CN105462980B

CN105462980B - hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用

Info

Publication number: CN105462980B
Application number: CN201510979628.5A
Authority: CN
Inventors: 高晓东; 杨丽霞; 陈戎; 陈一戎; 李永新; 赵永强; 苗海东; 巨生贵
Original assignee: GANSU PROVINCIAL HOSPITAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Current assignee: GANSU PROVINCIAL HOSPITAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2015-12-23
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2035-12-23
Also published as: CN105462980A

Abstract

本发明提供了一种hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用，属于基因药物技术领域。因反义寡核苷酸序列为：5^，‑GGAGCGCGCGGCATCGCGGG‑3^，。hTERT基因全硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS‑ODN）抑制氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP‑flu端粒酶活性后，藏药镰状棘豆总黄体酮（TFOF）对LNCaP‑flu细胞凋亡有增敏作用。

Description

hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用

技术领域

本发明提供了一种hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用，特别是涉及一种hTERT基因全硫代修饰的反义寡核苷酸、包含有藏药镰状棘豆总黄体酮（TFOF）的药物组合物，以及它们在用于制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用，属于基因药物技术领域。

背景技术

前列腺癌是男性泌尿系最常发生的肿瘤之一，在美国其发病率在肿瘤患者中占第一位，死亡率占第二位。研究表明，前列腺癌细胞属于雄激素依赖性细胞，通过抑制人体雄激素的产生，前列腺癌细胞生长速度变缓，出现惰性生长的现象，甚至出现前列腺癌转移灶萎缩的情况，治疗效果良好。随着抗雄药物的治疗，前列腺癌细胞会由雄激素依赖性转化为雄激素非依赖型，抗雄药物治疗会逐渐失去作用。雄激素非依赖型前列腺癌的治疗是临床上最棘手的问题之一。最新研究表明，雄激素可以调节前列腺癌细胞的端粒酶活性。现已证明hTERT基因mRNA与端粒酶活性表达一致，其上游表达对端粒酶活性表达起重要作用，被认为是端粒酶活性表达的限速因子。雄激素阻断会导致前列腺癌细胞端粒酶限速因子hTERT基因的表达活性受到抑制伴有癌细胞端粒酶活性的降低，因此使用端粒酶抑制剂替代雄激素可以降低雄激素非依赖型前列腺癌端粒酶的活性。人类端粒酶主要在雄激素非依赖型前列腺癌中表达，而在正常组织及良性肿瘤中不表达，表明端粒酶激活与该疾病发生过程关系密切。

镰状棘豆为豆科棘豆属（oxytropis D.C.）植物镰状棘豆（O.falcata Bunge）的干燥全草，是一味重要的藏药。镰状棘豆味辛、性寒，有小毒，具有清热解毒，生肌愈疮，抗炎镇痛，涩脉止血等功效。在藏药中有“草药之王”的美誉。镰状棘豆主要含有黄酮，生物碱，皂苷类等成分，药理研究表明，具有镇痛，抗炎，抗氧化，抗肿瘤等活性。有实验研究藏药镰状棘豆总黄酮(TFOF)对肝癌细胞SMMC-7721凋亡作用的影响。

反义技术的基本原理就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段(反义核酸)以抑制或封闭专一靶基因表达的技术，有理由发展成为一种新的基因治疗药物。

发明内容

本发明提供了一种hTERT基因全硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN），其可以对氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP端粒酶活性产生影响，另外，本发明还提供一种药物组合物，反义寡核苷酸与镰状棘豆总黄酮(TFOF)，AS PS-ODN对端粒酶活性抑制作用可以对TFOF诱导氟它胺耐受型(雄激素非依赖型)前列腺癌细胞LNCaP凋亡产生增敏作用。

根据本发明的第一个方面：

一种前列腺癌细胞hTERT基因反义寡核苷酸，其核苷酸序列为：5^，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3^，。

所述的反义寡核苷酸上的所有碱基是经过硫代修饰的。

根据本发明的第二个方面：

一种用于治疗氟它胺耐受型前列腺癌的组合物，包括有权利要求1所述的反义寡核苷酸，以及镰状棘豆总黄酮（TFOF）。

根据本发明的第三个方面：

包含有上述组合物的药物，所述的药物是以水为载体，其中反义寡核苷酸的浓度是5～20µmol/L，镰状棘豆总黄酮的浓度是0.05～0.2g/L。

根据本发明的第三个方面：

上述的反义寡核苷酸在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。

根据本发明的第四个方面：

上述的组合物在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。

有益效果：hTERT基因反义核酸对TFOF诱导的氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu凋亡有增敏作用。

附图说明

图1hTERT基因反义核酸与0.1g/L TFOF联合作用48h对LNCaP-flu细胞活力的影响。

图2空白样本的流式细胞仪检测散点图。

图3 S PS-ODN样本的流式细胞仪检测散点图。

图4 AS PS-ODN样本的流式细胞仪检测散点图。

图5 TFOF样本的流式细胞仪检测散点图。

图6 TFOF +S PS-ODN样本的流式细胞仪检测散点图。

图7 TFOF +AS PS-ODN样本的流式细胞仪检测散点图。

图8 hTERT反义核酸与TFOF0.1g/L联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率（A:空白; B: S PS-ODN; C: AS PS-ODN; D: TFOF; E: TFOF+S PS-ODN; F: TFOF+AS PS-ODN）。

具体实施方式

实施例1 材料和方法

1.1.1主要试剂

RPMI 1640培养粉为北京天为时代科技有限公司产品，胎小牛血清为兰州民海生物制品公司产品，台盼蓝为兰州百奥生物制品公司产品，藏药镰状棘豆总黄酮(TFOF)为武汉博士德生物制品公司产品。Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品。

1.1.2引物合成

根据hTERT基因mRNA的序列分析，设计出互补于起始密码子的反义片段共20个碱基长度作用的靶序列。

反义片段hTERTAS PS-ODN的序列为5^，-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3^，（SEQ ID NO.1）。

作为对照的正义片段S PS-ODN的序列为5^，-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3^，（SEQ IDNO.2）。

以上每条链进行碱基全部硫代修饰，由北京赛百胜生物制品公司合成，纯化，分装。

1.1.3细胞培养

LNCaP细胞株由兰州大学第二医院泌尿研究所惠赠。采用含10%胎小牛血清（60℃灭活3 min），100U/ml青霉素，100U/ml链霉素的RPMI-1640培养液，在37℃，5%CO₂饱和湿度条件下培养。LNCaP细胞含10%FBS的RPMI1640培养液中。羟基氟它胺用无水乙醇溶解后加入磷酸盐缓冲液(PBS，常规培养于pH7.2)至羟基氟它胺终浓度为10^-4mol/L储存。LNCaP加入羟基氟它胺至终浓度为10^-7mol/L后连续培养80代，使之成为氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu，实验选用对数生长期细胞。

1.1.4镰状棘豆总黄酮的制备

取镰状棘豆干药材100g，经95%，50%乙醇依次提取，减压回收乙醇，加2%NaOH 溶解，滤过，滤过液加1%HCl调至pH 值为5，以氯仿、乙酸乙酯依次萃取，合并萃取液，浓缩至干，得镰状棘豆总黄酮。将所得总黄酮部位进行纯度测定。

1.1.5TFOF样品的配制

称取镰状棘豆总黄酮适量，以无血清DMEM 培养基为基质，二甲基亚砜(DMSO)助溶，DMSO终浓度为0.5%。过滤除菌，4℃保存备用。

1.1.6 统计学分析方法数据采用均数+标准差表示，使用SPSS16.0统计学软件，采用单因素方差分析进行统计学处理，以P<0.05确定为有统计学意义。

1.1.7hTERT AS PS-ODN 最适作用浓度的选择

实验分为AS PS-ODN组，S PS-ODN组及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×10⁵细胞。寡核苷酸浓度分为4组，第1天向培养液中分别加入5，10，15，20µmol/L，第2，3天追加原剂量的一半；空白对照组加入相同量的培养液。观察时间为24，48，72h。采用台盼蓝拒染法计数细胞，并收集细胞进行端粒酶活性检测，得出最适作用浓度10µmol/L（S PS-ODN作用浓度与之相同）。

实施例2 AS PS-ODN对氟它胺耐受型前列腺癌细胞LNCaP-flu端粒酶活性的影响

实验分为AS PS-ODN组，S PS-ODN组及空白对照组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×10⁵细胞。采用TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性，按试剂盒说明书操作。用最适浓度10µmol/L的ODN处理后，收集寡核苷酸处理不同时期的LNCaP-flu细胞（24 h，48h，72 h），用PBS洗涤细胞二次，加入1ml冰冷的Wash buffer，置冰上5 min ，（19×10³ g 4℃离心30 min）;弃上清后加入40 µL冰冷的Lysis buffer，置冰上5 min，（19×10³ g 4℃离心30 min）;离心后上清测定其蛋白浓度至5-10 µg/mL。取5µL PCR扩增产物，加入20µL变性试剂，置室温孵育10 min，加入225 混合液，（含地高辛标记的检测抗体），混匀后转100µL混合液于抗生物素包被的微孔板上，37℃杂交2h，加入过氧化物酶偶联的地高辛抗体（anti-DIG-POD）100µL，室温孵育30 min。最后加入过氧化物酶底物四甲基对氨基联苯（TMB）孵育10min，加入终止液终止反应。测定450nm和655nm吸光度（A）值。

TRAP-PCR-ELISA法显示，实验组加入AS PS-ODN 48 h， LNCaP-flu细胞端粒酶活性下降，作用72h， LNCaP-flu细胞端粒酶活性明显下降，与S PS-ODN组及空白对照组比有统计学意义（P<0.05）(表1)。

表1hTERT基因反义核酸对LNCaP-flu细胞端粒酶活性的影响

采用标准差，与正义核酸和对照组比较，P <0.05

实施例3 台盼蓝拒染法检测hTERT AS PS-ODN与TFOF联合作用对LNCaP-flu细胞活力的影响

实验分为6组：AS PS-ODN组、S PS-ODN组、空白对照组、TFOF组、TFOF+ S PS-ODN组、TFOF+ AS PS-ODN组。采用24孔培养板，每组接种3孔，每孔接种1×10⁵细胞。第一天加入ODN 10µmol/L， 24h后加入0.1g/L TFOF，空白对照组加入等量培养液。加入TFOF后24、48、72、96h采用台盼蓝拒染法检测LNCaP-flu细胞的活力。

hTERTAS PS-ODN作用于LNCaP-flu细胞24h后加入TFOF0.1g/L共同作用48h，LNCaP-flu细胞抑制率与AS PS-ODN组，S PS-ODN组，空白对照组，TFOF组，TFOF+S PS-ODN组相比，有显著性差异（P<0.01），如图1（采用标准差，与正义核酸和对照组比较， P <0.01）。

实施例4 流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率

调整细胞待测密度为1×10⁵个/ml，取1ml细胞，冷PBS洗2次，（3.38×10³g 4℃ 离心10 min），细胞悬浮于200µl结合缓冲液中。加入10µl Annexin-V-FITC 和5µl的PI，避光室温反应15 min。加入300 µl结合缓冲液，立即上机检测。

如图2所示，hTERT AS PS-ODN与0.1g/L TFOF联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率为35.6%，hTERT S PS-ODN与0.1g/L TFOF联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率为10.8%，0.1g/L TFOF单独作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率为8.35%，hTERT AS PS-ODN作用组LNCaP-flu细胞凋亡百分率为2.2%，hTERT S PS-ODN作用组LNCaP-flu细胞凋亡百分率为1.9%，对照组LNCaP-flu细胞凋亡百分率为1.8%，hTERT AS PS-ODN与TFOF联合作用48h，LNCaP-flu细胞凋亡百分率与单用TFOF作用组，hTERT S PS-ODN与TFOF联合作用组，hTERTAS PS-ODN，hTERT S PS-ODN作用组及对照组进行比较有统计学意义(P <0.05). 单用TFOF作用组与hTERT S PS-ODN与TFOF联合作用组二者无显著差异（采用标准差，与正义核酸和对照组比较，P <0.05）。流式细胞仪检测散点图如图2～7中所示，纵坐标PI，横坐标FITC。

另外，还考察了不同的hTERT AS PS-ODN的浓度与TFOF/壳聚糖联用对细胞凋亡的影响。各组中分别采用hTERT AS PS-ODN5～30µmol/L+100ng/ml TFOF+5µmol/L壳聚糖对培养板中LNCaP-flu细胞进行处理，处理时间为48h，每孔接种1×10⁵细胞。依同法进行凋亡细胞的百分率的测定，在不同的hTERT AS PS-ODN的浓度条件下的细胞凋亡率如表2所示。

表2 不同的hTERT AS PS-ODN的浓度条件下的细胞凋亡率

通过以上实验可以看出，藏药镰状棘豆总黄酮通过影响癌细胞生长周期、抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞的凋亡。抑制hTERT基因表达后，肿瘤细胞失去了DNA修复能力，使染色体片段化，同时削弱了肿瘤细胞对DNA损伤的反应，因而加速了TFOF对肿瘤细胞凋亡的作用。总之，LNCaP-flu细胞经过hTERT AS PS-ODN与TFOF联合作用，细胞活力明显受到抑制，LNCaP-flu细胞凋亡百分率明显增高，hTERT AS PS-ODN抑制了端粒酶hTERT表达可以增加LNCaP-flu细胞对TFOF诱导凋亡的敏感性。

序列表

<110> 甘肃省中医院血液净化中心

<120> hTERT基因反义寡核苷酸、药物组合物及应用

<130> none

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> AS PS-ODN

<400> 1

ggagcgcgcg gcatcgcggg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> PS-ODN

<400> 2

cccgcgatgc cgcgcgctcc 20

Claims

1.一种用于治疗氟它胺耐受型前列腺癌的组合物，其特征在于：包括有反义寡核苷酸，以及镰状棘豆总黄酮；所述的反义寡核苷酸核苷酸序列为： GGAGCGCGCGGCATCGCGGG，所述的反义寡核苷酸上的所有碱基是经过硫代修饰的。

2.包含有权利要求1所述的组合物的药物，其特征在于：所述的药物是以水为载体，其中反义寡核苷酸的浓度是5～20μmol/L，镰状棘豆总黄酮的浓度是0.05～0.2g/L。

3.权利要求1所述的组合物在制备治疗氟它胺耐受型前列腺癌药物中的应用。