CN104830904B - 肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体及其制备方法和应用，siRNA表达载体含有由肿瘤特异性启动子和热休克元件调控表达的siRNA表达框，制备方法简单，具有良好的肿瘤特异性，从而可以降低其对正常细胞产生的毒副作用，并且siRNA表达载体在热激的条件下可高效率地敲除目的基因，条件可控，并且避免外源诱导物引起的免疫反应，因此可用于肿瘤靶向治疗，具有很好的应用前景。

Description

肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体，还涉及该siRNA表达载体的制备方法和应用。

背景技术

RNAi是在生物进化上高度保守的特异性转录后基因沉默过程，并已经成为强大的基因操作工具。它几乎可以用来研究任何一种基因的分子途径以及表型和基因型之间的关系。但仍存在些许不足之处，如RNAi时间和空间上的不可控性及非靶向性，上述不足严重限制了RNAi在基因治疗领域中的广泛应用。因此，RNAi在时间和空间上的不可控性以及非靶向性是需要亟待解决的难题。诱导型RNAi技术可以通过诱导物介导shRNA的表达进而实现对靶基因的有效调控，因此也成为了近些年RNAi技术的研究热点。目前所存在的诱导型RNAi系统主要包括两大类：一种是利用已经构建成熟的调控系统(例如：Tet-on和Tet-off)，另一种是基于胁迫诱导型Pol II类启动子(如HSP70)。相比较而言，前者成本高，耗时长，调控系统比较复杂，不可控因素较多，其中诱导药物对细胞的毒性较大。而后者可直接在外界因素(如：缺氧、热激和冷激)的刺激下实现对目的基因的调控，操作简单，成本较低，同时对细胞无明显损伤，但是胁迫诱导型Pol II类启动子受外界因素调控，并不具有靶向性，同样不能满足RNAi在基因治疗领域中的应用。

因此，急需一种在时间和空间上可调控的靶向RNAi表达载体，为RNAi在基因治疗领域中应用奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体；本发明的目的之二在于提供肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的制备方法；本发明的目的之三在于提供肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体，所述siRNA表达载体含有由肿瘤特异性启动子和热休克元件调控表达的siRNA表达框。

优选的，所述肿瘤特异性启动子为人端粒酶逆转录酶启动子，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

优选的，所述热休克元件为HSE(MN)或HSE(XY)，所述HSE(MN)的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，所述HSE(XY)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述siRNA表达框如SEQ ID NO.6所示。

2、所述肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的制备方法，包括如下步骤：

a.以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物克隆人端粒酶逆转录酶启动子，然后合成热休克元件，所述热休克元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；

b.将步骤a克隆的人端粒酶逆转录酶启动子和热休克元件替换pMHSP70psil质粒的HSP70启动子，所述热休克元件位于所述人端粒酶逆转录酶启动子的5’端；再将SEQ IDNO.6所示序列连入启动子的3’端，得肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体。

优选的，步骤a中，克隆人端粒酶逆转录酶启动子的扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

3、所述肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体构建靶向干扰肿瘤治疗基因表达的载体中的应用。

优选的，所述肿瘤治疗基因为SNCG基因。

本发明的有益效果在于：本发明公开了肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体，该载体具有如下优点：

1)具有良好的肿瘤特异性，从而可以降低其对正常细胞产生的毒副作用；

2)由hTERT和热休克元件HSE启动子调控的siRNA本底表达水平很低，具有较强的热诱导性；

3)由hTERT/HSE启动子调控的siRNA表达载体在热激的条件下可高效率地敲除目的基因，由于本发明是用热来控制siRNA的表达而不是传统的外源诱导物，因此避免了免疫反应。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为pHSP70-EGFP、phTERTp-EGFP质粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/HSE(XY)p-EGFP质粒在人永生化表皮细胞(HaCaT)和人正常肝细胞(HL7702)细胞中荧光分布情况。

图2为pMHSP70psil、phTERTp-EGFP质粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/HSE(XY)p-EGFP质粒在人永生化表皮细胞(HaCaT)和人正常肝细胞(HL7702)细胞中EGFP蛋白表达情况。

图3为表达siRNA的质粒表达框结构图。

图4为pMhTERTppsil质粒、pMhTERT/HSE(MN)ppsil质粒和pMhTERT/HSE(XY)ppsil质粒结构图。

图5为SqRT-PCR和Western-blot检测HepG2细胞中不同处理组SNCG基因含量；a为在HepG2细胞中通过SqRT-PCR检测SNCG基因的沉默效果；b为用柱形图显示SNCG基因在RNA水平上的表达差异(均值±标准差，n＝3，*p<0.01)，Control组是指空白对照组，Mockcontrol是指只在细胞中加入转染试剂，pMhTERTpsil组是本实验中的阴性对照组即不含有热休克元件组；c为在HepG2细胞中通过Western-blot检测SNCG基因的沉默效果。

图6为SqRT-PCR技术检测MCF-7细胞中不同实验组SNCG基因含量；a为在MCF-7细胞中通过SqRT-PCR检测SNCG基因的沉默效果，b为用柱形图显示SNCG基因在RNA水平上的表达差异(均值±标准差，n＝3，*p<0.01)，Control组是指空白对照组，Mock control是指只在细胞中加入转染试剂，pMhTERTpsil组是本实验中的阴性对照组即不含有热休克元件组)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子

根据人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子序列(Genbank：AF325900)设计克隆hTERT启动子的引物，具体如下：

上游引物：5′-ggaagatctgattcgcgggcacagacg-3′(SEQ ID NO.1)，下划线为BglII酶切位点；

下游引物：5′-cggggtaccccacgtgcgcagcaggac-3′(SEQ ID NO.2)，下划线为KpnI酶切位点。

然后以乳腺癌细胞株MCF-7基因组为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存，将扩增产物切胶回收，获得hTERT启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2、合成热休克元件(HSE)

人工合成HSE(MN)和HSE(XY)序列，具体如下：

HSE(MN)序列为：5’-gaaggttcatttgaaggttcatttgaaggttc-3’(SEQ ID NO.4)；

HSE(XY)序列为：5’-agaacgttctagaacgttctagaacgttcttctagaacgttct-3’(SEQID NO.5)。

然后设计根据hTERT启动子序列和HSE(MN)与HSE(XY)的序列，设计含hTERT和HSE的启动子hTERT/HSE(MN)与hTERT/HSE(XY)的上游引物，具体引物如下：

hTERT/HSE(MN)启动子上游引物：5′-ggaagatctgaaggttcatttgaaggttcatttgaaggttcgattcgcgggcacagacg-3′(SEQ ID NO.6)，下划线为BglII酶切位点，黑体为HSE(MN)；

hTERT/HSE(XY)启动子上游引物：

5′-cggggtaccagaacgttctagaacgttctagaacgttcttctagaacgttctccacgtgcgcagcaggac-3′(SEQ ID NO.7)，下划线为BglII酶切位点，黑体为HSE(XY)。

然后分别以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为上游引物，SEQ ID NO.2为下游引物，进行PCR扩增，分别获得hTERT/HSE(MN)启动子和hTERT/HSE(XY)启动子。

实施例3、构建phTERTp-EGFP和phTERT/HSEp-EGFP质粒

1、构建phTERTp-EGFP质粒

将实施例1克隆hTERT启动子用BglII和KpnI双酶切，回收目的片段，然后用BglII和KpnI双酶切pHSP70-EGFP质粒(构建方法参见Yi Liao,Jianguo Feng,Qian Yi,HanweiCui,Ling He and Liling Tang*.A siRNA system based on HSP70promoter results incontrollable and powerful gene silencing by heat-induction.BiotechnologyProgress.2013；29(5):1289-97)，回收骨架载体，将回收的目的片段和骨架载体用T4连接酶连接，从而成功获得phTERTp-EGFP质粒。

2、构建phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒

将实施例克隆hTERT/HSE(MN)启动子用BglII和KpnI双酶切，回收目的片段，然后用BglII和KpnI双酶切pMHSP70psil质粒，回收质粒骨架，用T4DNA连接酶将目的片段和骨架质粒进行连接，转化，菌落PCR和测序，从而成功获得phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒。

3、构建phTERT/HSE(XY)p-EGFP质粒

将实施例克隆hTERT/HSE(XY)启动子用BglII和KpnI双酶切，回收目的片段，然后用BglII和KpnI双酶切pMHSP70psil质粒，回收质粒骨架，用T4DNA连接酶将目的片段和骨架质粒进行连接，转化，菌落PCR和测序，从而成功获得phTERT/HSE(XY)p-EGFP质粒。

实施例4、鉴定phTERTp-EGFP、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/HSE(XY)p-EGFP质粒的表达能力和肿瘤特异性

将实施例3构建的phTERTp-EGFP质粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/HSE(XY)p-EGFP质粒分别转染人永生化表皮细胞(HaCaT)和人正常肝细胞(HL7702)细胞，同时用pHSP70-EGFP质粒分别转染人永生化表皮细胞(HaCaT)和人正常肝细胞(HL7702)细胞作为对照，在37℃条件下正常培养，然后观察绿色荧光表达情况，并检测实验组和对照组中EGFP表达情况，结果如图1和2所示。由图1和2可知，pHSP70p-EGFP质粒在HL7702细胞和HaCaT细胞中具有较高表达，表明在HSP70启动子在人正常细胞中能够高效启动EGFP基因表达，而phTERTp-EGFP质粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/HSE(XY)p-EGFP在HaCaT和HL7702细胞的表达明显低于HSP70启子，表明phTERTp-EGFP质粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/HSE(XY)p-EGFP具有良好的肿瘤特异性。

实施例5、构建表达siRNA的质粒

先分别在hTERT、hTERT/HSE(MN)和hTERT/HSE(XY)启动子下游连接上可插入shRNA的表达框序列，该序列具体如下：5′-gctagcagggtaccccccgctcgaggtactagttctagagc-3′(SEQ ID NO.8)，下划线分别为Kpn I，XhoI，XbaI酶切位点，将其设计在启动子的后引物序列中，所设计的后引物命名为序列如下：

5′-gctctagaactagtacctcgagcggggggtaccctgctagcccacgtgcgcagcaggac-3′(SEQID NO.9)，人工合成上述序列。然后用hTERT启动子上游引物(SEQ ID NO.1)和SEQ ID NO.7所示的下游引物，分别以phTERTp-EGFP质粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/HSE(XY)p-EGFP为模板，扩增出含有shRNA表达框的hTERT、hTERT/HSE(MN)、hTERT/HSE(XY)目的片段，并用BglII和XbaI双酶切这些目的片段，切胶回收。然后分别用BglII和XbaI双酶切pMHSP70psil质粒(构建方法参见公开号为CN102994548A的中国专利)，切胶回收。用T4DNA连接酶将目的片段和骨架质粒进行连接，转化，菌落PCR，摇菌和测序，成功获得pMhTERTpsil质粒、pMhTERT/HSE(MN)psil质粒和pMhTERT/HSE(XY)psil质粒，这种质粒仅含有shRNA表达框，并未插入siRNA序列。

接下来设计siSNCG序列，前引物：5′-ctggtgagcagcgtcaacactgaagttctctcagtgttgacgctgctcaccaaaac-3′(SEQ ID NO.10)，后引物：5′-tcgagttttggtgagcagcgtcaacactgagagaacttcagtgttgacgctgctcaccaggtac-3'(SEQ ID NO.11)，序列由生工合成。用NEBbuffer 2将siSNCG的两条引物退火形成双链，退火反应体系为：NEB buffer2.5μl，siSNCG-F 1μg，siSNCG-R 1μg，Nuclease-Free Water加至50μl，94℃反应2min，65℃反应10min，37℃反应10min，在常温下静置5min，由此获得含有KpnI和XhoI黏性末端的siSNCG双链。接下来用KpnI和XhoI分别双酶切pMhTERTpsil质粒、pMhTERT/HSE(MN)psil质粒和pMhTERT/HSE(XY)psil质粒，然后将退火形成的siSNCG双链用T4DNA连接酶连接至质粒上，转化，菌落PCR，摇菌，测序，从而成功构建了pMhTERTpsiSNCG质粒、pMhTERT/HSE(MN)psiSNCG质粒和pMhTERT/HSE(XY)psiSNCG质粒，结构如图4所示。图3为调控表达shRNA的二级结构示意图，表达框内有一个正义链、茎环序列、反义链和一个终止序列组成，酶切位点两侧保守序列编码小内含子剪切因子。

实施例6、检测可调控性siRNA表达载体

将pMhTERTpsiSNCG质粒、pMhTERT/HSE(MN)psiSNCG质粒和pMhTERT/HSE(XY)psiSNCG质粒用Effectene Transfection Reagent(QIAGEN)试剂转染至HepG2和MCF-7细胞中，分别设置37℃正常生长的HepG2和MCF-7细胞为对照组(Control)，37℃和43℃诱导只加转染试剂对照组(37℃Mock control(Mock)和43℃Mock control(Mock))，37℃和43℃诱导pMhTERTpsiSNCG(hTERT+siSNCG)对照组；37℃和43℃诱导pMhTERT/HSE(MN)psiSNCG(hTERT+HSE(MN)+siSNCG)处理组和37℃和43℃诱导pMhTERT/HSE(XY)psiSNCG(hTERT+HSE(XY)+siSNCG)处理组；热激条件为转染12后进行第一次43℃热激，时间70min，然后将细胞放入37℃环境中恢复生长6小时，如此操作重复3次。收取不同处理组的细胞，通过半定量PCR(SqRT-PCR)和Western-blot检测不同实验组SNCG基因含量，结果如图5和图6所示。图5为通过SqRT-PCR和Western-blot在HepG2细胞中检测不同实验组SNCG基因含量，图6为通过SqRT-PCR技术在MCF-7细胞中检测不同实验组SNCG基因含量。上述结果表明在HepG2和MCF-7两种人肿瘤细胞中，未热激时pMhTERT/HSE(MN)psiSNCG质粒和pMhTERT/HSE(MN)psiSNCG质粒组沉默SNCG效率很低，仅为10％左右。而热激后，pMhTERT/HSE(MN)psiSNCG质粒和pMhTERT/HSE(MN)psiSNCG沉默SNCG基因的效率大幅度提高，最高可达到73％。说明hTERT启动子与HSE(MN)或HSE(XY)结合的启动子可以对siRNA实现有效热调控，因此构成载体后能够形成时间和空间上可调控的靶向RNAi表达载体。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体在构建靶向干扰肿瘤治疗基因表达的载体中的应用，其特征在于：所述siRNA表达载体含有由肿瘤特异性启动子和热休克元件调控表达的siRNA表达框；所述肿瘤特异性启动子为人端粒酶逆转录酶启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述热休克元件为HSE（MN）或HSE（XY），所述HSE（MN）的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，所述HSE（XY）的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述siRNA表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；其构建方法如下：

a.克隆获得人端粒酶逆转录酶启动子，然后合成热休克元件，所述热休克元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；

b.将步骤a克隆的人端粒酶逆转录酶启动子和热休克元件替换pMHSP70psil质粒的HSP70启动子，所述热休克元件位于所述人端粒酶逆转录酶启动子5’端；再将SEQ ID NO.8所示序列连入启动子的3’端，得肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤a中，克隆人端粒酶逆转录酶启动子的扩增条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤治疗基因为SNCG基因。