CN109576364A

CN109576364A - 用于胃癌诊断、化疗和预后检测的分子标记物及试剂盒

Info

Publication number: CN109576364A
Application number: CN201811230979.6A
Authority: CN
Inventors: 黄家强; 张鹭鹭; 林舒晔; 王晓月; 田荣孟
Original assignee: Beijing Jiaotong University
Current assignee: Beijing Jiaotong University
Priority date: 2018-10-22
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2019-04-05

Abstract

本发明提供了一种用于胃癌早期诊断、化疗和预后检测的分子标记物及其在制备胃癌诊断、化疗与预后检测的制剂中的应用和试剂盒，属于分子诊断技术领域。该分子标记物为位于MZF1基因内的一段DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列至少包含一个甲基化位点的修饰，具有敏感性强、特异性高的特点。MZF1基因序列的DNA甲基化和与其相关组蛋白修饰可作为胃癌发展的早期诊断、化疗与预后检测的分子标志物和药物作用靶点。基于检测MZF1基因内DNA序列甲基化的试剂盒可以特异地检测MZF1基因相关的DNA甲基化水平，还能够对MZF1基因相关的DNA甲基化水平进行特异、定量检测，检测结果可以为胃癌患者病情及个体化用药监测、肿瘤早期诊断，也为患者对药物治疗的预后提供了评价方法。

Description

用于胃癌诊断、化疗和预后检测的分子标记物及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种用于胃癌早期诊断、化疗和预后检测的分子标记物及其在制备胃癌诊断、化疗与预后检测的制剂中的应用和试剂盒。

背景技术

胃癌(Gastric cancer,GC)是我国最常见的高发性肿瘤之一，其致死率在世界及我国居各类恶性肿瘤的前列。由于缺乏早期发现的有效检测手段，在就诊患者中，多数处于中晚期，已失去手术机会或要借助新辅助化疗后再实施手术治疗。对于中晚期的患者的临床治疗多以化疗为主，这样的治疗方式虽然能在一定程度上可抑制肿瘤的恶化，但化疗的毒性作用导致的不良反应和痛苦，以及后期病人对化疗药的耐受，带来了一系列的生物学和临床问题。因此，研究肿瘤化疗耐药的分子通路机制，从而鉴别能够抑制肿瘤细胞增殖、提高化疗敏感性的分子靶标，为肿瘤的精准诊断与个体化治疗提供新的思路，具有重要的临床意义和科学价值。

胃癌的发生发展是一个多因素和多基因变异的累积过程，其中遗传变异和表观遗传学紊乱所导致的癌基因的扩增或突变和肿瘤抑制基因的沉默与功能丧失，在胃癌发生和进展中起重要作用(Cancer Genome Atlas Research N:Comprehensie molecularcharacterization of gastric adenocarcinoma.Nature 513:202-209,2014.)。表观遗传通过DNA甲基化及组蛋白等的修饰改变调控细胞组织特异性基因表达，参与机体的发育分化、功能代谢诸多生命活动。与基因突变不同，表观遗传学改变导致的渐进性表型变化(亚健康-疾病早期-疾病)在一定条件下可以逆转，这一特性为一些疾病尤其是肿瘤的预防治疗开辟了新的途径，如抑癌基因启动子区CpG岛异常高甲基化及组蛋白修饰异常所致基因表达与功能的异常改变，不仅作为表观遗传标志物与靶点应用于肿瘤的分子诊断、治疗及预后评估等，而且被认为是引发疾病以及化疗耐药形成的主要因素之一(Oh JH,Jung SH,Hong SJ,and Rhyu MG:DNA Methylation as Surrogate Marker For Gastric Cancer.JCancer Prev 20:172-178,2015.)。

近年来，大量文献提及锌指蛋白家族成员-髓样锌指蛋白1(myeloid zinc finger1，MZF1)在众多恶性肿瘤的发生、发展及远处转移等方面发挥作用。金属硫蛋白2A(MT2A)和NF-κB参与胃癌的致癌作用和化学敏感性。然而，MT2A在肿瘤发生和化学抗性中的NF-κB活化机制因肿瘤细胞类型的不同而不同，并且在胃癌中仍然不清楚其机制。我们最近发现人胃癌中MT2A和 NFκB抑制剂α(NFKBIA，也称为IκB-α)的表达降低与患者预后不良有关。我们还通过二烯丙基三硫化物(DATS)提供了胃癌中MT2A表观遗传上调的第一个证据，DATS是一种大蒜衍生化合物能够抑制胃癌进展的。研究表明，DATS能通过“MT2A-NF-κB”途径增加胃癌细胞对化疗药物多西紫杉醇 (DOC)的敏感能力，其中DATS诱导的MT2A可能通过直接抑制NF-κB活化，在胃癌中增强NFKBIA(IκB-α)转录。然而，MT2A是一种低分子量的重金属结合蛋白，不太可能通过直接结合其启动子来调节NFKBIA活性作为转录因子。因此，MT2A和NF-κB之间的精确联系仍有待阐明。

通过TRANSFAC数据库对结合NFKBIA启动子的推定转录因子的分析揭示了多个潜在的转录因子结合位点(TFBS)，其中位于NFKBIA启动子的-498/-493 区域呈现转录因子骨髓锌指1(MZF1)的典型结合基序。MZF1属于哺乳动物 Krüppel样转录因子家族，参与细胞增殖和分化。MZF1通过作为转录激活因子和阻遏物起作用，对调节恶性肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭至关重要。然而，很少有研究揭示MZF1对癌症发展的双重影响，因此需要阐明MZF1的生物功能及其在胃肿瘤发生中的调节作用。

因此，基于胃癌组织细胞中转录因子骨髓锌指基因1(MZF1)呈现由DNA 低甲基化协同组蛋白低乙酰化所致表观沉默，在MZF1中筛选基因内具有强敏感性、高特异性的胃癌诊断、化疗与预后检测的分子标志物，以及寻找有效的检测方法，对于胃癌的早诊早治具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于胃癌早期诊断、化疗和预后检测的分子标记物及其在制备胃癌诊断、化疗与预后检测的制剂中的应用和试剂盒，以解决上述背景技术中存在的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一方面，本发明的一种用于胃癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，该分子标记物具有敏感性强、特异性高的特点。

所述分子标记物为位于MZF1基因翻译起始位点即起始密码子ATG上游序列3000bp(-3000bp)至其下游序列1000bp(+1000bp)的DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且至少包含一个甲基化位点。

优选的，所述分子标记物为位于MZF1基因起始密码子ATG上游序列2049bp 至其上游序列1049bp的DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，且至少包含一个甲基化位点。

另一方面，本发明提供上述分子标记物在制备胃癌诊断、化疗与预后检测的试剂中的应用。所述药品包括检测所述分子标记物表达水平的制剂。

优选的，检测所述分子标记物表达水平的特异性扩增的引物包括甲基化引物和非甲基化引物；所述甲基化引物的上游序列如SEQ ID No.3所示，所述甲基化引物的下游序列如SEQ ID No.4所示；所述非甲基化引物上游序列如 SEQ ID No.5所示，所述非甲基化引物下游序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，检测所述分子标记物表达水平的特异性扩增的引物包括适合甲基化特异性qPCR检测MSP的甲基化引物和适合MSP的非甲基化引物；所述适合 MSP的甲基化引物的上游序列如SEQ ID No.7所示，所述适合MSP的甲基化引物的下游序列如SEQ ID No.8所示；所述适合MSP的非甲基化引物上游序列如SEQ ID No.9所示，所述适合MSP的非甲基化引物下游序列如SEQ ID No.10所示。

第三方面，本发明提供一种用于胃癌诊断、化疗与预后检测的试剂盒，包含检测一种分子标记物表达水平的制剂，所述分子标记物的序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述试剂盒还包括用于MSP的甲基化对照DNA模板和非甲基化对照DNA模板。

优选的，所述用于MSP的甲基化对照DNA模板为经硫化修饰后的甲基化 DNA，所述经硫化修饰后的甲基化DNA为经硫化修饰后在MZF1基因内区域呈现 90％以上甲基化的肿瘤细胞DNA；所述用于MSP的非甲基化对照DNA模板为正常组织细胞DNA，所述正常组织细胞DNA为MZF1基因内区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA。

通过使用DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化抑制剂可逆转MZF1在胃癌细胞中的表达沉默，表明MZF1基因在胃癌中表达沉默与其基因DNA高甲基化和与低组蛋白修饰相关。因此，MZF1基因序列的DNA甲基化和与其相关组蛋白修饰可作为胃癌发展的早期诊断、化疗与预后检测的分子标志物和药物作用靶点。

本发明有益效果：本发明用于胃癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，该分子标记物具有敏感性强、特异性高的特点；基于检测MZF1基因内DNA 序列甲基化的试剂盒可以特异地检测MZF1基因相关的DNA甲基化水平，还能够对MZF1基因相关的DNA甲基化水平进行特异、定量检测；检测结果可以为胃癌患者病情及个体化用药监测、肿瘤早期诊断，也为患者对药物治疗的预后检测提供了评价方法。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：表示使用表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-脱氧胞苷(5-Aza- 2’-deoxycytidine，5-Aza)分别或联合组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A (trichostatinA，TSA)处理人GC细胞后MZF1的表达变化示意图；GAPDH: RT-PCR的内控。

图2：MZF1基因结构示意图，显示甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性qPCR(qPCR)及硫化测序(BS)分析MZF1基因的区域位置，每条竖线代表一个CpG位点，数字代表着相距TSS的位置。TSS：转录起始位点。

图3：为通过qPCR分析GC细胞系中MZF1的基因内DNA甲基化状况，其中， U：非甲基化；M：甲基化。

图4：为18对配对肿瘤和癌旁样本MZF1用qPCR方法检测在肿瘤的甲基化和肿瘤的表达之间的相关性分析。*:p<0.05。

图5：为31例肿瘤样本MZF1用MSP方法检测在肿瘤的甲基化和肿瘤的表达之间的相关性分析。*:p<0.05。

图6为本发明实施例所述的在胃癌细胞系和原发性胃癌临床组织标本中，肿瘤的恶性分化程度与MZF1的DNA甲基化关系示意图。

其中，A：为琼脂凝胶电泳显示使用表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza- 2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza)分别或联合组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)处理人GC细胞后MZF1的表达变化。

B：为琼脂凝胶电泳显示MSP分析GC细胞系的结果。IVD：体外的甲基化 DNA作为MSP阳性控制；NL：正常血液淋巴细胞DNA作为MSP阴性控制，MSP:甲基特异性PCR。

C：为MSP方法检测人正常胃组织(Normal gastric tissue)(n＝6)和原发性胃癌(Gastric cancer tissue)(n＝6)组织标本中的MZF1基因内甲基化状态以验证qPCR引物。

D：为qPCR方法检测人正常胃组织(Normal gastric tissue)(n＝18) 和原发性胃癌(Gastric cancer tissue)(n＝18)组织标本中的MZF1基因内甲基化状态。

E：为31例肿瘤样本MZF1用MSP方法检测基因内甲基化状态。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的模块。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或模块，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、模块和/或它们的组。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语 (包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例做进一步的解释说明，且实施例并不构成对本发明实施例的限定。

本领域普通技术人员应当理解的是，附图只是一个实施例的示意图，附图中的部件或装置并不一定是实施本发明所必须的。

实施例

本发明实施例提供一种用于胃癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，该分子标记物在制备用于胃癌诊断、化疗与预后检测的药品中的应用及一种试剂盒。

本发明实施例中，提供一种用于胃癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，该分子标记物具有敏感性强、特异性高的特点。

本发明实施例中，MZF1基因DNA具有高甲基化。通过使用DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化抑制剂可逆转MZF1在胃癌细胞中的表达沉默，表明MZF1 基因在胃癌中表达沉默与其基因DNA高甲基化和与低组蛋白修饰相关。因此， MZF1基因序列的DNA甲基化和与其相关组蛋白修饰可作为胃癌发展的早期诊断、化疗与预后检测的分子标志物和药物作用靶点。

在本发明的具体实施例中，用于胃癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，为位于MZF1基因翻译起始位点即起始密码子ATG上游序列3000bp(- 3000bp)至其下游序列1000bp(+1000bp)的DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且至少包含一个甲基化位点。

在本发明的具体实施例中，所述分子标记物为位于MZF1基因起始密码子 ATG上游序列2049bp至其上游序列1049bp的DNA序列，该DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，且至少包含一个甲基化位点。

本发明实施例，还提供一种上述分子标记物在制备胃癌诊断、化疗与预后检测的试剂中的应用。

进一步，所述应用为所述分子标记物在制备胃癌诊断、化疗与预后检测的药物作用靶点或试剂盒中的应用。

本发明还提供了检测上述分子标记物的物质在制备胃癌诊断、化疗与预后检测的试剂中的应用。

优选的，所述物质为检测上述分子标记物的引物，以及包含上述引物的试剂或试剂盒。

本发明实施例进一步提供了一种用于胃癌诊断、化疗与预后检测的试剂盒，包括检测MZF1基因内的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示DNA序列的引物；优选的为检测MZF1基因内的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示DNA序列的引物。

所述引物包括甲基化引物和非甲基化引物；其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4 所示；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

利用上述甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果 MZF1基因存在甲基化，则会得到140bp大小的片段；如果MZF1基因未发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本发明将该引物称为甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的Tm 55.74，GC含量55.00％，下游引物的Tm 59.27， GC含量45％。

利用该非甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果 MZF1基因未发生甲基化，则会得到142bp大小的片段；如果MZF1基因发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本发明将该引物称为非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm 54.73，GC含量43.48％，下游引物的Tm 59.71，GC含量34.78％。

如果上述140bp和142bp大小的两个片段均呈现在PCR扩增产物中，则提示 MZF1基因发生部分甲基化。

进一步，所述试剂盒还包括用于qPCR的甲基化和非甲基化引物；其中所述qMSP甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

利用上述甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行qMSP扩增，如果 MZF1基因存在甲基化，则会得到128bp大小的片段；如果MZF1基因未发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本发明将该引物称为甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的Tm 56.53，GC含量35.71％，下游引物的Tm 55.77， GC含量56.00％。

利用该非甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行qPCR扩增，如果 MZF1基因未发生甲基化，则会得到128bp大小的片段；如果MZF1基因发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本发明将该引物称为非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm54.83，GC含量35.71％，下游引物的Tm 51.61，GC含量56.00％。

进一步，所述试剂盒还包括用于MSP的甲基化对照DNA模板和非甲基化对照DNA模板；

其中，所述用于MSP的甲基化对照DNA模板为经硫化修饰后的呈现90％以上高甲基化的DNA；优选的，为经硫化修饰后在MZF1基因内区域呈现90％以上高甲基化的肿瘤细胞DNA；所述用于MSP的非甲基化对照DNA模板为正常组织细胞 DNA；优选的，为MZF1基因内区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA。

试验1胃癌的早期诊断与预后检测的分子标志物的发现

经过筛选鉴定(具体方法详见试验2和试验3)，肿瘤细胞中MZF1基因内呈现显著高甲基化状态，如图3和图6(B)所示。使用表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza)或组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)可逆转MZF1在胃癌细胞中的表达沉默，而且二者联合用药具有增强效应，表明MZF1在胃癌组织细胞中表达沉默受表观调控，如图1所示，表示使用表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza)分别或联合组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)处理人GC细胞后MZF1 的表达变化；GAPDH:RT-PCR的内控；如图6(A)所示，琼脂凝胶电泳显示使用表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’- deoxycytidine，5-Aza)分别或联合组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)处理人GC细胞后MZF1的表达变化。因此，MZF1在胃癌中表达沉默与其基因DNA高甲基化和与低组蛋白修饰相关。

MSP和qPCR方法检测人正常胃组织(Normal gastric tissue)(n＝24) 和原发性胃癌(Gastric cancer tissue)(n＝24)组织标本中的MZF1基因内甲基化状态，如图4所示，为18对配对肿瘤和癌旁样本MZF1用qPCR方法检测在肿瘤的甲基化和肿瘤的表达之间的相关性分析结果示意图，其中，*:p< 0.05；图6(C)为MSP方法检测人正常胃组织(Normalgastric tissue) (n＝6)和原发性胃癌(Gastric cancer tissue)(n＝6)组织标本中的MZF1 基因内甲基化状态图，以验证qPCR引物；图6(D)所示，为qPCR方法检测人正常胃组织(Normal gastric tissue)(n＝18)和原发性胃癌(Gastric cancer tissue)(n＝18)组织标本中的MZF1基因内甲基化状态示意图。从图 4中可以看出MZF1基因内在人正常胃组织72％呈现非甲基化状态；而在原发性胃癌组织标本中则呈现甲基化状态高达89％，提示在原发性胃癌组织标本中 MZF1基因内的高甲基化。

以上结果提示MZF1基因内甲基化可作为胃癌早诊及预后的分子标志物。

试验2MZF1基因内DNA甲基化的专用引物的设计

从NCBI呈现的MZF1基因序列中选取富含CG的DNA区域，确定可能的CpG 岛；根据DNA甲基化修饰在基因内分布特性(Wang，Y.,et al.Sci Rep 2016,6:22051.)，通过人工比对分析，从GenBank选取特定的MZF1基因序列中富含CG的DNA区域，用软件Primer Express3.0设计多条引物对,筛选出以下甲基化引物和非甲基化引物，所有引物由华大公司(北京)合成。

所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-TTTAGGATGAGGCGGTTTTC -3'(如SEQ ID No.3所示)，下游引物核苷酸序列为：5'- CGCGCTATTCCTTCTACAACTAC-3'(如SEQ IDNo.4所示)；

所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'- TAGGATGAGGTGGTTTTTGAA-3'(如SEQ ID No.5所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-TAAAACTAACCTCCCTCCTCACAC-3'(如SEQID No.6所示)。

进一步，从GenBank选取特定的MZF1基因序列中富含CG的DNA区域，用软件PrimerExpress 3.0设计多条引物对,筛选出以下适合qPCR检测的甲基化引物和非甲基化引物，所有引物由华大公司(北京)合成。

所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-TTTATAGAAAAATTAAGAAATTAGTCGG-3'(如SEQ ID No.7所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-AAATACAATAACGAAATCATACGTC-3'(如SEQ ID No.8所示)；

所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-TTTATAGAAAAATTAAGAAATTAGTTGG-3'(如SEQ ID No.9所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-AAATACAATAACAAAATCATACATC-3'(如SEQ ID No.10所示)。

试验3检测MZF1基因内DNA甲基化修饰的试剂盒的组成

一种检测MZF1基因内DNA序列甲基化修饰的试剂盒，即用于胃癌诊断、化疗与预后检测的试剂盒，包含核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的甲基化引物，核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的非甲基化引物、核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQID No.8所示的适合qPCR检测的甲基化引物，核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的适合qPCR检测的非甲基化引物、用于MSP的甲基化对照DNA模板(经硫化修饰后在MZF1基因内区域呈现90％以上甲基化的DNA)、非甲基化对照DNA模板(MZF1基因内区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA)、作为阴性系统对照的去离子水、PCR反应试剂。

试验4细胞及组织中MZF1甲基化的检测

(1)胃细胞系DNA的提取流程如下：

1)将处于生长对数期、状态良好的上述胃癌细胞系和正常胃上皮细胞系，移除培养基，用冰冷的1×PBS轻柔清洗细胞两次。

2)加胰酶1mL，消化1min，再加入2mLDMEM完全培养基中和，轻柔吹打悬浮细胞，移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，收集细胞。

3)加入DNA提取液2mL，蛋白酶K(10mg/mL)100μL，吹打混匀后，置 50℃恒温水浴锅中3h。

4)取出，冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿，上下颠倒混匀，4200 rpm离心15min，小心转移上层液体至新的15mL离心管中。

5)加入1/10体积的7.5mol/L醋酸铵，2倍体积的无水乙醇，轻柔混匀， 10000rpm离心20min，弃上清。

6)加入70％乙醇500μL，洗涤沉淀两次，13000rpm离心5min，弃上清，风干。

7)加入pH8.0的TE溶液100μL溶解DNA，取其中1μLDNA溶液，用 NanoDrop2000c超微量核酸分析仪测DNA浓度，剩余样品储存于-20℃冰箱。

(2)胃组织DNA提取流程如下：

1)取液氮罐中冻存胃组织，切取200mg到1g，用预冷研钵研磨组织标本。

2)每100mg组织标本加入1mLDNA提取液，100μL10mg/mL的蛋白酶K，轻柔吹打混匀置于50℃恒温水浴锅中，消化过夜，在刚开始消化的1h内颠倒混匀数次。

3)之后步骤同胃细胞系DNA提取流程。

(3)阳性对照IVD(In Vitro Methylation DNA)样品的制备流程如下：

1)吸取50μg胃癌细胞系DNA至1.5mL EP管中，加双蒸水至150μL。

2)依次向1.5mL EP管中加入60μL双蒸水、25μL10×缓冲液、2.5μL 32mmol/LSAM、12.5μLSSS1甲基化酶，轻弹混匀，置于37℃，孵育4h。

3)依次加入5μL32mmol/LSAM、6μLSSS1甲基化酶，轻弹混匀，37℃，孵育4h。

4)向1.5mLEP管中加入260μL酚/氯仿(1:1)，上下颠倒混匀后，12000 rpm离心10min，小心转移上清至新的1.5mLEP管中。

5)加入350μL氯仿，12000rpm离心3min，小心地将上清转移到新的1.5 mLEP管中。

6)依次加入1μL糖原、35μL 7.5mol/L乙酸铵、3倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀。

7)置于-20℃冰箱，沉淀2h；13000rpm离心，20min，弃上清，

8)加入500μL70％乙醇，13000rpm离心5min，弃上清，风干后溶解于100 μL双蒸水中。

9)取1μL样品，用NannoDrop2000c测所得DNA浓度，剩余样品置于-20℃冰箱保存。

(4)细胞和组织DNA样品硫化过程如下：

1)取2μg基因组DNA于1.5mL离心管中，用双蒸水稀释至50μL。

2)加5.5μL2mol/LNaOH，混匀，置于37℃，孵育15min。

3)依次加30μL新鲜配制的10mmol/L氢醌，520μL新鲜配制的3mol/L亚硫酸氢钠，混匀，置于50℃水浴锅中孵育16h。

4)将1.5mLEP管从水浴锅中取出，放置试管架上，冷却至室温。

5)将纯化柱安装到真空泵上，编号，用2mL塑料吸管轻柔地将硫化后DNA 样品转移到纯化柱内。

6)用移液枪吸取1mLDNA Clean-Up Resin，加入到纯化柱中，轻柔吹打混匀，打开柱子下面的阀门，用真空泵抽吸液体，液体吸干后关闭阀门。

7)用2mL塑料吸管吸取2mL80％的异丙醇，加到纯化柱内，打开柱子下面的阀门，用真空泵抽吸液体，液体吸干后关闭阀门。

8)取下纯化柱，安装到新的1.5mL的离心管中，加入50μL预热至55℃的双蒸水，10000rpm离心1min。

9)加入5.5μL3mol/L氢氧化钠，混匀，静置5min。

10)依次加入1μL糖原，17μL7.5mol/L醋酸铵，3倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃沉淀2h。

11)低温离心，4℃，13000rpm，30min，弃上清。

12)加入500μL70％乙醇，清洗一遍，4℃，13000rpm离心5min，弃上清，风干。

13)加入20μL双蒸水溶解，-80℃保存。

(5)甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)

1)MSP甲基化引物序列：

上游引物5'-TTTAGGATGAGGCGGTTTTC-3'(如SEQ ID No.3所示)

下游引物5'-CGCGCTATTCCTTCTACAACTAC-3'(如SEQ ID No.4所示)

MSP非甲基化引物序列：

上游引物5'-TAGGATGAGGTGGTTTTTGAA-3'(如SEQ ID No.5所示)

下游引物5'-TAAAACTAACCTCCCTCCTCACAC-3'(如SEQ ID No.6所示)。

2)用于PCR扩增的反应体系如表1所示：

表1

每一组PCR反应包括一个阳性对照，体外用Sss I甲基转移酶处理胃癌细胞DNA样品作为PCR模板，一个阴性对照，用正常人外周淋巴细胞DNA作为PCR模板。

3)PCR反应条件如下：

95℃,5min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；35cycles；72℃， 7min；4℃。

4)凝胶电泳：MSP产物在2％的琼脂糖胶上电泳。

(6)甲基化特异性q-PCR(qMSP)

1)qPCR甲基化引物序列：

上游引物5'-TTTATAGAAAAATTAAGAAATTAGTCGG-3'(如SEQ ID No.7所示)

下游引物5'-AAATACAATAACGAAATCATACGTC-3'(如SEQ ID No.8所示)

qPCR非甲基化引物序列：

上游引物5'-TTTATAGAAAAATTAAGAAATTAGTTGG-3'(如SEQ ID No.9所示)

下游引物5'-AAATACAATAACAAAATCATACATC-3'(如SEQ ID No.10所示)。

2)qPCR扩增的反应体系如表2所示：

表2

3)反应条件为：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min； 40个循环，收集荧光；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；60℃，15s；制作溶解曲线。实验结果采用标准曲线法分析数据，溶解曲线保证产物的特异性。

(7)结果判定

图6以硫化修饰后的DNA作为甲基化对照，人外周血淋巴细胞DNA作为非甲基化对照，去离子水作为阴性系统对照建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对胃癌细胞系和组织标本进行MSP检测。

IVD标记为甲基化对照，NL标记非甲基化对照，H₂O为阴性系统对照。

结果判读方法如下：

用甲基化引物(图6中以M表示)进行扩增，有扩增产物，而用非甲基化引物(图中6以U表示)进行扩增，无扩增产物的标本，判读为完全甲基化；

用甲基化引物及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物的标本，判读为部分甲基化；

用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，用甲基化引物进行扩增，无扩增产物的标本，判读为非甲基化。

部分甲基化及完全甲基化的标本均判读为甲基化。

扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图所示：图6(B)中，四株胃癌细胞系中，SGC7901、BGC823和AGS为甲基化状态；MGC803呈现部分甲基化状态；永生化胃上皮细胞系GES1则呈现部分甲基化状态；图6(C)中，正常组织为未甲基化状态或部分甲基化状态；图6(C)、(E)中，胃癌组织中除三例为未甲基化状态，其余均为甲基化或部分甲基化状态。

扩增产物qPCR结果如图所示：图4中，BGC823为甲基化状态；GES-1呈现非甲基化状态；其余细胞系则呈现部分甲基化状态；图6(D)中，胃癌组织均为甲基化或部分甲基化状态。

综上所述，本发明实施例通过我们在人胃癌细胞系和原发性肿瘤中发现 MZF1与MT2A相关的表观遗传沉默。MZF1通过与MT2A相互作用直接靶向NFκBα的启动子区域来抑制胃癌的发生。MZF1和MT2A的下调与胃癌的恶性潜能和患者的不良存活相关。因此，我们的结果描绘了由DATS引发的MT2A/MZF1-NF- κB信号级联反应的机制基础，以抑制肿瘤生长并增加人胃癌的化学敏感性。本发明实施例中，用于胃癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，该分子标记物具有敏感性强、特异性高的特点；基于检测MZF1基因内DNA序列甲基化的试剂盒可以特异地检测MZF1基因相关的DNA甲基化水平，还能够对MZF1基因相关的DNA甲基化水平进行特异、定量检测；检测结果可以为胃癌患者病情及个体化用药监测、肿瘤早期诊断，也为患者对药物治疗的预后检测提供了评价方法。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 北京交通大学

<120> 用于胃癌诊断、化疗和预后检测的分子标记物及试剂盒

<130> 2018

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4000

<212> DNA

<213> 人(person)

<400> 1

ataaaagcac aaagttggat acaaaactgc ttagtgagct acaaagcgat acactggaca 60

gaaagcattt gcaacctatc aacctgtaca gggtagcata taactggaca gcatctggac 120

tcctaagttt tcctaacagt tttacctcgg attctccctg tctctcttcg tgctgtcatc 180

tttctctagg tcttcgaaaa ctgtcaatcc atcttactgt atctctaatt tctgtccctt 240

ttctcccttc ttgtttctgt ccctctccct tcttgtctac ctcttgagtc tggatatctg 300

catttcttgt ctctgtgaac ccattctgcg tttccttctt tgtgtctctt tcatctgcat 360

ccctttctga tctgcctctc tcttgctaac tgttctgaca cctgtttgcc cggccctgac 420

cctctgatcc actcagccct cttataactt ggacccgtgt ctctatgttt gttcacttat 480

tttcactgtc tctcctcgcg tcgagtctcc ggtcctccca gtctgtgagt ctgtctctct 540

gtctctctct ctcttcctcc cgccggtcct tcgtctctct ttgcccttga gtctctggtc 600

tctctccgtc tctcctcgct gtttctatcg atcggcatct ctctgcccca gtacccttcc 660

ccacctcttc atcccacatg ccccattgca ttttcaacgc ccgccgcgtc tccgggttac 720

ccaggcgatg tcgagtcgtg tccccaggtt accatggaga cgttcagggc ccgcccctcg 780

cccatgatca cagaggaacg tcatcgcgcc gcgcgcgcac gtacacacga agggcctgct 840

gactacatct gccggaaagc atcgggccaa gcctttctcc attttgcggt ctaggaagta 900

gcagaggccc cttcctgtag ggagttgcca tggagacgcg gtggggcacc gacggagttc 960

taatgacggc cgtgattggt gcaggatcct gctaatctca ggaaggcccg tagagaagtg 1020

aggaaaacgt ggtggggggc atgcgcgatc tggtaggcgg tgctgccgtc tgttgtacct 1080

gagaggcttg cgcatgccga cgcacggatt cgaggcgggg agcatgggaa gaagcggcca 1140

ggagtatgac ctgatcattg cgaccaccgc taggggaagg gaggagaggg tgtagaaacg 1200

gggacgaggg tgggggaagg gcaaggaggc gctcgagctg gtgcgcggag catcctggga 1260

gacgtagtcc agcgggaggg ggaagtcgaa gactgcgcgt gctcaggagc gcggagcggc 1320

ccgctgagcg cagaggtgag ggcggggtcc tcttaaccgg gagggctatc gtgtggacgg 1380

gggcggtggc tgcagactcg gggattccgg ctccccagtg agaccggaag cgcggggaac 1440

gaatccgggc agtccttgcg ggagcgccca gggctagagc gagaggcttg tcaatcacta 1500

ctcgttgcca cgacgacagg ctttgggagc cccgcccccg gttgcctagg cgtcgtctgg 1560

acctaccttg gcaccctgga gcggaagttg ccgcctggac ttctgggaag tgtatttcgg 1620

gaccctccgt aggtacctgc catcttggct atgacccaag tctctcccag ggtttcaggt 1680

tgacttggca ccttgaagag tggaggcttg gcccccagga tgaggcggcc ctcgaaatcg 1740

atgccaccca cgggggaatg attctgcggt gccatcccct tcataaacgc agattccttc 1800

ctaaagccgc agctgcagaa ggaacagcgc gaggagggag gtcagcccca cttgcaaatg 1860

gggaaacaag ttctcgaagg cacagtgatc tgaagatggg cggaatcaga gtctcgggac 1920

ttccttgcag gctcctgttc cggcagtctt ggagcctttg ccgccccccc acccattgcg 1980

aagctccccc atccccttcc aaccccagct aaatcaggaa gctgagatgg ggcattgcgt 2040

agtgtgatgt tgggcttaga agatggggct gagtagggag agagggtgct gcctgggagc 2100

tgagccatac aagtgactgc acaggttgac atggaggatt aggtggagtg aggcttccaa 2160

gcagggaggg gaatgatggt ggggcccaaa tgaggagcca catcgaagta gatgagagaa 2220

tagaaggtga agtaagggct ggcgttgggt agggggagac gccagcagtg atgctgatgc 2280

ccaggctgta ggtgtatagg tgccatccac ctggtaaaga gagagctgta gcgcaggaat 2340

gaggttgcac atgtagaaga agggaaggat acaggggaga gaagtgtctt ctagtcctaa 2400

aaaacagcct gtgggctggc atggtggaac aaacctgtaa gtcccagcac ttcgggaggt 2460

caaggtaaga ggatcatctg cttgagccca ggagttcaag aacagcctag gcaacatagt 2520

aagatcccat ccctacagaa aaattaagaa attagccgga tgtcgtggca cacacctgtt 2580

gtctcagcta cttgggaggc cgatctctgg agcccgggag gtcaagtctg cagtgacgca 2640

tgatctcgcc actgcacttc agcctgggca actgactgac agcatgtctc aaagaaaaga 2700

aaaaaaagcc tgtgtttgga gcagggagac tgtcagagac tttgcacagg cccaagcgga 2760

gagaagacca gggatacagg tggctaaggg agggcttcca gctgcataag tctgtgggtt 2820

gtagatggcc tttctttgcc tgtttcctca tctgccttcc acatggggta ggtctgagga 2880

tcaaacggta cagcatagac taggcagtga agcattcact gtactccttt tgcaacagcc 2940

tcatcctatt tcttcaccag gggcagacac tggcctcaga tacctgacct ggtaccctct 3000

atgaggcctg cggtgctggg ctccccagac cgagcacccc cagaagatga ggggcctgtc 3060

atggtgaagc tagaggactc tgaggaggag ggtgaggctg ccttatggga cccaggccct 3120

gaagctgcac gcctgcgttt ccggtgcttc cgctatgagg aggccacagg gccccaagag 3180

gccctggccc agctccgaga gctgtgtcgc cagtggctgc gtccagaggt acgctccaag 3240

gagcagatgc tggagctgtt ggtgctggag cagttcctgg gcgcactgcc ccctgagatc 3300

caggcccgtg tgcaggggca gcggccaggc agccccgagg aggctgctgc cctagtagat 3360

gggctgcgcc gggagccggg cggaccccgg agatgggtga gtgagtgtcc acgagtgggg 3420

ttcaggactg gagcatcatc cagctcggcc tcaccctggg cagcaccacg ctttgccaga 3480

cacacgttct cccttgtggt acagaagtgg ccacctgcaa cagagaccct gtgcaaggct 3540

gcccagggca gagggattcc agggccagac tccccagccc attcctgcat cacctgcagt 3600

cacgtggaca taggagctgc aggctagggg aatatgggga aggtactgga aggccacgat 3660

gtcagagcag gggagggact gcaggtggtc ccttcattct ttgctcaggg cctaggggag 3720

gtaggtcctt ggaggaccta gtcagtaggt atttacaagg caggcccctg ggatcctaca 3780

gtgggatggg cacccacaaa ccccaggttg cggccagcct tactctctgg taggacttct 3840

gatggtgggg gcacctcccc aggtcacagt ccaggtgcag ggccaggagg tcctatcaga 3900

gaagatggag ccctccagtt tccagcccct acctgaaact gagcctccaa ctccagagcc 3960

tgggcccaag acacctccta ggactatgca ggaatcacca 4000

<210> 2

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人(person)

<400> 2

cactggacag aaagcatttg caacctatca acctgtacag ggtagcatat aactggacag 60

catctggact cctaagtttt cctaacagtt ttacctcgga ttctccctgt ctctcttcgt 120

gctgtcatct ttctctaggt cttcgaaaac tgtcaatcca tcttactgta tctctaattt 180

ctgtcccttt tctcccttct tgtttctgtc cctctccctt cttgtctacc tcttgagtct 240

ggatatctgc atttcttgtc tctgtgaacc cattctgcgt ttccttcttt gtgtctcttt 300

catctgcatc cctttctgat ctgcctctct cttgctaact gttctgacac ctgtttgccc 360

ggccctgacc ctctgatcca ctcagccctc ttataacttg gacccgtgtc tctatgtttg 420

ttcacttatt ttcactgtct ctcctcgcgt cgagtctccg gtcctcccag tctgtgagtc 480

tgtctctctg tctctctctc tcttcctccc gccggtcctt cgtctctctt tgcccttgag 540

tctctggtct ctctccgtct ctcctcgctg tttctatcga tcggcatctc tctgccccag 600

tacccttccc cacctcttca tcccacatgc cccattgcat tttcaacgcc cgccgcgtct 660

ccgggttacc caggcgatgt cgagtcgtgt ccccaggtta ccatggagac gttcagggcc 720

cgcccctcgc ccatgatcac agaggaacgt catcgcgccg cgcgcgcacg tacacacgaa 780

gggcctgctg actacatctg ccggaaagca tcgggccaag cctttctcca ttttgcggtc 840

taggaagtag cagaggcccc ttcctgtagg gagttgccat ggagacgcgg tggggcaccg 900

acggagttct aatgacggcc gtgattggtg caggatcctg ctaatctcag gaaggcccgt 960

agagaagtga ggaaaacgtg gtggggggca tgcgcgatct ggtaggcggt gctgccgtct 1020

gttgtacctg agaggcttgc gcatgccgac gcacggattc gaggcgggga gcatgggaag 1080

aagcggccag gagtatgacc tgatcattgc gaccaccgct aggggaaggg aggagagggt 1140

gtagaaacgg ggacgagggt gggggaaggg caaggaggcg ctcgagctgg tgcgcggagc 1200

atcctgggag acgtagtcca gcgggagggg gaagtcgaag actgcgcgtg ctcaggagcg 1260

cggagcggcc cgctgagcgc agaggtgagg gcggggtcct cttaaccggg agggctatcg 1320

tgtggacggg ggcggtggct gcagactcgg ggattccggc tccccagtga gaccggaagc 1380

gcggggaacg aatccgggca gtccttgcgg gagcgcccag ggctagagcg agaggcttgt 1440

caatcactac tcgttgccac gacgacaggc tttgggagcc ccgcccccgg ttgcctaggc 1500

gtcgtctgga cctaccttgg caccctggag cggaagttgc cgcctggact tctgggaagt 1560

gtatttcggg accctccgta ggtacctgcc atcttggcta tgacccaagt ctctcccagg 1620

gtttcaggtt gacttggcac cttgaagagt ggaggcttgg cccccaggat gaggcggccc 1680

tcgaaatcga tgccacccac gggggaatga ttctgcggtg ccatcccctt cataaacgca 1740

gattccttcc taaagccgca gctgcagaag gaacagcgcg aggagggagg tcagccccac 1800

ttgcaaatgg ggaaacaagt tctcgaaggc acagtgatct gaagatgggc ggaatcagag 1860

tctcgggact tccttgcagg ctcctgttcc ggcagtcttg gagcctttgc cgccccccca 1920

cccattgcga agctccccca tccccttcca accccagcta aatcaggaag ctgagatggg 1980

gcattgcgta gtgtgatgtt 2000

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 3

tttaggatga ggcggttttc 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 4

cgcgctattc cttctacaac tac 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 5

taggatgagg tggtttttga a 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 6

taaaactaac ctccctcctc acac 24

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 7

tttatagaaa aattaagaaa ttagtcgg 28

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 8

aaatacaata acgaaatcat acgtc 25

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 9

tttatagaaa aattaagaaa ttagttgg 28

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列(artificial synthesis)

<400> 10

aaatacaata acaaaatcat acatc 25

Claims

1.一种用于胃癌诊断、化疗与预后检测的分子标记物，其特征在于：所述分子标记物为位于MZF1基因内的一段DNA序列，该DNA序列如SEQ ID No.1所示，且该DNA序列至少包含一个甲基化位点。

2.根据权利要求1所述的分子标记物，其特征在于：所述DNA序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种如权利要求1或2所述的分子标记物在制备胃癌诊断、化疗与预后检测的药品中的应用，其特征在于：所述药品包括检测所述分子标记物表达水平的特异性扩增引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：检测所述分子标记物表达水平的特异性扩增引物包括甲基化引物和非甲基化引物；所述甲基化引物的上游序列如SEQ ID No.3所示，所述甲基化引物的下游序列如SEQ ID No.4所示；所述非甲基化引物上游序列如SEQ IDNo.5所示，所述非甲基化引物下游序列如SEQ ID No.6所示。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：检测所述分子标记物表达水平的特异性扩增引物包括适合甲基化特异性qPCR检测MSP的甲基化引物和适合MSP的非甲基化引物；所述适合MSP的甲基化引物的上游序列如SEQ ID No.7所示，所述适合MSP的甲基化引物的下游序列如SEQ ID No.8所示；所述适合MSP的非甲基化引物上游序列如SEQ ID No.9所示，所述适合MSP的非甲基化引物下游序列如SEQ ID No.10所示。

6.一种用于胃癌诊断、化疗与预后检测的试剂盒，其特征在于：包含检测一种分子标记物表达水平的制剂，所述分子标记物的序列如SEQ ID No.1所示。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：检测所述分子标记物表达水平的特异性扩增的引物包括甲基化引物和非甲基化引物；所述甲基化引物的上游序列如SEQ ID No.3所示，所述甲基化引物的下游序列如SEQ ID No.4所示；所述非甲基化引物上游序列如SEQID No.5所示，所述非甲基化引物下游序列如SEQ ID No.6所示。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：检测所述分子标记物表达水平的特异性扩增的引物包括适合甲基化特异性qPCR检测MSP的甲基化引物和适合MSP的非甲基化引物；所述适合MSP的甲基化引物的上游序列如SEQ ID No.7所示，所述适合MSP的甲基化引物的下游序列如SEQ ID No.8所示；所述适合MSP的非甲基化引物上游序列如SEQ ID No.9所示，所述适合MSP的非甲基化引物下游序列如SEQ ID No.10所示。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于MSP的甲基化对照DNA模板和非甲基化对照DNA模板。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述用于MSP的甲基化对照DNA模板为经硫化修饰后的甲基化DNA，所述经硫化修饰后的甲基化DNA为经硫化修饰后在MZF1基因内区域呈现90％以上甲基化的肿瘤细胞DNA；所述用于MSP的非甲基化对照DNA模板为正常组织细胞DNA，所述正常组织细胞DNA为MZF1基因内区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA。