CN105420240B - 治疗肾癌的hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗肾癌的hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用，属于基因药物技术领域。因反义寡核苷酸序列为：5^，‑GGAGCGCGCGGCATCGCGGG‑3^，。hTERT基因全硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS‑ODN）抑制肾癌GRC‑1细胞端粒酶活性后，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)对GRC‑1细胞凋亡有增敏作用。

Description

治疗肾癌的hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用

技术领域

本发明提供了一种治疗肾癌hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用，特别是涉及一种hTERT基因全硫代修饰的反义寡核苷酸、包含有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的药物组合物，以及它们在用于制备治疗肾癌药物中的应用，属于基因药物技术领域。

背景技术

端粒位于染色体的末端，具有防止染色体末端降解、融合，起到保护染色体完整性、维持细胞稳定性的作用。端粒酶功能在于合成染色体末端的重复序列，以维持端粒的长度和稳定性。人类端粒酶主要在肿瘤组织中表达，而在正常组织及良性肿瘤中，除了一些具有高度再生潜力和生殖细胞组织外，几乎不表达，表明端粒酶激活与肿瘤发生过程关系密切。现已发现人类端粒酶反转录酶催化亚单位 （human telomerase reversetranscriptase， hTERT），克隆了hTERT核酸序列，其基因含有逆转录酶高度保守特异序列。现已证明hTERT基因mRNA与端粒酶活性表达一致，其上游表达对端粒酶活性表达起重要作用，被认为是端粒酶活性表达的关键组分和限速因子。

TRAIL是肿瘤坏死因子（TNF）细胞因子家族的新成员，和TNF、调亡相关因子配体（FasL）一样，TRAIL也是通过与细胞膜上的相应的死亡受体(DR4，DR5)结合，激活Caspase通路，传递和放大凋亡信号，从而诱导靶细胞发生快速、大量、高效的凋亡反应^[1]。TRAIL与其受体DR4，DR5特异性结合激活信号转导系统，启动凋亡程序的进行^[2]。DR4，DR5同样是一种促进细胞凋亡的基因，可以合成执行细胞凋亡的酶：核酸内切酶（DNase）和凋亡蛋白酶（caspase）。前者导致肿瘤细胞染色体DNA 片段化，后者水解细胞的蛋白质结构，导致细胞的全面解体^[3]。

反义技术的基本原理就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段(反义核酸)以抑制或封闭专一靶基因表达的技术，有理由发展成为一种新的基因治疗药物。

[1] Wu XX， Kakehi Y， Mizutani Y， et al. Enhancement of TRAIL/Apo2Lmediated apoptosis by adriamycin through inducing DR4 and DR5 in renal cellcarcinoma cells[J]. Int J Cancer， 2003， 104(4): 409-417.

[2] 钦宪，何丽娅，李平法主编.医学分子生物学[M].郑州:郑州大学出版社，2003.105-116

[3] Msutomi K， Possemato R，Wong JM， et al. The telomerase reversetranscriptase regulates chromatin state and DNA damage responses [J]. PNAS，2005，102:8222-8227。

发明内容

本发明提供了一种hTERT基因全硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN），其可以对肾癌细胞GRC-1端粒酶活性产生影响，另外，本发明还提供一种药物组合物，反义寡核苷酸与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，AS PS-ODN对端粒酶活性抑制作用可以对TRAIL诱导肾癌细胞GRC-1凋亡产生增敏作用。

根据本发明的第一个方面：

一种肾癌细胞hTERT基因反义寡核苷酸，其核苷酸序列为：5^，- GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3^，。

所述的反义寡核苷酸上的所有碱基是经过硫代修饰的。

根据本发明的第二个方面：

一种用于治疗肾癌的组合物，包括有权利要求1所述的反义寡核苷酸，以及肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。

根据本发明的第三个方面：

包含有上述组合物的药物，所述的药物是以水为载体，其中反义寡核苷酸的浓度是5～20µmol/L，TRAIL的浓度是50～150ng/ml。

根据本发明的第三个方面：

上述的反义寡核苷酸在制备治疗肾癌药物中的应用。

根据本发明的第四个方面：

上述的组合物在制备治疗肾癌药物中的应用。

有益效果：hTERT 基因的全硫代修饰反义寡核苷酸抑制GRC-1细胞hTERT表达及端粒酶的活性，可以增加GRC-1细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导凋亡的敏感性。采用端粒酶活性抑制剂结合肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体治疗肾癌具有良好应用前景。

附图说明

图1 是AS PS-ODN对肾癌GRC-1细胞端粒酶活性的影响研究中的电泳图。

图2 是RT-PCR检测AS PS-ODN对肾癌GRC-1细胞hTERT基因mRNA的影响研究中的电泳图（其中，M泳道是marker: PBR322 DNA/Mspl DNA分子量标准；1 和 2 泳道分别是对照组细胞 处理24、48 h后； 3 和 4 泳道分别是AS PS-ODN 处理组细胞处理24、48 h后； 5和 6 泳道分别是 S PS-ODN处理组细胞处理24、48 h后）。

图3是hTERT反义核酸与100ng/mlTRAIL联合作用48h，GRC-1细胞凋亡百分率示意图（其中图例为：A: 空白组； B: S PS-ODN； C: AS PS-ODN； D: TRAIL； E: TRAIL +S PS-ODN； F: TRAIL+AS PS-ODN）。

具体实施方式

实施例1 材料和方法

1.1.1主要试剂

PMBI-1640培养粉为北京天为时代科技有限公司产品，胎小牛血清为兰州民海生物制品公司产品，端粒酶检测试剂盒购自南京凯基生物公司，噻唑蓝为兰州百奥生物制品公司产品，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体为武汉博士德生物制品公司产品。异硫氰酸荧光素标记的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白双染凋亡检测试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品。

1.1.2引物合成

从基因库中查出hTERT基因mRNA的全部，根据hTERT基因mRNA的序列分析，设计出互补于起始密码子的反义片段，选择起始密码子上游6个碱基及后续的14个碱基共20个碱基长度为作用的靶序列。

hTERT 基因的反义寡核苷酸的序列为5^，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3^，（SEQ IDNO.1）。

正义核酸序列为5^，-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3^，（SEQ ID NO.2）。

以上每一条链上的所有碱基都进行全硫代修饰，由北京赛百胜生物制品公司合成，纯化，分装。本研究采用全硫代修饰反义核酸，硫代是指硫元素代替磷酸基团自由氧，是目前反义核酸应用研究最多的一种修饰，可以增强反义核酸的稳定性，提高反义核酸对核酸酶的耐受性，使其药物半衰期增加10倍，同时增强反义核酸对肿瘤细胞的亲核性，从而使反义核酸更容易进入肿瘤细胞核内发挥其抗肿瘤作用。

各序列经计算机网上检索证实与hTERT基因以外的已知人类基因无同源性。hTERT上游引物5^，-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3^，（SEQ ID NO.3）；下游引物为5^，-GGATGAAGCGCAGTCTGGA-3^，（SEQ ID NO.4），均由上海生工生物工程技术公司合成。

1.1.3细胞培养

GRC-1细胞株由兰州大学第二附属医院泌尿研究所提供。采用含100mL/L 胎小牛血清（60℃灭活3 min），100u/ml青霉素，100u/ml链霉素的PMBI-1640培养基，在37℃，50mL/L CO₂饱和湿度条件下培养。实验选用对数生长期细胞。

1.1.4 统计学分析方法 数据采用均数+标准差表示，使用SPSS16.0统计学软件，采用非参数秩和检验进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

实施例2 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸对肾癌GRC-1细胞端粒酶活性的影响

首先，采用TRAP-银染法对端粒酶活性定性分析，按试剂盒说明书操作。实验分为AS PS-ODN组，S PS-ODN组及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×10⁵细胞。用最适浓度10µmol/L的ODN处理后，收集寡核苷酸处理不同时期后的GRC-1细胞（24 、48 、72 h），用PBS洗涤细胞二次，加入1ml冰冷的Wash buffer，置冰上5min ，4℃离心（3000rpm， 5min）。弃上清后加入40 µl冰冷的Lysis buffer，置冰上30 min 4℃离心（13000 rpm， 30 min；离心上清测定其蛋白浓度至5-10µg/ml。取9ulPCR扩增产物，加入1µl10×上样缓冲液，在12%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳1h。置于硝酸银染液浸泡30min，显色液显色10min，直到全部条带显色， 置于10%乙酸浸泡5min终止反应。

TRAP-银染法结果如图1所示，1、2、3条带是hTERT AS PS-ODN处理细胞24、48、72h后；4、5、6条带是hTERT S PS-ODN处理细胞24、48、72h后；7、8、9条带是对照组细胞24、48、72h后。可以看出，AS PS-ODN对肾癌GRC-1细胞端粒酶的活性有明显的抑制作用，条带不明显，显著与与S PS-ODN组及空白对照组存在差别。

接下来，采用TRAP-PCR-ELISA法对端粒酶活性定量分析，按试剂盒说明书操作。实验分为hTERT AS PS-ODN组，S PS-ODN及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×10⁵细胞。采用端粒重复序列扩增-多聚酶链反应-酶联免疫吸附测定法检测端粒酶活性，按试剂盒说明书操作。用最适浓度10µmol/L的寡核苷酸处理后，收集寡核苷酸处理不同时期后的GRC-1细胞（24 、48 、72 h），用磷酸盐缓冲液洗涤细胞二次，加入1ml冰冷的洗涤缓冲液置冰上5 min， 4℃离心（3000rpm，5 min）；弃上清后加入40 µl冰冷的细胞裂解液置冰上30 min 4℃离心（13000rpm， 30 min）；离心上清测定其蛋白浓度至5-10µg/ml。取5µl 聚合酶链式反应扩增产物，加入20 µl变性试剂，置室温孵育10 min，加入225µl混合液，（含地高辛标记的检测抗体），混匀后转100µl混合液于抗生物素包被的微孔板上，37℃杂交2 h，加入过氧化物酶偶联的地高辛抗体100µl， 室温孵育30min。最后加入过氧化物酶底物四甲基对氨基联苯孵育10min，加入终止液终止反应。测定450nm和655nm吸光值（A）。结果如表1所示：

表1 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸对肾癌GRC-1细胞端粒酶活性的影响

与对照组相比，P<0.05。

实施例3 AS PS-ODN对肾癌GRC-1细胞hTERT基因mRNA的影响

实验分为AS PS-ODN组，S PS-ODN组及空白对照组。用最适浓度10µmol//L的ODN处理后，收集寡核苷酸处理不同时期GRC-1细胞（24 h，48 h），用Trizol RNA提取试剂盒提取总RNA，按照MMLV一步法RT-PCR试剂盒的操作步骤进行RT-PCR检测。EP管中加入RT-PCRbuffer 25µL，模板RNA1µL，上游引物1µL，下游引物1µL，M-MuLV RT1µL，加入无菌双蒸水至50µL。以β-actin 作为内对照进行PCR扩增。PCR条件：1循环：37-40℃ cDNA 合成30min；38循环：94℃变形15s，60℃退火30s，72℃延伸1min；1循环： 72℃延伸10min。扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶分析仪分析结果。

RT-PCR法结果显示，AS PS-ODN作用于GRC-1细胞24 h，48 h， hTERT基因mRNA 相对表达量分别与S PS-ODN组及空白对照组相比，有显著性差异（P<0.05）（如图2和表2所示）。

表2 AS PS-ODN对肾癌GRC-1细胞hTERT基因mRNA的影响

与对照组相比，P<0.05。

实施例4流式细胞仪测定hTERT基因蛋白的表达水平

收集寡核苷酸处理不同时期后的GRC-1细胞（24 h，48 h，72 h）1×10^5，，4℃，70mL/L的乙醇固定15 min，加入含10mL/L的吐温-20穿透缓冲液洗2次，加入hTERT基因抗体50µL，4℃孵育1 h， 缓冲液洗2次，加入异硫氰酸荧光素标记的兔抗羊免疫球蛋白50µL，4℃孵育30min， 缓冲液洗2次，置流式细胞仪上检测。

流式细胞仪测定结果显示，AS PS-ODN作用于GRC-1细胞24 h， 48 h，72 h，hTERT基因蛋白表达的阳性细胞的百分率分别与S PS-ODN组及空白对照组相比，有统计学差异（P<0.05），如表3所示。

表3 AS PS-ODN对肾癌GRC-1细胞hTERT基因蛋白表达水平的影响

实施例5噻唑蓝比色试验检测hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）联合对GRC-1细胞活力的影响

实验分为6组：空白对照组(A 组)、S PS-ODN (B 组)、hTERT AS PS-ODN组(C 组)、TRAIL组(D 组)、TRAIL+ S PS-ODN (E 组)，TRAIL+ AS PS-ODN组(F 组)。采用24孔培养板，每组接种三孔，每孔接种1×10⁵细胞。第一天加入寡核苷酸 10µmol/L， 24 h后加入100ng/ml TRAIL，空白对照组加入等量培养液。加入TRAIL24 h，48 h，72 h，96 h后， 分别采用噻唑蓝比色试验检测GRC-1细胞的活力。不同作用时间的细胞，每孔加入噻唑蓝溶液20ul， 37℃孵育4h，弃去孔内培养液，每孔加入150µl二甲基亚砜，振荡10min。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。抑制率=1-实验组A值/空白对照组A值。

hTERT AS PS-ODN作用于GRC-1细胞24 h加入100ng/ml TRAIL共同作用48 h，GRC-1细胞抑制率为39%，与hTERT AS PS-ODN组，S PS-ODN组，空白对照组，TRAIL组，TRAIL+ SPS-ODN组相比有统计学意义（P<0.05）（表4）。

表4 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体联合作用对GRC-1细胞活力的影响(百分率)

实施例6流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率

调整细胞待测密度为1×10⁵细胞，取1ml细胞，冷磷酸盐缓冲液洗2次（1000rpm 4℃ 离心10 min），细胞悬浮于200µl结合缓冲液中。加入10µl异硫氰酸荧光素标记的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白和5µl碘化丙啶避光室温反应15min。加入300 µl结合缓冲液，立即上机检测。

hTERT AS PS-ODN10µmol/L +100ng/ml TRAIL联合作用48 h，GRC-1细胞凋亡百分率为35.18%，与TRAIL作用组、hTERT S PS-ODN+TRAIL联合作用组、hTERT AS PS-ODN组、hTERT S PS-ODN组及对照组进行比较，差异有统计学意义(P <0.05)。 单用TRAIL作用组与hTERT S PS-ODN+TRAIL联合作用组，二者无显著差异（P>0.05）（如图3）。

在其它处理时间的试验中，AS PS-ODN作用于GRC-1细胞24 h， 48 h，72 h，hTERT基因蛋白表达的阳性细胞百分率明显下降。GRC-1细胞经过hTERT全硫代修饰反义寡核苷酸与TRAIL联合作用，细胞活力明显受到抑制；GRC-1细胞凋亡百分率明显增高，与单用TRAIL组比较，有统计学意义。

另外，还考察了不同的hTERT AS PS-ODN的浓度与TRAIL/叶酸联用对细胞凋亡的影响。各组中分别采用hTERT AS PS-ODN5～30µmol/L+100ng/ml TRAIL+5µmol/L叶酸对培养板中GRC-1细胞进行处理，处理时间为48h，每孔接种1×10⁵细胞。依同法进行凋亡细胞的百分率的测定，在不同的hTERT AS PS-ODN的浓度条件下的细胞凋亡率如表5所示。

表5 不同的hTERT AS PS-ODN的浓度条件下的细胞凋亡率

从上实验可以看出，抑制hTERT表达后，肿瘤细胞失去了DNA修复能力，使染色体片段化，同时削弱了肿瘤细胞对DNA损伤的反应，因而加速了TRAIL对肿瘤细胞的凋亡作用。

序列表

<110> 甘肃省中医院血液净化中心

<120> 治疗肾癌的hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> AS PS-ODN

<400> 1

ggagcgcgcg gcatcgcggg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> PS-ODN

<400> 2

cccgcgatgc cgcgcgctcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> F-P

<400> 3

cggaagagtg tctggagcaa 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> R-P

<400> 4

cgatgaagcg cagtctgga 19

Claims (1)

1.用于治疗肾癌的组合物在制备治疗肾癌药物中的应用，其特征在于，所述的用于治疗肾癌的组合物的组成是：反义寡核苷酸、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体、叶酸；所述的反义寡核苷酸核苷酸序列为5’-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3’，并且所述的反义寡核苷酸上的所有碱基是经过硫代修饰的，其中反义寡核苷酸的浓度是5～20μmol/L，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的浓度是50～150ng/ml，叶酸的浓度是5μmol/L。