CN105462980A - hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用，属于基因药物技术领域。因反义寡核苷酸序列为：5，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3，。hTERT基因全硫代修饰反义寡核苷酸（AS？PS-ODN）抑制氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu端粒酶活性后，藏药镰状棘豆总黄体酮（TFOF）对LNCaP-flu细胞凋亡有增敏作用。

Description

hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用
技术领域
本发明提供了一种hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用，特别是涉及一种hTERT基因全硫代修饰的反义寡核苷酸、包含有藏药镰状棘豆总黄体酮（TFOF）的药物组合物，以及它们在用于制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用，属于基因药物技术领域。
背景技术
前列腺癌是男性泌尿系最常发生的肿瘤之一，在美国其发病率在肿瘤患者中占第一位，死亡率占第二位。研究表明，前列腺癌细胞属于雄激素依赖性细胞，通过抑制人体雄激素的产生，前列腺癌细胞生长速度变缓，出现惰性生长的现象，甚至出现前列腺癌转移灶萎缩的情况，治疗效果良好。随着抗雄药物的治疗，前列腺癌细胞会由雄激素依赖性转化为雄激素非依赖型，抗雄药物治疗会逐渐失去作用。雄激素非依赖型前列腺癌的治疗是临床上最棘手的问题之一。最新研究表明，雄激素可以调节前列腺癌细胞的端粒酶活性。现已证明hTERT基因mRNA与端粒酶活性表达一致，其上游表达对端粒酶活性表达起重要作用，被认为是端粒酶活性表达的限速因子。雄激素阻断会导致前列腺癌细胞端粒酶限速因子hTERT基因的表达活性受到抑制伴有癌细胞端粒酶活性的降低，因此使用端粒酶抑制剂替代雄激素可以降低雄激素非依赖型前列腺癌端粒酶的活性。人类端粒酶主要在雄激素非依赖型前列腺癌中表达，而在正常组织及良性肿瘤中不表达，表明端粒酶激活与该疾病发生过程关系密切。
镰状棘豆为豆科棘豆属（oxytropisD.C.）植物镰状棘豆（O.falcataBunge）的干燥全草，是一味重要的藏药。镰状棘豆味辛、性寒，有小毒，具有清热解毒，生肌愈疮，抗炎镇痛，涩脉止血等功效。在藏药中有“草药之王”的美誉。镰状棘豆主要含有黄酮，生物碱，皂苷类等成分，药理研究表明，具有镇痛，抗炎，抗氧化，抗肿瘤等活性。有实验研究藏药镰状棘豆总黄酮(TFOF)对肝癌细胞SMMC-7721凋亡作用的影响。
反义技术的基本原理就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段(反义核酸)以抑制或封闭专一靶基因表达的技术，有理由发展成为一种新的基因治疗药物。
发明内容
本发明提供了一种hTERT基因全硫代修饰反义寡核苷酸（ASPS-ODN），其可以对氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性产生影响，另外，本发明还提供一种药物组合物，反义寡核苷酸与镰状棘豆总黄酮(TFOF)，ASPS-ODN对端粒酶活性抑制作用可以对TFOF诱导氟它胺耐受型(雄激素非依赖型)前列腺癌细胞LNCaP凋亡产生增敏作用。
根据本发明的第一个方面：
一种前列腺癌细胞hTERT基因反义寡核苷酸，其核苷酸序列为：5，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3，。
所述的反义寡核苷酸上的所有碱基是经过硫代修饰的。
根据本发明的第二个方面：
一种用于治疗氟它胺耐受型前列腺癌的组合物，包括有权利要求1所述的反义寡核苷酸，以及镰状棘豆总黄酮（TFOF）。
根据本发明的第三个方面：
包含有上述组合物的药物，所述的药物是以水为载体，其中反义寡核苷酸的浓度是5～20μmol/L，镰状棘豆总黄酮的浓度是0.05～0.2g/L。
根据本发明的第三个方面：
上述的反义寡核苷酸在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。
根据本发明的第四个方面：
上述的组合物在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。
有益效果：hTERT基因反义核酸对TFOF诱导的氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu凋亡有增敏作用。
附图说明
图1hTERT基因反义核酸与0.1g/LTFOF联合作用48h对LNCaP-flu细胞活力的影响。
图2空白样本的流式细胞仪检测散点图。
图3SPS-ODN样本的流式细胞仪检测散点图。
图4ASPS-ODN样本的流式细胞仪检测散点图。
图5TFOF样本的流式细胞仪检测散点图。
图6TFOF+SPS-ODN样本的流式细胞仪检测散点图。
图7TFOF+ASPS-ODN样本的流式细胞仪检测散点图。
图8hTERT反义核酸与TFOF0.1g/L联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率（A:空白;B:SPS-ODN;C:ASPS-ODN;D:TFOF;E:TFOF+SPS-ODN;F:TFOF+ASPS-ODN）。
具体实施方式
实施例1材料和方法
1.1.1主要试剂
RPMI1640培养粉为北京天为时代科技有限公司产品，胎小牛血清为兰州民海生物制品公司产品，台盼蓝为兰州百奥生物制品公司产品，藏药镰状棘豆总黄酮(TFOF)为武汉博士德生物制品公司产品。Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品。
1.1.2引物合成
根据hTERT基因mRNA的序列分析，设计出互补于起始密码子的反义片段共20个碱基长度作用的靶序列。
反义片段hTERTASPS-ODN的序列为5，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3，（SEQIDNO.1）。
作为对照的正义片段SPS-ODN的序列为5，-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3，（SEQIDNO.2）。
以上每条链进行碱基全部硫代修饰，由北京赛百胜生物制品公司合成，纯化，分装。
1.1.3细胞培养
LNCaP细胞株由兰州大学第二医院泌尿研究所惠赠。采用含10%胎小牛血清（60℃灭活3min），100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的RPMI-1640培养液，在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养。LNCaP细胞含10%FBS的RPMI1640培养液中。羟基氟它胺用无水乙醇溶解后加入磷酸盐缓冲液(PBS，常规培养于pH7.2)至羟基氟它胺终浓度为10-4mol/L储存。LNCaP加入羟基氟它胺至终浓度为10-7mol/L后连续培养80代，使之成为氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu，实验选用对数生长期细胞。
1.1.4镰状棘豆总黄酮的制备
取镰状棘豆干药材100g，经95%，50%乙醇依次提取，减压回收乙醇，加2%NaOH溶解，滤过，滤过液加1%HCl调至pH值为5，以氯仿、乙酸乙酯依次萃取，合并萃取液，浓缩至干，得镰状棘豆总黄酮。将所得总黄酮部位进行纯度测定。
1.1.5TFOF样品的配制
称取镰状棘豆总黄酮适量，以无血清DMEM培养基为基质，二甲基亚砜(DMSO)助溶，DMSO终浓度为0.5%。过滤除菌，4℃保存备用。
1.1.6统计学分析方法数据采用均数+标准差表示，使用SPSS16.0统计学软件，采用单因素方差分析进行统计学处理，以P<0.05确定为有统计学意义。
1.1.7hTERTASPS-ODN最适作用浓度的选择
实验分为ASPS-ODN组，SPS-ODN组及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×105细胞。寡核苷酸浓度分为4组，第1天向培养液中分别加入5，10，15，20μmol/L，第2，3天追加原剂量的一半；空白对照组加入相同量的培养液。观察时间为24，48，72h。采用台盼蓝拒染法计数细胞，并收集细胞进行端粒酶活性检测，得出最适作用浓度10μmol/L（SPS-ODN作用浓度与之相同）。
实施例2ASPS-ODN对氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu端粒酶活性的影响
实验分为ASPS-ODN组，SPS-ODN组及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×105细胞。采用TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性，按试剂盒说明书操作。用最适浓度10μmol/L的ODN处理后，收集寡核苷酸处理不同时期的LNCaP-flu细胞（24h，48h，72h），用PBS洗涤细胞二次，加入1ml冰冷的Washbuffer，置冰上5min，（19×103g4℃离心30min）;弃上清后加入40μL冰冷的Lysisbuffer，置冰上5min，（19×103g4℃离心30min）;离心后上清测定其蛋白浓度至5-10μg/mL。取5μLPCR扩增产物，加入20μL变性试剂，置室温孵育10min，加入225混合液，（含地高辛标记的检测抗体），混匀后转100μL混合液于抗生物素包被的微孔板上，37℃杂交2h，加入过氧化物酶偶联的地高辛抗体（anti-DIG-POD）100μL，室温孵育30min。最后加入过氧化物酶底物四甲基对氨基联苯（TMB）孵育10min，加入终止液终止反应。测定450nm和655nm吸光度（A）值。
TRAP-PCR-ELISA法显示，实验组加入ASPS-ODN48h，LNCaP-flu细胞端粒酶活性下降，作用72h，LNCaP-flu细胞端粒酶活性明显下降，与SPS-ODN组及空白对照组比有统计学意义（P<0.05）(表1)。
表1hTERT基因反义核酸对LNCaP-flu细胞端粒酶活性的影响
采用标准差，与正义核酸和对照组比较，P<0.05
实施例3台盼蓝拒染法检测hTERTASPS-ODN与TFOF联合作用对LNCaP-flu细胞活力的影响
实验分为6组：ASPS-ODN组、SPS-ODN组、空白对照组、TFOF组、TFOF+SPS-ODN组、TFOF+ASPS-ODN组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×105细胞。第一天加入ODN10μmol/L，24h后加入0.1g/LTFOF，空白对照组加入等量培养液。加入TFOF后24、48、72、96h采用台盼蓝拒染法检测LNCaP-flu细胞的活力。
hTERTASPS-ODN作用于LNCaP-flu细胞24h后加入TFOF0.1g/L共同作用48h，LNCaP-flu细胞抑制率与ASPS-ODN组，SPS-ODN组，空白对照组，TFOF组，TFOF+SPS-ODN组相比，有显著性差异（P<0.01），如图1（采用标准差，与正义核酸和对照组比较，P<0.01）。
实施例4流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率
调整细胞待测密度为1×105个/ml，取1ml细胞，冷PBS洗2次，（3.38×103g4℃离心10min），细胞悬浮于200μl结合缓冲液中。加入10μlAnnexin-V-FITC和5μl的PI，避光室温反应15min。加入300μl结合缓冲液，立即上机检测。
如图2所示，hTERTASPS-ODN与0.1g/LTFOF联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率为35.6%，hTERTSPS-ODN与0.1g/LTFOF联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率为10.8%，0.1g/LTFOF单独作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率为8.35%，hTERTASPS-ODN作用组LNCaP-flu细胞凋亡百分率为2.2%，hTERTSPS-ODN作用组LNCaP-flu细胞凋亡百分率为1.9%，对照组LNCaP-flu细胞凋亡百分率为1.8%，hTERTASPS-ODN与TFOF联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率与单用TFOF作用组，hTERTSPS-ODN与TFOF联合作用组，hTERTASPS-ODN，hTERTSPS-ODN作用组及对照组进行比较有统计学意义(P<0.05).单用TFOF作用组与hTERTSPS-ODN与TFOF联合作用组二者无显著差异（采用标准差，与正义核酸和对照组比较，P<0.05）。流式细胞仪检测散点图如图2～7中所示，纵坐标PI，横坐标FITC。
另外，还考察了不同的hTERTASPS-ODN的浓度与TFOF/壳聚糖联用对细胞凋亡的影响。各组中分别采用hTERTASPS-ODN5～30μmol/L+100ng/mlTFOF+5μmol/L壳聚糖对培养板中LNCaP-flu细胞进行处理，处理时间为48h，每孔接种1×105细胞。依同法进行凋亡细胞的百分率的测定，在不同的hTERTASPS-ODN的浓度条件下的细胞凋亡率如表2所示。
表2不同的hTERTASPS-ODN的浓度条件下的细胞凋亡率
通过以上实验可以看出，藏药镰状棘豆总黄酮通过影响癌细胞生长周期、抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞的凋亡。抑制hTERT基因表达后，肿瘤细胞失去了DNA修复能力，使染色体片段化，同时削弱了肿瘤细胞对DNA损伤的反应，因而加速了TFOF对肿瘤细胞凋亡的作用。总之，LNCaP-flu细胞经过hTERTASPS-ODN与TFOF联合作用，细胞活力明显受到抑制，LNCaP-flu细胞凋亡百分率明显增高，hTERTASPS-ODN抑制了端粒酶hTERT表达可以增加LNCaP-flu细胞对TFOF诱导凋亡的敏感性。
序列表
<110>甘肃省中医院血液净化中心
<120>hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用
<130>none
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>ASPS-ODN
<400>1
ggagcgcgcggcatcgcggg20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>PS-ODN
<400>2
cccgcgatgccgcgcgctcc20

Claims (6)

1.一种前列腺癌细胞hTERT基因反义寡核苷酸，其特征在于：其核苷酸序列为：5，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3，。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌细胞hTERT基因反义寡核苷酸，其特征在于：所述的反义寡核苷酸上的所有碱基是经过硫代修饰的。
3.一种用于治疗氟它胺耐受型前列腺癌的组合物，其特征在于：包括有权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，以及镰状棘豆总黄酮。
4.包含有权利要求3所述的组合物的药物，其特征在于：所述的药物是以水为载体，其中反义寡核苷酸的浓度是5～20μmol/L，镰状棘豆总黄酮的浓度是0.05～0.2g/L。
5.权利要求1或2所述的反义寡核苷酸在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。
6.权利要求3所述的组合物在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。
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