CN106544342B - Mt2a基因组蛋白乙酰化修饰检测试剂盒及引物对 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种组蛋白乙酰化修饰的MT2A基因组检测试剂盒及引物对,该检测试剂盒,包括如序列表SEQ ID No:1至SEQ ID No:2所示的引物对、阳性引物对、染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)试剂组、核酸提取试剂和PCR反应试剂。本方法可以特异地检测MT2A基因组DNA相关的组蛋白乙酰化水平,同时本发明的试剂盒还能够对MT2A基因组DNA相关的组蛋白乙酰化水平进行特异、定量检测,检测结果可以为肿瘤患者治疗的方案制定提供依据,也为肿瘤患者对药物治疗的预后提供了评价方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于组蛋白乙酰化修饰的基因组检测,更具体地,涉及组蛋白乙酰化修饰相关的MT2A启动子区的基因检测。
背景技术
胃癌是我国最常见的高发肿瘤之一,其死亡率在世界和中国均占各类恶性肿瘤死因的第二位(Bray F,et al 2012;13(8):790-801)。由于缺乏早期发现的有效检测手段,在就诊患者中,90%以上处于中晚期。对于中晚期的患者,临床治疗多以化疗为主,这样的治疗方式虽然能在一定程度上抑制肿瘤的发展,但化疗所产生的副作用以及后期病人对化疗药的耐受,是不可忽视并亟需解决的问题,因此鉴别能够提高化疗敏感性的分子标志物及治疗靶点具有重要的临床应用价值(Orditura M,et al,2014 Feb 21;20(7):1635-1649)。
胃癌发生发展的分子机制涉及到癌基因与抑癌基因的表达失衡、引起细胞信号转导通路的异常调变等,是遗传学和表观遗传学(Epigenetics)渐进性异常改变的累积过程。肿瘤表观遗传学的改变不涉及核苷酸序列的变化,而是通过DNA甲基化(DNAmethylation)、组蛋白修饰(Histone modification),非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)及重塑蛋白质与DNA或其它分子的相互作用等机制,从而影响和调控相关基因的表达与功能,并最终影响遗传特征。与基因突变不同,表观遗传学改变所致的表型变化在一定条件下可以逆转,这一特性为疾病尤其是肿瘤的早期诊断与防治提供了新的靶标 (Rivera CM,etal,Cell.2013 Sep 26;155(1):39-55;Choi JD,et al,Genomics Inform 2013 Dec;11(4):164-173;Plass C,et al,Nat Rev Genet.2013 Nov; 14(11):765-80.)。因此,研究基因差异表达及其表观遗传学调控在胃癌发生、发展中的作用,对胃癌的监测预警、分子分型、个体化诊断及精准医疗都具有十分重要的意义。
研究表明抑癌基因(Tumor suppressor gene,TSG)启动子区CpG岛异常高甲基化及组蛋白乙酰化修饰异常所致的基因表达与功能异常对肿瘤的发生发展,特别是癌症发生的初期,起到了关键作用,并作为表观遗传标志物与靶点应用于肿瘤的分子诊断与治疗。组蛋白乙酰化水平与靶基因的转录活性高低与肿瘤抑制基因的沉默状态直接相关。组蛋白乙酰化及去乙酰化是表观遗传学的一个重要组成部分,组蛋白乙酰化是通过组蛋白乙酰基转移酶 (Histone acetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylases, HDACs)协同完成的,常见于组蛋白H3的赖氨酸9、14、18、23(H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K23ac)和H4的赖氨酸5、8、12、16(H4K5ac、 H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac)等位点。组蛋白的乙酰化和去乙酰化之间的动态平衡是维持体内基因正常表达的重要方面,对细胞分化,增殖与转移有着重要意义,其中任何一个方面的失衡都可能导致肿瘤的产生。国内外有研究报道HDAC1和HDAC2在胃癌中高表达。HDAC1和HDAC2在具有高度氨基酸同源性的前提下,二者常常形成异二聚体参与组成蛋白复合体,如Sin、 NuRD和CoREST。许多涉及细胞周期调控,分化和发展的转录因子与HDAC1、 HDAC2或HDAC1/2复合体有直接关系。siRNA干扰HDAC1或HDAC2,在影响该蛋白表达量的同时破坏了HDAC1或HDAC2参与组成的转录抑制复合体的完整性和功能,从而影响胃癌细胞的增殖、凋亡、分化与转移等特性。 HDAC抑制剂作用机理是HDAC1能使参与组成的复合蛋白体缺乏完整性,进而影响了该蛋白的功能。siHDAC1会导致超乙酰化的发生,从而引起部分类型的肿瘤细胞凋亡。
金属硫蛋白家族(Metallothioneins,MT)是一类富含半胱氨酸的小分子 (6-7kDa)金属结合蛋白,有四个主要亚型:MT-1(MT-1A,-B,-E,-F,-H,-I, -J,-K,-L和-X)、MT2A、MT-3和MT-4,与MT-3和MT-4呈现的局限性表达相比,MT-1和MT2A在人体广泛表达[12]。MTs是机体的一种保护性蛋白,参与多种应激反应,其基因启动子区域含有多种调控元件,如金属调控元件 (metal regulatory elements,MREs)、抗氧化反应元件、糖皮质激素反应元件和转录激酶反应元件等,MT这种复杂的结构基础决定了其容易被多种因素,如金属离子、激素、细胞因子、烷化剂等诱导的特性(Babula P,et al,Metallomics. 2012Aug;4(8):739-50;Ruttkay-Nedecky B,et al,International journal of molecularsciences.2013;14(3):6044-66)。金属硫蛋白分子参与体内金属平衡和解毒,与细胞凋亡与增殖关系密切等(Babula P,et al,Metallomics.2012 Aug; 4(8):739-50;Ruttkay-Nedecky B,et al,International journal of molecular sciences. 2013;14(3):6044-66;Sharma S,et al,Int J Nanomedicine.2013;8:1477-88)。多项研究表明MT分子在肿瘤发生发展、癌症患者预后、肿瘤化疗耐药等方面具有重要作用(Pedersen MO,et al,Progress in histochemistry and cytochemistry.2009;44(1):29-64;Janssen AM,etal,The Journal of pathology. 2000;192(3):293-300),提示MT可能与化疗的敏感性相关,因此被视为潜在的早期敏感生物标记(Sharma S,et al,Int J Nanomedicine.2013;8:1477-88)。
抑癌基因的表观沉默是胃癌发生发展的重要机制之一(Gigek CO,et al,Epigenomics.2012 Jun;4(3):279-94;Ali Z,et al,J Nanosci Nanotechnol.2013 Jan;13(1):40-51)。MTs被报导在人源肝细胞癌中作为抑癌基因呈现甲基化沉默状态,并可能作为预后标志物(Park Y,et al,Journal of gastroenterology and hepatology.2013;28(9):1565-72.,27;Sakamoto LH,et al,Pediatr Res.2010 Apr;67(4):387-93;Kanda M,et al,Int J Oncol.2009 Sep;35(3):477-83.);MT1F 在结肠癌中具有抑癌基因作用,因其等位基因杂合性丢失(Loss of heterozygosity)而导致表达下降(Yan DW,et al,Biochim Biophys Acta.2012 Jun;1822(6):918-26)。一项在人源肝细胞癌的研究表明,表观遗传沉默引起的细胞中MT1M表达下降,可导致NF-κB激活,促进肿瘤发生(Mao J,et al,Carcinogenesis.2012;33(12):2568-77.)。MTs作为抑癌基因在其它组织细胞中也有报导,如在恶性黑色素瘤细胞与组织中,MT1E启动子区CpG岛呈现的高甲基化状态与其表达下调及肿瘤转移相关,因此被认为是潜在的抑癌基因(Faller WJ,et al,Melanomaresearch.2010;20(5):392-400.);在甲状腺肿瘤发生过程中,启动子的甲基化和组蛋白修饰,共同作用导致MT1G失活,发现MT1G作为抑癌基因主要通过介导PI3K/Akt通路并部分通过激活 Rb/E2F通路发挥作用(Fu J,et al,BMC Cancer.2013 Oct 8;13:462.);在单核细胞的分化过程中,转录因子PU.1负调控MT1A的表达,伴随MT1A启动子甲基化和组蛋白H4的乙酰化修饰降低,提示MT-1A受PU.1的表观遗传学调控(Suzuki S,et al,Biochem BiophysRes Commun.2013Apr 12; 433(3):349-53);在肝癌和前列腺癌组织中,MT1H表达下降,与病人的不良预后相关,而且MT1H重金属结合蛋白的抑癌基因活性受组蛋白甲基化活性的调控(Han YC,et al,J Pathol.2013 Jun;230(2):184-93)。一项研究在分析比较OE33和FLO-1两株食管腺癌细胞系的表观遗传改变时发现,与FLO-1 相比,OE33细胞在MT3启动子区呈现较多的抑制性组蛋白修饰标志 (H3K9me2)、和较少的活性修饰的组蛋白(H3K4me2,H3K9ac),和引起较高密度的DNA甲基化,这些表观遗传修饰协同调控MT3的表达沉默,并具有区域位置的特异性(Peng D,et al,PLoS One.2011;6(7):e22009),证实早前在胃癌中MT3外显子1高甲基化引起MT3的表达下调(Deng D,et al, Carcinogenesis.2003 Jan;24(1):25-9)。
一些重要基因的表观沉默不仅可作为肿瘤发生的特征性表观遗传标志物,而且这种表观变化可通过改变一些关键药物应答基因的表达来影响肿瘤对药物的敏感性(ZellerC,et al,Oncogene.2012 Oct 18;31(42):4567-76;Shen L,et al,Cancer Res.2007 Dec1;67(23):11335-43.),因而可作为分子标志物预测化疗的敏感或耐受,并可能成为克服耐药的新靶点。如胃癌中甲基化所致基因 CHFR(checkpoint with FHA and RING finger)导致表观失活,可能成为预测胃瘤对微管抑制剂多西他赛(Docetaxel,DOC)和紫杉醇的敏感性的潜在分子标志物(Satoh A,et al,Cancer Res.2003 Dec 15;63(24):8606-13);胃癌治疗中基因BMP4的甲基化和表达状态与胃瘤对顺铂的敏感性密切相关,因此可能有望作为顺铂耐药的分子标志物(Ivanova T,et al,Gut.2013 Jan;62(1):22-33.);通过联合用药抑制DNA甲基化和组蛋白去乙酰化,可激活一些药敏相关的表观沉默基因而达到增加药物敏感性,及降低耐药性的目的(Steele N,et al,Br J Cancer.2009 Mar 10;100(5):758-63;Cacan E,et al PLoS One.2014 Jan 27;9(1):e87455)。最近一项研究通过高通量筛查体系探讨药物分子在治疗前列腺癌的效果时,发现组蛋白去乙酰化抑制剂二硫化四乙基秋兰姆 (tetraethylthiuram disulfide,DSF)能够有效抑制前列腺癌细胞的增殖与生长,并能够诱导MTs的表达(Iljin K,et al,Clin Cancer Res.2009 Oct 1;15(19):6070-8)。
已有明确研究表明,而MT1E则能增加恶性黑色素瘤对顺铂诱导凋亡的敏感性(Faller WJ,et al,Melanoma research.2010;20(5):392-400.),基因敲除MT2A可增加小鼠炎症相关胃癌(Mita M,et al The Journal of toxicological sciences.2012;37(6):1261-5;Mitani T,et al,Journal of gastroenterology and hepatology.2008;23(8Pt2):e334-9.),或致癌物诱发肝癌(Majumder S,et al, Cancer research.2010;70(24):10265-76)的发生率。这些研究提示MT2A可能作为新的表观调控标志物及靶点应用于胃癌化疗敏感性治疗方案的预测与检测,但是现在还未有可靠且灵敏的通过检测MT2A基因组DNA组表观遗传学状态的方法,用于预测治疗方案的有效性。
MT2A基因组区域在16号染色体区段Chromosome 16,NC_000016.10,长度约为932bp(56608566-56609497),表观遗传学修饰具有很大的差异性,因而确定有效的检测区域,并设计稳定且灵敏的检测方法成为解决这一问题的难点。因此,需要提供一种MT2A基因组DNA组蛋白乙酰化的检测试剂盒及引物对。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种MT2A基因组蛋白乙酰化的检测引物对。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种MT2A基因组蛋白乙酰化的检测试剂盒。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种MT2A基因组蛋白乙酰化的检测方法。
为解决上述技术问题,本发明采用下述技术方案:
一种MT2A基因组蛋白乙酰化的检测引物对,该引物对如序列表SEQ ID No:1和SEQID No:2所示,具体地:
上游引物核苷酸序列为:
MT2A-FP:5'-AGGTTATTCGGAGCCCCCTT-3',(SEQ ID No:1);和
下游引物核苷酸序列为:
MT2A-RP:5'-GTTCCTCAGTCCACAACCGA-3',(SEQ ID No:2)。
考虑到MT2A基因组蛋白乙酰化修饰的多样性和较难直接得出活化性组蛋白乙酰化对应的MT2A启动子区的激活位点,我们通过优化分析,大致获得H3K9ac结合活性较为确切的区段共809bp(Chromosome 16,NC_000016.10 version,56608566-56609497),并根据此区段设计特定的基因组引物对,见序列表中SEQ ID No:1和SEQ ID No:2,设计引物的上下游长度范围分别 12-30bp。
一种包含上述引物对的检测试剂盒,其包括如序列表SEQ ID No:1和 SEQ ID No:2所示的引物对和阳性对照引物对。
所述检测试剂盒进一步包括染色质免疫共沉淀试剂组。
所述检测试剂盒进一步包括核酸提取试剂。
所述检测试剂盒进一步包括PCR反应试剂。
SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示引物对用于检测MT2A基因组蛋白的乙酰化,上述引物可以分装,也可以预先混合在一起。
优选地,所述阳性对照引物为检测GAPDH基因的引物对,该引物对核苷酸序列如下:
上游引物核苷酸序列为:
GAPDH-FP:5'-CACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3',(SEQ ID No:3)和
下游引物核苷酸序列为:
GAPDH-RP:5'-ACTCACCCGTTGACTCCGAC-3',(SEQ ID No:4)。
具体地,所述染色质免疫共沉淀试剂组包括样品洗涤缓冲液、免疫复合物沉淀洗涤缓冲液、裂解缓冲液、附着有蛋白A的珠子、稀释缓冲液、蛋白酶抑制剂、乙酰化组蛋白的抗体、对照IgG和洗脱缓冲液。
所述染色质免疫共沉淀试剂组进一步包括鲑鱼精DNA和白蛋白。
所述染色质免疫共沉淀试剂组可以选自但不限于商业出售的用于染色质免疫共沉淀的试剂盒或试剂组,选自但不限于EpiTech ChIPOneDay kit (QIAGEN)。
其中所述洗涤缓冲液主要用于样品收集和预处理过程中的洗涤,主要用于去除样品上粘附的液体或试剂,如培养基、体液或血液等。所述洗涤缓冲液选自但不限于PBS、TBS、TE或TBE等缓冲液,只要能够保持样品完整,样品不被裂解导致样品的损失的缓冲液都可以使用。
其中裂解缓冲液主要用于裂解样品细胞膜和核膜,以释放待检测物质,优选地,裂解缓冲液使用前加入蛋白酶抑制剂。
所述稀释缓冲液用于裂解后样品的稀释,以降低裂解液中去垢剂对抗体蛋白的影响,优选地,稀释缓冲液用前加入蛋白酶抑制剂。
所述蛋白酶抑制剂选自丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天(门)冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂中的一种或多种。优选地,所述蛋白酶抑制剂选自但不限于商业出售的用于染色质免疫共沉淀的蛋白酶抑制剂组合。
所述乙酰化组蛋白的抗体的作用是结合乙酰化的组蛋白(抗原),根据检测目标不同,可以加入抗组蛋白H3乙酰化的抗体和/或抗组蛋白H4乙酰化的抗体,所述抗组蛋白H3乙酰化的抗体选自抗H3K14ac抗体、抗H3K18ac抗体、抗H3K23a抗体c和抗H3K9Ac抗体中的一种或多种,所述抗组蛋白H4 乙酰化的抗体选自抗H4K5ac抗体、抗H4K8ac抗体、抗H4K12ac抗体、抗 H4K16ac抗体和抗H4ac抗体中的一种或多种。优选地为抗H3K9Ac抗体或抗 H4K5ac抗体。对照IgG是与乙酰化组蛋白抗体同类的非特异性抗体,主要用于检测非特异性结合组蛋白。
所述鲑鱼精DNA的作用为:和白蛋白一起封闭附着有蛋白A的珠子,以获得预处理的蛋白A的珠子。预处理的蛋白A的珠子可消除珠子的非特异性结合,鲑鱼精DNA与很多实验物种的同源性相差很远,所以鲑鱼精DNA 不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。另外,蛋白A具有与免疫球蛋白抗体非抗原结合点的Fc段结合,附着有蛋白A的珠子能够与抗乙酰化组蛋白的抗体 (抗体)及乙酰化的组蛋白(抗原)形成蛋白A-抗体-抗原复合物,因而附着有蛋白A的珠子主要为了沉淀蛋白A-抗体-抗原复合物,即免疫共沉淀复合物(下同),进而获得免疫复合物沉淀。优选地为附着有蛋白A的珠子为 Sepharose 4B珠子,可以选自但不限于商业出售的用于免疫共沉淀的蛋白 A-Sepharose 4B珠子,或蛋白A/G-Sepharose 4B珠子;更优选地,所述蛋白 A Sepharose 4B珠子或蛋白A/G-Sepharose 4B珠子为鲑鱼精DNA和白蛋白封闭的预处理的蛋白A Sepharose 4B珠子或蛋白A/G-Sepharose 4B珠子。
所述免疫复合物沉淀洗涤缓冲液是用于洗涤免疫复合物沉淀。
其中,所述核酸提取试剂可以选自但不限于商业出售的用于提取核酸的试剂盒或试剂,优选地为QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取试剂盒。
其中,所述定量PCR反应试剂可以选自但不限于商业出售的用于半定量和定量PCR试剂盒或反应试剂。具体地,所述半定量PCR反应试剂包括PCR 缓冲液、dNTP混合物和DNA聚合酶。所述定量PCR反应试剂包括PCR缓冲液、SYBR Green染料、ROX染料、TaqMan探针、dNTP混合物和DNA 聚合酶。
一种利用上述试剂盒检测MT2A基因组蛋白乙酰化的检测方法,其包括如下步骤:
收集、预处理和洗涤样品;裂解样品;染色质DNA超声片段化;免疫沉淀裂解样品中组蛋白乙酰化的染色质,获得免疫复合物沉淀;洗涤所述免疫复合物沉淀;提取免疫复合物沉淀中的染色质DNA;PCR扩增提取的DNA;结果判定。
其中所述收集、预处理和洗涤样品的方法为:将收集的培养的细胞或组织样品用洗涤缓冲液洗涤;用福尔马林预处理;用洗涤缓冲液洗涤福尔马林预处理的样品。
优选地,用预热的洗涤缓冲液洗涤收集的培养的细胞或组织样品,优选地,洗涤次数为1-5次,更优选地,洗涤次数为1-2次。洗涤缓冲液的预热温度可根据样品来源和种类不同进行调整,优选地为室温预热。样品的洗涤次数需要根据样品来源和种类进行调整,以便后续的检测达到最佳的效果。
所述福尔马林为1%福尔马林,其预处理的温度为室温37℃;福尔马林预处理时间为5-30min,优选地预处理时间为10min。
福尔马林预处理的样品的洗涤方法为用冰冷洗涤缓冲液洗涤1-5次,优选地,洗涤次数为1-2次;然后将样品移入冰冷的洗涤缓冲液中,离心,弃上清,优选地在4℃以1000g离心5min,其中离心仅为了沉淀组织细胞。
其中所述裂解样品的方法为:用裂解缓冲液重悬已洗涤的福尔马林预处理的样品,并孵育;优选地,用冰冷的裂解液重悬已洗涤福尔马林预处理的样品;优选地,在冰上孵育待裂解的样品。
其中所述染色质DNA超声片段化的方法为,经超声随机剪切,裂解的样品形成一定大小染色质小片段,经离心,收集上清,即为用于免疫沉淀的染色质片段化样品。
其中所述免疫沉淀样品中组蛋白乙酰化的染色质的方法为:用稀释缓冲液稀染色质片段化样品后,加入预处理的蛋白A珠子,进行免疫预清洗;离心留取上清,留存部分上清作为“样品投入控制(Input)”,优选地,留存0.5-10%的上清作为Input,更优选地,留存1%的上清作为Input;均分剩余上清,分别加入抗乙酰化组蛋白抗体和对照IgG并孵育;加入预处理的蛋白A珠子,孵育,离心,弃上清留取沉淀,该沉淀为染色质与抗体免疫复合物沉淀(免疫复合物沉淀)。优选地,所述乙酰化组蛋白抗体为抗H3K9Ac的单抗,对照 IgG是与乙酰化组蛋白抗体同类的非特异性抗体。
优选地,所述免疫预清洗的时间30min-2h,更优选地,免疫预清洗的时间40min。
优选地,抗体与上清孵育温度为4℃,孵育时间为2小时至过夜,所述过夜指6-12小时,更优选地,孵育时间为2小时。
优选地,加入预处理的蛋白A珠子,孵育时间为30min-2h,更优选地,孵育时间为1h。
预处理的蛋白A珠子是指并经过鲑鱼精DNA和白蛋白的预处理封闭。
所述洗涤免疫复合物沉淀的方法为:用洗涤缓冲液洗涤免疫复合物沉淀。优选地,所述免疫沉淀复合物洗涤缓冲液包括TSE Ⅰ、TSE Ⅱ、buffer Ⅲ和 TE缓冲液,具体地,依次用TSE Ⅰ、TSE Ⅱ、buffer Ⅲ和TE洗涤免疫沉淀复合物,优选地,洗涤次数为1-3次。
所述提取染色质DNA可用市售DNA提取试剂(核酸提取试剂)或试剂盒进行,优选为QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)提纯试剂盒。
所述PCR扩增提取的DNA的方法为半定量PCR或定量PCR扩增提取的 DNA,可采用市售的半定量PCR反应试剂或试剂盒或定量PCR反应试剂或试剂盒。
所述结果计算方法为:数据结果通过2-△△Ct方法判断,
试验或对照样品沉淀的标准化(normalization):
首先计算每个样品中乙酰化抗体(Ab)或对照IgG(IgG)相对样品投入控制(Input)的量,
·Ct"标准化样品沉淀"=Ct[样品沉淀]-(Ct[样品投入控制]-Log2 (投入稀释因子))
其中Ct[样品沉淀]为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀或IgG样品的沉淀。当Ct[样品沉淀]为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀时,·Ct"标准化样品沉淀"为加入抗乙酰化抗体的标准化样品沉淀;当Ct[样品沉淀]为加入IgG的样品沉淀时,·Ct"标准化样品沉淀"为加入 IgG的标准化样品沉淀。
当样品投入控制为投入免疫共沉淀样品的1%时,投入稀释因子=6.6。
计算样品的沉淀=2(-·Ct"标准化样品沉淀")×100%。
·Ct"标准化样品沉淀"为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀或IgG样品的标准化样品沉淀。
每一个样品同时用抗乙酰化的抗体和IgG处理样品,IgG作为非特异性结合的对照,在计算样品的有效沉淀时需用该样品乙酰化抗体的沉淀减去对照IgG的非特异沉淀:
样品有效沉淀(%of Input)
=2(-·Ct"标准化样品沉淀"(Ab))×100%-2(-·Ct"标准化样品沉淀"(IgG))×100%。
或
样品有效沉淀(fold change)=2(-·Ct样品有效沉淀)
实验组与对照组样品中阳性对照或目的基因的有效沉淀富集倍数为:
阳性对照或目的基因的富集=实验组样品有效沉淀/对照组样品有效沉淀。
所述对照组样品为施用药物前或正常人或动物来源的样品。所述结果判定方法:
乙酰化抗体(Ab)的样品沉淀≥0.1%,或/和其有效沉淀>0.01%,视为阳性沉淀富集。
乙酰化抗体(Ab)的样品沉淀中<0.1%,或/和其有效沉淀≤0,视为无沉淀富集。
本发明的有益效果如下:
本方法可以特异地检测MT2A基因组DNA的乙酰化水平,同时本发明的试剂盒还能够对MT2A基因组DNA乙酰化水平进行特异、定量检测,检测结果可以为肿瘤患者治疗的方案制定提供依据,也为肿瘤患者对药物治疗的预后提供了评价方法。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出大蒜素上调MT2A mRNA(A)和蛋白质(B)的表达,并具有处理浓度的依赖性,其中DATS代表大蒜素,β -actin为对照。
图2示出乙酰化诱导剂TSA(Trichostatin A)具有与大蒜素(DATS)相似的诱导MT2A的表达的作用,其中control为对照。
图3示出大蒜素特异性上调MT2A,对MT2A高度同源的MT1E,MT1F, MT1G没有十分明显的上调作用,其中control为对照,TSA(Trichostatin A) 为阳性乙酰化药物,纵坐标为实时定量的PCR结果。
图4示出大蒜素抑制HDAC1和HDAC2的表达,促进组蛋白乙酰化的水平,如H3K9Ac和H4K5Ac,β -actin为对照。
图5示出ChIP结合半定量PCR(A)和qPCR(B),证实组蛋白H3K9Ac 能明显富集、招募MT2A基因组特异性结合片段。证实大蒜素可通过组蛋白乙酰化特异诱导胃癌细胞中MT2A的表达,其中control为对照,TSA为阳性乙酰化药物,Input为样品投入控制,H3K9ac为抗H3K9ac抗体。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1:MT2A基因组DNA组蛋白乙酰化的专用引物的设计
根据组蛋白修饰在基因组分布特性,从GenBank选取特定的MT2A基因序列,利用DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析,找出MT2A的保守基因序列,用软件Primer Express 3.0设计引物,上游引物MT2A-FP:核苷酸序列为: 5'-AGGTTATTCGGAGCCCCCTT-3',(SEQ IDNo.1),下游引物MT2A-RP:核苷酸序列为:5'-GTTCCTCAGTCCACAACCGA-3',(SEQ ID No.2);
所有引物由天一辉远技术公司合成。
实施例2:MT2A基因组DNA组蛋白乙酰化的检测试剂盒的组成
MT2A基因组DNA组蛋白乙酰化的检测试剂盒,其如序列表SEQ ID No. 1至SEQ IDNo.2所示的引物对、如序列表SEQ ID No.3至SEQ ID No.4所示的阳性对照引物对、染色质免疫共沉淀试剂组、核酸提取试剂和PCR反应试剂。
其中用于检测MT2A基因组DNA组蛋白乙酰化的引物见实施例1;
所述染色质免疫共沉淀试剂组1%的福尔马林、PBS、裂解缓冲液、稀释缓冲液、TSEI、TSE II、Buffer III、TE缓冲液、洗脱缓冲液,上述各试剂配制方法如下:
1%的福尔马林:37%的甲醛与PBS按体积比1:36稀释。
裂解缓冲液:1%SDS,5mM EDTA,50mM Tris.HCl[pH 8.0],protease inhibitorcocktail;
稀释缓冲液:1%Triton X-100,2mM EDTA,150mM NaCl,20mM Tris. HCl[pH8.0],protease imhibitor cocktail;
TSE I:0.1%SDS,1%Triton X-100,2mM EDTA,20mM Tris.HCl[pH 8.0], 150mMNaCl;
TSE II:0.1%SDS,1%Triton X-100,2mM EDTA,20mM Tris.HCl[pH 8.0], 500mMNaCl,
Buffer III:0.25M LiCl,1%NP-40,1%deoxycholate,1mM EDTA,10mM Tris.HCl[pH 8.0];
TE缓冲液:10mM Tris.HCl,pH 8.0,1mM EDTA;
洗脱缓冲液:1%SDS,0.1M NaHCO3;
预处理的蛋白A珠子:50%蛋白A Sepharose 4B,0.2mg/ml SS-DNA, 0.5mg/mlBSA,0.05%NaAzide,1mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH 8.
所述核酸提取试剂为QIAamp DNA Mini Kit提纯试剂盒(QIAGEN公司)
所述定量PCR反应试剂为Transtart Green qPCR Supermix(2X,全式生物基因有限公司)
实施例3:MT2A基因组DNA组蛋白乙酰化的特异性试验
1.制备样品
将胃癌细胞接种于直径10cm培养皿中,待细胞长到60-80%左右,加入 DATS(40μM)处理12h,阴性对照组中加入生理盐水,阳性对照加入TSA (5nM)处理24h。每组收集3-5个培养皿。
2.收集并洗涤样品
用室温预热的PBS洗涤细胞1-2次,然后用1%福尔马林37℃处理10min。用冰冷PBS清洗细胞2次,然后用细胞刮棒移入1ml冰冷的PBS中,4℃离心3,000rpm,2min,弃上清。用400μl的裂解缓冲液重悬细胞沉淀,冰上孵育10min。
3.染色质DNA超声片段化,超声处理16次,每次2s,4℃,14,000g 离心15min,收集上清。
4.免疫共沉淀:
超声处理液以1:10稀释,加入预处理的蛋白A珠子进行免疫清洗40 min-1h,离心取上清。取稀释液10μl作为Input组分,剩余的,分别取1 毫升稀释液移至1.5ml EP管中,分别加入H3K9Ac单抗,或正常IgG,4℃孵育2-h过夜,然后再加入预处理的蛋白A珠子,孵育1h。离心去除上清留取沉淀,获得免疫复合物沉淀。依次用1ml TSE Ⅰ,TSE Ⅱ和buffer Ⅲ洗涤免疫复合物沉淀各1次,每次5min;用TE洗涤2次,每次5min;用100μl 洗脱缓冲液于室温孵育10min以洗脱珠子上的免疫复合物,2次,收集合并洗脱液。
5.核酸提取
将洗脱液置于65℃水浴中6h,以使免疫复合物中蛋白和DNA分离。分离后的DNA片段经提纯试剂盒提纯后,-20℃保存。核酸产物进行下一步的半定量和实时定量PCR,步骤见下。
6.PCR扩增:
目的基因:MT2A的promoter结合区引物对
a)用实施例1制备的MT2A基因启动子区特异性引物进行定量PCR扩增。
试剂:Transtart Green qPCR Supermix(2X,全式生物基因有限公司)
Passive Dye I荧光染料(全式生物基因有限公司)
扩增仪器AB7500Fast
扩增条件:95℃,10min;95℃ 15s,60℃,1min(40循环)。
数据结果通过2-△△Ct方法进行计算。b)或用实施例1制备的MT2A基因启动子区特异性引物进行半定量PCR扩增。
条件:95℃,5minutes;94℃,30seconds,63℃,20seconds,72℃,20 seconds(3cycles);94℃,30seconds;61℃,30seconds,72℃,30seconds(5 cycles);94℃,30seconds,58℃,30seconds,72℃,30second(8cycles)and 94℃, 30seconds,55℃,30seconds,72℃,30seconds(28cycles);72℃,10minutes。
7.结果判定
用1.5%琼脂糖胶对上述的半定量PCR产物进行核酸电泳,100V,20分钟。结果见图5A;定量PCR的判定,结果见图5B。
实施例4
将胃癌细胞接种于直径10cm培养皿中,待细胞长到60-80%左右,加入 DATS(40μM)处理12h,或HDAC抑制剂Trichostatin A(TSA)(5nM) 处理24h;阴性对照组中加入生理盐水,每组收集3-5个培养皿。分别分离 RNA和蛋白质,进行RT-PCR和Western blot分析,结果显示出DATS上调 MT2A mRNA(A)和蛋白质(B)的表达,并具有处理浓度的依赖性(图1)。而且TSA具有与DATS相似的诱导MT2A的表达的作用(图2)。进一步 RT-qPCR分析显示,在上述相同处理条件下,DATS上调MT2A,而对MT2A 高度同源的MT1E,MT1F,MT1G没有十分明显的上调作用,提示DATS上调MT2A mRNA表达的特异性(图3)。Western blot进一步分析上述处理条件下,DATS对胃癌细胞组蛋白乙酰化及相关抑制酶的表达水平,结果显示 DATS抑制HDAC1和HDAC2的表达,促进组蛋白乙酰化的表达水平,如 H3K9Ac和H4K5Ac(图4)。为进一步分析DATS促进组蛋白乙酰化的增加是否与诱导MT2A的表达相关,通过ChIP结合半定量PCR(A)和qPCR (B)分析,证实DATS促进的组蛋白乙酰化(H3K9Ac)能明显富集、招募 MT2A基因组特异性结合片段。证实DATS可通过组蛋白乙酰化特异诱导胃癌细胞中MT2A的表达(图5)。
申请人首次通过ChIP-qPCR验证胃癌细胞中MT2A基因组DNA相关组蛋白修饰呈现较低的乙酰化水平,并通过大蒜素的作用而逆转恢复。从而在胃癌细胞模型中,证实大蒜素通过干扰HDAC1和HDAC2可以恢复抑癌基因 MT2A的表达。同时本发明的试剂盒能够特异、准确地检测MT2A的乙酰化水平。
HDAC抑制剂能够通过调变组蛋白乙酰化抑制肿瘤的生长,已广泛应用于临床治疗肿瘤等疾病。大蒜素具有明确的抗癌防癌作用。但大蒜素(如 DATS)、HDAC抑制剂(如TSA)及其它肿瘤化疗药,是否通过调控MT2A 抑制的肿瘤生长,尚不明确。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前研究体内蛋白质与DNA相互作用的唯一方法,在基因表达调控研究中起着无可替代的作用。真核生物的基因组 DNA与组蛋白等相互作用构成染色质,是遗传物质的载体和存在形式。研究染色质中蛋白质与DNA相互作用是阐明基因表达调控机制的基本途径。
由于HDAC抑制剂已广泛应用于临床治疗肿瘤等疾病,MT2A基因组 DNA组表观遗传学状态,尤其是组蛋白乙酰化,可作为新的表观调控标志物及靶点应用于肿瘤化疗敏感性治疗方案有效性的预测与检测。本发明的方法能够用于肿瘤化疗敏感性治疗方案有效性的预测与检测。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定,对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举,凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (11)
1.一种MT2A基因组蛋白乙酰化修饰的检测引物对,其特征在于,该引物对如序列表SEQID No:1和SEQ ID No:2所示。
2.一种包含权利要求1所述引物对的检测试剂盒,其特征在于,包括如序列表SEQ IDNo:1至SEQ ID No:2所示的引物对和阳性对照引物对。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包括染色质免疫共沉淀试剂组。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包括核酸提取试剂。
5.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒进一步包括PCR反应试剂。
6.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述阳性对照引物对如序列表SEQID No:3和SEQ ID No:4所示。
7.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述染色质免疫共沉淀试剂组包括样品洗涤缓冲液、免疫复合物沉淀洗涤缓冲液、裂解缓冲液、附着有蛋白A的珠子、稀释缓冲液、蛋白酶抑制剂、乙酰化组蛋白的抗体、对照IgG和洗脱缓冲液。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒,其特征在于,所述染色质免疫共沉淀试剂组进一步包括鲑鱼精DNA和白蛋白。
9.根据权利要求7所述的检测试剂盒,其特征在于,所述附着有蛋白A的珠子为蛋白A-Sepharose 4B珠子或蛋白A/G-Sepharose 4B珠子。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒,其特征在于,所述蛋白ASepharose 4B珠子或蛋白A/G-Sepharose 4B珠子为鲑鱼精DNA和白蛋白封闭的预处理的蛋白A Sepharose 4B珠子或蛋白A/G-Sepharose 4B珠子。
11.根据权利要求7所述的检测试剂盒,其特征在于,所述乙酰化组蛋白的抗体为抗H3K9Ac抗体或/和抗H4K5ac抗体。
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