CN110423727A - 永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定 - Google Patents

永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定 Download PDF

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Abstract

永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定，涉及子宫内膜异位症。iheESCs细胞构建；iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定。构建的iheESCs细胞的细胞生长周期明显延长，其增殖速率、雌/孕激素受体、EMT标志蛋白等均未发生改变，同时蜕膜化诱导反应、雌激素和炎症反应均为发生改变，并且构建后的细胞不具有致瘤性。因此，构建的iheESCs细胞相比于普通的原代细胞具有明显的生命周期长、表型稳定、状态活性均更高的特点，可适用于子宫内膜异位症病理机制，子宫内膜容受性生理机制等研究，在临床实验、医学生物实验等均具有一定的适用性。

Description

永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定
技术领域
本发明涉及子宫内膜异位症，尤其是涉及永生化人子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞(immortalized humanendometriosiseutopicstromalcells,iheESCs)构建及鉴定。
背景技术
子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)，简称内异症，是一种具有雌激素依赖和炎症反应特征的慢性妇科疾病，常伴随盆腔疼痛、月经异常、性交疼等，甚至引发不孕不育，严重影响妇女生理和心理健康，给家庭带来经济和精神负担。内异症是指具有生长功能的子宫内膜在子宫腔外的其他部位如卵巢、腹壁等生长繁殖的良性病变，其发病率高达6％～15％，同时其复发率达到6％～67％。内异症的发病涉及众多影响因素，其具体机制目前尚未揭示。普遍接受的观点是“经血逆流学说”，即子宫内膜随月经经血逆流到腹腔后，粘附并生长在腹腔等部位。因此，子宫内膜的状态和基因表型和子宫内膜异位症发生发展密切相关，而内异症病人来源的子宫内膜(在位内膜)的原代细胞常被用于研究内异症及内异症病人子宫内膜容受性下降导致不孕不育的病理机制。但是，子宫内膜原代细胞生命周期短，而且容易退分化，失去对激素、细胞因子等应激反应，因此构建生命周期长、功能形状稳定的细胞株对内异症的科学研究非常重要。
目前已有多篇专利专注于人子宫内膜细胞的培养：中国专利CN 2018112805372通过经血过滤分离出子宫内膜组织，并通过胶原酶消化提取子宫内膜细胞的方法；中国专利CN 2006100866851提出通过激素调控体内动物和体外细胞的方法，大规模获取和扩增子宫内膜细胞的方法；中国专利CN 2018101571959建立原代人子宫内膜上皮细胞气液相培养模型与鉴定子宫内膜上皮细胞气液相培养模型。但是，现有的专利均仅关注与正常妇女的子宫内膜培养，而对内异症的子宫内膜细胞关注较少。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述不足，提供通过高表达人端粒酶(hTERT)构建永生化在位内膜间质细胞系，并验证其生长、迁移、侵袭及雌激素、炎症应激反应等功能，为内异症的发病机制研究和子宫内膜容受性的探索提供新的细胞来源，构建生命周期长且子宫内膜特征保持稳定细胞系的永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定方法。
本发明包括以下步骤：
1)iheESCs细胞构建；
在步骤1)中，所述iheESCs细胞构建的具体方法可为：
(1)将含有hTERT的目的质粒和慢病毒包装质粒(VSVG/PMDL/REV)共转染293T工具细胞，24～48h后收集病毒上清液；将上清液感染子宫内膜异位症病人的子宫内膜，24～48h后观察荧光，并提取RNA和蛋白质，通过qPCR及Western Blot检测发现hTERT表达表达明显升高，细胞形态无明显改变；
(2)通过不间断培养对照细胞和感染细胞，发现hTERT过表达后，细胞可多传代至35代，而对照细胞仅能传代至18代；以上数据说明成功过表达hTERT，并且细胞周期成功延长1倍，说明永生化细胞iheESCs构建成功；
2)iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定：
在步骤2)中，所述iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定具体方法可为：
(1)通过CCK8增值实验检测，iheESCs细胞和对照细胞的增殖无明显差异；而Transwell实验表明iheESCs细胞和对照细胞的迁移、侵袭能力无明显改变；
(2)采用Western Blot检测发现子宫内膜的雌激素受体ERα和ERβ，孕激素受体PR以及Keratin、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表达为发生改变；免疫细胞化学结果表明，iheESCs和对照细胞的间质标志蛋白Vimentin表达明显，而上皮标志蛋白Keratin表达低，二者均具有明显的间质特征；
(3)采用10nM孕激素和10mMcAMP培养液诱导iheESCs蜕膜化，5～7days后，iheESCs细胞变成丰满圆润，通过qRT-PCR检测发现胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)和催乳素(PRL)表达明显升高，表明iheESCs的依然保持蜕膜化生理功能；
(4)通过CCK-8实验发现雌激素促进iheESCs细胞增殖，Transwell实验发现雌激素促进iheESCs的迁移、侵袭能力，说明iheESCs细胞具有完善的雌激素应激反应；qRT-PCR和Western Blot检测发现LPS诱导iheESCs的炎症反应，IL-1β和IL-6等炎症因子的表达显著升高，表示iheESCs的炎症反应功能保持正常；
(5)验证iheESCs细胞的增长和致癌性，体外平板克隆群落形成实验提示其增殖和对照细胞移植，不具有子宫内膜癌细胞Ishikawa的恶性增殖的特征；体内裸鼠成瘤实验说明iheESCs不具有致癌能力。
本发明构建的iheESCs细胞的细胞生长周期明显延长，其增殖速率、雌/孕激素受体、EMT标志蛋白等均未发生改变，同时蜕膜化诱导反应、雌激素和炎症反应均为发生改变，并且构建后的细胞不具有致瘤性。因此，本发明构建的iheESCs细胞相比于普通的原代细胞具有明显的生命周期长、表型稳定、状态活性均更高的特点，可适用于子宫内膜异位症病理机制，子宫内膜容受性生理机制等研究，在临床实验、医学生物实验等均具有一定的适用性。
附图说明
图1为本发明实施例1构建iheESCs细胞后于荧光显微镜下红色荧光表达图谱。
图2为本发明实施例1构建iheESCs细胞后，通过qRT-PCR检测hTERT的mRNA表达图谱。
图3为本发明实施例1构建iheESCs细胞后，通过Western Blot检测hTERT蛋白质含量图谱。
图4为本发明实施例1iheESCs细胞和对照细胞形态对比图谱。
图5为本发明实施例2iheESCs细胞和对照细胞经无间断培养后的生命周期(培养代数)图谱。
图6为本发明实施例2iheESCs细胞和对照细胞120h生长周期对比图谱。
图7为本发明实施例2iheESCs细胞和对照细胞通过Transwell实验检测迁移能力对比图谱。
图8为本发明实施例2iheESCs细胞和对照细胞通过Transwell实验检测迁移能力的量化图谱。
图9为本发明实施例2iheESCs细胞和对照细胞通过Transwell实验检测侵袭能力对比图谱。
图10为本发明实施例2iheESCs细胞和对照细胞通过Transwell实验检测侵袭能力的量化图谱。
图11为本发明实施例2通过Western Blot定量iheESCs细胞上皮-间质的标志蛋白、雌孕激素受体表达图谱。
图12为本发明实施例2 iheESCs细胞通过免疫细胞化学检测Keratin、Vimentin的表达图谱。
图13为本发明实施例3 0.1μM MPA和cAMP共处理iheESCs细胞72h后细胞形态变化图谱。
图14为本发明实施例3 0.1μM MPA和cAMP共处理iheESCs细胞72h后通过qRT-PCR检测胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)的表达图谱。
图15为本发明实施例3 0.1μM MPA和cAMP共处理iheESCs细胞72h后通过qRT-PCR检测催乳素(PRL)的表达图谱。
图16为本发明实施例4通过CCK8实验检测200nM雌激素作用iheESCs细胞120h细胞增殖变化图谱。
图17为本发明实施例4通过EdU实验检测200nM雌激素作用下iheESCs细胞48h细胞分裂情况变化图谱。
图18为本发明实施例4通过EdU实验检测200nM雌激素作用下iheESCs细胞48h细胞分裂情况变化的量化图谱。
图19为本发明实施例4通过Transwell实验检测200nM雌激素作用iheESCs细胞48h后迁移能力变化图谱。
图20为本发明实施例4通过Transwell实验检测200nM雌激素作用iheESCs细胞48h后迁移能力变化的量化图谱。
图21为本发明实施例4通过Transwell实验检测200nM作用iheESCs细胞48h后侵袭能力变化图谱。
图22为本发明实施例4通过Transwell实验检测200nM作用iheESCs细胞48h后侵袭能力变化的量化图谱。
图23为本发明实施例5通过qRT-PCR检测100μg/mL脂多糖(LPS)作用iheESCs细胞48h后IL-1β表达图谱。
图24为本发明实施例5通过qRT-PCR检测100μg/mL脂多糖(LPS)作用iheESCs细胞48h后IL6mRNA表达图谱。
图25为本发明实施例5通过Western Blot检测100μg/mL脂多糖(LPS)作用iheESCs细胞48h后IL-1β和IL6蛋白质表达图谱。
图26为本发明实施例6通过平板克隆形成实验检测iheESCs细胞、对照细胞和子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞群落形成能力图谱。
图27为本发明实施例6通过体内裸鼠成瘤实验检测iheESCs细胞、对照细胞和子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞肿瘤形成能力图谱。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：慢病毒感染在位间质细胞，构建iheESCs细胞
将含有人hTERT基因转载至GV492载体，混合转染试剂Lipo2000和慢病毒包装质粒VSVG/PMDL/REV，加入293T工具细胞中，24h后收取病毒上清液并离心去杂质；上清液孵育子宫内膜异位症病人的在位间质细胞，24h后换成新鲜培养液，荧光显微镜下观察细胞表达红色转染荧光，qRT-PCR及Western Blot检测hTERT表达水平明显升高，说明hTERT转染成功；连续培养细胞，iheESCs细胞可传代至35代，而普通细胞只能传至18代，说明构建后iheESCs细胞的增殖周期明显延长，永生化特性构建成功。
结果如图1～5所示，经慢病毒感染后，iheESCs显著高表达hTERT，并且相对于对照细胞，iheESCs细胞形态未发生明显改变，同时iheESCs细胞的生命周期显著延长。
实施例2：iheESCs细胞生长周期、迁移和侵袭、雌孕激素受体及上皮-间质特征蛋白表达检测
进一步深入地检查iheESCs细胞的生理功能变化。采用CCK-8实验检测iheESCs细胞的生长规律，发现iheESCs细胞和对照细胞没有明显的改变；Western Blot检测ERα、ERβ及PR等雌孕激素，上皮-间质标志蛋白Keratin、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin等均未具有明显的差异；通过免疫细胞组化实验显示iheESCs细胞的上皮-间质状态保持不变。以上说明iheESCs细胞的基本特征没有明显的改变。
结果如图6所示，iheESCs细胞和对照细胞生长曲线没有明显差别。
结果如图7～10所示，iheESCs细胞和对照细胞的迁移、侵袭能力无明显差异。
结果如图11和12所示，iheESCs细胞和对照细胞的上皮-间质特征蛋白无明显改变，且雌激素受体ERα、ERβ及孕激素PR均未发生改变。
实施例3：iheESCs细胞蜕膜化特征反应
子宫内膜具有容受受精卵的作用，而子宫内膜间质细胞在容受过程会有蜕膜化的重要变化，因此本发明着重验证iheESCs细胞蜕膜化能力。采用10nM雌激素、0.1μM MPA及0.01M cAMP溶于DMEM/F12培养液作为蜕膜化诱导液，培养iheESCs细胞72h。结果发现雌激素诱导细胞变成梭形，而蜕膜液明显诱导细胞变成圆形，同时qPCR检测出iheESCs细胞表达更高的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP1)和催乳素(PRL)表达明显升高，说明iheESCs细胞依然保存了蜕膜化的过程，提示可以作为模式细胞株用于研究子宫内膜容受性。
结果如图13～15所示，iheESCs细胞在蜕膜化诱导培养液的作用下，细胞形态变圆，并且IGFBP1和PRL表达升高，说明iheESCs细胞依然具有蜕膜化的生理功能。
实施例4：iheESCs细胞的雌激素应激反应
子宫内膜细胞对雌激素极为敏感，而雌激素应激反应对子宫内膜的生长、增殖极为重要。CCK-8实验发现雌激素明显促进iheESCs细胞的增殖；Transwell实验发现雌激素促进iheESCs细胞的迁移侵袭能力；Western Blot实验分析雌激素促进iheESCs细胞的Keratin、E-cadherin，抑制Vimentin、N-cadherin的表达。说明iheESCs细胞仍然具有正常的雌激素应激反应。
结果如图16～18所示，在雌激素E2作用下，iheESCs细胞分裂和增殖明显升高。
结果如图19～22所示，雌激素E2明显促进iheESCs细胞的迁移、侵袭。
实施例5：iheESCs细胞炎症反应
具有雌激素依赖性子宫内膜异位症的另一特征是其具有明显的炎症反应。本发明通过100μg/ml脂多糖(LPS)诱导iheESCs细胞的炎症反应。qRT-PCR实验检测LPS处理后，IL-1β、IL-6、IL-8和MCP-1等促炎因子表达显著升高，而抑炎因子IL-4表达明显下调。说明iheESCs细胞具有正常的炎症应激反应。
结果如图23～25所示，脂多糖LPS作用下，iheESCs细胞的IL-1β、IL-6的表达明显升高。
实施例6：iheESCs细胞致瘤性检测
永生化细胞均具有恶化的风险，为进一步验证iheESCs细胞是否恶变，证明其在实验用途的可用性。首先在细胞体外水平，通过集落形成实验检测iheESCs细胞的群落形成能力，结果显示对比Ishikawa细胞显著形成大量细胞群落，iheESCs细胞和普通子宫内膜在位间质细胞形成群落数量较少并且无明显差异。裸鼠成瘤实验发现iheESCs细胞和普通子宫内膜在位间质细胞均未诱导裸鼠形成肿瘤，而阳性对照的Ishikawa细胞明显诱导裸鼠形成肿瘤。综上，iheESCs细胞不具有致瘤作用。
结果如图26和27所示，iheESCs细胞和对照细胞的群落形成能力无明显差异，而癌细胞Ishikawa具有极强的群落形成能力；裸鼠成瘤实验表明，对照细胞和iheESCs细胞移植小鼠均未成瘤，而癌细胞Ishikawa明显成瘤。

Claims (3)

1.永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定，其特征在于包括以下步骤：
1)iheESCs细胞构建；
2)iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定。
2.如权利要求1所述永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定，其特征在于在步骤1)中，所述iheESCs细胞构建的具体方法为：
(1)将含有hTERT的目的质粒和慢病毒包装质粒共转染293T工具细胞，36～48h后收集病毒上清液；将上清液感染子宫内膜异位症病人的子宫内膜，24～48h后观察荧光，并提取RNA和蛋白质，通过qPCR及Western Blot检测发现hTERT表达表达明显升高，细胞形态无明显改变；
(2)通过不间断培养对照细胞和感染细胞，发现hTERT过表达后，细胞可多传代至35代，而对照细胞仅能传代至18代；以上数据说明成功过表达hTERT，并且细胞周期成功延长1倍，说明永生化细胞iheESCs构建成功。
3.如权利要求1所述永生化子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞构建和鉴定，其特征在于在步骤2)中，所述iheESCs细胞作为子宫内膜间质细胞特征的鉴定具体方法为：
(1)通过CCK8增值实验检测，iheESCs细胞和对照细胞的增殖无明显差异；而Transwell实验表明iheESCs细胞和对照细胞的迁移、侵袭能力无明显改变；
(2)采用Western Blot检测发现子宫内膜的雌激素受体ERα和ERβ，孕激素受体PR以及Keratin、E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表达为发生改变；免疫细胞化学结果表明，iheESCs和对照细胞的间质标志蛋白Vimentin表达明显，而上皮标志蛋白Keratin表达低，二者均具有明显的间质特征；
(3)采用10nM孕激素和10mMcAMP培养液诱导iheESCs蜕膜化，5～7d后，iheESCs细胞变成丰满圆润，通过qRT-PCR检测发现胰岛素样生长因子结合蛋白-1和催乳素表达明显升高，表明iheESCs的依然保持蜕膜化生理功能；
(4)通过CCK-8实验发现雌激素促进iheESCs细胞增殖，Transwell实验发现雌激素促进iheESCs的迁移、侵袭能力，说明iheESCs细胞具有完善的雌激素应激反应；qRT-PCR和Western Blot检测发现LPS诱导iheESCs的炎症反应，IL-1β和IL-6等炎症因子的表达显著升高，表示iheESCs的炎症反应功能保持正常；
(5)进一步验证iheESCs细胞的增长和致癌性，体外平板克隆群落形成实验提示其增殖和对照细胞移植，不具有子宫内膜癌细胞Ishikawa的恶性增殖的特征；体内裸鼠成瘤实验说明iheESCs不具有致癌能力。
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