (zh) 一种多器官转移人膀胱癌细胞
CN105062973A (zh) 一株携带tp53突变的hpv阴性阴茎鳞癌细胞系及其用途
CN111996252B (zh) Dyrk2基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
CN107496924A (zh) AhR抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用和抗肿瘤组合物
CN108048401A (zh) 人胆道癌细胞系及应用
CN106540274A (zh) 一种miRNA在制备治疗矽肺药物中的应用
CN113862361A (zh) 一种诊断和治疗膀胱癌的分子标志物hsf1及其用途
CN103940998A (zh) 血清microRNA作为肝细胞癌转移的早期诊断标志物的应用
CN107828789A (zh) 肺癌靶向治疗的抑制剂及其应用和kap1作为药物靶标在筛选抗肺癌的药物中的应用
CN101974086A (zh) 抗ebv潜伏膜蛋白lmp2a单克隆抗体的制备方法及其应用
CN103361403A (zh) 一种检测膀胱癌相关风险基因的试剂盒
CN106636444A (zh) Fam78a基因的用途
CN109929804B (zh) 一种人卵巢癌细胞系及其制备方法和应用
CN111575384A (zh) 人glt8d1基因在肿瘤临床诊疗中的应用
CN112941183B (zh) 非编码基因miR-187-5p在原发性肝癌诊疗中的应用
CN103432593B (zh) 一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151125

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication