CN103333893B - 一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体为一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用，本发明提供了一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA，如SEQ？ID？NO.1,靶序列如SEQ？ID？NO：2，该shRNA通过如SEQ？ID？NO.3所示的DNA模板序列转录生成，将模板序列与线性化载体重组后，再与hTERT启动子序列重组，获得抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA真核表达质粒；经验证，真核表达质粒载体在人DOK细胞和KB细胞中能稳定持续的降低PRPS2？mRNA和蛋白表达水平，导致细胞增殖抑制、细胞周期阻遏、凋亡发生，克服了体外化学合成siRNA的作用时间短、毒性大等缺点。

Description

一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体为一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用。

背景技术

5-氟尿嘧啶作为抗代谢药物的一种，已广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗，其作用机制是通过干扰DNA合成与mRNA翻译导致细胞死亡。然而5-氟尿嘧啶由于其非特异性，对患者产生较强的毒副作用，可能导致冠状动脉痉挛、冠状动脉血栓形成、心肌炎和心脏猝死等副作用的发生[SorrentinoMF,KimJ,FoderaroAE,TruesdellAG.5-fluorouracilinducedcardiotoxicity:reviewoftheliterature[J].CardiolJ.2012;19(5):453-458.]。所以，探寻新的有效抗代谢类药物是肿瘤治疗的一个亟待解决问题。hTERT只在端粒酶阳性细胞和组织中表达，如肿瘤或者干细胞；85%以上的人类恶性肿瘤中端粒酶都会异常表达，但正常细胞中却无此现象[HiyamaE,HiyamaK.Telomeraseastumormaker[J].CancerLett.2003,194(2):221-233.]。人正常组织细胞内hTERT基因为单拷贝基因，总长约为40kb，定位于染色体的5p15.33区，在hTERT基因的转录起始点上游的181bp片段为核心启动子序列，hTERT基因启动子具有高肿瘤靶向性及较强的启动活性，从而成为肿瘤靶向基因治疗中具有巨大应用潜力的启动子[王峰，刁勇，许瑞安.人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子在肿瘤基因治疗中的应用[J].中国生化药物杂志，2012，33（5）：686-689.]。

PRPS2是PRPS家族成员之一，由PRPS2基因编码。PRPS2基因是位于X染色体短臂Xp22.2-p22.3的管家基因，几乎在所有细胞中均有表达，在增殖较快的组织如胸腺、肺、胃、小肠、脾和睾丸组织中表达量较高。肿瘤组织是细胞增殖旺盛的组织，其核苷酸的从头合成是肿瘤细胞增殖的首要步骤。阻断肿瘤细胞核苷酸的从头合成也是目前临床广泛应用的抗代谢类肿瘤化疗药物（如5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和环胞苷等）的作用机制。利用RNA干扰（RNAinterference，RNAi）表达载体，对PRPS2基因的表达进行特异性抑制，有望阻断肿瘤细胞的恶性增殖和生长，进而达到治疗肿瘤的目的。

RNAi是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默现象，已成为人类基因功能研究的有力工具，同时在基因干预治疗的应用中具有很大潜力。特别是应用RNAi技术在哺乳动物细胞中高效特异阻断特定基因的表达，为恶性肿瘤的基因治疗提供了新方法。RNAi常用两种方法:siRNA和shRNA。siRNA合成的成本较高，作用时间相对短暂，而且长双链RNA在哺乳动物细胞中会诱发细胞毒效应。而shRNA方法对靶基因的作用持续时间、细胞的毒性反应以及合成价格等方面有一定的优势，因此使用shRNA进行RNA干扰是目前较为常用的方法[BrummelkampTR,BernardsR,AgamiR．AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAsinmammaliancells.Science，2002，296(5567)：550-553]。

shRNA是一段具有紧密发卡环的RNA序列，利用载体把编码目标shRNA的DNA序列导入细胞，载体中的启动子可启动该序列表达为特定shRNA。这种重组了编码shRNA载体的DNA序列可随着细胞的增殖而被传递到子代细胞中去，从而使目标基因的沉默可被遗传。导致目标基因表达降低（沉默）的机制是：shRNA在细胞胞液中可形成发卡结构，然后被细胞液中特定的酶切割成siRNA；siRNA结合到RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)上；RISC结合到目标基因转录形成的mRNAs上，在其他酶的作用下将其降解，达到目标基因沉默效应[PaddishPJ,CaudyAA,BernsteinE,etal．ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.GenDev，2002，16：948-958.]。

众所周知，口腔癌是发生在口腔的恶性肿瘤之总称，大部分属于鳞状上皮细胞癌，即所谓的黏膜发生变异。在临床实践中口腔癌包括牙龈癌、舌癌、软硬腭癌、颌骨癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌、唇癌、和上颌窦癌以及发生于颜面部皮肤黏膜的癌症等。口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一。目前，手术切除和放射治疗仍是治疗口腔癌的两种最有效方法，虽然术后使病人生存率得到了较大提高，但总体愈后仍不乐观，导致病人死亡的主要原因是肿瘤的复发和转移。因此，研制治疗口腔癌的新型药物具有重要的经济价值和社会效益，如上所述，采用RNA干扰技术将成为治疗口腔癌的有效途径。但到目前为止，还没有关于将PRPS2基因作为治疗口腔癌靶基因的报道，更没有一种同时含有hTERT启动子序列和PRPS2shRNA干扰序列的真核表达载体作为治疗口腔癌药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA，其碱基序列如SEQIDNO：1所示,即5’-CCAUACGCCCGACAAGAUAAACUCGAGUUUAUCUUGUCGGGCGUAUGG-3’，其针对的靶序列是人PRPS2的mRNA第422～440位，如SEQIDNO：2所示，即5’-AUACGCCCGACAAGAUAAA-3’。该shRNA通过如SEQIDNO：3所示的DNA模板序列转录生成，即

5’-CCATACGCCCGACAAGATAAACTCGAGTTTATCTTGTCGGGCGTATGG-3’。

本发明所述的抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA的载体构建方法如下，将所述SEQIDNO：1的模板序列SEQIDNO：3与线性化载体pGPU6/GFP/NeosiRNA重组后，再与hTERT启动子序列SEQIDNO：4重组，最终获得抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA真核表达质粒，命名为pGGN-hTERT-PRPS2；所述SEQIDNO：3插入线性化载体pGPU6/GFP/NeosiRNA的限制性酶切位点为EcoRⅠ和BamHⅠ，所述hTERT启动子序列SEQIDNO：4为基因AB016767的3081-3424位，SEQIDNO：4序列替换线性化载体pGPU6/GFP/NeosiRNA的U6启动子的酶切位点为Acc65Ⅰ和HindⅢ。

本发明所述的抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA在制备治疗口腔癌药物中的应用。

本发明提供了一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA以及具有高肿瘤靶向性及较强的启动活性的hTERT启动子序列，然后将真核细胞PRPS2基因的可编码其shRNA的DNA序列重组至pGPU6/GFP/NeosiRNA真核表达载体，再用334bp的hTERT启动子序列替换U6启动子，构建成新的干扰载体pGGN-hTERT-PRPS2；分别转染正常口腔粘膜上皮细胞NOK、异常增生口腔粘膜上皮细胞DOK、口腔表皮样癌细胞KB等口腔癌细胞后，检测对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡作用的差异，经过大量实验验证，本发明所述的pGGN-hTERT-PRPS2载体能显著抑制人DOK细胞（异常增生口腔粘膜上皮细胞）、KB细胞（口腔表皮样癌细胞）PRPS2mRNA和蛋白表达，并导致细胞增殖抑制、细胞周期阻遏、凋亡发生，而对NOK细胞（正常口腔粘膜上皮细胞）无上述作用。

本发明的有益之处是：1、成功基因重组获得特异性抑制人DOK细胞和KB细胞PRPS2基因表达的shRNA真核表达载体pGGN-hTERT-PRPS2；2、真核表达载体pGGN-hTERT-PRPS2在人DOK细胞和KB细胞中能稳定持续的降低PRPS2mRNA和蛋白表达水平，克服了体外化学合成siRNA的作用时间短、毒性大等缺点；3、pGGN-hTERT-PRPS2在人DOK细胞和KB细胞中能有效抑制口腔癌细胞的增殖、细胞周期阻遏、细胞凋亡，而对人NOK细胞无上述作用，说明pGGN-hTERT-PRPS2在肿瘤组织中特异性表达。因此，本发明利用RNA干扰技术，为人口腔癌的治疗提供了新途径，为抗肿瘤药物的开发提供了新材料。

附图说明

图1为本发明所述hTERT序列与文献报道hTERT序列的比对图谱，图中，334.seq即为本发明所述hTERT序列，89.seq、181bp、241bp、786bp为文献报道hTERT序列；其中图1a、图1b、图1c分别为对比序列的一段，三部分顺次连接构成整个比对图谱；

图2为本发明设计并合成PRPS2的一对shRNA序列，为48bases，其3’末端和5’末端可形成自身碱基配对，中间6bases形成loop环；

图3为含有如图2所示shRNA序列的编码序列shDNA和hTERT启动子序列的载体构建示意图，命名为pGGN-hTERT-PRPS2；

图4为pGGN-hTERT-PRPS2载体中shDNA测序鉴定图谱，其中a为本发明shDNA测序鉴定图谱，b为阴性对照序列鉴定图谱；

图5为pGGN-hTERT-PRPS2载体中hTERT启动子测序鉴定图谱；

图6为细胞转染pGGN-hTERT载体荧光与光镜比较（100×）图谱，其中A、B为转染NOK细胞；C、D为转染DOK细胞；E、F为转染KB细胞，其中A1、B1、C1、D1、E1、F1均为转染pGGN-hTERT-NC；A2、B2、C2、D2、E2、F2均为转染pGGN-hTERT-PRPS2；

图7为转染后RT-PCR法检测pGGN-hTERT-PRPS2干扰载体对PRPS2mRNA表达结果与阴性对照组的电泳图；

图8为转染后RT-PCR法检测pGGN-hTERT-PRPS2干扰载体对PRPS2mRNA表达水平的定量分析图，与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；

图9为转染后Westernblot法检测细胞内PRPS2mRNA蛋白表达结果与阴性对照组的电泳图；

图10为转染后Westernblot法检测细胞内PRPS2mRNA蛋白表达水平的定量分析图，与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；

图11为PRPS2表达下调对细胞增殖能力的影响示意图；

图12：AnnexinV/PI双染色法检测PRPS2表达下调对口腔细胞凋亡的影响，A：NOK细胞对照组；B：NOK细胞实验组；C：DOK细胞对照组；D：DOK细胞实验组；E：KB细胞对照组；F：KB细胞实验组；

图13：AnnexinV/PI双染色法检测PRPS2表达下调对口腔细胞凋亡的定量分析图，与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；

图14：PI染色法检测PRPS2表达下调对口腔细胞周期的影响示意图，其中A：NOK细胞对照组；B：NOK细胞实验组；C：DOK细胞对照组；D：DOK细胞实验组；E：KB细胞对照组；F：KB细胞实验组；

图15：PI染色法检测PRPS2表达下调对口腔细胞周期影响的定量分析图，与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者按照生产厂商所建议的条件。

实施例1：

本发明所述hTERT启动子序列的设计

启动子区是RNA聚合酶的结合区，其序列直接决定结构，结构直接关系到转录的效率。使用DNAMAN分析软件将本发明设计使用的334bp的hTERT启动子序列（SEQIDNO：4）与文献报道的4个hTERT启动子序列进行比对，分别是文献[HorikawaI,CablePL,AfshariC,BarrettJC.Cloningandcharacterizationofthepromoterregionofhumantelomerasereversetranscriptasegene.CancerRes.1999Feb15;59(4):826-830.]报道的59bp的hTERT启动子序列（SEQIDNO：5）、文献[TakakuraM,KyoS,KanayaT,HiranoH,TakedaJ,YutsudoM,InoueM.Cloningofhumantelomerasecatalyticsubunit(hTERT)genepromoterandidentificationofproximalcorepromotersequencesessentialfortranscriptionalactivationinimmortalizedandcancercells.CancerRes.1999Feb1;59(3):551-557.]报道的181bp的hTERT启动子序列（SEQIDNO：6）、文献[YuST,ChenL,WangHJ,TangXD,FangDC,YangSM.hTERTpromotestheinvasionoftelomerase-negativetumorcellsinvitro.IntJOncol.2009Aug;35(2):329-336.]报道的241bp的hTERT启动子序列（SEQIDNO：7）和文献[WangW,JinB,LiW,XuCX,CuiFA,LiuB,YanYF,LiuXX,WangXL.TargetedantitumoreffectinducedbyhTERTpromotermediatedODCantisenseadenovirus.MolBiolRep.2010Oct;37(7):3239-3247.]报道的786bp的hTERT启动子序列（SEQIDNO：8）。结果见图1。结果显示，本发明所述的334bp的hTERT启动子序列（SEQIDNO：4）与其他4篇文献报道的5’端序列和3’端序列均明显不同，在5’端对转录基本调控元件和转录因子结合位点进行了调整，在3’端对-10区同-35区之间核苷酸数目进行了调整，经试验验证，本发明所述hTERT启动子序列具有较高的肿瘤靶向性及较强的启动活性。

实施例2：

可特异性降低人口腔癌细胞PRPS2基因表达的shRNA的设计

在NCBI数据库中查找人PRPS2基因的mRNA碱基序列（GeneBank编号：NM_001039091.2），使用siRNA查找工具软件（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）选择靶点序列，靶点序列为人PRPS2mRNA的第422～440位，如SEQIDNO：2所示，5’-AUACGCCCGACAAGAUAAA-3’。根据靶点序列设计的可转录生成shRNA的DNA序列为：SEQIDNO：3：5’-CCATACGCCCGACAAGATAAACTCGAGTTTATCTTGTCGGGCGTATGG-3’，其转录后生成的shRNA序列为：SEQIDNO：1：5’-CCAUACGCCCGACAAGAUAAACUCGAGUUUAUCUUGUCGGGCGUAUGG-3’。

实施例3：

可特异性降低人口腔癌细胞PRPS2基因表达的重组载体pGGN-hTERT-PRPS2的构建

（1）将SEQIDNO：3重组于pGPU6/GFP/NeosiRNA真核表达载体的设计方案为:EcoRⅠ-Targetsensesequence-Hairpinloop-Targetantisensesequence-Terminator-BamHⅠ，具体操作步骤如下：

操作第一步：使用DNA合成仪合成SEQIDNO：3所示的DNA，并在两端加上EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位点，其结构模式图见图2。

操作第二步：将上述人工合成的单链DNA序列退火形成双链结构。退火反应体系为：将各2mL的正向和反向DNA寡核苷酸与46ml的退火Buffer混合，在95℃持续4min，70℃持续10min，慢慢冷却退火的寡核苷酸至10℃。

操作第三步：将第二步退火产物与pGPU6/GFP/NeosiRNA载体进行双酶切，37℃、14h，产物进行1.5%琼脂糖凝胶分离，回收，纯化酶切产物。

操作第四步：各取2mL酶切产物，加入适量T4DNA连接酶，16℃、16h。

操作第五步：将含有重组pGPU6/GFP/NeosiRNA载体的第四步混合液转化至JM109大肠杆菌，铺板，挑单菌落培养，提质粒。

操作第六步：将提取的质粒根据EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点定位测序，判断重组载体中是否插入正确的可转录生成SEQIDNO：3序列的DNA序列。

（2）将hTERT启动子与载体pGPU6/GFP/NeosiRNA重组的实验方案如下：

操作第一步：使用DNA合成仪合成SEQIDNO：4所示的hTERT启动子DNA，并在两端加上Acc65Ⅰ和HindⅢ的酶切位点，其结构模式图见图3。

操作第二步：PCR扩增hTERT启动子，该引物上下游分别含有相应酶切位点Acc65Ⅰ和HindⅢ，以便酶切后插入pGPU6/GFP/NeosiRNA中的启动子位置。使用20mL反应体系，由于GC含量较高，故在反应体系中使用GCBuffer。反应条件为：94℃30s，65℃30s，72℃60s，共30个循环。

操作第三步：将第二步产物用0.8%琼脂糖凝胶分离，切取含有hTERT启动子的约334bp片段的琼脂糖胶，称量后置于EP管中，使用DNA回收试剂盒回收目的片段。

操作第四步：将第三步回收产物与pGPU6/GFP/NeosiRNA质粒进行双酶切，37℃、10h，产物进行0.8%琼脂糖凝胶分离，回收，纯化酶切产物。

操作第五步：各取2mL酶切产物，加入适量T4DNA连接酶，4℃、12h。

操作第六步：得到重组有hTERT启动子的pGPU6/GFP/NeosiRNA载体，将其混合液转化至JM109大肠杆菌，铺板，挑单菌落培养，提质粒。

操作第七步：将提取的质粒根据Acc65Ⅰ、HindⅢ酶切位点定位测序，判断重组载体中是否插入正确的如SEQIDNO：4所述的序列。

质粒特征如图3所示，其中shDNA代表编码shRNA（SEQIDNO：1）的DNA序列（SEQIDNO：3）。重组载体命名为pGGN-hTERT-PRPS2。进一步对shDNA和hTERT启动子区域分别进行DNA测序检测，结果显示，pGGN-hTERT-PRPS2的shDNA和hTERT启动子区域DNA序列与上述设计一致。见图4、图5。

实施例4：

利用重组载体pGGN-hTERT-PRPS2（以pGGN-hTERT-NC为对照）瞬时转染人NOK、DOK、KB细胞

取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于培养皿中，转染时细胞密度达70-80%；使用EffecteneTransfectionReagent转染试剂盒进行转染。取0.8mg质粒加6.4mLEnhancer，混匀后加入100mLBufferEC中，震荡混匀1s，室温孵育5min；加15mLEffecteneTransfectionReagent，震荡混匀10s，室温孵育10min；加600mLIMDM培养基，震荡混匀1s，加入细胞中；6h后补加血清至10%，72h后收集细胞进行鉴定；显微镜下观察NOK、DOK、KB细胞中绿色荧光蛋白的表达，利用ImageJ软件对其转染效率进行分析。转染pGGN-hTERT-PRPS2、pGGN-hTERT-NC两种载体至NOK、DOK、KB细胞72h后，荧光显微镜与光镜下对比，见图6。利用ImageJ软件对其转染效率进行分析，比较转染效率，三种细胞的实验组和对照组的转染效率均介于40-50%，见表1。

表1：pGGN-hTERT载体转染口腔细胞72h转染效率（）

实施例:5：

转染后半定量RT-PCR法检测pGGN-hTERT-PRPS2对PRPS2mRNA表达的干扰作用

转染72h后取出六孔板，DEPC水洗三次后每孔加入1mlTrizol，吹打细胞，移入1.5mlEp管中;室温放置10min后，每管中滴加200ml氯仿，涡旋振荡1min，室温静置5min;4℃12000g离心15min，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品;小心吸取上清液约450ml于新离心管中，在管内加入600ml冷冻的异丙醇，混匀，-20℃放置10min;4℃12000g离心10min,弃去上清，加入1ml预冷的75％乙醇;洗涤沉淀后，4℃12000g离心6min，小心吸去上清;风干约5min，加入DEPC水约10ml即为总RNA液。

取RNA2mg，5×PrimeScriptBuffer4mL，加RNaseFreedH₂O至总体积20mL，37℃反应15min，85℃反应5s，反转录得cDNA；PCR扩增人PRPS2基因，上游引物为：5’-GATTGCGTCATCATCCAGAGT-3’，下游引物为：5’-CATTCGCCTTCTTCCTCTCTT-3’。以管家基因GAPDH为内参照，上游引物为：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。反应条件为：94℃30s，60℃30s，72℃60s，共30个循环。反应体系如表2。

表2：PCR反应体系组成表

pGGN-hTERT-PRPS2干扰载体作用72h后收集细胞，分别提取总RNA和总蛋白，RT-PCR检测细胞内PRPS2mRNA的表达，干扰效果=（对照组-实验组）/转染效率，结果显示，NOK细胞中对照组与实验组PRPS2mRNA相对表达量分比为1.00±0.02、0.95±0.02；DOK细胞中对照组与实验组PRPS2mRNA相对表达量分比为0.95±0.02、0.75±0.04；KB细胞中对照组与实验组PRPS2mRNA相对表达量分比为0.98±0.06、0.36±0.04。NOK细胞中PRPS2表达量未受影响，DOK、KB细胞中实验组PRPS2表达分别显著下调（25.6±2.2）%、（62.2±4.8）%，见图7、图8。

实施例6：

转染pGGN-hTERT-PRPS2后Westernblot法检测对PRPS2蛋白表达的干扰作用

收集转染72h后细胞，吸弃6孔板中的旧培养基，用PBS冲洗细胞2次；6孔板每孔中加入70mL细胞裂解液与PMSF混合液，使其均匀覆盖于细胞表面，冰上裂解20min；用胶头滴管吹打细胞，将其移至1.5mLEp管中，冰上裂解1h，期间每10min振荡一次；4℃12000g离心10min，吸取上清即为细胞总蛋白；BCA法测定蛋白浓度，调整总蛋白浓度。

（1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳：清洗、组装胶架，使用少量去离子水检查密封性，按照表3量取试剂。先配制12%分离胶，灌注，室温静置40min至胶凝固，再配制6%积层胶，灌注，室温静置40min；将胶架放入垂直电泳槽，加入电泳缓冲液；样品中加入相应量5×上样缓冲液，封口后煮沸10min,使蛋白变性；使用加样器上样，每泳道加入50mg样品，另有一泳道加入5mL蛋白质Marker；恒压120V电泳至溴酚蓝抵达分离胶下缘或下1/4处，终止电泳。

（2）转膜：电泳结束后拆开胶架，根据蛋白质Marker标记切取适当大小的分离胶，切角做标记，移至转膜液中浸泡；剪取与切取的分离胶大小略相等或稍小的中性滤纸12张和已活化的聚偏二氟乙烯膜（PolyvinylideneFluoride，PVDF膜）1张，切角做标记，放入转膜液中浸泡数分钟；使用半干电泳转膜仪转膜，转膜时使用恒定电流，电流大小为膜的面积乘以1.5mA/cm²，时间为2-4h左右。

（3）封闭：转膜结束后，使用1×丽春红染液染膜，10min后取出以水清洗，观察膜上是否有蛋白条带；再次冲洗膜至颜色完全消褪后移入封闭液中，室温下置于摇床上摇动封闭3h；同时将分离胶用考马斯亮兰染液染色1h、脱色45min，观察转膜是否完全。

（4）抗体标记：从封闭液中取出膜；根据切角标记分别将膜移入以各蛋白一抗稀释液（1:200）中，置于4℃摇床上摇动12-16h；TBST洗膜3次，10min/次，再次加入相应辣根过氧化物酶标记二抗稀释液（1：1000），室温下置于摇床上摇动3h；用TBST洗膜3次，10min/次。

（5）ECL发光成像：取出PVDF膜，用滤纸轻轻吸干(不可摩擦膜的蛋白标记面)，置于凝胶成像仪的黑色胶片上；将ECL发光液A液和B液取适量等体积混合，滴加ECL混合工作液覆盖在膜上，确保其均匀覆盖，静置1-2min；使用BIO-RAD凝胶成像仪观察拍照。

（6）蛋白条带定量分析：通过BIO-RAD图像分析软件分析蛋白条带，各蛋白条带灰度值通过内参β-actin校正，反映各蛋白相对表达水平。

表3：5%积层胶、12%分离胶SDS-PAGE配方

WesternBlot检测细胞内PRPS2mRNA的表达，结果显示，NOK细胞中对照组与实验组PRPS2蛋白水平相对表达量分比为1.00±0.01、0.96±0.03；DOK细胞中对照组与实验组PRPS2蛋白水平相对表达量分比为0.98±0.04、0.75±0.04；KB细胞中对照组与实验组PRPS2蛋白水平相对表达量分比为0.98±0.05、0.30±0.04。NOK细胞中PRPS2表达量未受影响，DOK、KB细胞中实验组PRPS2表达分别显著下调（23.3±4.2）%，（64.7±3.7）%，见图9、10。

实施例7：

CCK8检测pGGN-hTERT-PRPS2作用于NOK、DOK、KB细胞后对增殖能力的抑制作用

参考文献[QingYe,BoFeng,Yuan-FeiPeng，etal.Expressionofγ-synucleinincolorectalcancertissuesanditsroleoncolorectalcancercelllineHCT116[J].WorldJGastroenterol.2009October28;15(40):5035–5043.]的方法进行细胞增殖能力检测。将96孔板每孔接种100微升2000个细胞。转染72h后，每孔加入10μLCCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育1h，用酶标仪检测A450。

利用CCK8检测细胞增殖能力。结果显示，NOK细胞实验组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），DOK细胞增殖速度实验组与对照组相比，明显减慢，差异有统计学意义（P<0.01），KB细胞增殖速度实验组与对照组相比，明显减慢，差异有统计学意义（P<0.01）。见表4、图11。说明pGGN-hTERT-PRPS2特异性干扰DOK、KB细胞中PRPS2，使得DOK、KB细胞增殖能力分别下降（23.4±5.1）%、（34.4±4.7）%，而对NOK细胞无影响。

表4：PRPS2表达下调对口腔细胞增殖能力的影响（N=5，）

注：与正常组1比较，*P<0.05，**P<0.01。

实施例8：

AnnexinV/PI检测pGGN-hTERT-PRPS2作用于NOK、DOK、KB细胞后促进细胞凋亡与坏死的作用效果

参考文献[TangD,KangR,ChehCW,LiveseyKM,LiangX,SchapiroNE,BenschopR,SparveroLJ,AmoscatoAA,TraceyKJ,ZehHJ,LotzeMT.HMGB1releaseandredoxregulatesautophagyandapoptosisincancercells.Oncogene.2010Sep23;29(38):5299-5310.]的方法采用AnnexinV/PI检测检测细胞凋亡与坏死情况。用不含EDTA的胰酶消化收集细胞；用PBS洗涤细胞二次（1000r/min离心5min）收集1-5×10⁵细胞；加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞；加入5μLAnnexinV-EGFP混匀后，加入5μLPropidiumIodide，混匀；室温、避光、反应15min；流式细胞仪检测。

采用AnnexinV/PI双染色法对细胞凋亡情况进行定量。细胞凋亡检测结果显示，pGGN-hTERT-PRPS2干扰载体作用72h后，各组凋亡率分别为（8.28±0.69）%、（8.60±0.61）%、（18.60±1.13）%、（25.45±2.32）%、（44.42±0.65）%、（77.76±4.24）%，见表5。NOK细胞中实验组较对照组相比，凋亡率无显著差异（P>0.05）；DOK、KB细胞凋亡率显著增加，分别增加了（6.85±2.32）%、（33.34±4.42）%（P<0.05），见表5、图12、图13。

表5：PRPS2表达下调对口腔细胞凋亡的影响（72h，N=3，）

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

实施例9：

pGGN-hTERT-PRPS2作用于NOK、DOK、KB细胞后导致细胞周期阻遏的作用效果。

参考文献[YunJM,AfaqF,KhanN,MukhtarH.Delphinidin,ananthocyanidininpigmentedfruitsandvegetables,inducesapoptosisandcellcyclearrestinhumancoloncancerHCT116cells[J].MolCarcinog.2009,48(3):260-270.]的方法检测细胞周期的变化。胰酶消化收集细胞；用PBS洗涤细胞二次常温2000r/min离心5min后收集1×106细胞；弃去上清，加入1.5mLPBS，拍打成细胞悬液，加预冷的70％乙醇；4℃固定过夜；1500r/min离心5min，弃去上清，PBS冲洗后加入100μLRNaseA，37℃水浴保温30min，再加入400μLPI染色液混匀，4℃避光30min，使用流式细胞仪进行检测。

分别将PRPS2干扰载体转染NOK、DOK、KB细胞72h后进行PI染色后通过流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果显示，pGGN-hTERT-PRPS2干扰载体作用72h后，NOK细胞实验组较对照组各个阶段均无统计学差异（P>0.05），DOK、KB细胞G0/G1期细胞比例显著上升（9.1±2.07）%、（9.76±1.01）%（P<0.01）。说明PRPS2基因低表达能够导致HCT116细胞阻滞于G0/G1期，细胞分裂减缓。见表6、图14、图15。

表6：PI染色法检测PRPS2表达下调对口腔细胞周期的影响（72h，，N=3）

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

<110>山西医科大学

<120>一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用

<160>8

<170>PatentInVersion3.5

<210>1

<211>48

<212>RNA

<213>人工序列

<400>1

　　CCAUACGCCCGACAAGAUAAACUCGAGUUUAUCUUGUCGGGCGUAUGG

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人（Homosapiens）

<400>2

　　AUACGCCCGACAAGAUAAA

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

　CCATACGCCCGACAAGATAAACTCGAGTTTATCTTGTCGGGCGTATGG

<210>4

<211>334

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

　　1GACCCCCGGGTCCGCCCGGAGCAGCTGCGCTGTCGGGGCCAGGCCGGGCTCCCAGTGGAT

61TCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGG

121CACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCC

181CGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCT

241TTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCG

301CACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGCCACCCCCGCG

<210>5

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

　GACGCCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCT

<210>6

<211>181

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

　1CGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTT

61CCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCC

121CAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTC

181G

<210>7

<211>241

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

　1CACAGACGCCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGT

61CCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCC

121TCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCG

181GCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGG

241G

<210>8

<211>786

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

　1TTTGGGGTGGTTTGCTCATGGTGGGGACCCCTCGCCGCCTGAGAACCTGCAAAGAGAAAT

61GACGGGCCTGTGTCAAGGAGCCCAAGTCGCGGGGAAGTGTTGCAGGGAGGCACTCCGGGA

121GGTCCCGCGTGCCCGTCCAGGGAGCAATGCGTCCTCGGGTTCGTCCCCAGCCGCGTCTAC

181GCGCCTCCGTCCTCCCCTTCACGTCCGGCATTCGTGGTGCCCGGAGCCCGACGCCCCGCG

241TCCGGACCTGGAGGCAGCCCTGGGTCTCCGGATCAGGCCAGCGGCCAAAGGGTCGCCGCA

301CGCACCTGTTCCCAGGGCCTCCACATCATGGCCCCTCCCTCGGGTTACCCCACAGCCTAG

361GCCGATTCGACCTCTCTCCGCTGGGGCCCTCGCTGGCGTCCCTGCACCCTGGGAGCGCGA

421GCGGCGCGCGGGCGGGGAAGCGCGGCCCAGACCCCCGGGTCCGCCCGGAGCAGCTGCGCT

481GTCGGGGCCAGGCCGGGCTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGCTTC

541CCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCC

601GCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCC

661TCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCG

721AGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGCCACCCCC

781GCGATG

Claims (1)

1.一种抑制人口腔癌细胞PRPS2表达的shRNA在制备治疗口腔癌药物中的应用，其特征在于所述的shRNA碱基序列如SEQIDNO：1所示,即

5’-CCAUACGCCCGACAAGAUAAACUCGAGUUUAUCUUGUCGGGCGUAUGG-3’。