JP7366332B2 - 脳幹オルガノイドの作製方法 - Google Patents
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(1-1)第1工程
ヒトES細胞を50%Accutase(PBSにより希釈)によって剥離し、400万個の細胞を5mlの mTeSR(登録商標)1(modified Tenneille Serum Replacer 1:エムテイザー1)培地にて培養した。mTeSR培地には、中脳ドパミン作動性神経細胞前駆細胞への分化を促すため10μM SB431542及び1μM Dorsomorphinを添加した。また、mTeSR培地には細胞の生存率をあげるためROCK inhibitorとして10μM Y-27632を加えた。培養は、細胞の接着を妨げ、胚様体形成を促すため、オービタルシェーカー上で行った。具体的には分化培地を含む培養皿を37℃/5%インキュベータ内で80rpmで回転するオービタルシェーカー上に置き72時間培養した(図1)。なお本発明にかかる脳幹オルガノイドの作製工程の全てにおいて、実験ごとの再現性を担保するため、複数タンパクの混合物であるMatrigelは使用されていない。
第1工程の後、培地をmTESRTM1から神経幹細胞の培養に最適化された5mlのNeurobasal培地に変更した。Neurobasal培地には、10μM SB431542及び1μM Dorsomorphinが添加された。またNeurobasal培地には、神経前駆細胞の増殖促進のために2μMプロゲステロン及び10mMプトレシンが添加された。更にNeurobasal培地には、神経前駆細胞のアポトーシス抑制のために3μMセレナイト、86μMインスリン及び1.0mMトランスフェリンが添加された。分化培地を含む培養皿が37℃/5%インキュベータ内で80rpmで回転するオービタルシェーカー上に置かれ、144時間培養した(図1)。
第3工程でも、培地は5mlのNeurobasal培地であった。Neurobasal培地には、神経前駆細胞の増殖促進のため20ng/mL bFGFが添加された。またNeurobasal培地には、2μMプロゲステロン及び10mMプトレシンが添加された。更にNeurobasal培地には、3μMセレナイト、86μMインスリン及び1.0mMトランスフェリンが添加された。分化培地を含む培養皿が37℃/5%インキュベータ内で80rpmで回転するオービタルシェーカー上に置かれ、168時間培養した(図1)。なおドパミン作動性神経細胞以外の神経細胞も分化させるため、神経幹細胞をドパミン作動性神経細胞への分化を強力に誘導するFGF8は使用しなかった。本発明にかかる脳幹オルガノイドの作製工程の全てにおいてFGF8は使用されていない。
第4工程でも、培地は5mlのNeurobasal培地であった。Neurobasal培地には、神経前駆細胞の増殖促進のため20ng/mL bFGF及び20ng/mL EGFが添加された。またNeurobasal培地には、2μMプロゲステロン及び10mMプトレシンが添加された。更にNeurobasal培地には、3μMセレナイト、86μMインスリン及び1.0mMトランスフェリンが添加された。分化培地を含む培養皿が37℃/5%インキュベータ内で80rpmで回転するオービタルシェーカー上に置かれ、144時間培養した(図1)。
第5工程でも、培地は5mlのNeurobasal培地であった。Neurobasal培地には2μMプロゲステロンが添加された。またNeurobasal培地には、神経細胞の分化を促すため10ng/mL NT-3、10ng/mL GDNF及び10ng/mL BDNFが添加された。またNeurobasal培地には、200μM Ascorbic acid、1mM cAMP、3μMセレナイト、86μMインスリン及び1.0mMトランスフェリンが添加された。分化培地を含む培養皿が37℃/5%インキュベータ内で80rpmで回転するオービタルシェーカー上に置かれ、144時間培養した(図1)。これにより脳幹オルガノイドが作製された。
定量的PCRにより、ドパミン作動性神経細胞マーカーであるTyrosine hydroxylase (TH)の発現が確認できた。これにより作製された脳幹オルガノイド中に、ドパミン作動性神経細胞が包含されることが確認された(図2)。また免疫染色でも、THの発現が確認できた(図2)。これにより作製されたオルガノイドに中脳辺縁系路と中脳皮質路があることが示される。
定量的PCRにより、延髄に存在するアセチルコリン作動性神経細胞のマーカーであるCholine acetyltransferase (ChAT)の発現が確認できた。これにより作製された脳幹オルガノイド中に、延髄に存在するアセチルコリン作動性神経細胞が包含されることが確認された(図3)。また免疫染色でも、ChATの発現が確認できた(図3)。これにより作製されたオルガノイドに延髄があることが示される。
定量的PCRにより、橋にあるノルアドレナリン作動性神経細胞のマーカーであるドパミン-β-ヒドロキシラーゼ(DBH)の発現が確認できた。これにより作製された脳幹オルガノイド中に、橋にあるノルアドレナリン作動性神経細胞が包含されることが確認された(図4)。また免疫染色でも、DBHの発現が確認できた(図4)。これにより作製されたオルガノイドに橋があることが示される。
作製した脳幹オルガノイドについて定量的PCR法による遺伝子発現解析を行った。定量的PCRによって、神経幹細胞マーカーであるSOX2、MASH1やSLC1A3の発現が確認された(図5)。また中脳への分化に必須であるOtx2の発現が確認された(図5)。また、ドパミン作動性神経細胞の前駆細胞に発現するFOXAやNurr1の発現も確認された(図5)。さらに、グルタミン作動性神経細胞やGABA作動性神経細胞のマーカーであるvGlut1(図5)、GAD67の発現も確認された(図5)。また、神経細胞の成熟を示すMAP2、オリゴデンドロサイトの成熟を示すMBP、OLIG2の発現も確認され、作製したオルガノイドが未熟なままではなく、成熟、分化していることが示された(図5)。
作製した脳幹オルガノイドについて免疫染色法による発現解析を行った。SOX2, FOXA2及びTHの発現が確認できた(図6A,6B,6C)。また、TUJ1及びS100βを発現する細胞の存在も確認できた(図6B,6D)。
トランスクリプトームは、特定の状況下において細胞中に存在する全ての一時転写産物の総体を指す呼称である。原則として、細胞に存在するゲノム(DNAの全塩基配列)は同一個体内の全ての細胞で同一であり、特定の個体から採取された細胞であれば、環境に変化が生じてもゲノムは一定である。一方、トランスクリプトームは、各遺伝子の発現状況(頻度)が反映された結果であるため、同一個体の細胞であっても各細胞の存在環境に呼応した固有の構成を取るため、例えば異なる組織の細胞間では全く異なる態様を示す。
Claims (7)
- ES細胞から脳幹オルガノイドを作製する方法であって、
前記脳幹オルガノイドにおける脳幹は、中脳、延髄及び橋を合わせた部位であり、
TGFβ阻害剤SB431542、BMP阻害剤ドルソモルフィン及びROCK inhibitorY-27632を含む第1の培地中で、ES細胞を培養して神経誘導を行う第1工程と、
TGFβ阻害剤SB431542、BMP阻害剤ドルソモルフィン、黄体ホルモンプロゲステロン、トランスフェリン、インスリン、プトレシン及びセレナイトを含む第2の培地中で、神経誘導を継続する第2工程と、
FGFシグナル伝達経路作用物質として20ng/mLのbFGF、黄体ホルモンプロゲステロン、トランスフェリン、インスリン、プトレシン及びセレナイトを含む第3の培地中で、神経誘導されたES細胞から神経幹前駆細胞を形成する第3工程と、
FGFシグナル伝達経路作用物質として20ng/mLのbFGF、20ng/mLのEGF、黄体ホルモンプロゲステロン、トランスフェリン、インスリン、プトレシン及びセレナイトを含む第4の培地中で、神経幹前駆細胞の形成を継続する第4工程と、
BDNF及びGDNFである神経栄養因子及び黄体ホルモンプロゲステロン、トランスフェリン、インスリン及びセレナイトを含む第5の培地中で、神経幹前駆細胞から神経細胞を形成して脳幹オルガノイドを作製する第5工程と、
を有することを特徴とする脳幹オルガノイドの作製方法。 - 前記第1の培地、前記第2の培地、前記第3の培地、前記第4の培地及び前記第5の培地には、いずれも、マトリゲルが含まれない、ことを特徴とする請求項1に記載の脳幹オルガノイドの作製方法。
- 前記第1の培地は、フィーダー非依存的基本培地である、ことを特徴とする請求項1に記載の脳幹オルガノイドの作製方法。
- 前記フィーダー非依存的基本培地は、mTeSR1、hESF9又はSTEMPRO(登録商標)である、ことを特徴とする請求項3に記載の脳幹オルガノイドの作製方法。
- 前記第2の培地、前記第3の培地、前記第4の培地及び前記第5の培地は、神経幹細胞増殖用培地である、ことを特徴とする請求項1乃至4の何れか1項に記載の脳幹オルガノイドの作製方法。
- 前記神経幹細胞増殖用培地は、Neurobasal(登録商標)培地である、ことを特徴とする請求項5に記載の脳幹オルガノイドの作製方法。
- 前記第1工程の培養時間は54~90時間であり、前記第2工程の培養時間は126~162時間であり、前記第3工程の培養時間は150~186時間であり、前記第4工程の培養時間は126~162時間であり、前記第5工程の培養時間は126~162時間である、ことを特徴とする請求項1乃至6に記載の何れか1項に記載の脳幹オルガノイドの作製方法。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110002897A1 (en) | 2009-06-11 | 2011-01-06 | Burnham Institute For Medical Research | Directed differentiation of stem cells |
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---|---|---|---|---|
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WO2017060884A1 (en) | 2015-10-08 | 2017-04-13 | Université Du Luxembourg | Means and methods for generating midbrain organoids |
JP2019502407A (ja) | 2016-01-14 | 2019-01-31 | オハイオ ステイト イノベイション ファウンデーション | 神経オルガノイド組成物および使用方法 |
WO2017160234A1 (en) | 2016-03-14 | 2017-09-21 | Agency For Science, Technology And Research | Generation of midbrain-specific organoids from human pluripotent stem cells |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
ENGEL et al.,Cellular and Molecular Life Sciences,2016年,Vol. 73, No. 19,p.3693-3709,DOI:10.1007/s00018-016-2265-3 |
HAGINO et al.,Neuropsychopharmacology,2015年,Vol. 40, No. 5,p.1141-1150,DOI: doi:10.1038/npp.2014.295 |
SMITS et al.,Cell and Tissue Research,2020年,Vol. 382, No. 3,p.463-476,DOI:10.1007/s00441-020-03249-y |
WACHS et al.,Laboratory Investigation,2003年,Vol. 83, No. 7,p.949-962,DOI:10.1097/01.LAB.0000075556.74231.A5 |
ZHOU et al.,Differentiation,2016年,Vol. 92, No. 4,p.183-194,DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.diff.2016.06.002 |
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