CN103343125A

CN103343125A - 一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用

Info

Publication number: CN103343125A
Application number: CN2013102405351A
Authority: CN
Inventors: 武秀萍; 陈显久; 吴彬; 李冰; 解军
Original assignee: Shanxi Medical University
Current assignee: Shanxi Medical University
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2013-10-09

Abstract

本发明涉及生物医药领域，提供一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用。抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA的序列如SEQIDNO：1所示；靶序列是人PRPS2的mRNA第422～440位；将模板序列与线性化载体重组获得抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA真核表达质粒。本发明成功基因重组获得shRNA真核表达载体；该载体在人HCT116细胞中能稳定持续的降低PRPS2的表达水平，克服了体外化学合成siRNA的作用时间短、毒性大等缺点；能有效抑制HCT116细胞的增殖、细胞周期阻遏、细胞凋亡。因此，本发明为人结肠癌的治疗提供了新工具，为抗肿瘤药物的开发提供了新材料。

Description

一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用。

背景技术

嘌呤和嘧啶与体内核酸代谢密切相关，嘌呤又与能量代谢直接相关。一方面，磷酸核糖焦磷酸合成酶（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase，PRPS）是体内唯一催化磷酸核糖焦磷酸（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase，PRPP）合成的酶，PRPP是体内嘌呤、嘧啶从头合成和补救合成的重要底物，同时也是该通路上的重要调节因子[Sudha Mannava, Vladimir Grachtchouk, Linda J. Wheeler. Direct role of nucleotide metabolism in C-MYC-dependent proliferation of melanoma cells. Cell Cycle，2008，7(5)：2392-2400]。另一方面，体内细胞能直接利用的最普遍的能量提供化合物——腺嘌呤三磷酸核苷（Adenosine Triphosphate，ATP）是PRPS的底物，而ATP所含有的腺嘌呤成份又需要以PRPS催化的产物作为底物合成，因此，嘌呤代谢紊乱将导致体内能量代谢紊乱。

PRPS2是PRPS家族成员之一，由PRPS2基因编码。PRPS2基因是位于X染色体短臂Xp22.2-p22.3的管家基因，几乎在所有细胞中均有表达，在增殖较快的组织如胸腺、肺、胃、小肠、脾和睾丸组织中表达量较高。肿瘤组织是细胞增殖旺盛的组织，其核苷酸的从头合成是肿瘤细胞增殖的首要步骤。阻断肿瘤细胞核苷酸的从头合成也是目前临床广泛应用的抗代谢类肿瘤化疗药物（如5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和环胞苷等）的作用机制。利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）表达载体，对PRPS2基因的表达进行特异性抑制，有望阻断肿瘤细胞的恶性增殖和生长，进而达到治疗肿瘤的目的。

RNAi是由双链RNA 分子介导的序列特异性转录后基因沉默现象，已成为人类基因功能研究的有力工具，同时在基因干预治疗的应用中具有很大潜力。特别是应用RNAi 技术在哺乳动物细胞中高效特异阻断特定基因的表达，为恶性肿瘤的基因治疗提供了新方法。RNAi 常用两种方法: siRNA 和shRNA。siRNA合成的成本较高，作用时间相对短暂，而且长双链RNA在哺乳动物细胞中会诱发细胞毒效应。而shRNA 方法对靶基因的作用持续时间、细胞的毒性反应以及合成价格等方面有一定的优势，因此使用shRNA 进行RNA 干扰是目前较为常用的方法[Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R．A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science，2002，296(5567)：550-553]。

shRNA是一段具有紧密发卡环的RNA序列，利用载体把编码目标shRNA的DNA序列导入细胞，载体中的启动子可启动该序列表达为特定shRNA。这种重组了编码shRNA载体的DNA序列可随着细胞的增殖而被传递到子代细胞中去，从而使目标基因的沉默可被遗传。导致目标基因表达降低（沉默）的机制是：shRNA在细胞胞液中可形成发卡结构，然后被细胞液中特定的酶切割成siRNA；siRNA结合到RNA 诱导沉默复合物 (RNA-induced silencingcomplex，RISC) 上；RISC结合到目标基因转录形成的mRNAs上，在其他酶的作用下将其降解，达到目标基因沉默效应[ Paddish PJ, Caudy AA, Bernstein E, et al．Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Gen Dev，2002，16：948-958.]。

结肠癌在我国的发病率有增高的趋势。结肠癌起病隐匿，早期常无明显的临床表现，病情发展较慢，出现明显的症状时大多已到了中晚期，死亡率仅次于肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤第三位。结肠癌是一个严重危害人们健康的可怕杀手。结肠癌主要治疗方法如下：手术治疗、化疗、放疗、生物治疗，免疫疗法和基因疗法均属于生物治疗，目前临床上应用得较多的是免疫疗法。生物治疗能够预防肿瘤的复发和转移，还能提高放疗、化疗的疗效，减少放疗、放疗的毒副作用。分子靶向治疗，是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点（该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段），来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。

2010年美国临床肿瘤协会（ASCO）报告，分子靶向治疗在结肠癌上带来了许多令人鼓舞的研究结果，如单克隆抗体与化疗联合方案可使患者平均生存期延长24个月左右。但是靶向治疗的研究才刚起步，靶向治疗的预测指标仍不明确，也就是说，我们难以在用药前预测患者是否从治疗中获益。虽然一些靶向药物对晚期结肠癌治疗的疗效已经获得公认，但是这些药物应用时间及应用方式仍存在很大的争议。随着靶向药物的广泛应用，耐药问题也日益突出。目前结肠癌的药物治疗处于从单纯细胞毒性治疗逐渐过渡到分子靶向治疗时代。结肠癌的靶向治疗研究任然任重而道远。

到目前为止，关于将PRPS2基因作为治疗结肠癌靶基因的未见报道。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术的不足，提供一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用。

本发明是由如下技术方案实现的：

一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA的序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，即5’- CCAUACGCCC GACAAGAUAA ACUCGAGUUU AUCUUGUCGG GCGUAUGG -3’。其靶序列是人PRPS2的mRNA第422-440位，如SEQ ID NO：2所示，即5’- AUACGCCCGA CAAGAUAAA -3’。该shRNA通过如SEQ ID NO：3所示的DNA模板序列转录生成，即5’- CCATACGCCC GACAAGATAA ACTCGAGTTT ATCTTGTCGG GCGTATGG -3’。

该抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA的载体构建，将SEQ ID NO：1的模板序列SEQ ID NO：3与线性化载体GV102重组，获得抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA真核表达质粒，命名为GV102-PRPS2-3。该SEQ ID NO：1的模板序列插入GV102的限制性酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ。

该抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA在制备治疗结肠癌药物中的应用。

本发明的有益之处是：1、成功基因重组获得特异性抑制人HCT116细胞PRPS2基因表达的shRNA真核表达载体GV102-PRPS2-3。2、GV102-PRPS2-3在人HCT116细胞中能稳定持续的降低PRPS2 mRNA和蛋白表达水平，克服了体外化学合成siRNA的作用时间短、毒性大等缺点。3、GV102-PRPS2-3在人HCT116细胞中能有效抑制HCT116细胞的增殖、细胞周期阻遏、细胞凋亡。因此，本发明为人结肠癌的治疗提供了新工具，为抗肿瘤药物的开发提供了新材料。

附图说明：

图1：本发明设计并合成PRPS2的一对shRNA序列；

图2：本发明设计的含抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA编码序列的shRNA真核表达载体构建图；

图3：载体GV102-PRPS2-3转染HCT116细胞后荧光显微镜照片和光镜照片；

图中A为荧光显微镜照片；B为白光照片；

图4：GV102-PRPS2-3转染HCT116细胞后半定量RT-PCR法检测PRPS2 mRNA表达的电泳图；

图中C组为正常细胞组，0组为转染GV102-PRPS2空白载体的细胞组即阴性对照组，1组和2组为转染PRPS2其他干扰载体的实验组对照，3组为转染GV102-PRPS2-3载体的细胞组；

图5：GV102-PRPS2-3转染HCT116细胞后半定量RT-PCR法检测PRPS2 mRNA表达的定量分析图；

图6：GV102-PRPS2-3转染HCT116细胞后Western blot法检测PRPS2 蛋白表达的凝胶成像图；

图7：GV102-PRPS2-3转染HCT116细胞后Western blot法检测PRPS2 蛋白表达的定量分析图；

图8：Annexin V/PI双染色法检测PRPS2表达下调对HCT116细胞凋亡的定量测定图；

图9：PI染色检测下调PRPS2表达后HCT116细胞周期变化分析图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者按照生产厂商所建议的条件。

实施例1：

一种抑制人结肠癌HCT116细胞PRPS2基因表达的shRNA的设计及其表达载体GV102-PRPS2-3的构建：可特异性降低人结肠癌HCT116细胞PRPS2基因表达的shRNA的设计及表达载体GV102-PRPS2-3的构建。

在NCBI数据库中查找人PRPS2基因的mRNA碱基序列（GeneBank编号：NM_001039091.2），使用siRNA查找工具软件（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_ finder.html）选择靶点序列，靶点序列为人PRPS2 mRNA的第422～440位。根据靶点序列设计的可转录生成shRNA的DNA序列为：SEQ ID NO：3：5’- CCATACGCCC GACAAGATAA ACTCGAGTTT ATCTTGTCGG GCGTATGG -3’；其转录后生成的shRNA序列为：SEQ ID NO：1：5’- CCAUACGCCC GACAAGAUAA ACUCGAGUUU AUCUUGUCGG GCGUAUGG -3’，如图1，为48bases，其3’末端和5’末端可形成自身碱基配对，中间6bases形成loop环。

将SEQ ID NO：3重组于GV102真核表达载体的设计方案为: BamHⅠ -Target sense sequence-Hairpin loop-Target antisense sequence-Terminator - HindⅢ。

操作第一步：使用DNA合成仪合成SEQ ID NO：3所示的DNA，并在两端加上BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点，其结构模式图见图1。

操作第二步：将上述人工合成的单链DNA序列退火形成双链结构。退火反应体系为：将各2mL的正向和反向DNA 寡核苷酸与46ml的退火Buffer混合，在95℃持续4min，70℃持续10min，慢慢冷却退火的寡核苷酸至10℃。

操作第三步：将第二步退火产物与GV102载体进行双酶切，37 ℃、14 h，产物进行1.5%琼脂糖凝胶分离，回收，纯化酶切产物。

操作第四步：各取2μL酶切产物，加入适量T4 DNA连接酶，16℃、16h。

操作第五步：将含有重组GV102载体的第四步混合液转化至JM109大肠杆菌，铺板，挑单菌落培养，提质粒。

操作第六步：将提取的质粒根据BamHⅠ、HindⅢ酶切位点定位测序，判断重组载体中是否插入正确的可转录生成SEQ ID NO：1序列的DNA序列。质粒特征如图2所示，其中shDNA代表编码shRNA（SEQ ID NO：1）的DNA序列（SEQ ID NO：3）。重组载体命名为GV102-PRPS2-3，其中，hU6启动子：289-616；shDNA：617-640；CMV启动子：671-1259；GFP：1283-2002；SV40启动子：2672-3049；新霉素：3077-3871；pUC ori:4108-5276;氨苄青霉素：6233-5373。

实施例2：

利用重组载体GV102-PRPS2-3瞬时转染人结肠癌HCT116细胞。

取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于培养皿中，转染时细胞密度达70-80%；使用Effectene Transfection Reagent转染试剂盒进行转染。取0.8mg质粒加6.4mL Enhancer，混匀后加入100mL Buffer EC中，震荡混匀1s，室温孵育5min；加15mL Effectene Transfection Reagent，震荡混匀10s，室温孵育10min ；加600mL IMDM培养基，震荡混匀1s，加入细胞中；6h后补加血清至10%，72h后收集细胞进行鉴定；显微镜下观察HCT116细胞中绿色荧光蛋白的表达：随着转染时间的延长，绿色荧光逐渐增多增强，在72h时达到最强，同一视野白光和荧光下对比观察细胞中绿色荧光蛋白的表达，经计算得出72h质粒的转染效率约为60-70%。转染后细胞荧光显微镜图和光镜图见图3。

实施例3：

转染后半定量RT-PCR法检测GV102-PRPS2-3对PRPS2 mRNA表达的干扰作用。

转染72h后取出六孔板，DEPC水洗三次后每孔加入1ml Trizol，吹打细胞，移入1.5mlEp管中;室温放置 10min后，每管中滴加200ml氯仿，涡旋振荡1min，室温静置 5min;4℃ 12000g离心15min，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有 RNA样品;小心吸取上清液约 450ml于新离心管中，在管内加入600ml冷冻的异丙醇，混匀，-20℃放置10min;4℃12000g离心 10min,弃去上清，加入1ml 预冷的75％乙醇;洗涤沉淀后，4℃ 12000g离心6min，小心吸去上清;风干约5min，加入DEPC水约10ml即为总RNA液。

取总RNA液2mg，5×PrimeScript Buffer 4mL，加RNase Free dH₂O至总体积20mL，37℃反应15min，85℃反应5s，反转录得cDNA；PCR 扩增人PRPS2基因，上游引物为：5’- GATTGCGTCA TCATCCAGAG T-3’（SEQ ID NO：4），下游引物为：5’- CATTCGCCTT CTTCCTCTCT T-3’（SEQ ID NO：5）。以管家基因GAPDH 为内参照，上游引物为：5’- AGAAGGCTGG GGCTCATTT G -3’（SEQ ID NO：6），下游：5’- AGGGGCCATC CACAGTCTTC-3’（SEQ ID NO：7）。反应条件为：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，共30 个循环。反应体系如表1。

表1：PCR反应体系组成表

RT-PCR检测细胞内PRPS2 mRNA的表达，结果显示，转染GV102-PRPS2空白载体的细胞（图4中“0”组）与正常组（图4中“C”组）的细胞中PRPS2相对表达量无统计学差异（P>0.05），而转染GV102-PRPS2-3载体的细胞（指图4中“3”组）中PRPS2的相对表达量为0.27±0.05，较阴性对照组（图4中“0”组）PRPS2表达显著下降（P<0.05），见图5。

实施例4：

转染GV102-PRPS2-3后Western blot法检测对PRPS2蛋白表达的干扰作用。

收集转染72 h 后细胞，吸弃6孔板中的旧培养基，用PBS冲洗细胞2次；6孔板每孔中加入70mL细胞裂解液与PMSF混合液，使其均匀覆盖于细胞表面，冰上裂解20min；用胶头滴管吹打细胞，将其移至1.5mL Ep管中，冰上裂解1h，期间每10min振荡一次；4℃ 12000g离心10min，吸取上清即为细胞总蛋白；BCA法测定蛋白浓度，调整总蛋白浓度。

（1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳：清洗、组装胶架，使用少量去离子水检查密封性，按照表2量取试剂。先配制12%分离胶，灌注，室温静置40min至胶凝固，再配制6%积层胶，灌注，室温静置40min；；将胶架放入垂直电泳槽，加入电泳缓冲液；样品中加入相应量5×上样缓冲液，封口后煮沸10min,使蛋白变性；使用加样器上样，每泳道加入50mg样品，另有一泳道加入5mL蛋白质Marker；恒压120V电泳至溴酚蓝抵达分离胶下缘或下1/4处，终止电泳。

（2）转膜：电泳结束后拆开胶架，根据蛋白质Marker标记切取适当大小的分离胶，切角做标记，移至转膜液中浸泡；剪取与切取的分离胶大小略相等或稍小的中性滤纸12张和已活化的聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride，PVDF膜）1张，切角做标记，放入转膜液中浸泡数分钟；使用半干电泳转膜仪转膜，转膜时使用恒定电流，电流大小为膜的面积乘以1.5mA/cm²，时间为2-4h左右。

（3）封闭：转膜结束后，使用1×丽春红染液染膜，10min后取出以水清洗，观察膜上是否有蛋白条带；再次冲洗膜至颜色完全消褪后移入封闭液中，室温下置于摇床上摇动封闭3h；同时将分离胶用考马斯亮兰染液染色1h、脱色45min，观察转膜是否完全。

（4）抗体标记：从封闭液中取出膜；根据切角标记分别将膜移入以各蛋白一抗稀释液（1:200）中，置于4℃摇床上摇动12-16h；TBST洗膜3次，10min/次，再次加入相应辣根过氧化物酶标记二抗稀释液（1：1000），室温下置于摇床上摇动3h；用TBST洗膜3次，10min/次。

（5）ECL发光成像：取出PVDF膜，用滤纸轻轻吸干(不可摩擦膜的蛋白标记面)，置于凝胶成像仪的黑色胶片上；将ECL发光液A液和B液取适量等体积混合，滴加ECL混合工作液覆盖在膜上，确保其均匀覆盖，静置1-2min；使用BIO-RAD凝胶成像仪观察拍照。

（6）蛋白条带定量分析：通过BIO-RAD图像分析软件分析蛋白条带，各蛋白条带灰度值通过内参β-actin校正，反映各蛋白相对表达水平。

表2：5%积层胶、12%分离胶SDS-PAGE配方

Western blot检测细胞内PRPS2蛋白表达，结果显示，转染GV102-PRPS2空白载体的细胞（图6中“0”组）与正常组（图6中“C”组）的PRPS2 蛋白水平无统计学差异（P>0.05），而转染GV102-PRPS2-3载体的细胞（指图6中“3”组）中相对表达量分别为0.30±0.04，较阴性对照组（图6中“0”组）PRPS2表达显著下降（P<0.05），见图7。

实施例5：

CCK8检测GV102-PRPS2-3作用于HCT116细胞后对增殖能力的抑制作用。

参考文献[Qing Ye, Bo Feng, Yuan-Fei Peng，et al. Expression of γ-synuclein in colorectal cancer tissues and its role on colorectal cancer cell line HCT116[J]. World J Gastroenterol. 2009 October 28; 15(40): 5035–5043.]的方法进行细胞增殖能力检测。将 96孔板每孔接种100微升2000个细胞。转染72h后，每孔加入10μL CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育1h，用酶标仪检测A₄₅₀。

采用CCK8检测细胞增殖能力。结果显示，转染GV102-PRPS2空白载体的阴性对照组细胞与正常对照组细胞增殖能力相比差异无统计学意义（P>0.05），而转染GV102-PRPS2载体的细胞增殖速率与阴性对照组相比，明显减慢，差异有统计学意义（P<0.01）。实验组细胞增殖活力在转染48h后抑制率达（14.0±3.15）%，转染72h后抑制率达（21.0±4.23）%，说明PRPS2低表达对HCT116细胞的增殖产生抑制作用，见表3。

表3：PRPS2低表达对HCT116细胞增殖能力的影响（N=5，）

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

实施例6：

Annexin V/PI检测GV102-PRPS2-3作用于HCT116细胞后促进细胞凋亡与坏死的作用效果。

参考文献[Tang D, Kang R, Cheh CW, Livesey KM, Liang X, Schapiro NE, Benschop R, Sparvero LJ, Amoscato AA, Tracey KJ, Zeh HJ, Lotze MT. HMGB1 release and redox regulates autophagy and apoptosis in cancer cells. Oncogene. 2010 Sep 23;29(38):5299-5310.]的方法采用Annexin V/PI检测检测细胞凋亡与坏死情况。用不含EDTA的胰酶消化收集细胞；用PBS洗涤细胞二次（1000r/min离心5min）收集1~5×10⁵细胞；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V-EGFP混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应15min；流式细胞仪检测。

采用Annexin V/PI双染色法对细胞凋亡情况进行定量。结果显示，转染GV102-PRPS2-0载体的细胞中细胞凋亡率为（22.24±1.92）%，与正常对照组（19.37±0.87）%相比，无统计学差异（P>0.05）；转染GV102-PRPS2-3载体的细胞（实验组3）为（32.55±0.14）%，与阴性对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），说明下调PRPS2基因的表达可显著增加HCT116细胞的凋亡，见图8、表4。

表4：PRPS2表达下调对HCT116细胞凋亡的影响（72h，N=3，）

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

实施例7：

GV102-PRPS2-3作用于HCT116细胞后导致细胞周期阻遏的作用效果。

参考文献[Yun JM, Afaq F, Khan N, Mukhtar H. Delphinidin, an anthocyanidin in pigmented fruits and vegetables, induces apoptosis and cell cycle arrest in human colon cancer HCT116 cells[J]. Mol Carcinog. 2009, 48(3):260-270.]的方法检测细胞周期的变化。胰酶消化收集细胞；用PBS洗涤细胞二次常温2000r/min离心5min后收集1×10⁶细胞；弃去上清，加入1.5mL PBS，拍打成细胞悬液，加预冷的70％乙醇；4℃固定过夜；1500r/min离心5min，弃去上清，PBS冲洗后加入100μL RNase A，37℃水浴保温30min，再加入400μL PI染色液混匀，4℃避光30min，使用流式细胞仪进行检测。

分别将PRPS2干扰载体转染HCT116细胞72h后进行PI染色后通过流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果显示，转染GV102-PRPS2-0载体的细胞的细胞周期与正常对照组比较，各个阶段细胞数量无统计学差异（P>0.05），PRPS2基因沉默后，HCT116细胞的周期发生明显变化，而GV102-PRPS2-3载体（指实验组3）的G1期细胞数量显著增加（P<0.01），S期细胞数量显著减少（P<0.05），G2/M期无明显差异。说明PRPS2基因低表达能够导致HCT116细胞阻滞于G0/G1期，细胞分裂减缓，见图9、表5。

表5：PI染色检测下调PRPS2表达对HCT116细胞周期的影响（72h，，N=3）

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

序列表

<<110> 山西医科大学

<120>一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA及其载体的构建和应用

<160> 7

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 48

<212> RNA

<213>人工序列

<400>1

CCAUACGCCC GACAAGAUAA ACUCGAGUUU AUCUUGUCGG GCGUAUGG

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213>人（Homo sapiens）

<400> 2

AUACGCCCGA CAAGAUAAA

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>3

CCATACGCCC GACAAGATAA ACTCGAGTTT ATCTTGTCGG GCGTATGG

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GATTGCGTCA TCATCCAGAG T

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CATTCGCCTT CTTCCTCTCT T

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

AGAAGGCTGG GGCTCATTTG

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

AGGGGCCATC CACAGTCTTC

Claims

1.一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，即5’- CCAUACGCCC GACAAGAUAA ACUCGAGUUU AUCUUGUCGG GCGUAUGG -3’。

2.根据权利要求1所述的一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA，其特征在于：其靶序列是人PRPS2的mRNA第422～440位，如SEQ ID NO：2所示，5’- AUACGCCCGA CAAGAUAAA -3’。

3.根据权利要求1所述的一种抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA，其特征在于：该shRNA通过如SEQ ID NO：3所示的DNA模板序列转录生成，即5’- CCATACGCCC GACAAGATAA ACTCGAGTTT ATCTTGTCGG GCGTATGG -3’。

4.一种如权利要求1所述的抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA的载体构建，其特征在于：将SEQ ID NO：1的模板序列SEQ ID NO：3与线性化载体GV102重组，获得抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA真核表达质粒，命名为GV102-PRPS2-3，所述SEQ ID NO：1的模板序列插入GV102的限制性酶切位点为BamHⅠ和HindⅢ。

5.一种如权利要求书1所述的抑制结肠癌细胞PRPS2表达的shRNA在制备治疗结肠癌药物中的应用。