CN105497057B

CN105497057B - 小分子非编码RNA miR-100在制备用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN105497057B
Application number: CN201510672284.3A
Authority: CN
Inventors: 庄诗美; 周慧超; 方坚鸿; 尚丽茹
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2035-10-15
Also published as: CN105497057A

Abstract

本发明提供一种小分子非编码RNA miR‑100在制备用于治疗肿瘤包绕型血管(VETC)类型肝癌的药物中的用途，其中所述miR‑100的RNA序列为5’‑AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG‑3’。本发明通过免疫组化和实时定量PCR检测了人肝癌组织标本，表明肝癌病人组织标本中miR‑100的低表达与病人组织肿瘤包绕型血管类型以及Ang‑2的高表达显著相关；小鼠成瘤实验的结果表明恢复miR‑100的表达可显著抑制肝癌细胞表达Ang‑2、形成肿瘤包绕型血管和转移的能力。因此，miR‑100均可用于制备治疗形成肿瘤包绕型血管的肝癌病人的药物。

Description

小分子非编码RNA miR-100在制备用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及小分子非编码RNA miR-100及其在制备VETC血管类型肝癌治疗药物中的应用。

背景技术

原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其中50％发生于中国，且发病率和致死率逐年上升，严重危害我国人民的健康。众所周知，易于发生转移是癌症难以根治并导致病人死亡的主要原因。一般认为，肿瘤中微血管密度越高，肿瘤越易于发生血行转移。但是，肝癌的微血管密度与肝癌复发转移的关系仍存在争议。最近我们发现：除毛细管状血管，肝癌中还广泛存在VETC(vessels thatencapsulate tumor cluster，肿瘤包绕型血管)类型血管，它们相连成网，将肿瘤块包绕分隔开。具备VETC血管类型的肝癌病人通常术后复发率更高，生存时间更短。更为重要的是，VETC能够通过与癌旁血管融合释放被VETC分隔的肿瘤块，从而帮助肿瘤发生转移。这提示：VETC血管结构对肿瘤细胞发生转移具有重要的影响，因此制备针对VETC血管类型肝癌的治疗药物具有重要的应用价值。

Sugino等于2002年最早报道了肿瘤中类似VETC的血管结构的存在，他们观察到乳腺癌细胞移植瘤中血管发展成融合的血窦样结构，并包绕肿瘤团块；随后，该课题组在人肝癌、肾癌和甲状腺癌中都观察到融合的血窦样结构的现象。我们之前的报道首次证明了VETC结构是肝癌独立的预后不良预测因素，与肝癌的转移密切相关。至今,关于VETC形成的潜在分子机制知之甚少。分别有两个研究小组发现：乳腺癌细胞株过表达SLPI和黑色素瘤过表达VEGFA可促进肿瘤细胞株成瘤组织中VETC结构血管的形成，但是具体机制不明。最近，我们首次揭示了Ang-2是诱导VETC形成的关键分子，在肿瘤细胞中敲低Ang-2的表达能够显著破坏VETC的形成，并最终导致转移率下降。

Ang-2是血管重塑的重要调控分子，能够通过结合其受体Tie-2，激活下游信号通路，下调内皮细胞中粘附分子VE-Cad的表达，增加血管的通透性，并抑制周细胞的募集，从而阻碍血管成熟。缺少周细胞保护的不成熟血管通常处于一种不稳定的状态，它们通过感受外部信号，决定是出芽还是凋亡。在缺乏促血管生成信号的情况下，Ang-2高表达会导致内皮细胞凋亡，进而发生血管衰退；然而在富含VEGF等促血管生成信号的肿瘤中，Ang-2会促进内皮细胞接受促血管生成信号，诱导内皮细胞的增殖和迁移，引起血管生成。研究表明，Ang-2在多种肿瘤组织中高表达，且其表达水平与患者的生存时间显著负相关。多个基于动物模型的研究表明，抑制Ang-2的活性不仅能够增加肿瘤血管上周细胞的覆盖，使得血管正常化，还显著抑制了移植瘤的血管生成以及肿瘤生长。我们的前期结果表明，抑制肝癌细胞中Ang-2的表达不仅能够抑制VETC的形成，还能够抑制转移。由此可见，Ang-2主要起到促肿瘤的作用，是一个重要的抗血管药物潜在的靶分子。

microRNA(miRNA)是一类保守的小分子非编码RNA，通过识别靶基因的3’非编码区域(3’UTR)抑制mRNA翻译或促进蛋白降解，从而在转录后水平调控蛋白编码基因的表达。miRNA的异常调控已被证实参与了多种肿瘤的发生发展。由于一个miRNA通常能够识别多个蛋白编码基因，同时调控多种生物学功能，包括增殖、凋亡、血管生成和转移等等，因此在肿瘤中过表达miRNA是一种潜在的抗肿瘤治疗策略。然而，国内外文献中至今未见有关miRNA参与VETC血管类型调控的研究报道。因此，研究miRNA在VETC类型血管生成中的作用及其在肝癌诊治中的应用，对于制备高效的抗肿瘤血管生成药物以及肿瘤个体化治疗意义重大。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种抑制肿瘤细胞Ang-2表达和形成VETC血管，进而治疗肝癌的小分子非编码RNA。

首先，本发明的内容小分子非编码RNA miR-100在制备用于治疗VETC血管类型肝癌的药物中的应用，其中所述miR-100的RNA序列为：

miR-100,5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’(Seq ID No.1)；

在另一实施方案中，本发明的小分子非编码RNA miR-100抑制肿瘤细胞诱导形成VETC血管。在优选的实施方案中，本发明的小分子非编码RNA miR-100抑制肿瘤细胞中Ang-2的表达。

在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗VETC血管类型肝癌的药物，其包含所述小分子非编码miR-100。

在另一实施方案中，本发明提供了用于治疗VETC血管类型肝癌的药物，其包含能表达miR-100的试剂。在优选的实施方案中，所述表达miR-100的试剂包括RNA拟似物、过表达miR-100的质粒和携带有miR-100序列的病毒。

本发明的内容还包括所述能表达miR-100的试剂在在制备用于治疗VETC血管类型肝癌的药物中的用途。

进一步，本发明的内容还包括小分子非编码RNA miR-100在制备抑制肿瘤细胞中Ang-2的表达和抑制肿瘤细胞诱导形成肿瘤包绕型血管的试剂中的用途。

本发明通过免疫组化和实时定量PCR检测了人肝癌组织标本，表明肝癌病人组织标本中miR-100的低表达与病人组织肿瘤包绕型血管类型以及Ang-2的高表达显著相关；小鼠成瘤实验的结果表明恢复miR-100的表达可显著抑制肝癌细胞表达Ang-2、形成VETC类型血管和转移的能力。因此，miR-100均可用于制备治疗形成VETC血管类型的肝癌病人的药物，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为肝癌组织标本miR-100的表达水平与包绕型血管VETC的相关性统计图。图1是实施例1的实验结果。

图2为小鼠移植瘤实验结果图，检测在肝癌细胞中过表达miR-100对血管形态和转移的影响。其中，图2A是免疫组化检测人原代肝癌细胞VETC-2小鼠移植瘤中包绕型血管的代表图和血管指数统计图，代表图下方标示对应的每组发生转移的荷瘤小鼠数目/成瘤小鼠总数；图2B是鼠肝癌细胞Hepa1-6移植瘤的包绕型血管指数统计图。图2是实施例2中的实验结果。

图3为miR-100调控肝癌细胞表达Ang-2的实验结果图。其中，图3A为在VETC-2或Hepa1-6细胞中稳定过表达miR-100后，肝癌细胞中Ang-2蛋白水平的蛋白质印迹检测图；图3B为在VETC-2或Hepa1-6细胞中拮抗内源miR-100后，细胞中Ang-2蛋白水平的蛋白质印迹检测图。图3是实施例3中的实验结果。

图4为检测VETC-2和Hepa1-6形成的小鼠移植瘤中Ang-2表达的实验结果图。其中，图4A为免疫组化检测稳定过表达miR-100或对照的VETC-2小鼠移植瘤Ang-2表达的代表图和其相对表达量的统计图；图4B为免疫组化标记稳定过表达miR-100或其对照的Hepa1-6小鼠移植瘤Ang-2表达的统计图。图4是实施例3中的实验结果。

图5为人肝癌组织中miR-100和Ang-2表达相关性的统计图。图5是实施例3中的实验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。

本发明所采用的miR-100拟似物由上海吉玛公司合成，序列从Sanger microRNA序列数据库miRBase V15.0获得，其双链RNA序列从5’端到3’端分别为：

miR-100正义链，5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’(Seq ID No.1)；

miR-100反义链,5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’(Seq ID No.2)。

阴性对照组的阴性对照RNA序列(也称NC)为上海吉玛公司合成的用于siRNA实验的标准阴性对照序列，其RNA序列从5’端到3’端分别为：

正义链，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(Seq ID No.3)；

反义链，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(Seq ID No.4)。

本发明所采用的慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(简称pCDH),购自System Biosciences；慢病毒包装体系Lenti-X HTX Packaging Mix购自Clontech。

实施例1：人组织标本miR-100的表达肝癌组织血管类型密切相关

1.1实时定量PCR(qPCR)检测

(1)RNA提取：切取肝癌组织(收集于中山大学附属肿瘤医院标本库)，用Trizol裂解，提取RNA；

(2)逆转录和PCR：利用TaqMan MicroRNA Assay kit试剂盒(购自ABI)提供的反应体系进行逆转录及PCR。PCR反应中每个样品设置3个复孔，得到每个PCR循环反应的Ct值。用核小分子RNARNU6B的表达水平进行标准化，得到目标miRNA的表达值为2^-ΔCt(ΔCt＝Ct_靶miR-Ct_参照基因)。

1.2免疫组化检测

人肝癌组织的切片由中山大学附属肿瘤医院标本库提供。制成4μm石蜡切片4℃保存。后续检测步骤为：

(1)脱蜡以及抗原修复：55℃烤片30min以上，放于二甲苯中脱蜡两次，10min/次；依次用100％、95％、90％、80％、70％和双蒸水洗3min；然后用0.3％的双氧水处理10min，灭活内源性过氧化物酶；双蒸水再洗3次，3min/次；浸泡于修复液中，于10mM柠檬酸钠修复液(pH 6.0)中微波修复10min，室温冷却半小时；1×PBS洗3次，3min/次；

(2)抗体孵育及染色：用抗人CD34的抗体(购自Santa Cruz公司)进行孵育，4℃过夜；恢复室温，弃去抗体液，用1×PBS洗3次，5min/次；加入二抗，37℃半小时；用1×PBS洗3次，5min/次；加入DAB显色液进行显色，然后用苏木精复染。

(3)计数：根据CD34染色镜下判断血管类型；视野中若观察到包绕型结构的血管(VETC)，则定义为VETC⁺，反之则定义为VETC^-。

1.3结果分析

如图1所示，我们共检测了106份肝癌组织标本，通过染色CD34标记血管内皮细胞，再根据血管形态分组，发现所检测的肝癌组织中有37例(35％)具有VETC血管结构，定义为VETC⁺标本，有69(65％)未检测到VETC血管结构，定义为VETC^-标本。利用qPCR检测对应肝癌组织标本中miR-100的表达水平，与血管类型进行相关性分析，我们发现miR-100在VETC⁺的肝癌组织中表达显著低于VETC^-组织(P<0.001，T检验)。

上述结果显示，肝癌病人组织miR-100的表达下调可能促进了VETC的形成。

实施例2：miR-100抑制移植瘤形成VETC和发生转移

2.1细胞感染

(1)构建表达miR-100的病毒载体：miR-100的表达片段以正常人外周血白细胞的RNA逆转录所得的cDNA为模板进行扩增。扩增获得的PCR产物插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(pCDH,System Biosciences,CA)骨架EcoRI和BamHI的位点

(2)包装病毒：于24孔板中，用磷酸钙转染法将0.3μg包装混合质粒和0.3μg表达质粒共转至预先贴好的293T包装细胞中。转染后48h收集含有慢病毒的上清。500g离心10min去除细胞碎片，病毒上清，于-80℃贮存。

(3)感染靶细胞：在24孔板中种植适当密度的VETC-2(发明人分离自肝癌病人癌组织)或Hepa1-6，加入慢病毒感染，24h后更换培养基，换入新鲜的培养基。多次传代得到一定数目的细胞后，通过流式分选GFP阳性的细胞。筛选到阳性细胞后进行qPCR检测miRNA的过表达效率。

2.2小鼠肝原位成瘤

(1)制作细胞悬液：用DMEM重悬上述2.1制得的稳定株(细胞数为2×10⁶/只鼠)，与Matrigel以1：1的比例混合。

(2)手术：用戊巴比妥钠(30mg/kg体重)麻醉裸鼠或C57BL/6小鼠，将细胞悬液接种至肝包膜下(30ul/只)。

(3)后续处理：5周后，处死并解剖小鼠，取出肿瘤，拍照观察，福尔马林固定肿瘤、肝脏和肺组织。脱水包埋后，制作石蜡切片用于免疫组化或是H&E染色。

2.3免疫组化

小鼠的肿瘤组织取自步骤2.2，制成4μm石蜡切片4℃保存。后续检测步骤为：

(1)脱蜡以及抗原修复：55℃烤片30min以上，放于二甲苯中脱蜡两次，10min/次；依次用100％、95％、90％、80％、70％和双蒸水洗3min；然后用0.3％的双氧水处理10min，灭活内源性过氧化物酶；双蒸水再洗3次，3min/次；浸泡于修复液中，于10mM柠檬酸钠修复液(pH 6.0)中高压热修复10min，室温冷却半小时；1×PBS洗3次，3min/次；

(2)抗体孵育及染色：用抗鼠CD34的抗体(购自Biolend公司)进行孵育，4℃过夜；恢复室温，弃去抗体液，用1×PBS洗3次，5min/次；加入二抗，37℃半小时；用1×PBS洗3次，5min/次；加入DAB显色液进行显色，然后用苏木精复染。

(3)计数：在低倍视野(100×)下拍摄5个血管生成旺盛的视野并计算被内皮细胞包绕的肿瘤块的个数。每个视野平均的内皮细胞包绕肿瘤块的个数被定义为包绕型血管指数(Index of VETC)，包绕型血管指数则用于衡量包绕型血管形成的程度。

2.4H&E染色

小鼠的肝(去除接种肿瘤细胞的肝叶)和肺组织取自步骤2.2，制成4μm石蜡连续切片4℃保存。两者后续检测步骤为：

(1)脱蜡：55℃烤片30min以上，放于二甲苯中脱蜡两次，10min/次；依次用100％、95％、90％、80％、70％和双蒸水洗3min；然后用0.3％的双氧水处理10min；

(2)染色：苏木精染色5min，水洗3min，伊红复染30s，水洗1min。

(3)统计：显微镜下观察是否有转移结节，统计转移的发生率。

2.5结果分析

如图2所示，A图显示过表达miR-100的人肝癌原代细胞VETC-2在小鼠体内形成的肿瘤，其组织血管类型发生了显著的改变，而且转移率也大大降低(Ctrl vs.miR-100＝100％vs.57.1％)。通过计算包绕型血管指数，过表达miR-100的VETC-2移植瘤形成包绕型血管的能力显著减弱。B图显示，过表达miR-100抑制Hepa1-6肝癌细胞诱导形成包绕型血管(每个10×视野内包绕型血管的指数Ctrl vs.miR-100＝28.2vs.9.8)。

综上所述，过表达miR-100可以显著抑制人或鼠肝癌细胞于小鼠体内形成VETC血管以及发生转移的能力。这表明能表达miR-100的试剂可以用于制备治疗VETC血管类型肝癌的药物。

实施例3：miR-100均能够抑制肝癌细胞表达Ang-2

3.1细胞转染

采用Lipofectamine RNAi MAX转染试剂(购自Life Technology)反转的方式转染RNA寡核苷酸，具体步骤如下(以24孔板为例)：

(1)将50nM miRNA拟似物或者100nM miRNA抑制剂加至100 μl opti-MEM中并混匀，加入1 μl Lipofectamine RNAi MAX并轻柔混匀，室温静置15min；

(2)将上述静置的混合液加入24孔板，随后加入500 μl细胞悬液，米字形混匀后置于5％CO₂、37℃培养箱中培养。

miRNA抑制剂购自上海吉玛，为单链RNA，其RNA序列从5’端到3’端分别为：

anti-miR-100:CACAAGUUCGGAUCUACGGGUU(Seq ID No.5)

对照anti-miR-C:CAGUACUUUUGUGUAGUACAA(Seq ID No.6)

3.2蛋白质印迹

(1)电泳前：制备SDS-PAGE胶；1×SDS细胞裂解液提取蛋白；

(2)电泳：蛋白在浓缩胶中按恒流10mA/块进行电泳，在分离胶中则按恒流20mA/块进行电泳；

(3)转膜：电泳结束后取出凝胶，根据目的蛋白分子量的大小，割取相应大小的凝胶。按照海绵垫—滤纸—PVDF膜(0.45μm孔径)—凝胶—滤纸—海绵垫的顺序制备“夹心饼”，在电泳槽中置入冰盒，恒流250mA转膜4小时；

(4)封闭及孵育抗体：转膜结束后取出PVDF膜，1×TBS洗5分钟后加入含有5％脱脂奶粉的TBS/T封闭半小时以上；弃封闭液，1×TBS/T溶液洗膜，5min/次，重复3次。加入适当比例稀释的Ang-2(购自Novus公司)或β-actin(内源对照，购自武汉博士德公司)一抗溶液(稀释液为含1％BSA的TBS/T)，4℃孵育过夜。回收一抗，1×TBS/T溶液室温洗膜，5min/次，重复3次。加入相应种属的二抗，室温孵育1h。

(5)显影：将膜浸泡于ECL试剂3-5min显色，然后用Tanon 5200进行成像以及分析(图3)。

3.3实时定量PCR(qPCR)检测

(1)RNA提取：切取肝癌组织，用Trizol裂解，提取RNA；

(2)逆转录和PCR：利用TaqMan MicroRNA Assay kit试剂盒(购自ABI)提供的反应体系进行逆转录及PCR。PCR反应中每个样品设置3个复孔，得到每个PCR循环反应的Ct值。用核小分子RNA RNU6B的表达水平进行标准化，得到目标miRNA的表达值为2^-ΔCt(ΔCt＝Ct_靶miR-Ct_参照基因)。根据106份人肝癌组织标本中miR-100表达的平均值，将标本分为高低表达两组。

3.4免疫组化

小鼠的肿瘤组织切片取自步骤2.3，人肝癌组织切片取自1.2。

(2)抗体孵育及染色：用抗Ang-2的抗体(能检测人源和鼠源Ang-2，购自Novus公司)进行孵育，4℃过夜；恢复室温，弃去抗体液，用1×PBS洗3次，5min/次；加入二抗，37℃半小时；用1×PBS洗3次，5min/次；加入DAB显色液进行显色，然后用苏木精复染。

(3)计数：Ang-2染色后在高倍视野(400×)下拍照，用ImagePro Plus软件扫描，并计算整个视野中Ang-2阳性信号面积。对于人肝癌组织，拍摄10个代表视野，并将所有标本的平均值定义为1；对于小鼠移植瘤组织，拍摄5个视野，并将对照组的平均值定义为1。

小鼠的肿瘤组织切片组织染色及免疫组化结果如图4所示，人肝癌组织切片结果如图5所示。

3.4结果分析

如图3所示，A图显示过表达miR-100可明显抑制人肝癌细胞VETC-2和鼠肝癌细胞株Hepa1-6中内源Ang-2的表达；B图显示抑制细胞内源的miR-100后，肝癌细胞Ang-2的蛋白表达上调。

如图4所示，A图显示，在小鼠移植瘤模型中，相较于对照组(VETC2-Ctrl)，miR-100过表达的细胞所形成的移植瘤中Ang-2的蛋白水平显著较低；在小鼠肝癌细胞中也观察到类似现象，B图显示过表达miR-100抑制Hepa1-6肿瘤细胞形成的移植瘤中Ang-2的表达。

如图5所示，相对于miR-100高表达的病人，miR-100低表达的临床肝癌病人组织标本表达更高水平的Ang-2。

综上所述，过表达miR-100能够抑制人或鼠肝癌细胞表达Ang-2。这表明，miR-100可以用作制备治疗VETC血管类型肝癌的药物。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims

1.小分子非编码RNA miR-100在制备用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物中的应用，其中所述miR-100的RNA序列为5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述miR-100抑制肿瘤细胞诱导形成肿瘤包绕型血管。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述miR-100抑制肿瘤细胞中Ang-2的表达。

4.能表达小分子非编码RNA miR-100的试剂在制备用于治疗肿瘤包绕型血管类型肝癌的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述能表达小分子非编码RNA miR-100的试剂包括小分子RNA拟似物。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述能表达小分子非编码RNA miR-100的小分子RNA拟似物包括直接化学合成的双链RNA、质粒和病毒载体中的一种或多种。