CN102676518A - 一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新型抗肿瘤amiRNA序列，其包含下列序列中的任意一条或一条以上：amiRNA-hTERT 1：正义链5’-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’；反义链5’-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’；amiRNA-hTERT 2：正义链5’-CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’；反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’；amiRNA-hTERT 3：正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。本发明能抑制肿瘤的生长、增殖和迁移，使肿瘤细胞进入衰老状态而促其凋亡。

Description

一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用。

背景技术

端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段重复的DNA序列5’-GGTTAG-3’，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，维持着染色体和基因组的完整性与稳定性(Rlackburn，E.H.Nature，350，569-573；1991.)。在正常体细胞中，细胞每分裂一次，由于DNA复制时的“冈崎片段”效应，端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致凋亡或其它癌变。因此，端粒和细胞老化有明显的关系。其长度反映着细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”(Kim Sh，S.H.，et al.Oncogene 21，503-511；2002.)。当端粒缩短到一定程度时，某些细胞为了逃避短端粒带来的凋亡效应，只有突变产生相应的“端粒维持机制”。通过“端粒维持机制”，这些细胞进行疯狂的增殖和复制，慢慢走向癌化的道路。目前已经报道的“端粒维持机制”除少数是‘非端粒酶依赖型’的外，绝大部分都是‘端粒酶依赖型’的，简单的说就是通过表达端粒酶来实现端粒的延伸或维持((Shay and Roninson，2004)。

端粒酶(Telomerase)，在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。简单来说，端粒酶是RNA和蛋白质的复合体，如人的端粒酶分别由起模板作用的端粒酶RNA(hTR)、起组装作用的端粒酶结合蛋白(hTP1)和起催化作用的端粒酶逆转录酶(hTERT)组成(Olovnikov，1971)。越来越多的研究表明，在哺乳动物中，各细胞中hTR的表达是普遍的，特异性不强；而hTERT则呈现与端粒酶活性极强的正相关性，是端粒酶活性的限速成份(Meyerson et al.，1997)。

实验表明，约85％-90％的肿瘤细胞中呈现端粒酶活性显著升高，而正常的成体细胞则显示低活性，因而端粒酶作为肿瘤治疗的最理想靶点早已是一个不争的事实(Hahn et al.，1999)。近年来通过调节端粒酶活性来干预肿瘤的研究日益增多，同时也取得了很好的效果，但主要局限在寡核苷酸和疫苗的临床研究方面(Brunsvig et al.，2006；Gandellini et al.，2007)。杰隆(Geron)的GRN163L是此类药物开发中最前沿的一个候选药物，早在2005年，FDA同意GRN163L在患慢性淋巴细胞白血病患者的临床实验。2007年，Geron公司开始GRN163L单独治疗多发性骨髓瘤的I期临床试验。2008年开始了GRN163L治疗乳腺癌的I期临床实验。同年12月，Geron发布了有关GRN163L治疗再发的和难治的多发性骨髓瘤的暂时性临床试验数据。2009年，Greron又发布了Geron163L对肿瘤干细胞的实验进展，包括非小型细胞肺癌、乳癌、胰脏炎、前列腺癌、小儿科神经肿瘤。数据显示，在以Geron163L治疗后，人类乳癌细胞MCF7的假定干细胞数量与自我再生的能力大幅减弱。目前Geron163L正处于临床II期试验中同样令人振奋的是KAEL-GemVax公司的抗端粒酶疫苗GV1001业已进入临床III期。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默(C，NapoliC et al.，Plant Cell.2：279-289；1990)。RNAi现象是生物体中非常普遍的一种基因调节行为，按其引发源分可以划分为内源性的微RNA(microRNA，miRNA)干扰和外源性的小RNA(small RNA，siRNA)干扰现象(Jinek and Doudna，2009)。miRNA是一种内源性、20-25bp长的双链RNA，通过与目的基因的部分(极少是完全)互补配对来实现对基因的转录后基因调控作用，在生物体的生长发育各个阶段从未停止工作过。在人体中，高达30％的基因受到miRNA的调控作用(Bartel，2004)。如果单纯从片段长度上进行推算的话，理论上人体基因组应该存在4^20-25种符合miRNA长度的微RNA片段，但到目前为止在人类中却只发现1424种miRNA，且没有一种已知miRNA是直接靶向hTERT的(miRBase Release 17：April，27，2011)。因此，若能根据miRNA形成原理来设计更多靶向作用的人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)，我们将有可能实现对端粒酶依赖的肿瘤RNAi治疗的新突破。因为目前对端粒酶依赖的肿瘤RNAi治疗方面，由于没有找到一种直接靶向hTERT的miRNA及siRNA的脱靶效应及毒副作用使得miRNA和siRNA途径都黯然失色。这就迫使我们将注意力转向新的RNAi方向(即amiRNA)，实验表明，针对于相同的靶点，amiRNA融合了单纯miRNA和siRNA的优点。首先，由于amiRNA设计时采用了miRNA的原则，具有miRNA的内源性优势，具有比siRNA更高的表达、包装和基因沉默效率，并且能很好的规避siRNA带来的干扰素效应这一大难题；其次，同样由于amiRNA设计时兼顾了siRNA的完全配对原则，必然导致amiRNA比常规miRNA具有更强的靶向性和基因沉默作用，同时也降低了难以控制的多靶、脱靶效应(Zeng et al.，2002)。

尽管siRNA和miRNA技术都已经非常成熟，也取得了一定的成果，但其干扰效果、特异性和副作用(如脱靶、干扰素效应)却始终不容乐观(Gandellini et al.，2007)。然而，被寄予厚望的amiRNA却只刚刚开始，目前虽有少数有关利用amiRNA来调控靶基因表达的成功案例，但却尚未有利用amiRNA靶向hTERT来实现肿瘤细胞的高效、低毒治疗的报道(Dickins et al.，2005)。因此，寻找和筛选一些高效、专一的靶向人端粒酶hTERT基因的amiRNA序列将成为肿瘤RNAi疗法的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用，本发明的端粒酶hTERT本身是肿瘤细胞的特异性标记之一，本发明涉及的amiRNA-hTERT能高效抑制hTERT表达，从而抑制肿瘤的生长、增殖和迁移，同时使肿瘤细胞进入衰老状态而促进其凋亡。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

根据miRNA和siRNA形成和结构特点设计了多条可能靶向hTERT的amiRNA-hTERT序列，通过实验筛选出高效抑制hTERT的amiRNA-hTERT的3条序列，该序列为下述序列中的任意一条或一条以上：

amiRNA-hTERT 1(amiR1)：正义链5’-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’；

                      反义链5’-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’；

amiRNA-hTERT2(amiR2)：正义链5’-CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’；

                      反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’；

amiRNA-hTERT3(amiR3)：正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；

                      反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。

所述的序列中，优选对hTERT沉默效率最好的amiRNA为：

amiRNA-hTERT3(amiR3)：正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；

                      反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。

本发明所提供的amiRNA由正义链和反义链组成，amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT2的正义链模拟了常规siRNA，长度为19个核苷酸；它的反义链则模拟了常规miRNA，长度为21个核苷酸；amiRNA-hTERT3则是将amiRNA-hTERT2的正义链改造成完全跟其反义链互补配对。

本发明所提供的3对amiRNA经Realtime PCR验证可以显著降低hTERT的mRNA表达，经Western blot方法证明可以明显降低hTERT的蛋白表达水平，在酶活性方面，Telo-TRAP和ElISA方法同时验证了3对amiRNA都能明显抑制hTERT的活性，从而实现对hTERT在转录本、蛋白和酶活多个层面抑制作用。并在体外细胞系列实验中验证了设计并合成的3对amiRNA对肿瘤细胞生长、增殖、迁移的特异性抑制作用和促进凋亡效果，而对正常细胞没有显著作用。并且能抑制内皮细胞的小管形成，为将来肿瘤治疗中抑制肿瘤周边血管形成提供了可能。动物水平的裸鼠移植瘤实验同样证实了合成的3对amiRNA能抑制移植瘤的形成和生长。整体效果来说，设计并合成的3对amiRNA中，其中以amiRNA-hTERT 3效果最佳。

一种新型抗肿瘤amiRNA序列在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所提供的amiRNA序列可用于制备与hTERT基因相关疾病的治疗药物，如抗肿瘤药物。该amiRNA序列可以通过化学合成以化学药物用于肿瘤的预防和治疗，也可以经过包装(如质粒或病毒类载体)最后以基因药物形式用于肿瘤的预防和治疗中。

本发明的有益效果是：本发明的端粒酶hTERT本身是肿瘤细胞的特异性标记之一，本发明涉及的amiRNA-hTERT能高效抑制hTERT表达，从而抑制肿瘤的生长、增殖和迁移，同时使肿瘤细胞进入衰老状态而促进其凋亡；在有效浓度方面，本发明中的amiRNA-hTERT 3只需1.56nM的浓度就可以实现对宫颈癌细胞Hela的81％的生长抑制作用，比以往报道的靶向hTERT的siRNA(约50-100nM)等效作用浓度降低近2个数量级；在RNAi治疗的副作用方面，本发明中的3对amiRNA都没有检测到明显的干扰素效应和脱靶效应。

附图说明

图1是本发明amiRNA对NCI-H446，Hela，U2-OS，Huvec转染效率的测定。1-1为Cy3标记的amiRNA转染实验细胞后荧光、白光及拟合图片；1-2为根据荧光细胞所占比例计算所得的转染效率结果；

图2是本发明amiRNA对NCI-H446hTERT mRNA表达水平的抑制效果；

图3是本发明amiRNA对NCI-H446hTERT蛋白表达水平的抑制效果；其中3-1是hTERT蛋白的Western blot图谱；3-2为根据蛋白条带显色亮度计算所得的蛋白表达效率；

图4是本发明amiRNA对NCI-H446细胞hTERT酶活的抑制效果；其中4-1为TRAP法检测hTERT酶活的电泳图谱；4-2为3-2为以NC为参照，根据条带显色亮度计算所得的相对总体酶活；

图5是本发明amiRNA对Hela，NCI-H446，U2-OS，Huvec的增殖影响及amiRNA-hTERT 3对Hela细胞增殖影响的量效曲线；其中5-1为MTT法测定amiRNA对Hela，NCI-H446，U2-OS，Huvec的增殖影响的结果；5-2为amiRNA-hTERT 3对Hela细胞增殖影响的量效曲线；

图6是本发明amiRNA对NCI-H446，Hela，U2-OS，Huvec细胞迁移能力的影响；其中6-1为划痕法测定细胞迁移能力的细胞图谱；6-2为根据划痕愈合率计算得到的细胞迁移能力结果；

图7是本发明amiRNA对NCI-H446，Huvec细胞侵袭能力的影响；其中7-1为transwell法测定细胞侵袭能力的细胞图谱；7-2为根据通过小室的细胞量计算得到的细胞侵袭能力结果；

图8是本发明amiRNA对NCI-H446单细胞软琼脂克隆形成能力的影响；其中8-1为细胞在软琼脂上形成的细胞克隆图谱；8-2为根据有效克隆的总体积计算得到的细胞克隆形成能力结果；

图9是本发明amiRNA对Huvec小管形成能力的影响；其中9-1为细胞在ECM胶上形成的小管的细胞图谱；9-2为根据有效小管结点量计算得到的细胞小管形成能力结果；

图10是本发明amiRNA对NCI-H446，Hela，Huvec，U2-OS细胞凋亡的影响；其中10-1为用PI单染细胞后做的流式图谱；10-2为根据细胞流式仪显示的凋亡率得到的细胞凋亡统计结果；

图11是本发明amiRNA对NCI-H446细胞干扰素通路相关基因IFN-beta，OAS1，STAT1的影响；

图12是本发明pAM-CAG-EGFP载体图谱及amiRNA对靶点基因的沉默效果；其中12-1为靶点沉默实验中所用的pAM-CAG-EGFP载体图谱；12-2为细胞转染含靶点质粒的amiRNA后的荧光表达变化；12-3为根据荧光表达效率所得的沉默效果统计结果；

图13是本发明amiRNA对NCI-H446细胞裸鼠移植瘤成瘤性及凋亡的影响；其中13-1为裸鼠移植瘤实验中裸鼠及其移植瘤的图谱；13-2为根据肿瘤体积计算所得的肿瘤生长曲线；13-3为肿瘤的免疫组化图谱。

具体实施方式

实施例1

amiRNA-hTERT的设计与合成。

从GenBank中查得人端粒酶逆转录酶基因hTERT的cDNA序列号(NM_198253)，结合目前常用的siRNA，miRNA mimics设计原理及天然miRNA结构特点综合进行amiRNA设计：①先用siRNA法则进行定位，再将预选的作用位点演变成miRNA mimics形式，最后根据天然miRNA结构特点进行结构优化，得到待选amiRNA；②分别选择靶基因hTERT序列的翻译区(ORF)和3’非翻译区(3’-UTR)为靶区域进行设计；③GC的百分比含量控制在35％-55％；④评估等级设为最高级的5星；⑤BLAST验证序列的特异性。结果得到2条amiRNA(amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2)，同时对amiRNA-hTERT 2进行结构改造得到amiRNA-hTERT 3，见表1(只列举最后验证有效的3条)。如表1所示，表1为设计的amiRNA-hTERT的三条有效引物序列

设计所得3条amiRNA由上海吉玛制药技术有限公司代为合成，合成时采用以下原则：①进行G，C碱基的2’Ome修饰；②在各链的3’末端人为添加2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸dTdT；③产品经PAGE纯化验证。阴性对照(NC)同时也购自上海吉玛制药技术有限公司。

实施例2

体外细胞实验评价amiRNA-hTERT的抗肿瘤效果。

1.细胞培养及amiRNA-hTERT转染效率的测定

本实施例根据实验目的针对性的选择了4株细胞(均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，分别为端粒酶低表达的正常细胞(HUVEC)、端粒酶阴性的肿瘤细胞(U2-OS)和端粒酶高表达的肿瘤细胞(Hela和NCI-H446)。所有细胞均在含有10％胎牛血清(Gibico公司)、100U/ml氨苄青霉素和100ug/ml硫酸链霉素(Sigma公司)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)中，37℃、5％CO₂、饱和湿度的环境条件下进行连续培养。转染前一天，细胞以4000个/孔的量接种于96孔板中。amiRNA-hTERT的转染完全按照Invitrogen的Lipo2000(Invitrogen公司)方案进行，amiRNA的转染浓度为50nM，使用

siRNALabeling Kit转染检测试剂盒(Ambion公司)。即先将待转染的amiRNA进行荧光染料Cy3标记，amiRNA的转染浓度为50nM，转染后6h用PBS洗去残余标记物，接着进行荧光观察(Nikon Ti-U，Japan)及软件分析(NIS-Elements software，Nikon)。具体操作完全按照Lipo2000和

siRNA Labeling Kit厂家提供的使用说明进行，并且全部操作均在避光条件下进行。结果表明amiRNA-hTERT能对所选细胞实现高效转染，分别为NCI-H446(93.4％)、Hela(95.1％)、U2-OS(95.2％)、HUVEC(96.5％)，结果见图1所示。

2.分析amiRNA-hTERT对hTERT的沉默效果

为了充分评价amiRNA-hTERT对hTERT的沉默效果，我们将从hTERT发挥作用的不同层面(转录本、蛋白和酶活)进行测定。

(1)qPCR分析hTERT mRNA的变化。NCI-H446和Hela细胞在各自转染amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2，amiRNA-hTERT 3和NC后24h，用Trizol Reagent(Invitrogen公司)按其说明书进行总RNA提取(由此开始在冰上进行操作)，接着用Bio Mate仪器(Thermo，USA)测定RNA纯度和浓度，立刻进行反转录(相关试剂购自Zoman公司)：加入5xRT缓冲液10ul，dNTP(2.5mM)4ul，Rnasin(40U/ul)1ul，RTase(200u/ul)1ul，Oligo18(50uM)0.1ul，RNA 2ug，补充ddH2O到50ul，充分混匀后42℃孵育60min。完成反转录之后用RealtimePCR(ABI，USA)对hTERT表达水平进行定量，内参为GAPDH。操作按Zoman的“2x SYBR Green qPCR kit”方案进行，即模板2ul，上、下游引物(10uM)1ul，2xMix 10ul，补充ddH2O到20ul。扩增条件为：95℃4min→(94℃45s，60℃45s，72℃45s)40cycle→meltcurve。

qPCR实验结果表明，3对amiRNA能明显下调端粒酶阳性的两种细胞(NCI-H446和Hela)hTERT的表达。以NCI-H446为例(如图2所示)，相对于NC来说，amiRNA-hTERT 1降低了72％的hTERT表达，amiRNA-hTERT 2为89％，而amiRNA-hTERT 3达到99％，初步认定amiRNA-hTERT 3在抑制hTERT表达时最为有效。

(2)SDS-PAGE和Western Blot分析hTERT蛋白的变化。在转染amiRNA后用CHAPS裂解液(Beyotime公司)裂解NCI-H446细胞，裂解液经12000rpm x 20min离心后取上清。经BCA蛋白浓度检测试剂盒(Beyotime公司)测定蛋白浓度，取30ug蛋白上清进行8％SDS-PAGE跑胶，之后进行转膜，剪下目的蛋白条带，用1％脱脂奶粉(Beyotime公司)封闭过夜，按1∶500加入对应性一抗(兔抗人hTERT一抗、兔抗人Actin一抗，Santa公司)，37℃孵育2h，用TBST洗3次，用1∶1000的二抗(山羊抗兔IgG-HRP，Santa公司)孵育2h，再用TBST洗3次，用ECL检测试剂盒(Beyotime公司)显色。结果显示，在端粒酶阳性的NCI-H446细胞中，相对于NC来说，amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2和amiRNA-hTERT 3分别下调其hTERT的蛋白表达约58％，87％和98％，抑制效果明显，尤其是amiRNA-hTERT 3(如图3所示)。相类似的结果也在另一株端粒酶阳性的Hela细胞中得到。

(3)端粒酶活性的测定。分别在NCI-H446，Hela细胞中转染amiRNA，转后3d收集细胞，接着用TeloChaser试剂盒(TOYOBO公司)进行端粒酶活性检测。具体操作为用TeloChaser试剂盒(TOYOBO公司)自带的裂解液配制细胞提取液并裂解细胞，离心后取上清液进行BCA蛋白浓度定量，用三蒸水将相同蛋白量的上清液统一配成20ul反应液，配好Extension mix后加入20ul提取液上清进行端粒酶延伸反应，之后用异丙醇和乙醇纯化反应产物，以所得产物为模板，加入TeloChaser试剂盒(TOYOBO公司)自带引物进行PCR反应，结束后用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶经过夜固定后进行银染显色。结果表明所设计的3种amiRNA都能很有效的抑制端粒酶活性，以Hela细胞为例(如图4所示)，3对amiRNA的抑制率分别16％，77％和99％。同时用TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS kit(Roche公司)对处理细胞进行端粒酶活性检测，也得到相似的结果，具体操作同其说明书。

3.分析各amiRNA对细胞增殖的影响

转染前一天，将正常细胞Huvec，端粒酶阴性细胞U2-OS，端粒酶阳性细胞NCI-H446和Hela分别按3E+3个细胞/孔接种于96孔板中，接板后20h进行amiRNA转染，转染浓度统一为50nM，除阴性对照组(NC)外，同时增设一组只加lipo 2000的lipo对照组，用于评价整体实验操作可靠性。转染后每2天更换一次培养基，第四天加入MTT标记物(Roche公司)，吸去培养液，加入溶解液后孵育过夜，用分光光度计(Eppendorf，Germany)检测580nm吸光度，具体操作同cell proliferation kit I(Roche公司)。结果显示，相对于NC来说，3种amiRNA对端粒酶阴性(或低表达)的细胞(U2-OS，Huvec)没有显著作用，而对端粒酶阳性的细胞(NCI-H446，Hela)却有明显的增殖抑制作用，尤其是amiRNA-hTERT 3效果更为显著，对Hela细胞的抑制率达到85％。

选择最为有效的amiRNA-hTERT 3进一步做量效曲线，以确定其最低有效浓度。同样转染前一天，将Hela分别按3E+3个细胞/孔接种于96孔板中，接板后20h进行amiRNA-hTERT 3转染，转染浓度从100nM开始逐渐进行半量递减(100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM，1.56nM，0.78nM，0nM)，同时设一个完全的空白组(Blank)来评价实验的操作可靠性。实验组中各浓度的lipo 2000用量统一为lipo2000操作方案的推荐用量，其余操作完全按lipo2000说明书进行。转让后第四天用cell proliferation kit I(Roche公司)进行细胞增殖测定，操作按其说明进行。结果表明，对应Hela来说，amiRNA-hTERT 3在0.78nM时开始呈现强劲的细胞增殖抑制效果，在1.56nM时基本达到其最大的抑制率(82％)，这个浓度是目前报道的靶向hTERT的最低有效浓度。结果见图5所示。

4.分析各amiRNA对细胞迁移和侵袭的影响

NCI-H446，Hela，U2-OS，Huvec细胞按8000个细胞/孔接种于96孔板中，20h后进行amiRNA转染，转后48h用200ul黄枪头在培养孔的中间位置划“十”字，再用PBS洗去悬浮细胞，换上新鲜培养液继续培养24h并拍照。此划痕实验结果显示，NCI-H446，Hela，Huvec三种细胞的迁移能力明显收到amiRNA的影响，尤其是amiRNA-hTERT3的作用更为显著，如图6所示，图6为Huvec，NCI-H446的实验结果。

另外，选NCI-H446，Huvec细胞进行Transwell侵袭实验来检验所设计的amiRNA是否会影响细胞的侵袭性能。实验细胞在转染amiRNA 48h后，分别将NCI-H446，Huvec细胞用无血清培养基(Invitrogen公司)稀释，并按3E+5、5E+4个细胞/孔的量接种于Transwell(Costar公司)上层小室中，放入含有正常血清浓度培养基(Invitrogen公司)的小室中继续培养4-8h，取出小室用含1％乙醇的结晶紫溶液(Sigma公司)固定、染色，再用棉球檫去小室上层细胞，显微镜(Nikon，Japan)下统计已经侵袭到小室下层的细胞。结果表明3对amiRNA都能不同程度的显著抑制细胞的侵袭，如图7所示。

5.软琼脂实验分析各amiRNA对细胞克隆形成能力的影响

将1.2％低熔点琼脂糖(Sigma公司)与2×细胞培养基(Invitrogen公司)以1∶1的体积比混合制备0.6％的混合琼脂铺着24孔培养板(Corning公司)(0.25ml/孔)，凝固形成底层琼脂。NCI-H446，Hela细胞在转染amiRNA或NC后24h消化并进行计数，取适量细胞(300个细胞/孔)与预先制备好的0.3％的混合琼脂混匀后铺在培养板底层琼脂的上面，凝胶后形成顶层琼脂，培养箱培养14d后用结晶紫染色，随即选择5个视野统计有效克隆(细胞量大于50个)的数量和大小，最后以各自有效克隆的总体积为克隆能力形成评价指标。结果显示，相对于对照组NC来说，所选amiRNA都能显著减少处理细胞的克隆数目，尤其是amiRNA-hTERT 3处理过的细胞基本不能形成有效克隆，如图8所示，图8为NCI-H446的实验结果。

6.小管形成实验分析各amiRNA对细胞小管形成能力的影响

Huvec细胞按5E+4个细胞/孔接到24孔板后20h分别进行amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2，amiRNA-hTERT 3及NC转染，转染试剂使用lipo2000，转染浓度统一为50nM，具体操作按照lipo2000说明书进行。第二天将matrigel胶(BD公司)放入4℃解冻，解冻完成后在冰上用含10％FBS的RPMI1640培养基(Invitrogen公司)将matrigel胶配成1x的工作液，50ul/孔平铺到96孔板中，之后转染培养箱中凝固待用。Huvec细胞转染后48h后进行消化并计数，调整细胞密度至1.5E+4个细胞/ml取100ul细胞细胞悬液加入昨天预制好的matrigel胶上，每组设3个复孔，放入培养箱中继续培养6h后进行显微观察并拍照。统计完整小管和有效接点数作为评价小管形成指标。结果表明，阴性对照NC组能形成完整的小管，而amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2除少数有效接点并不能形成完整小管，尤其是amiRNA-hTERT 3连有效接点都不能形成，细胞基本呈散点状或简单的短线状。说明所选3对amiRNA都能显著的抑制小管形成，尤其是amiRNA-hTERT 3效果最为显著。如图9所示。

7.流式细胞术分析各amiRNA对细胞凋亡的影响

NCI-H446，Hela，Huvec，U2-OS细胞按2E+5个细胞/well接种到6孔板中，接板后20h用Lipo2000进行amiRNA转染，转染浓度为50nM，具体操作按照lipo2000说明书进行，每组设3个复孔。转染后每2天更换一次培养基，第四天消化收集细胞，将相同3个复孔的细胞混合成一管，用PBS重悬后，1000rpm X 5min离心收集细胞。用300ul预冷的PBS重悬细胞，加入700ul冰冻的无水乙醇后混匀，放入4度冰箱过夜。细胞固定24h后弃固定液，用1ml预冷的PBS重悬细胞，1000rpm X 10min收集细胞，再用1ml PBS重悬细胞和离心收集，重复3次。用750ul预冷的PBS重悬细胞，加入50μL 1mg/mLRNase A(Beyotime公司)，37℃水浴处理30min。取出EP管，在冰上放置2min后加200μL 100g/mL PI(Sigma公司)，4℃避光染色30min，过400目筛网(Zoman公司)后立刻上流式细胞仪(Beckman，USA)进行检测，激发波长488nm，收集波长630nm，每组样品检测3E+4个细胞。用Beckman流式细胞仪自带的软件生成图谱并进行凋亡分析。结果表明，对于正常细胞Huvec和端粒酶阴性的U2-OS来说，3对amiRNA都没有明显的促凋亡效果，而对端粒酶阳性的NCI-H446和Hela来说，3对amiRNA都能明显的促进细胞的凋亡，尤其是amiRNA-hTERT 2最为明显。如图10所示。

8.amiRNA专一性的验证

(1)对干扰素信号通路的影响测定

NCI-H446以5E+4个细胞/well接种到24孔板中，接板后20h用lipo2000进行amiRNA转染，转染浓度为50nM，转染操作按lipo2000方案进行。转染后24h用Trizol Reagent(Invitrogen公司)按其说明书进行总RNA提取(由此开始在冰上进行操作)，接着用Bio Mate仪器(Thermo，USA)测定RNA纯度和浓度，立刻进行反转录(相关试剂购自Zoman)：加入5xRT缓冲液10ul，dNTP(2.5mM)4ul，Rnasin(40U/ul)1ul，RTase(200u/ul)1ul，Oligo18(50uM)0.1ul，RNA 2ug，补充ddH2O到50ul，充分混匀后42℃孵育60min。完成反转录之后用Realtime PCR仪器(ABI，USA)对干扰素信号通路中的标志性基因(IFN-beta，OAS-1，STAT1)的表达水平进行定量，内参为GAPDH。操作按Zoman的“2x SYBR Green qPCR kit”方案进行，即模板2ul，上、下游引物(10uM)1ul，2xMix 10ul，补充ddH2O到20ul。扩增条件为：95℃4min→(94℃45s，60℃45s，72℃45s)40cycle→meltcurve。

qPCR结果表明，3对amiRNA虽然都能不同程度的影响到3个干扰素基因的表达变化，但只是轻微的发生改变，跟常规的siRNA引起的干扰素效应(通常为10倍以上变化)有本质差异，说明所选amiRNA不会引起明显的干扰素效应，副作用小。如图11所示。

(2)靶点沉默实验验证amiRNA的专一性

根据amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2，amiRNA-hTERT 3在人端粒酶逆转录酶基因hTERT(NM_198253)上的靶点位置，以各自靶点为中心在hTERT基因序列上分别向上下游延伸100bp作为各自的待验证片段(amiRNA-hTERT 1：3890-4010；amiRNA-hTERT 2：2820-3040；amiRNA-hTERT 3：2820-3040)，由上海生工合成上述片段，并通过ClaI，SalI两个酶切位点克隆到pAM-CAG-EGFP载体中的EGFP表达框下游，得到2个靶点沉默载体(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 1，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2)。

HEK293细胞以5000个细胞/孔接种于96孔板中，20h后进行质粒和amiRNA的共转，转染按lipo2000操作方案进行。实验设2组阴性对照组(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 1+NC，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+NC)、3组实验组(pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 1+amiRNA-hTERT 1，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+amiRNA-hTERT 2，pAM-CAG-EGFP-amiRNA-hTERT 2+amiRNA-hTERT 3)。转染后48h进行荧光检测，以确定amiRNA对靶点质粒表达的沉默效果。荧光照片显示，相对于阴性对照组，3组实验组虽然也有微量的绿色荧光表达，但表达量非常低，而阴性对照组则呈现正常转染后的高荧光表达，表明amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2，amiRNA-hTERT 3能够高效的沉默含各自靶点的基因片段，作用位点专一。如图12所示。

实施例3

动物实验评价amiRNA-hTERT的抗肿瘤效果。

NCI-H446细胞按1.5E+7个细胞/皿接种到直径15cm的培养皿中(Corning公司)，接板后20h用Lipo2000分别进行amiRNA-hTERT 1，amiRNA-hTERT 2和NC转染，转染浓度为50nM，转染方案按lipo2000说明书进行。转染后24h消化细胞并计数，800rpm x 5min离心收集细胞，用预冷PBS重悬细胞并离心收集，用PBS重悬细胞并调整细胞密度为0.5E+8个细胞/ml，按100ul/只细胞量接种到4周龄的BABL/c裸鼠左前肢腋下(国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心(NLARSH)上海斯莱克实验动物有限责任公司)，每组设6只裸鼠。接瘤后第5天开始每3天测一次肿瘤的长a和宽b，按1/2*a*b*b公式计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。接瘤后29天腹腔注射2％的无巴比妥钠(Sigma公司)100ul/只，等裸鼠完全麻醉后拍照，接着脱颈处死裸鼠并剥离移植瘤，将取下的瘤体排列好拍照后制作冰冻切片。肿瘤生长曲线表明，amiRNA处理组先有一个肿瘤变小的过程，紧接着是平缓生长期，再进入对数生长期，而NC只经过一个平缓生长期就很快进入对数生长期，说明amiRNA处理后能抑制肿瘤的成瘤能力。切片经TUNEL凋亡检测试剂盒(Beyotime公司)染色表明，amiRNA-hTERT2能促进肿瘤细胞的凋亡。见图13所示。

表1

Claims (3)

1.一种新型抗肿瘤amiRNA序列，其特征在于，其包含下列序列中的任意一条或一条以上，它们的序列为：

amiRNA-hTERT 1(amiR1)：

正义链5’-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’；

反义链5’-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’；

amiRNA-hTERT2(amiR2)：

正义链5’-CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’；

反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’；

amiRNA-hTERT3(amiR3)：

正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；

反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。

2.如权利要求1所述的一种新型抗肿瘤amiRNA序列，其特征在于，所述的序列为：

amiRNA-hTERT3(amiR3)：正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；

反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。

3.如权利要求1或2所述的一种新型抗肿瘤amiRNA序列在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的amiRNA序列用于制备与hTERT基因相关疾病的治疗药物，该amiRNA序列能通过化学合成以化学药物用于肿瘤的预防和治疗，也能经过包装，质粒或病毒类载体最后以基因药物形式用于肿瘤的预防和治疗中。

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