CN114107491A - Muc22基因启动子区相关的组蛋白修饰分析引物对及检测试剂盒 - Google Patents

Muc22基因启动子区相关的组蛋白修饰分析引物对及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了MUC22基因启动子区相关的组蛋白修饰分析引物对及检测试剂盒。本发明所提供的引物对为引物对A(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)、引物对B(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)或引物对C(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)。本引物对及试剂盒可以特异定量检测组蛋白乙酰化修饰相关的MUC22基因启动子区DNA特定序列，据此评估试剂、药物等表观调控MUC22基因活性与表达的组蛋白乙酰化水平及其变化，同时还可特异定量检测MUC22基因转录表达变化以评估表观调控MUC22基因表达的效果。检测结果可以为肿瘤患者(尤其是肺鳞癌)诊断与治疗提供依据，也为肿瘤患者对药物治疗的预后提供了评价方法。

Description

MUC22基因启动子区相关的组蛋白修饰分析引物对及检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及MUC22基因启动子区相关的组蛋白修饰分析引物对及检测试剂盒。
背景技术
染色质(Chromatin)由组蛋白(Histone)包装基因组DNA形成有序结构。组蛋白尤其是其氨基末端(N-terminal)的尾部(Histone tail)上氨基酸可发生多种表观修饰，包括乙酰化(Acetylation)、甲基化(Methylation)、糖基化(glycosylation)、磷酸化(phosphorylation)等。这些电荷改变可结合或排斥DNA，即改变DNA易接近性(Accessibility)，从而产生基因活性与表达变化，此即组蛋白表观修饰及其调控。
染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是基于抗体捕捉富集基因原理，用于研究蛋白质-DNA相互作用的专门技术，是ENCyclopedia of DNAElements(ENCODE)项目采用的一项重要技术，在基因表达调控研究中起着无可替代的作用(The ENCODE Project Consortium.,Abascal,F.,Acosta,R.et al.Perspectives onENCODE.Nature 583,693–698(2020))。染色质免疫共沉淀结合定量PCR(ChIP-qPCR)，通过抗表观修饰组蛋白的抗体，免疫沉淀染色质(组蛋白-DNA复合体)，分离经抗体特异富集的沉淀DNA，经过qPCR分析，以此DNA评估组蛋白乙酰化等修饰水平及其变化。
癌症是严重威胁人类健康，影响社会与经济发展，与受限于检测标志物敏感性、组织特异性密切相关。因此，用于肿瘤精确诊断及监测的生物标志物尤其是肿瘤分子标志物的转化研究，具有重要的临床应用价值。与肿瘤发生发展相关基因，即肿瘤相关基因，可作为潜在的肿瘤分子标志物，或治疗靶标。相较基因突变，表观修饰具有组织特异性、早期发生、动态可逆，且有表观药物，更合适作为分子标志物或靶标应用于早诊与用药评估。
非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常见的肺癌类型，并且仍然是目前全球癌症相关死亡率和发病率的主要原因。NSCLC分为两种主要亚型：肺腺癌(Lung Adenocarcinoma，LUAD)和鳞状细胞癌(Lung Squamous Cell Carcinoma，LUSC，简称鳞癌)，分别约占所有肺癌病例的40％和30％(Travis WD:Lung Cancer Pathology:Current Concepts.Clinics in chest medicine 41:67-85,2020.)。肺腺癌和肺鳞癌来自不同的上皮细胞类型，具有明显的基因组异常和功能变异性，因此需要非常不同的治疗策略(Bustamante-Marin XM and Ostrowski LE:Cilia and Mucociliary Clearance.ColdSpring Harbor perspectives in biology 9,2017.)。例如，腺癌主要起源于分泌粘液并表达与其远端支气管起源一致的生物标志物的细胞的外周气道，而肺鳞癌主要起源于较大的近端气道的上皮细胞。相比肺腺癌针对性靶向疗法，肺鳞癌中致癌的驱动因素寥寥无几，这限制了靶向疗法在临床试验中的可用性。
粘蛋白(Muscin,MUC)是粘膜屏障的主要成分，可由细支气管外泌或与膜结合的特化上皮细胞所表达的一系列高分子量糖蛋白组成。迄今在鉴定出的21种粘蛋白中，大多数表达在呼吸道或肺实质中，包括分泌型和膜结合型(Kufe DW:Mucins in cancer:function,prognosis and therapy.Nature reviews.Cancer 9:874-885,2009)。膜结合型MUCs存在于上皮细胞中，作为受体和传感器来介导信号转导。已显示MUC的异常表达通过多种途径与肺癌恶性程度有关。因此，MUC用作肿瘤相关抗原(TAA)和的肺癌免疫治疗靶标(Kufe DW:Mucins in cancer:function,prognosis and therapy.Naturereviews.Cancer 9:874-885,2009)。但有关粘蛋白家族新成员，粘蛋白(Muscin 22,MUC22)，研究报道甚少，其功能未明。
发明内容
本发明的目的是提供MUC22基因启动子区相关的组蛋白修饰分析引物对及检测试剂盒。
第一方面，本发明要求保护用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的引物对或引物对组。
本发明所要求保护的所述引物对组由引物对A、引物对B和引物对C组成；所述引物对为所述引物对A、所述引物对B或所述引物对C。
所述引物对A由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；
所述引物对B由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；
所述引物对C由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成。
第二方面，本发明要求保护用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的试剂盒。
本发明要求保护的用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的试剂盒含有前文第一方面中所引物对或引物对组。
进一步地，所述试剂盒中还可含有如下中的全部或部分：染色质免疫共沉淀试剂、核酸提取试剂、PCR反应试剂、阳性对照引物对。
其中，所述阳性对照引物对可为用于检测GAPDH基因的引物对；具体如：
GAPDH-FP：5'-CACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3'；
GAPDH-RP：5'-ACTCACCCGTTGACTCCGAC-3'。
具体地，所述染色质免疫共沉淀试剂包括样品洗涤缓冲液、免疫复合物沉淀洗涤缓冲液、裂解缓冲液、蛋白A或/和蛋白G附着珠子(Protein A/G)、稀释缓冲液、蛋白酶抑制剂、乙酰化组蛋白的抗体、对照IgG和洗脱缓冲液。
所述染色质免疫共沉淀试剂进一步包括鲑鱼精DNA和白蛋白。
所述染色质免疫共沉淀试剂可以选自但不限于商业出售的用于染色质免疫共沉淀的试剂盒或试剂组，选自但不限于EpiTech ChIPOneDay kit(QIAGEN)。
其中，所述洗涤缓冲液主要用于样品收集和预处理过程中的洗涤，主要用于去除样品上粘附的液体或试剂，如培养基、体液或血液等。所述洗涤缓冲液选自但不限于PBS、TBS、TE或TBE等缓冲液，只要能够保持样品完整，样品不被裂解导致样品的损失的缓冲液都可以使用。
所述裂解缓冲液主要用于裂解样品细胞膜和核膜，以释放待检测物质，优选地，裂解缓冲液用前加入蛋白酶抑制剂。
所述稀释缓冲液用于裂解后样品的稀释，以降低裂解液中去垢剂对抗体蛋白的影响，优选地，稀释缓冲液用前加入蛋白酶抑制剂。
所述蛋白酶抑制剂选自但不限于商业出售的用于染色质免疫共沉淀的蛋白酶抑制剂组合。优选地，所述蛋白酶抑制剂选自丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天(门)冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂中的一种或多种。
所述乙酰化组蛋白的抗体的作用是结合乙酰化的组蛋白(抗原)，根据检测目标不同，可以加入组蛋白H3乙酰化的抗体和/或组蛋白H4乙酰化的抗体，所述组蛋白H3乙酰化的抗体选自抗H3K9Ac抗体、抗H3K14ac抗体、抗H3K18ac抗体、抗H3K23ac抗体、抗H3K27ac抗体、抗H3K36ac抗体、抗H3K56ac抗体、抗H3K79ac抗体和抗H3ac抗体等中的一种或多种，所述组蛋白H4乙酰化的抗体选自抗H4K5ac抗体、抗H4K8ac抗体、抗H4K12ac抗体、抗H4K16ac抗体和抗H4ac抗体中的一种或多种。优选地为抗H3K9Ac抗体或抗H4K5ac抗体。对照IgG是与乙酰化组蛋白抗体同类的非特异性抗体，主要用于检测非特异性结合组蛋白。
所述鲑鱼精DNA的作用为：和白蛋白一起封闭附着有蛋白A或/和蛋白G的珠子，以获得预处理的蛋白A的珠子。预处理的蛋白A的珠子可消除珠子的非特异性结合，鲑鱼精DNA与很多实验物种的同源性相差很远，所以鲑鱼精DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。另外，如蛋白A具有与免疫球蛋白抗体非抗原结合点的Fc段结合，附着有蛋白A的珠子能够与抗乙酰化组蛋白的抗体(抗体)及乙酰化的组蛋白(抗原)形成蛋白A-抗体-抗原复合物，因而附着有蛋白A的珠子主要为了沉淀蛋白A-抗体-抗原复合物，即免疫共沉淀复合物(下同)，进而获得免疫复合物沉淀。优选地为附着有蛋白A的珠子为Sepharose 4B珠子，可以选自但不限于商业出售的用于免疫共沉淀的蛋白A-Sepharose 4B珠子，或蛋白A/G-Sepharose 4B珠子；更优选地，所述蛋白A Sepharose 4B珠子或蛋白A/G-Sepharose 4B珠子为鲑鱼精DNA和白蛋白封闭的预处理的蛋白A Sepharose 4B珠子或蛋白A/G-Sepharose4B珠子。
所述免疫复合物沉淀洗涤缓冲液是用于洗涤免疫复合物沉淀。
其中，所述核酸提取试剂可以选自但不限于商业出售的用于提取核酸的试剂盒或试剂，优选地为QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取试剂盒。
其中，所述定量PCR反应试剂可以选自但不限于商业出售的用于半定量和定量PCR试剂盒或反应试剂。具体地，所述半定量PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTP混合物和DNA聚合酶。所述定量PCR反应试剂包括PCR缓冲液、SYBR Green染料、ROX染料、TaqMan探针、dNTP混合物和DNA聚合酶。
第三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的引物对或引物对组或前文第二方面中所述的试剂盒在如下任一中的应用：
A1、检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况；
A2、制备用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况的产品。
在本发明中，所述检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况为检测非小细胞肺癌细胞中MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况。
进一步地，所述非小细胞肺癌具体为肺鳞癌。
第四方面，本发明要求保护MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰作为分子标志物在如下任一中的应用：
B1、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断；
B2、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估；
B3、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析。
第五方面，本发明要求保护用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质在如下任一中的应用：
B1、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断；
B2、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估；
B3、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析。
第六方面，本发明要求保护MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰作为药物作用靶点在制备用于治疗和/或预防非小细胞肺癌的产品中的应用。
进一步地，所述非小细胞肺癌具体可为肺鳞癌。
在上述各方面中，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列可如SEQ ID No.7所示(位于MUC22基因转录起始位点上游1000bp到下游1000bp的这一段DNA序列)。
进一步地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列可如SEQ ID No.8所示(位于MUC22基因转录起始位点上游366bp到下游855bp的这一段DNA序列)。
更进一步地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.9(位于MUC22基因转录起始位点上游105bp到下游18bp的这一段DNA序列)或SEQ ID No.10(位于MUC22基因转录起始位点上游366bp到上游117bp的这一段DNA序列)或SEQ ID No.11(位于MUC22基因转录起始位点下游778bp到下游855bp的这一段DNA序列)所示。
在第五方面中，用于检测所述MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质为前文第一方面中所述的引物对或引物对组或前文第二方面中所述的试剂盒。
第七方面，本发明要求保护具有如下B1至B3中任一所示功能的分子标记物。
B1、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断；
B2、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估；
B3、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析。
本发明要求保护的所述分子标记物为MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰。
进一步地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列可如SEQ ID No.7所示(位于MUC22基因转录起始位点上游1000bp到下游1000bp的这一段DNA序列)。
更进一步地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列可如SEQ ID No.8所示(位于MUC22基因转录起始位点上游366bp到下游855bp的这一段DNA序列)。
更加具体地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.9(位于MUC22基因转录起始位点上游105bp到下游18bp的这一段DNA序列)或SEQ ID No.10(位于MUC22基因转录起始位点上游366bp到上游117bp的这一段DNA序列)或SEQ ID No.11(位于MUC22基因转录起始位点下游778bp到下游855bp的这一段DNA序列)所示。
第八方面，本发明要求保护一种检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况的方法。
本发明要求保护的检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况的方法，可包括如下步骤：收集、预处理和洗涤样品；裂解样品；染色质DNA超声片段化；免疫沉淀裂解样品中组蛋白乙酰化的染色质，获得免疫复合物沉淀；洗涤所述免疫复合物沉淀；提取免疫复合物沉淀中的染色质DNA；利用前文第一方面中所述引物对或引物对组PCR扩增提取的DNA；结果判定。
其中，所述收集、预处理和洗涤样品的方法为：将收集的培养的细胞或组织样品用洗涤缓冲液洗涤；用福尔马林预处理；用洗涤缓冲液洗涤福尔马林预处理的样品。
优选地，用预热的洗涤缓冲液洗涤收集的培养的细胞或组织样品，优选地，洗涤次数为1-5次，更优选地，洗涤次数为1-2次。洗涤缓冲液的预热温度可根据样品来源和种类不同进行调整，优选地为室温预热。样品的洗涤次数需要根据样品来源和种类进行调整，以便后续的检测达到最佳的效果。
所述福尔马林为1％福尔马林，其预处理的温度为室温37℃；福尔马林预处理时间为5-30min，优选地预处理时间为10min。
福尔马林预处理的样品的洗涤方法为用冰冷洗涤缓冲液洗涤1-5次，优选地，洗涤次数为1-2次；然后将样品移入冰冷的洗涤缓冲液中，离心，弃上清，优选地在4℃以1000g离心5min，其中离心仅为了沉淀组织细胞。
其中，所述裂解样品的方法为：用裂解缓冲液重悬已洗涤的福尔马林预处理的样品，并孵育；优选地，用冰冷的裂解液重悬已洗涤福尔马林预处理的样品；优选地，在冰上孵育待裂解的样品。
其中，所述染色质DNA超声片段化的方法为：经超声随机剪切，裂解的样品形成一定大小染色质小片段，经离心，收集上清，即为用于免疫沉淀的染色质片段化样品。
其中，所述免疫沉淀样品中组蛋白乙酰化的染色质的方法为：用稀释缓冲液稀染色质片段化样品后，加入预处理的蛋白A珠子，进行免疫预清洗；离心留取上清，留存部分上清作为“样品投入控制(Input)”，优选地，留存0.5-10％的上清作为Input，更优选地，留存1％的上清作为Input；均分剩余上清，分别加入乙酰化组蛋白抗体和对照IgG并孵育；加入预处理的蛋白A珠子，孵育，离心，弃上清留取沉淀，该沉淀为染色质与抗体免疫复合物沉淀(免疫沉淀复合物)。优选地，所述乙酰化组蛋白抗体为抗H3K9Ac的单抗，对照IgG是与乙酰化组蛋白抗体同类的非特异性抗体。
优选地，所述免疫预清洗的时间30min-2h，更优选地，免疫预清洗的时间40min。
优选地，抗体与上清孵育温度为4℃，孵育时间为2小时至过夜，所述过夜指6-12小时，更优选地，孵育时间为2小时。
优选地，加入预处理的蛋白A珠子，孵育时间为30min-2h，更优选地，孵育时间为1h。
预处理的蛋白A珠子是指并经过鲑鱼精DNA和白蛋白的预处理封闭。
所述洗涤免疫沉淀复合物沉淀的方法为：用洗涤缓冲液洗涤结合有免疫沉淀复合物。优选地，所述免疫沉淀复合物洗涤缓冲液包括TSEⅠ、TSEⅡ、bufferⅢ和TE缓冲液，具体地，依次用TSEⅠ、TSEⅡ、bufferⅢ和TE洗涤免疫沉淀复合物，优选地，洗涤次数为1-3次。
所述提取染色质DNA可用市售DNA提取试剂(核酸提取试剂)或试剂盒进行，优选为QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN公司)提纯试剂盒。
所述PCR扩增提取的DNA的方法为半定量PCR或定量PCR扩增提取的DNA，可采用市售的半定量PCR反应试剂或试剂盒或定量PCR反应试剂或试剂盒。
所述结果计算方法为：数据结果通过2-△△Ct方法判断。
试验或对照样品沉淀的标准化(normalization)：
首先计算每个样品中乙酰化抗体(Ab)或对照IgG(IgG)相对样品投入控制(Input)的量：
ΔCt"标准化样品沉淀"＝Ct[样品沉淀]-(Ct[样品投入控制]-Log2 (投入稀释因子))
其中Ct[样品沉淀]为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀或IgG样品的沉淀。当Ct[样品沉淀]为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀时，ΔCt"标准化样品沉淀"为加入抗乙酰化抗体的标准化样品沉淀；当Ct[样品沉淀]为加入IgG的样品沉淀时，ΔCt"标准化样品沉淀"为加入IgG的标准化样品沉淀。
当样品投入控制为投入免疫共沉淀样品的1％时，投入稀释因子＝6.6。
计算样品的沉淀＝2(-ΔCt"标准化样品沉淀")×100％。
ΔCt"标准化样品沉淀"为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀或IgG样品的标准化样品沉淀。
每一个样品同时用抗乙酰化的抗体和IgG处理样品，IgG作为非特异性结合的对照，在计算样品的有效沉淀时需用该样品乙酰化抗体的沉淀减去对照IgG的非特异沉淀：
样品有效沉淀(％of Input)
＝2(-ΔCt"标准化样品沉淀"(Ab))×100％-2(-ΔCt"标准化样品沉淀"(IgG))×100％。
或
样品有效沉淀(fold change)＝2(-ΔCt样品有效沉淀)
实验组与对照组样品中阳性对照或目的基因的有效沉淀富集倍数为：
阳性对照或目的基因的富集＝实验组样品有效沉淀/对照组样品有效沉淀。
所述对照组样品为施用药物前或正常人或动物来源的样品。所述结果判定方法：
乙酰化抗体(Ab)的样品沉淀≥0.1％，或/和其有效沉淀>0.01％，视为阳性沉淀富集。
乙酰化抗体(Ab)的样品沉淀中<0.1％，或/和其有效沉淀≤0，视为无沉淀富集。
在所述方法中，待测样本可为非小细胞肺癌(如肺鳞癌)细胞和/或组织，包括但不限于血液等。
第九方面，本发明要求保护能够增强MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质在如下任一中的应用：
C1、制备用于逆转MUC22基因在非小细胞肺癌中肺鳞癌细胞中的表达沉默的产品；
C2、逆转MUC22基因在非小细胞肺癌中肺鳞癌细胞中的表达沉默。
进一步地，所述能够增强MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质可为组蛋白去乙酰化酶抑制剂或者组蛋白乙酰化酶促进剂。
在本发明的具体实施方式中，所述能够增强MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质具体为组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(Trichostatin A，TSA)。
本发明开发的检测引物对及试剂盒具有敏感性强、特异性高的特点；基于检测组蛋白乙酰化修饰表观调控相关的MUC22基因启动子区特定序列的试剂盒可特异定量检测MUC22基因特定DNA序列，据此评估表观调控MUC22基因活性与表达的组蛋白乙酰化水平，同时可特异定量检测MUC22基因转录表达变化以评估表观调控MUC22基因表达的效果。检测结果可以为肿瘤患者治疗的方案制定提供依据，也为肿瘤患者对药物治疗的预后提供了评价方法。
本发明通过研究了非小细胞肺癌中MUC的表达和表观遗传调控，发现MUC22在肺鳞癌的细胞和组织中表达下降，受表观调控，且非小细胞肺癌中MUC22的不同表达水平与患者预后效果相关。
附图说明
图1为肺鳞癌细胞中MUC22基因启动子区域相关的组蛋白乙酰化特异性富集分析。A为MUC22基因结构示意图，其中标记ChIP引物的扩增区域及验证MUC22基因mRNA表达RT-qPCR的扩增区域。这些数字表示相对于转录起始位点(TSS)的位置(MUC22基因序列源自NCBI Reference Sequence:NC_000006.12)。B为肺鳞癌细胞SK-MS-1经5μΜ表观调节剂Trichostatin A(TSA)作用24h，Western blotting分析细胞裂解物中组蛋白H3上第9位赖氨酸乙酰化1(Histone H3 lysine 9acetylation,H3K9ac)和组蛋白去乙酰化酶1(Histonedeacetylase 1，HDAC1)的蛋白表达水平作为质控药物产生的总体效果，即TSA通过抑制HDAC1增加组蛋白乙酰化。C为ChIP-qPCR分析组蛋白乙酰化在MUC22启动子区域特异性富集。肺鳞癌细胞SK-MS-1经5μΜ表观调节剂TrichostatinA(TSA)作用24h，用H3K9ac抗体或对照IgG抗体沉淀染色质。qPCR分析沉淀DNA片段，提示H3K9ac在MUC22启动子区域的特异富集。结果以输入数量的百分比表示(％of INPUT)。D为肺鳞癌细胞(NCl-H2170、SK-MES-1、NCI-H226)经5μΜ表观调节剂Trichostatin A(TSA)作用24h，RT-qPCR分析MUC22 mRNA的表达。*P<0.05,**P<0.01,与未经药物处理细胞相比(未配对t检验)。各图中Control为未经TSA处理的对照细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、MUC22基因启动子ChIP引物的设计
从NCBI呈现的MUC22基因序列中选取特定的MUC22基因序列，具体地，选取TSS位点上下游1000bp的DNA区域(SEQ ID No.7)，分别人工设计上游、中间与下游引物对。其针对的靶序列覆盖MUC22基因转录起始位点-366bp～+855bp(SEQ ID No.8)。见图1中A。
引物具体序列如下：
引物对1覆盖位于MUC22基因转录起始位点-105bp～+18bp的DNA序列(SEQ IDNo.9)；
所述ChIP引物如下：
上游引物：5'-CCTGTAATTTCAGCACTTTGGGAGG-3'(SEQ ID No.1)，
下游引物：5'-ACGCCAGCTAGTTTTTGTATTTTTAGT-3'(SEQ ID No.2)。
引物对2覆盖位于MUC22基因转录起始位点-366bp～-117bp的DNA序列(SEQ IDNo.10)；
所述ChIP引物如下：
上游引物：5'-GAGGCCATACGGCATGTCAG-3'(SEQ ID No.3)，
下游引物：5'-TCGCTTGGCCCACTTACCTA-3'(SEQ ID No.4)。
引物对3覆盖位于MUC22基因转录起始位点+778bp～+855bp的DNA序列(SEQ IDNo.11)；
所述ChIP引物如下：
上游引物：5'-TGATATATGGAGAGAGACCAGTAGA-3'(SEQ ID No.5)，
下游引物：5'-TGGTTCCTCCTGCTCTACGA-3'(SEQ ID No.6)。
所有引物由华大公司(北京)合成。
实施例2、肺鳞癌细胞系中MUC22基因启动子区域相关的组蛋白乙酰化特异性富集分析
一、Western blotting分析
1、制备样品
将供试的肺鳞癌细胞接种于直径10cm培养皿中，待细胞长到60-80％左右，加入TSA(5μM，在体系中的终浓度)处理24h，阴性对照组中加入生理盐水每组收集3-5个培养皿。
2、收集并洗涤样品
用室温预热的PBS洗涤细胞1-2次，然后用1％福尔马林37℃处理10min。用冰冷PBS清洗细胞2次，然后用细胞刮棒移入1ml冰冷的PBS中，4℃离心3,000rpm，2min，弃上清。用400μl的裂解缓冲液重悬细胞沉淀，冰上孵育10min。
3、Western blotting
将样品定量后，取30μg/孔计算加样量，将样品加入5×SDS凝胶加样缓冲液(中国Genstar公司，货号：E153-05)，100℃加热10min，顺序加样，电压120V进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后放入湿式电转仪中进行转膜，转膜结束后，将PVDF膜(美国Millipore公司，货号：IPVH00010)取出。5％脱脂牛奶封闭1h后，孵育一抗：H3K9ac抗体(英国abcam公司，货号：ab32129)和HDAC1抗体(英国abcam公司，货号：ab19845)，4℃过夜。加入抗兔的辣根过氧化物酶(英国abcam公司，货号：ab6721)标记的二抗孵育1h，加入ECL化学发光试剂盒(美国Themo Fisher公司，货号：32132)进行显色反应，用Smart Gel Image Analysis System进行显影。
4、结果分析
结果如图1中B，肺鳞癌细胞SK-MS-1经5μΜ表观调节剂TSA作用24h，Westernblotting分析细胞裂解物中组蛋白H3上第9位赖氨酸乙酰化1(Histone H3lysine9acetylation,H3K9ac)和组蛋白去乙酰化酶1(Histone deacetylase 1，HDAC1)的蛋白表达水平作为质控药物产生的总体效果，即TSA通过抑制HDAC1增加组蛋白乙酰化。
二、ChIP-qPCR分析
供试肺鳞癌细胞：SK-MES-1。
上述细胞均从国家生物医学实验细胞资源库购买获得，于申请者单位实验室正常条件培养传代。
1、制备样品
将供试的肺鳞癌细胞接种于直径10cm培养皿中，待细胞长到60-80％左右，加入TSA(5μM，在体系中的终浓度)处理24h，阴性对照组中加入生理盐水每组收集3-5个培养皿。
2、收集并洗涤样品
用室温预热的PBS洗涤细胞1-2次，然后用1％福尔马林37℃处理10min。用冰冷PBS清洗细胞2次，然后用细胞刮棒移入1ml冰冷的PBS中，4℃离心3,000rpm，2min，弃上清。用400μl的裂解缓冲液重悬细胞沉淀，冰上孵育10min。
3、染色质DNA超声片段化，超声处理16次，每次2s，4℃，14,000g离心15min，收集上清。
4、免疫共沉淀：
参照QIAGEN EpiTech ChIPOneDay kit protocol(德国，QIAGEN，货号334471)说明书进行操作。取100μl样品，加入900μl IP Buffer A，50μl Protein A Beads，4℃，360°垂直旋转50min。4℃，5000rpm离心1min，冰上放置1min。将上清移入新的离心管内，并吸取10μl作为Input。孵育一抗：阴性对照组，加入4μg Control IgG；阳性对照组，加入4μganti-RNA Polymerase II抗体；实验组，分别加入4μg anti-H3K9ac抗体。4℃，360°垂直旋转过夜。加入60μl Protein A Beads，4℃，360°垂直旋转1h。4℃，5000rpm离心1min，冰上放置1min，弃上清。依次加入1ml IP Wash Buffer I、IP Wash Buffer II、IP Wash BufferIII和IP Wash Buffer IV。加入每个Buffer溶液后将样品4℃，360°垂直旋转4min。4℃，5000rpm离心1min，冰上放置1min，弃上清后加入下一个Buffer溶液。加入30μl ElutionBuffer和2μl ChIP-Grade Proteinase K，45℃水浴30min。加入100μl DNA ExtractionBeads，涡旋震荡10s，95℃水浴10min。12000rpm离心1min，将上清转移到新的离心管内。
5、核酸提取
将洗脱液置于65℃水浴中6h，以使免疫复合物中蛋白和DNA分离。参照QIAquickPCR Purification Kit(德国，QIAGEN，货号28004)说明书进行核酸提纯。产物放置于20℃保存。核酸产物进行下一步的半定量和实时定量PCR，步骤见下。
6、PCR扩增：
目的基因：MUC22的启动子结合区引物对
用实施例1制备的MUC22基因启动子区特异性引物进行定量PCR扩增(下述结果是引物对1对应的结果)。
试剂：2×SYBR-Green：美国thermo fisher公司，货号4334973
扩增仪器：AB7500 Fast
扩增条件：95℃，10min；95℃15s，60℃，1min(40循环)。
数据结果通过2-△△Ct方法进行计算。
试验或对照样品沉淀的标准化(normalization)：
首先计算每个样品中乙酰化抗体(Ab)或对照IgG(IgG)相对样品投入控制(Input)的量：
ΔCt"标准化样品沉淀"＝Ct[样品沉淀]-(Ct[样品投入控制]-Log2 (投入稀释因子))
其中，Ct[样品沉淀]为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀或IgG样品的沉淀。当Ct[样品沉淀]为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀时，ΔCt"标准化样品沉淀"为加入抗乙酰化抗体的标准化样品沉淀；当Ct[样品沉淀]为加入IgG的样品沉淀时，ΔCt"标准化样品沉淀"为加入IgG的标准化样品沉淀。
当样品投入控制为投入免疫共沉淀样品的1％时，投入稀释因子＝6.6。
计算样品的沉淀＝2(-ΔCt"标准化样品沉淀")×100％。
ΔCt"标准化样品沉淀"为加入抗乙酰化抗体的样品沉淀或IgG样品的标准化样品沉淀。
每一个样品同时用抗乙酰化的抗体和IgG处理样品，IgG作为非特异性结合的对照，在计算样品的有效沉淀时需用该样品乙酰化抗体的沉淀减去对照IgG的非特异沉淀：
样品有效沉淀(％of Input)＝2(-ΔCt"标准化样品沉淀"(Ab))×100％-2(-ΔCt"标准化样品沉淀"(IgG))×100％。
7、结果判定
定量PCR结果见图1中C。ChIP-qPCR分析组蛋白乙酰化在MUC22启动子区域特异性富集。肺鳞癌细胞SK-MS-1经5μΜ表观调节剂Trichostatin A(TSA)作用24h，用H3K9ac抗体或对照IgG抗体沉淀染色质。qPCR分析沉淀DNA片段，提示H3K9ac在MUC22启动子区域的特异富集。结果以输入数量的百分比表示(％of INPUT)。
采用实施例1中的“引物对2和3”能够取得基本一致的技术效果。
实施例3、TSA可逆转MUC22在非小细胞肺癌细胞中的表达沉默
一、实验方法
供试肺鳞癌细胞：NCl-H2170、SK-MES-1和NCI-H226。
上述细胞均从国家生物医学实验细胞资源库购买获得，于申请者单位实验室正常条件培养传代。
1、细胞RNA提取及逆转录流程
(1)组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A(TSA，[R-(E,E)]-7-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧代-2,4-庚二烯酰胺，美国Sigma-Aldrich公司，货号：T1952)加药：当细胞生长密度达到70％时，加入5μM(终浓度)TSA处理，作用24小时。
(2)选择生长状态良好的细胞，按1mL/106个细胞加入Trizol试剂(美国Invitrogen公司，货号：15596026)。室温放置10min，充分裂解后氯仿抽提，每1mL Trizol加入0.2ml氯仿。
(3)剧烈震荡15s，室温放置5min，12000g，4℃离心15min。
(4)将分层后的上层无色液体转移至新的离心管中，使用预冷的异丙醇进行沉淀，每1mL Trizol加入0.5mL异丙醇，冰上放置20min。12000g，4℃离心10min，弃上清。
(5)用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，1mL Trizol加入1ml 75％乙醇，7500g，4℃离心5min，弃上清。干燥后加入适量的DEPC-H2O溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳确认，NanoDrop测定RNA浓度，-80℃保存。
(6)取1.0μg RNA逆转录为cDNA，使用北京全式金生物技术公司生产的TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(货号：AH301-02)：将1μL Anchored Oligo(dT)20、10μL 2×TS Reaction Mix和1μL RT/RI Enzyme Mix，加入DEPC-H2O至20μL。反应条件，42℃ 30min，85℃ 5min，逆转录得到的cDNA于-20℃放置。
2、qPCR
(1)qPCR引物序列：
RT-qPCR引物序列覆盖MUC22基因+19739～+19877bp(位于MUC22基因读码框内部)扩增产物239bp。
上游引物：5'-TGGCCTCTACTTCGGCCTTA-3'，
下游引物：5'-GGTGGAGGCCACGATAGTTT-3'。
(2)用于qPCR扩增的反应体系
如表1所示。
表1、qPCR扩增的反应体系
Figure BDA0002876163330000131
注：2×SYBR-Green：美国thermo fisher公司，货号4334973
(3)PCR反应条件如下：
50℃2min，95℃10min，95℃15s；60℃1min；40个循环，收集荧光；95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s，制作溶解曲线。实验结果采用2-ΔΔCt法分析数据，溶解曲线保证产物的特异性。
二、结果与分析
结果显示：使用表观药物TSA可逆转MUC22在肺鳞癌细胞NCI-H2170、SK-MES-1和NCI-H226中的表达沉默，表明MUC22在肺鳞癌组织细胞中表达沉默受表观调控，如图1中D所示。
由于使用表观药物HDAC抑制剂已应用于临床肿瘤治疗，因此MUC22基因甲基化可成为潜在分子靶标。
申请人首次通过ChIP-qPCR验证肺癌细胞中MUC22基因组DNA相关组蛋白修饰呈现较低的乙酰化水平，并通过TSA的作用而逆转恢复。从而在肺癌细胞模型中，证实TSA通过干扰HDAC抑制剂可以恢复抑癌基因MUC22的表达。同时本发明的试剂盒能够特异、准确地检测MUC22的乙酰化水平。
染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前研究体内蛋白质与DNA相互作用的唯一方法，在基因表达调控研究中起着无可替代的作用。真核生物的基因组DNA与组蛋白等相互作用构成染色质，是遗传物质的载体和存在形式。研究染色质中蛋白质与DNA相互作用是阐明基因表达调控机制的基本途径。
由于HDAC抑制剂已广泛应用于临床治疗肿瘤等疾病，MUC22基因组DNA组表观遗传学状态，尤其是组蛋白乙酰化，可作为新的表观调控标志物及靶点应用于肿瘤化疗敏感性治疗方案有效性的预测与检测。本发明的方法能够用于肿瘤化疗敏感性治疗方案有效性的预测与检测。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院；北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> MUC22基因启动子区相关的组蛋白修饰分析引物对及检测试剂盒
<130> GNCLN203439
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
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<210> 2
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<400> 5
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<212> DNA
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ggtgtcaaat aaagcctttt agtgaaggga tacctcaaaa accacctcta atttagggat 60
catataccca gagtaggact tcctgttttc tcctgcctca tataaattcc tgtgaagggc 120
tacgtggagt gtaaggaact ggtaattttg gcatgtgtta aggtgttatt tacgcagata 180
cactgtagaa tgaagtaaca ggagtaataa aaacttcttt ttttcctttc tttttttttt 240
aacaatctct tctcttccat ccactcttta aaaatgcatc cctcttgagg gagtatctca 300
tgagattgga gcaagagcag aatcagcaga aagaatagag gaggcagtgg cttatttaac 360
caaggagaaa aatcccatgg cagccaaccc accttatctg tctgtctgcc tattttagaa 420
tattcaagat ttgtcaacaa cttgctggga caaagcaatg tgctatgaag cacacttccc 480
tgaattgtac accattttct gtaaggggaa agagcttcct gttcactagt ttcttggttt 540
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ttaatgttac accttaagat aaaagacact tagagaggcc atacggcatg tcagctaaga 660
gcacagattg tggagctcga atttctggtt tcaaatccaa tttcattgtg actttccaca 720
aattccttaa ttcttctggg tctcagtttc catatttgta aacatgagag tgaaaatagt 780
acccacttca tggggttatt gtgaaggctt agaatagtcc tgcatttcgt aagcgctctg 840
taagttgtgt tatttttaaa atgttaggta agtgggccaa gcgaggtggc tcatgcctgt 900
aatttcagca ctttgggagg cggaggcggg tggatcacct gaggtcaggc ttttgagact 960
agcctgacca acatggtgaa accccatctc tactaaaaat acaaaaacta gctggcgtgg 1020
tggcaggcac ctgtagtccc agctacgtgg gaagctgagg caagagaata gcttgaacct 1080
gggaagtgga ggttgcagtg agccgagatt gcaccactgc actccagcct ggtcgacaga 1140
gcgagactcc gtctcaaaaa aatgaaaaat aaaaaatgtt aggtaagtta atgattcata 1200
ttttcttgaa aatatggaaa gacgtatcat aagagaagca tttttgctta attcaccaaa 1260
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tatagcagta gaatatttat gttactggta tttaatatga tatatggaga gagaccagta 1800
gaataatatg gggaaagtaa aatggaacta taagttcgta gagcaggagg aaccatttaa 1860
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tgagcccaag agttcaacac 2000
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cgt 123
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<212> DNA
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gtagagcagg aggaacca 78

Claims (10)

1.用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的引物对或引物对组，其特征在于：所述引物对组由引物对A、引物对B和引物对C组成；所述引物对为所述引物对A、所述引物对B或所述引物对C；
所述引物对A由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；
所述引物对B由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；
所述引物对C由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成。
2.用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的试剂盒，含有权利要求1所引物对或引物对组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有如下中的全部或部分：染色质免疫共沉淀试剂、核酸提取试剂、PCR反应试剂、阳性对照引物对。
4.权利要求1所述的引物对或引物对组或权利要求2或3所述的试剂盒在如下任一中的应用：
A1、检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况；
A2、制备用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况的产品。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况为检测非小细胞肺癌细胞中MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况；
进一步地，所述非小细胞肺癌为肺鳞癌。
6.MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰作为分子标志物在如下任一中的应用：
B1、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断；
B2、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估；
B3、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析；
或
用于检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质在如下任一中的应用：
B1、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断；
B2、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估；
B3、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析；
或
MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰作为药物作用靶点在制备用于治疗和/或预防非小细胞肺癌的产品中的应用；
进一步地，所述非小细胞肺癌为肺鳞癌。
7.根据权利要求1-6中任一所述的引物对或引物对组或试剂盒或应用，其特征在于：所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
进一步地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
更进一步地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示；
和/或
用于检测所述MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质为权利要求1-3中任一所述的引物对或引物对组或试剂盒。
8.具有如下B1至B3中任一所示功能的分子标记物，其特征在于：所述分子标记物为MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰；
B1、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行分子诊断；
B2、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行靶向治疗监测和/或用药预后评估；
B3、制备用于对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析的产品，或对非小细胞肺癌中肺鳞癌进行肿瘤异质性分析；
进一步地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
更进一步地，所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
更加具体地，所述所述MUC22基因启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.9或SEQ IDNo.10或SEQ ID No.11所示。
9.一种检测MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰情况的方法，包括如下步骤：收集、预处理和洗涤样品；裂解样品；染色质DNA超声片段化；免疫沉淀裂解样品中组蛋白乙酰化的染色质，获得免疫复合物沉淀；洗涤所述免疫复合物沉淀；提取免疫复合物沉淀中的染色质DNA；利用权利要求1中所述引物对或引物对组PCR扩增提取的DNA；结果判定。
10.能够增强MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质在如下任一中的应用：
C1、制备用于逆转MUC22基因在非小细胞肺癌中肺鳞癌细胞中的表达沉默的产品；
C2、逆转MUC22基因在非小细胞肺癌中肺鳞癌细胞中的表达沉默；
进一步地，所述能够增强MUC22基因启动子区域相关组蛋白乙酰化修饰的物质为组蛋白去乙酰化酶抑制剂或者组蛋白乙酰化酶促进剂；
更进一步地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA。
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