CN112190692B

CN112190692B - NrCAM在制备药物中的用途

Info

Publication number: CN112190692B
Application number: CN202011054607.XA
Authority: CN
Inventors: 陈晓军; 程亚丽; 徐郁慧; 吕巧英; 郝萌昕
Original assignee: Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Current assignee: Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN112190692A

Abstract

本申请公开了神经细胞粘附分子(NrCAM)在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病；本申请还公开了子宫内膜间质细胞和/或其培养物与孕激素的组合在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病。

Description

NrCAM在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及NrCAM在制备药物中的用途。

背景技术

由于子宫内膜不典型增生和子宫内膜癌发病年轻化，在治疗的同时保留生育功能是目前遇到的重要临床问题。大剂量孕激素是目前子宫内膜癌保留生育功能治疗的普遍方案，但多年来孕激素治疗的效果始终徘徊在70％-80％，孕激素治疗失败患者不得不切除子宫永久性丧失生育能力，此外还存在孕激素治疗时间长以及治愈后由于内膜损伤导致的生育率低的问题，因此如何获得孕激素替代治疗方案或者提高孕激素治疗的有效率是子宫内膜病变保育治疗中亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本申请的目的在于提供包含子宫内膜间质细胞和/或神经细胞粘附分子(NrCAM)的药物组合，及其在制备用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生病变药物中的用途。

一方面，本申请提供了神经细胞粘附分子(NrCAM)在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病。

在某些实施方式中，所述子宫内膜恶性增生病变包括子宫内膜癌和/或子宫内膜不典型增生。

在某些实施方式中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)具有如下功能的至少一种：

1)提高子宫内膜癌细胞DNA羟甲基化；

2)上调TET1基因的表达；

3)上调子宫内膜癌细胞孕激素受体表达；

4)上调HAND2基因和/或NR2F2基因的表达；

5)抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

在某些实施方式中，所述子宫内膜癌细胞DNA包括PRB基因的启动子区。

在某些实施方式中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)的序列如SEQ ID NO.1所示。

在某些实施方式中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)为所述药物的唯一有效成分。

另一方面，本申请提供了药物组合，其包含：

a)预防和/或治疗有效量的神经细胞粘附分子(NrCAM)；以及

b)预防和/或治疗有效量的孕激素。

1)提高子宫内膜癌细胞DNA羟甲基化；

2)上调TET1基因的表达；

3)上调子宫内膜癌细胞孕激素受体表达；

4)上调HAND2基因和/或NR2F2基因的表达；

5)抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

在某些实施方式中，所述孕激素包括醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮或、左炔诺孕酮、安宫黄体酮。

在某些实施方式中，其中所述神经细胞粘附分子(NrCAM)与所述孕激素各自分别存在于不同的容器中。

在某些实施方式中，所述药物组合包含第一制剂和第二制剂，所述第一制剂包含所述神经细胞粘附分子(NrCAM)和药学上可接受的第一载体，且所述第二制剂包含所述孕激素和药学上可接受的第二载体。

在某些实施方式中，所述药物组合包含药物组合物，且所述药物组合物包含所述神经细胞粘附分子(NrCAM)和所述孕激素。

另一方面，本申请还提供了神经细胞粘附分子(NrCAM)和孕激素的组合在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病。

1)提高子宫内膜癌细胞DNA羟甲基化；

2)上调TET1基因的表达；

3)上调子宫内膜癌细胞孕激素受体表达；

4)上调HAND2基因和/或NR2F2基因的表达；

5)抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

在某些实施方式中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)与所述孕激素被配置为同时向受试者施用。

在某些实施方式中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)与所述孕激素被配置为分别向受试者施用。

另一方面，本申请还提供了药物组合，其包含：

a)预防和/或治疗有效量的子宫内膜间质细胞和/或其培养物；以及

b)预防和/或治疗有效量的孕激素。

在某些实施方式中，所述子宫内膜间质细胞为孕激素受体阳性子宫内膜间质细胞。

在某些实施方式中，所述子宫内膜间质细胞为人子宫内膜间质细胞。

在某些实施方式中，所述孕激素受体阳性的子宫内膜间质细胞包含表达载体，所述载体包含编码孕激素受体的核酸序列。

在某些实施方式中，所述子宫内膜间质细胞能够表达所述神经细胞粘附分子(NrCAM)。

在某些实施方式中，所述子宫内膜间质细胞的培养物包括使用安宫黄体酮处理所述子宫内膜间质细胞所得的培养物。

在某些实施方式中，所述处理所述子宫内膜间质细胞的时间为12-48小时。

在某些实施方式中，所述安宫黄体酮的浓度为10μM。

另一方面，本申请还提供了子宫内膜间质细胞和/或其培养物与孕激素的组合在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病。

在某些实施方式中，所述安宫黄体酮的浓度为10μM。

在某些实施方式中，所述子宫内膜间质细胞的培养物包含所述神经细胞粘附分子(NrCAM)。

另一方面，本申请还提供了另预防和/或治疗子宫内膜恶性增生疾病的方法，其包括：

(1)向有需要的受试者施用治疗/预防有效量的间充质干细胞，或

(2)向有需要的受试者施用如下药物组合：a)预防和/或治疗有效量的神经细胞粘附分子(NrCAM)，以及b)预防和/或治疗有效量的孕激素；

(3))向有需要的受试者施用如下药物组合：a)预防和/或治疗有效量的子宫内膜间质细胞和/或其培养物，以及b)预防和/或治疗有效量的孕激素。

在某些实施方式中，所述安宫黄体酮的浓度为10μM。

1)提高子宫内膜癌细胞DNA羟甲基化；

2)上调TET1基因的表达；

3)上调子宫内膜癌细胞孕激素受体表达；

4)上调HAND2基因和/或NR2F2基因的表达；

5)抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

本申请提供的神经细胞粘附分子(NrCAM)、神经细胞粘附分子(NrCAM)与孕激素的组合、子宫内膜间质细胞或其培养物与孕激素的组合均能够显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖，其各自作为传统高剂量孕激素疗法的替代方案具有如下技术效果：

1)用于治疗对传统高剂量孕激素疗法不敏感或者出现耐药现象的肿瘤患者以达到治疗的效果。

2)神经细胞粘附分子(NrCAM)、子宫内膜间质细胞或其培养物与孕激素联用能够显著降孕激素的施用剂量，从而降低传统化疗药物的负面作用，以提高保留生育功能的治疗效果。

附图说明

图1显示的是本申请中间质细胞条件培养液能够增强孕激素对Ishikawa细胞和ECC-1细胞增殖的抑制作用，其中，图1A显示的是本申请中间质细胞条件培养液能够增强孕激素对Ishikawa细胞增殖的抑制作用，图1B显示的是本申请中间质细胞条件培养液能够增强孕激素对ECC-1细胞增殖的抑制作用。

图2显示的是本申请中间质细胞能够增强MPA对Ishikawa细胞和ECC-1细胞增殖的抑制作用，其中，图2A显示的是本申请中间质细胞能够增强MPA对Ishikawa细胞增殖的抑制作用，图2B显示的是本申请中间质细胞能够增强MPA对ECC-1细胞增殖的抑制作用。

图3显示的是本申请中MPA处理的间质细胞的条件培养基能够增强孕激素对Ishikawa细胞和ECC-1细胞增殖的抑制作用，其中，图3A显示的是本申请中MPA处理的间质细胞的条件培养基能够增强孕激素对Ishikawa细胞增殖的抑制作用，图3B显示的是本申请中MPA处理的间质细胞的条件培养基能够增强孕激素对ECC-1细胞增殖的抑制作用。

图4显示的是本申请中MPA处理的siPGR间质细胞的条件培养基对Ishikawa细胞和ECC-1细胞增殖影响的检测结果以及本申请中siPGR间质细胞中PGR转录和表达水平的检测结果，其中，图4A显示的是本申请中MPA处理的siPGR间质细胞的条件培养基对Ishikawa细胞增殖影响的CCK-8结果，图4B显示的是本申请中MPA处理的siPGR间质细胞的条件培养基对ECC-1细胞增殖影响的CCK-8结果，图4C显示的是本申请中MPA处理的siPGR间质细胞的条件培养基对Ishikawa细胞增殖影响的EdU染色图，图4D显示的是本申请中MPA处理的siPGR间质细胞的条件培养基对ECC-1细胞增殖影响的EdU染色图，图4E显示的是本申请中MPA处理的siPGR间质细胞的条件培养基对Ishikawa细胞增殖影响的EdU染色统计结果，图4F显示的是本申请中MPA处理的siPGR间质细胞的条件培养基对ECC-1细胞增殖影响的EdU染色统计结果，图4G显示的是本申请中siPGR间质细胞中PGR转录水平的QRT-PCR检测结果，图4H显示的是本申请中siPGR间质细胞中PGR表达水平的western blot检测结果。

图5显示的是本申请中MPA处理的间质细胞条件培养基和/或MPA能够增强孕激素对孕激素受体(PR)过表达HEC-1A细胞增殖的抑制作用及HEC-1A细胞PRB蛋白表达水平的检测结果，其中，图5A显示的是本申请中MPA处理的间质细胞条件培养基和/或MPA能够增强孕激素对孕激素受体(PR)过表达HEC-1A细胞增殖的抑制作用，图5B显示的是本申请中HEC-1A细胞PRB蛋白的过表达的westernblot检测结果。

图6显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对Ishikawa细胞和ECC-1细胞孕激素受体表达和转录水平的影响，其中，图6A显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对Ishikawa细胞孕激素受体表达水平的影响，图6B显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对ECC-1细胞孕激素受体表达水平的影响，图6C显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对Ishikawa细胞孕激素受体转录水平的影响，图6D显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对ECC-1细胞孕激素受体转录水平的影响。

图7显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对Ishikawa细胞和ECC-1细胞基因羟甲基化水平和PRB启动子区羟甲基化水平的影响，其中，图7A显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对Ishikawa细胞基因羟甲基化水平的影响，图7B显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对ECC-1细胞基因羟甲基化水平的影响，图7C显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对Ishikawa细胞PRB启动子区羟甲基化水平的影响，图7D显示的是本申请中不同间质细胞条件培养基或MPA对ECC-1细胞PRB启动子区羟甲基化水平的影响。

图8显示的是本申请中NrCAM、BMP2和ITGA10对Ishikawa细胞和ECC-1细胞增殖的影响，其中，图8A显示的是本申请中NrCAM剂量依赖性抑制Ishikawa细胞的增殖活力，图8B显示的是本申请中NrCAM剂量依赖性抑制ECC-1细胞的增殖活力，图8C显示的是本申请中BMP2不影响Ishikawa细胞的增殖，图8D显示的是本申请中BMP2在低剂量下抑制ECC-1细胞的增殖，图8E显示的是本申请中ITGA10促进Ishikawa细胞的增殖，图8F显示的是本申请中ITGA10促进ECC-1细胞的增殖，图8G显示的是本申请中ITGA10不影响Ishikawa细胞的增殖，图8H显示的是本申请中大剂量ITGA10抑制ECC-1细胞的增殖。

图9显示的是本申请中NrCAM能够增强孕激素对Ishikawa细胞、ECC-1细胞和HEC-1A细胞增殖的抑制作用以及不同浓度的BMP2、WISP1或ITGA10对Ishikawa细胞增殖的影响，其中，图9A显示的是本申请中NrCAM能够增强孕激素对Ishikawa细胞增殖的抑制作用，图9B显示的是本申请中NrCAM能够增强孕激素对ECC-1细胞增殖的抑制作用，图9C显示的是本申请中NrCAM能够增强孕激素对HEC-1A细胞增殖的抑制作用，图9D显示的是本申请中不同浓度的BMP2对Ishikawa细胞增殖的影响，图9E显示的是本申请中不同浓度的WISP1对Ishikawa细胞增殖的影响，图9F显示的是本申请中不同浓度的ITGA10对Ishikawa细胞增殖的影响。

图10显示的是本申请中干扰间质细胞NrCAM的QRT-PCR检测和westernblot检测结果以及干扰间质细胞NrCAM的条件培养基能够增加Ishikawa细胞和ECC-1细胞的增殖活力，其中，图10A显示的是本申请中干扰间质细胞NrCAM的QRT-PCR检测结果，图10B显示的是本申请中干扰间质细胞NrCAM的westernblot检测结果，图10C显示的是本申请中干扰间质细胞NrCAM的条件培养基能够增加Ishikawa细胞的增殖活力，图10D显示的是本申请中干扰间质细胞NrCAM的条件培养基能够增加ECC-1细胞的增殖活力。

图11显示的是本申请中不同浓度MPA呈剂量依赖性增加间质细胞NrCAM蛋白的表达以及MPA对PGR敲低的间质细胞NrCAM的表达影响的westernblot检测及其结果统计，其中，图11A显示的是本申请中不同浓度MPA呈剂量依赖性增加间质细胞NrCAM蛋白的表达，图11B显示的是本申请中MPA对PGR敲低的间质细胞NrCAM的表达影响的westernblot检测结果，图11C显示的是本申请中MPA对PGR敲低的间质细胞NrCAM的表达影响的western blot检测结果统计图。

图12显示的是本申请中NrCAM处理Ishikawa细胞或ECC-1细胞对PGR及其下游靶基因HAND2、NR2F2转录水平的影响以及对PR蛋白表达水平的影响，其中，图12A显示的是本申请中NrCAM处理Ishikawa细胞对PGR及其下游靶基因HAND2、NR2F2转录水平的影响，图12B显示的是本申请中NrCAM处理ECC-1细胞对PGR及其下游靶基因HAND2、NR2F2转录水平的影响，图12C显示的是本申请中NrCAM处理Ishikawa/ECC-1细胞对PR蛋白表达水平的影响。

图13A显示的是本申请中NrCAM处理Ishikawa或ECC-1细胞能够提高DNA羟甲基化水平和PRB启动子区羟甲基化水平、NrCAM处理Ishikawa细胞能够提高TET1和PGR转录水平以及NrCAM处理TET1敲减的Ishikawa细胞对PRB启动子区羟甲基化水平没有影响，其中，图13A显示的是本申请中NrCAM处理Ishikawa/ECC-1细胞能够提高DNA羟甲基化水平，图13B显示的是本申请中NrCAM处理Ishikawa细胞能够提高PRB启动子区羟甲基化水平，图13C显示的是本申请中NrCAM处理ECC-1细胞能够提高PRB启动子区羟甲基化水平，图13D显示的是本申请中NrCAM处理Ishikawa细胞能够提高TET1和PGR转录水平，图13E显示的是本申请中NrCAM处理TET1敲减的Ishikawa细胞对PRB启动子区羟甲基化水平没有影响。

图14显示的是本申请中NrCAM对裸鼠宫角移植瘤生长的影响。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

在本申请中，术语“神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule，NrCAM)”通常是指一种属于非钙依赖性粘附因子糖蛋白或其功能性变体。天然人NrCAM有多种亚型，目前已经鉴定出的有20种，OMIM/位置为6015817q31.1-q31.2。NrCAM能介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质间相互作用,在细胞的识别及转移、神经再生、跨膜信号的传导、学习和记忆等方面均起着一定的作用，例如本申请中NrCAM可以包括如SEQ ID NO.1所示序列。

在本申请中，术语“功能性变体”通常是指在天然多肽序列上进行氨基酸修饰(例如基团取代等)或者进行一个或多个氨基酸的插入、取代、和/或缺失(例如缺失一段氨基酸序列的截短体)从而得到的多肽序列。其可以全部或部分保留原天然多肽序列的功能，还可以具有比原天然多肽序列改进的功能。例如，所述功能性变体可以比原序列具有更好的生物活性(或功能)。例如，所述保留不必是完全保留。例如，所述功能性变体可以基本保留原序列功能，例如，保留原序列至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，或99％的功能。例如，具有原序列105％、110％、115％、125％、140％、160％、180％、200％、230％、260％的功能。例如，所述功能性变体的氨基酸序列可以与原氨基酸序列至少70％，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同。

在本申请中，术语“子宫内膜恶性增生疾病”通常指子宫内膜组织中由异常细胞生长形成赘生物或实体病变。例如，子宫内膜癌或子宫内膜不典型增生(也称作癌前病变)。子宫内膜不典型增生为子宫内膜增生的一种类型，其腺上皮有异型性，属于子宫内膜的上皮内肿瘤。具有癌变倾向。

在本申请中，术语“孕激素受体(progestogen receptor,PR/PGR)”通常是指人类中由位于Chr11:100.9–101Mb基因编码的核受体，其mRNA序列参见NM_000926，蛋白序列参见NM_008829。人类的PR存在PRA和PRB两种亚型，它们来源于同一个基因，经不同的启动子转录并翻译成两种亚型。PRB由933个氨基酸构成，相对分子质量为116000。PRA是PRB的截断形式，缺失N末端的164个氨基酸，共由769个氨基酸构成，相对分子质量为94000。

在本申请中，术语“子宫内膜间质细胞培养物”通常是指子宫内膜间质细胞经一段时间(例如4小时，8小时，12小时，16小时，20小时，24小时，36小时，48小时或更长时间)的培养后，除去所述子宫内膜间质细胞所得的培养液。在某些实施方式中，所述子宫内膜间质细胞培养物可以是子宫内膜间质细胞经有效浓度的孕激素(例如安宫黄体酮)培养所得。

在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指药学上可接受的涉及携带、储存、转运或施用细胞制剂的物质、组合物或媒介物。例如液体、半固体或固体填充剂，稀释剂，等渗剂，溶剂或包囊材料。

在本申请中，术语“药物组合”通常是指包含至少两种活性成分/治疗剂的组合。在一些实施方式中，各个活性成分/治疗剂可以各自制备成独立的制剂(固体、液体、凝胶体等)，在一些实施方式中，各个活性成分/治疗剂可以存在于不同的容器中，还可以在需要的时候同时或分别与合适的载体配制成期望的制剂；在一些实施方式中，各个活性成分/治疗剂可以是不同来源的(例如不同的商家制备生产或销售的)；在一些实施方式中，各个活性成分/治疗剂可以以混合的形式形成药物组合物，也称作药物组合物。

在本申请中，术语“表达载体”通常是指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。例如质粒。

在本申请中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退(这通过疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期的频度和持续时间的增加、或者由于罹患疾病而引起的损害或残疾的预防来证明)的任何药物量。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”通常是指当单独或与另一种治疗剂组合给有疾病发展或疾病复发的风险的受试者施用时抑制疾病的发展或复发的药物量。可以使用本领域技术人员已知的多种方法对治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力进行评估，比如在处于临床试验期间的人类受试者中、在动物模型系统中预测对人类的功效、或者通过在体外测定中测定药剂的活性。

在本申请中，术语“施用”通常是指通过任意引入或递送途径将所述药物或药物组合引入受试者的身体中。可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与所述药物组合接触的任何方法。例如，皮下注射、静脉注射或经阴道递送。

细胞株

(1)正常子宫内膜间质细胞均来自于2016年1月至2017年12月于复旦大学附属妇产科医院接受治疗的患者。原代提取正常子宫内膜间质细胞(来自绝经前、因“子宫肌瘤”行全子宫切除术的手术标本)共20例。病理诊断由两位及以上病理医师确认。参与研究患者同意术中取材并签署书面知情同意书。所有患者六个月内均未接受激素治疗。

原代细胞提取及培养步骤：1)取标本后放于无菌装有37℃预热的Hank's平衡盐溶液(HBSS)的离心管中运回；2)将子宫内膜组织在无菌条件下置于HBSS中去除血和组织碎片；3)将组织移入10cm培养皿中，在HBSS中剪成1mm³左右肉糜样组织小块，移入15ml离心管；4)离心1000rpm，6min。弃上清，4mlHBSS重悬，移入新15ml离心管；5)加I型胶原蛋白酶(6.4mg/ml)1ml，于37℃摇床消化2h；6)无菌吸管反复吹吸组织，加入细胞培养基终止消化，离心1000rpm，6min；7)弃上清，HBSS重悬，将100μm孔径的滤网放于培养皿内，将细胞悬液滴至滤网，镊子提起滤网，待液体滴落后，HBSS清洗滤网并弃去，此时滤过的细胞悬液为间质细胞和子宫内膜上皮细胞的混合物；8)将40μm孔径的滤网放于新的培养皿内，将细胞悬液滴至滤网，镊子提起滤网，待液体滴落后，HBSS清洗滤网，此时滤过的细胞悬液为间质细胞，腺上皮细胞被阻挡在滤网上，将过滤的细胞悬液移至15ml离心管，标记为NSC；9)将滤网倒置于新的培养皿上，HBSS冲洗滤网，将滤液移至新的15ml离心管，标记为NEC；10)两个离心管配平离心1000rpm，6min；11)弃上清，细胞培养基重悬NSC，用Defined-KSFM培养基重悬NEC后转移至培养皿，“之”字法混匀后放入37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中培养。

(2)子宫内膜癌细胞Ishikawa、子宫内膜癌细胞ECC-1、子宫内膜癌细胞HEC-1A均购自美国典藏细胞库，ATCC。

实验动物

本申请实施例中的实验动物购买于上海斯莱克实验动物有限公司，为雌性BALB/C裸鼠，3-4周。

统计学方法

本申请实施方式中所有实验至少重复3次，使用SPSS22.0进行数据统计分析。如果为两组独立样本，行t检验和双边检验。如果为多组独立样本，行ANOVA检验。差异性检验以P值(双尾)<0.05为标准。图示中，*:P<0.05，**:P<0.01,***:P<0.001,n.s.无统计学意义。

本申请实施方式中数据分析软件有GraphPad Prism 7.0，SPSS 22.0，MicrosoftExcel。

本申请实施方式中所用图像分析软件为Adobe Photoshop CS，Image J 3.0，OmniGraffle。

实施例1间质细胞条件培养基增强孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用

为验证间质细胞(NSC)是否通过旁分泌增强孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用，以常规方式按照相关产品说明书进行实验，使用细胞完全培养基(DMEM/F12培养基(购自Hyclone，USA)+10％胎牛血清(购自GIBCO，USA)+1％三抗混匀配制(购自GIBCO，USA))培养原代子宫内膜间质细胞48小时后，收集培养液(条件培养基，conditional medium，CM)，用于培养子宫内膜癌细胞Ishikawa(购自美国典藏细胞库，ATCC)和ECC-1(购自美国典藏细胞库，ATCC)，同时加入/不加入(+/-)MPA(安宫黄体酮，终浓度为10μM)培养48h，使用CCK-8试剂盒增殖实验检测子宫内膜癌细胞的增殖情况。具体步骤如下：

1.子宫内膜癌细胞复苏：1)提前1小时将8ml细胞培养基放入细胞培养箱预热并调水浴锅至37℃；2)分别将装有Ishikawa和ECC-1细胞悬液的冻存管从液氮罐中拿出，迅速放入37℃温水浴快速融化；3)冻存管口酒精消毒，于无菌操作台中拧开冻存管管盖，小心移出细胞悬液至有约4ml培养基的15ml离心管中，离心1000rpm，3min；4)弃上清，加入适量培养基于细胞沉淀中，轻柔吹打混匀，移至预热培养皿，“之”字晃动培养皿混匀细胞后将其放于37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中培养；5)8小时后小心拿出培养皿将其放于倒置显微镜下观察细胞贴壁和生长状态，生长良好者进行细胞换液。传代2-3次细胞状态稳定后，可进行功能学实验。

2.细胞消化传代：

1)在光学显微镜下观察到细胞的汇合度，汇合度达80％-90％时，可进行传代；2)将培养基吸去，并用无菌PBS清洗两次，加入1ml胰蛋白酶/大皿，37℃培养箱中消化3min；3)加入3ml培养基中和胰蛋白酶使其停止消化；4)轻轻吹打细胞，这时候细胞不贴壁漂浮在培养液中，用吸管收集至15ml离心管中；5)装有细胞悬液的离心管离心1000rmp，3min；6)用枪头吸去上清液，加入完全培养基重悬细胞；7)取新的10cm大皿铺板，以1:3倍数铺板传代。

3.间质细胞条件培养基(CM)收集：1)间质细胞密度在80％-90％时消化传代；2)6孔板铺板，每孔细胞量为1x10⁵个；3)24h后细胞贴壁，用PBS洗涤2次，换完全细胞培养基；4)待显微镜下细胞密度为70％-80％左右，吸去培养液，用PBS洗涤2次；5)每孔换成含1％碳吸附血清的无酚红细胞培养基，每孔4ml；6)24小时后收集间质细胞条件培养基ConditionalMedium(CM)；7)将收集的条件培养液离心1000rpm，15min；8)取上清液，于-80℃保存，用于后续实验。

4.间质细胞的CM和MPA处理子宫内膜癌细胞：1)将-80℃保存的条件培养基取出解冻融化；2)Ishikawa和ECC-1细胞铺板于96孔板中，每孔1000个细胞，放置于培养箱培养24小时；3)吸除细胞培养液，PBS洗涤2次，每孔加入100μl条件培养基，实验组加入终浓度为10μM的安宫黄体酮；4)培养48h后，吸除条件培养基，PBS洗涤2次，每孔加入预先配制的10％的CCK8溶液100μl；5)注意避光，放置于培养箱中孵育60min；6)用酶标仪测定每孔在450nm处的吸收光，测定OD值，进行统计分析。

结果如图1A-B所示，对于Ishikawa细胞，MPA组、CM(NSC)+MPA组的抑制率分别为11.72％、22.79％,CM(NSC)对Ishikawa没有明显抑制作用；在ECC-1细胞，MPA组、CM(NSC)+MPA组的抑制率分别为7.26％、25.88％，CM(NSC)对ECC-1没有明显抑制作用。这表明当子宫内膜间质细胞条件培养液联合MPA作用于子宫内膜癌细胞后，可以显著增强孕激素对子宫内膜癌细胞的抑制作用，即内膜间质细胞可以通过其分泌因子增强孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。

实施例2间质细胞增强孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用

使用间质细胞和子宫内膜癌细胞直接接触并+/-MPA(终浓度10μM)的方法，培养48h进行验证，CCK-8方法检测子宫内膜癌细胞的增殖情况。具体步骤如下：(1)取对数期生长的子宫内膜癌细胞Ishikawa/ECC-1、间质细胞(NSC)常规消化调整细胞浓度后按照间质细胞(500个/孔)、子宫内膜癌细胞(1000个/孔)、子宫内膜癌细胞(2000个/孔)+间质细胞(1000个/孔)接种于96孔板，每组10个重复，置细胞培养箱培养；(2)24h后观察细胞状态，应用无酚红培养基饥饿8h；(3)弃去静止液，换用含1％炭吸附血清的无酚红培养基，每组5个重复中加入10μMMPA，剩余对照组以加等体积的无水乙醇作为容积对照，培养48h；(4)观察细胞状态，且共培养组细胞汇合度为80％左右，弃去上清，使用CCK-8方法检测细胞增殖程度；(5)分析数据时共培养处理组吸光度减去间质细胞组吸光度来反映子宫内膜癌细胞增殖活力。

结果如图2A-B所示,对于Ishikawa细胞，MPA组、NSC+MPA组抑制率分别为16.44％，27.13％，单用NSC没有明显抑制作用；对于ECC-1细胞，MPA组、NSC+MPA组抑制率分别为10.39％，16.26％，单用NSC没有明显抑制作用。这表明单纯间质细胞对子宫内膜癌细胞的增殖没有明显抑制作用，但间质细胞可以增加孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用，且抑制幅度与间质细胞条件培养液联用孕激素对子宫内膜癌细胞的抑制幅度相当。因此上述结果说明间质细胞可以通过旁分泌作用协同孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖起到抑制作用。

实施例3孕激素作用后的间质细胞微环境增强孕激素对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用

参照实施例1中的方法，用MPA(终浓度10μM)预处理间质细胞48h,收集条件培养基后与子宫内膜癌细胞Ishikawa/ECC-1共培养，同时设置多组对照，CCK-8方法检测各组子宫内膜癌细胞的增殖情况。

结果如图3A-B所示，图中MPA为MPA单药组(终浓度10μM)，CM(NSC)为间质细胞条件培养基处理组，CM(NSC)+MPA为间质细胞条件培养基与MPA(终浓度10μM)的联用组，CM(NSC+MPA)为MPA预处理间质细胞后收集的条件培养基的处理组，CM(NSC+MPA)+MPA为为MPA预处理间质细胞后收集的条件培养基与MPA(终浓度10μM)联用组，2xMPA为MPA单药组(终浓度20μM)，对于Ishikawa细胞，MPA、CM(NSC)+MPA、CM(NSC+MPA)、CM(NSC+MPA)+MPA、2xMPA(20μM)组细胞抑制率分别为：11.72％、22.79％、24.95％、49.12％、39.53％，CM(NSC)没有明显抑制作用；在ECC-1细胞，MPA、CM(NSC)+MPA、CM(NSC+MPA)、CM(NSC+MPA)+MPA、2xMPA(20μM)组细胞抑制率分别为：7.26％、25.88％、13.35％、45.94％、14.61％，CM(NSC)没有明显抑制作用。这表明孕激素预处理的条件培养液对子宫内膜癌细胞有明显的抑制作用(抑制率：24.95％(Ishikawa),13.35％(ECC-1))，并且该条件培养液联合孕激素对癌细胞的抑制作用进一步增强(抑制率：49.12％(Ishikawa),45.94(ECC-1))比2xMPA的抑制效果(抑制率：39.53％(Ishikawa),14.61％(ECC-1)更显著，说明孕激素可以通过促进子宫内膜间质细胞分泌因子的释放增强孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。

实施例4孕激素通过间质细胞的孕激素受体增强孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用

应用si-PGR敲减间质细胞的孕激素受体(PGR干扰靶序列如SEQ ID NO.2所示)并用QRT-PCR和WB的方法检测其干扰效果，之后提取其条件培养基处理子宫内膜癌细胞48h，CCK-8和EdU增殖期细胞染色检测子宫内膜癌细胞增殖情况。具体步骤如下：

1.si-PGR

(1)转染前一天取生长状态良好的间质细胞，常规消化、重悬、调整细胞浓度后接种，摇匀放入细胞培养箱中培养；(2)待细胞密度达到50％-60％时，用无血清无双抗的DMEM/F12细胞培养基(静止液)饥饿8h；(3)稀释siPGR:将5μlsiPGR储存液加入至125μl无血清opti-MEM培养基中配成A液，轻轻混匀，室温静置5min；(4)稀释lipo3000:将5μllipo3000加入至125μl无血清opti-MEM培养基中配成B液，轻轻混匀，室温静置5min；(5)将A液和B液轻轻混匀，室温孵育15min；(6)弃去6孔板中的细胞培养液，每孔分别加入1750μl无抗生素培养基；(7)将含有siRNA-lipo3000的混合液加入6孔板中，轻轻混匀，放入细胞培养箱中培养，培养8h后，弃去6孔板中的培养液，加入含有新鲜DMEM/F-12细胞培养基，放入细胞培养箱培养；(8)转染效果检测：转染后24-72h可以进行siRNA沉默效果检测，RNA水平检测为检测沉默效率的最佳指标，采用QRT-PCR检测方法，于培养24h后，提取细胞RNA进行检测；蛋白水平检测为检测沉默效率的重要指标，采用WB检测方法，培养48h后，提取细胞蛋白质进行检测。(9)参照相关试剂说明书按照常规方式进行QRT-PCR和westernblot检测。使用mRNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取细胞RNA，使用GoScript^TM逆转录试剂盒(Promega)进行逆转录反应，使用2x SYBR Green qPCR Master Mix(Bimake)进行QRT-PCR反应，得到CT值之后，利用Graph Primer软件计算mRNA相对量，分析统计学差异。其中，QRT-PCR所用引物为：PGR正向引物(SEQ ID NO.7)；PGR反向引物：(SEQ ID NO.8)。GAPDH正向引物如SEQ ID NO.5所示，GAPDH反向引物如SEQ ID NO.6所示。western blot检测中抗孕激素受体抗体购自Santa Cruz，货号SC-166169，以1：200浓度使用，抗GAPDH抗体购自CellSignaling Technology，货号#5174，以1：1000浓度使用，二抗购自Cell SignalingTechnology，货号分别为7076，7074，以1：2000浓度使用。

之后参照实施例1的方式收集NSC/NSC-siPGR细胞的条件培养基处理Ishikawa/ECC-1子宫内膜癌细胞48h，并进行CCK-8检测。EdU增殖期细胞染色步骤如下：

(1)按照CCK-8实验相同的方式进行细胞铺板，用细胞培养基按照1000:1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50uM EdU培养基；(2)每孔加入100μl 50uM EdU培养基于37℃孵育2h，弃去培养基，PBS清洗细胞1-2次，每次5min。(3)细胞固定：1)每孔加入50μl细胞固定液(4％多聚甲醛)室温孵育30min，弃固定液；2)每孔加入50μl、2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5min后，弃甘氨酸溶液；3)每孔加入100μl PBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS；4)每孔加入100μl渗透剂(0.5％Triton-100)脱色摇床孵育10min，PBS清洗5min，弃PBS。(4)Apollo染色：1)每孔加入100μl的1XApollo染色反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；2)加入100μl渗透剂(0.5％Triton-100)脱色摇床清洗10min*2-3次，弃渗透液；3)每孔加入100μl甲醇清洗5min，1-2次，PBS清洗5min。(5)DNA染色：1)去离子水稀释Hochest,制备1XHochest反应液，避光保存；2)每孔加入100μl 1X Hochest反应液，室温避光,脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；3)PBS清洗3次后2h内荧光显微镜拍摄照片。

实验结果如图4A-H所示，其中，A-B为MPA(终浓度10μM)预处理NSC/NSC-siPGR细胞48h，收集条件培养液处理Ishikawa/ECC-1细胞48h，CCK-8方法检测细胞增殖活力的结果；C-D为MPA(终浓度10μM)预处理NSC/NSC-siPGR细胞48h，收集条件培养液处理Ishikawa/ECC-1细胞48h，EdU方法检测处于增殖期细胞数的结果；E-F为EdU增殖期细胞统计图，随机取5个100x视野，计算EdU/Hochest比值，标定Ctrl组为1；G-H为由QRT-PCR和WB验证的siPGR在NSC细胞中的干扰效果；EdU标记处于增殖期细胞，Hochest标定细胞核。以上结果均显示，干扰间质细胞孕激素受体(PR)后，无论是否加用MPA，间质细胞条件培养液对于子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用消失，表明孕激素通过间质细胞孕激素受体(PR)增强了旁分泌因子的分泌从而增加了其协同孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。

实施例5间质细胞微环境增强孕激素的增殖抑制作用与子宫内膜癌细胞孕激素受体表达水平相关

参照实施例3的方式收集间质细胞条件培养基处理孕激素受体(PR)弱阳性的子宫内膜癌细胞HEC-1A，以及转染pcDNA3.0-PRB质粒(质粒信息参见“Tumor suppressor SPOPmediates the proteasomal degradation of progesterone receptors(PRs)in breastcancer cells”，Am J Cancer Res.2015Sep15；5(10):3210-20.eCollection2015.)的HEC-1A细胞，并按照实施例4中的方式进行westernblot检测。CCK-8结果如图5A-B所示，其中，A为CCK-8方法检测MPA处理的间质细胞条件培养液联合MPA处理48h，能够逆转HEC-1A细胞的孕激素抵抗，且增加孕激素对HEC-1A-PR过表达细胞增殖抑制作用。B为HEC-1A细胞PRB蛋白的过表达westernblot检测结果。以上显示单独孕激素对HEC-1A无明显抑制作用，但加用间质细胞条件培养液后，孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用明显增强。在HEC-1A中转染pcDNA3.0-PRB质粒，并用WB的方法检测转染效率后，CCK-8数据显示：孕激素作用的间质细胞条件培养液能明显增加孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用，表明间质细胞微环境可以通过上调子宫内膜癌细胞PR从而增强孕激素对子宫内膜癌细胞的抑制作用。

实施例6孕激素处理的间质细胞的条件培养基上调子宫内膜癌细胞孕激素受体表达

为验证间质细胞微环境是否通过上调子宫内膜癌细胞PR增加孕激素对子宫内膜癌细胞增殖抑制作用，按照实施例3的方式收集各组间质细胞条件培养基，用间质细胞条件培养液处理子宫内膜癌细胞48h，QRT-PCR和westernblot检测其孕激素受体表达，QRT-PCR中所用PGR正向引物如SEQ ID NO.7所示，PGR反向引物如SEQ ID NO.8所示，western blot检测中抗孕激素受体抗体购自SantaCruz，货号SC-166169，以1：200浓度使用，抗GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology，货号#5174，以1：1000浓度使用，二抗购自CellSignaling Technology，货号分别为7076，7074，以1：2000浓度使用。

结果如图6A-D所示，其中，图A-B为western blot结果显示的间质细胞条件培养液培养Ishikawa或ECC-1细胞48h，CM(NSC)组PRB蛋白表达升高，CM(NSC+MPA)组PRB表达进一步升高，CM(NSC-siPGR)和CM(NSC-siPGR+MPA)组PRB表达无明显变化。图C-D为QRT-PCR结果显示间质细胞条件培养液培养Ishikawa/ECC-1细胞24h，CM(NSC)组PGR mRNA表达升高微弱或无统计学意义，CM(NSC+MPA)组PGR表达明显升高。这说明间质细胞条件培养液能够增加子宫内膜癌细胞孕激素受体的表达，而孕激素处理的间质细胞条件培养液能进一步增加子宫内膜癌细胞孕激素受体的表达，敲减间质细胞PGR后，无论是否经MPA刺激，其条件培养基对PR的上调作用均降低。上述条件培养液对子宫内膜癌细胞PGR的mRNA表达谱分析同样证实了该结果。

实施例7孕激素处理的间质细胞的条件培养基上调子宫内膜癌细胞孕激素受体PRB编码基因启动子区羟甲基化修饰

子宫内膜癌细胞PR基因第一外显子区域和启动子区域含有丰富的CpG岛，该部位发生基因甲基化修饰能够降低孕激素受体的表达。5mC修饰和5hmC修饰都与基因表达密切相关，5hmC可通过改变DNA甲基化状态来阻止肿瘤抑制基因和凋亡基因失活，在肿瘤发生和发展过程中起一定阻碍作用。表观遗传学调控是微环境调控肿瘤细胞的重要机制，本实施例分析间质细胞微环境是否通过羟甲基化修饰上调子宫内膜癌细胞孕激素受体的表达。

用间质细胞条件培养液处理子宫内膜癌细胞24h，之后进行点杂交及HmeDIP实验，具体步骤如下：

1.DNA的提取

(1)取对数生长期的子宫内膜癌细胞常规消化传代，调整细胞浓度后，以1x10⁵/孔接种于六孔板，细胞贴壁24h后观察细胞汇合度60％-70％左右时，无血清无酚红培养基饥饿8h按照实验设计处理子宫内膜癌细胞，培养24h后弃去培养基。PBS缓冲液洗1次，无EDTA的胰酶消化细胞，待细胞收缩变圆时终止消化，室温离心1000rpm，3min，弃去PBS。

(2)使用QIAGEN试剂盒提取DNA：1)200μl PBS重悬细胞样品，吸取20μl的QIAGEN蛋白酶加入样品中，充分混匀；2)加入200μl Buffer AL至样品中，涡旋振荡15s混匀；3)56℃孵育10min；4)快速离心，去除残留在1.5ml离心管盖子中的液滴；5)加入200μl(样品等体积)的乙醇(96-100％)，涡旋振荡15s混匀，振荡完毕后，快速离心，去除残留在1.5ml EP管盖子中的液滴；6)将上述混合物转移至QIAamp Mini离心管柱，注意不要弄湿边缘的环。扣上盖子，6000g离心1min。将QIAamp Min离心柱放入一个新的干净2ml接收管中，将滤液连同使用过的收集管丢弃；7)小心打开QIAamp Mini离心柱，加入500μl Buffer AW1(注意不要将边缘环弄湿)。盖紧盖子，离心8000rpm，1min。将QIAamp Mini离心柱转移至一个新的2ml收集管中，将滤液连同使用过的收集管丢弃；8)弃滤液，小心打开QIAamp Mini离心柱，加入500μl Buffer AW2(注意不要将边缘环弄湿)。盖紧盖子，最大转速离心14000rpm，3min；9)将QIAamp Mini离心柱转移到一个新的2ml收集管。最大转速离心1min，降低Buffer AW2残留的可能性；10)将QIAamp Mini离心柱转移到一个新的1.5ml收集管。小心打开离心柱，加入50μl Buffer AE，室温(15-25℃)孵育5min，然后离心8000rpm，1min。

2.点杂交

(1)使用NanoDrop 2000测出DNA浓度及A260/A280确认DNA质量，按照500ng/μl、1000ng/μl调节各样本浓度后离心备用；(2)设置逆转录仪，按照95℃，10min，4℃forever的程序处理备用样本。裁剪醋酸纤维素膜备用；(3)迅速离心，分别取1μl仔细地滴在NC膜上，室温晾干，紫外照射蛋白交联5min；(4)封闭、敷一抗、敷二抗、显影步骤与WB相同。(5)显影后回收NC膜，TBST摇床清洗5min，按照美蓝原液:ddH₂O＝1:1的比例配制美蓝工作液；(6)将NC膜置于美蓝工作液，均匀染色30s后，ddH₂O清洗2min，2次，置于干净滤纸上，待条带湿润未干时拍摄美蓝染色对照图。

3.HmeDIP

(1)QIADEN试剂盒提取基因组DNA；(2)超声碎裂产生100-600bp的随机片段，结果用琼脂糖凝胶电泳方法验证；(3)取5ug DNA 95℃变性10min，冰上冷却；(4)将DNA用IPbuffer溶解成500ul，充分混匀后取50ul作为Input。剩余EP管中加入0.5ul 5hmC抗体4℃摇床过夜(IPbuffer:10mM磷酸钠+140mM氯化钠+0.05％TritonX-100)；(5)快速离心EP管，混合物中加入30ul琼脂糖珠(用剪去尖头并用火烧过的100ul枪头吸取)4℃摇床孵育4h；(6)快速离心EP管，弃上清后1ml的IPbuffer清洗三遍；(7)250ul消化液重悬磁珠(消化液:50MmTris(PH8.0)+10Mm EDTA+0.5％SDS),加入5ul蛋白酶K(20mg/ml)，密封管口，56℃摇床过夜；(8)快速离心EP管，78℃孵育30min使蛋白酶K失活；(9)快速离心EP管并取出Input组，应用酚氯仿法提取DNA，QRT-PCR方法分析结果。

结果如图7A-D所示，其中，A-B为点杂交实验结果，间质细胞条件培养液培养Ishikawa/ECC-1细胞24h，CM(NSC)组基因羟甲基化水平无明显改变，CM(NSC+MPA)组基因羟甲基化水平明显升高，CM(NSC-siPGR)和CM(NSC-siPGR+MPA)组基因羟甲基化水平无明显改变。C-D为HmeDIP结果，间质细胞条件培养基培养Ishikawa/ECC-1细胞24h，CM(NSC)组PRB启动子区羟甲基化水平无明显改变，CM(NSC+MPA)组PRB启动子区羟甲基化水平明显升高，CM(NSC-siPGR)和CM(NSC-siPGR+MPA)组PRB启动子区羟甲基化水平明显降低或无改变。即，子宫内膜间质细胞条件培养基能够增加子宫内膜癌细胞DNA及PRB启动子区的羟甲基化水平，而孕激素预处理的间质细胞条件培养基能进一步增加子宫内膜癌细胞DNA及PRB启动子区的羟甲基化水平，敲减间质细胞PGR后，无论是否经MPA刺激，间质细胞条件培养液对基因羟甲基化上调作用均减弱。表明间质细胞分泌因子通过对子宫内膜癌细胞PRB的羟甲基化修饰促进PR表达，从而增强孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。

实施例8神经细胞粘附分子(NrCAM)是间质细胞协同孕激素抑制子宫内膜癌细胞增殖的重要分泌因子

比较MPA(终浓度10μM)作用前后间质细胞的表达谱的差异基因。根据RNAseq结果筛选出表达谱中差异倍数较高的前100个基因，并应用Signal IP 3.0软件分析基因信号肽，共预测性地筛选出10个潜在的分泌蛋白。QRT-PCR方法显示在MPA作用后，NrCAM、BMP2、WISP1和ITGA104个分泌因子mRNA水平显著升高，间质细胞siPGR后孕激素对上述4个分泌因子的上调作用减弱，因此上述四个分泌因子作为孕激素作用后间质细胞分泌的候选分泌因子进行后续工作。

添加外源性人重组分泌蛋白处理Ishikawa/ECC-1细胞48h，CCK-8分析4个分泌因子对子宫内膜癌细胞的增殖影响。果如图8A-H所示，其中A-B显示NrCAM(序列如SEQ IDNO.1所示)剂量依赖性抑制Ishikawa/ECC-1细胞增殖活力；C-D显示BMP2在低剂量下抑制ECC-1细胞增殖，高剂量时抑制作用消失，BMP2不影响Ishikawa细胞增殖；E-F显示TGA10促进Ishikawa/ECC-1细胞增殖；G-H显示大剂量WISP1抑制ECC-1细胞增殖，不影响Ishikawa细胞增殖。即，NrCAM显著抑制子宫内膜癌细胞增殖，且该抑制作用呈剂量依赖性。BMP2在低剂量(<10ng/ml)时抑制ECC-1细胞增殖，高剂量时抑制作用消失，但不影响Ishikawa细胞增殖。ITGA10促进Ishikawa/ECC-1增殖。大剂量WISP1(10000ng/ml)抑制ECC-1增殖，但不抑制Ishikawa细胞增殖。该表明NrCAM可能是子宫内膜间质细胞抑制子宫内膜癌细胞增殖的主要分泌因子。

实施例9神经细胞粘附分子(NrCAM)协同孕激素抑制子宫内膜癌细胞增殖

外源性添加人重组分泌蛋白NrCAM(1000ng/ml),+/-MPA(10μM)处理Ishikawa/ECC-1/HEC-1A细胞48h，CCK-8检测细胞增殖情况。结果如图9A-F所示，A-C显示NrCAM(1000ng/ml)和/或MPA(10μM)处理Ishikawa/ECC-1/HEC-1A细胞48h，NrCAM明显增加孕激素敏感性。D显示BMP2(1,10,1000,1000ng/ml)和/或MPA(10μM)处理Ishikawa细胞48h,BMP2降低孕激素敏感性。E.WISP1(1,10,1000,1000,10000ng/ml)和/或MPA(10μM)处理Ishikawa细胞48h，WISP1不影响孕激素敏感性。F.ITGA10(1，10，1000，1000，10000ng/ml)和/或MPA(10μM)处理Ishikawa细胞48h,ITGA10降低孕激素敏感性。结果表明NrCAM(1000ng/ml)联合MPA(10μM)能明显抑制子宫内膜癌细胞增殖；而WISP1不影响孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用，BMP2,ITGA10降低了孕激素对子宫内膜癌细胞的增殖抑制作用。

实施例10si-NrCAM间质细胞的条件培养基促进子宫内膜癌细胞增殖

参照实施例4中的方法干扰间质细胞NrCAM的表达，靶序列如SEQ ID NO.3所示。干扰间质细胞NrCAM后，QRT-PCR和western blot(WB)WB验证siNrCAM在NSC细胞中的干扰效果，QRT-PCR所用正向引物如SEQ ID NO.xx所示，反向引物如SEQ ID NO.xx所示，WB所用抗NrCAM抗体购自Proteintech，货号21608-1-AP，以1：1000浓度使用，二抗体购自CST，货号7074，以1：2000浓度使用。验证后收集NrCAM干扰的间质细胞条件培养基处理内膜癌细胞48h，CCK-8检测细胞增殖情况。

结果如图10A-D所示，A-B显示的是QRT-PCR和WB验证siNrCAM在NSC细胞中的干扰效果。C-D显示的是干扰间质细胞NrCAM,+/-MPA(10μM)预处理48h后，收集条件培养液处理Ishikawa/ECC-1细胞48h，CCK-8方法检测细胞增殖活力的结果，其表明：干扰NrCAM的间质细胞条件培养液增加子宫内膜癌细胞的增殖活力。

实施例11MPA通过作用于间质细胞孕激素受体促进NrCAM的分泌

分别将不同浓度的MPA(5，10，20μM)加入间质细胞或PGR干扰的间质细胞(siPGR)，参照前述方法通过QRT-PCR和western blot(WB)检测NrCAM的表达。结果如图11A-C所示，图A-B显示不同浓度MPA呈剂量依赖性增加NSC细胞NrCAM蛋白的表达。B显示干扰NSC的PGR后，NrCAM表达降低，且MPA对间质细胞NrCAM的表达无影响。C显示B图蛋白灰度分析结果，目标蛋白灰度(密度*面积)/GAPDH灰度得出目的蛋白相对表达量，将Ctrl组标化为1。该结果表明：MPA促进正常间质细胞NrCAM的表达，而敲减间质细胞PR后NrCAM的表达明显降低(见灰度分析)。MPA作用于正常间质细胞后NrCAM在翻译水平表达升高，进一步证明了RNA-seq结果的可靠性以及NrCAM作为孕激素诱导的间质细胞分泌因子发挥抑制子宫内膜癌增殖的作用。

实施例12NrCAM增加子宫内膜癌细胞孕激素受体表达并促进PGR下游靶基因转录

进一步分析了NrCAM对于子宫内膜癌细胞孕激素受体(PR)及下游通路的影响，外源性添加NrCAM(1000ng/m)处理Ishikawa/ECC-1细胞，12h后QRT-PCR检测相关基因的转录水平，所用引物为：PGR正向引物如SEQ ID NO.7所示，PGR反向引物如SEQ ID NO.8所示，HAND2正向引物如SEQ ID NO.11所示，HAND2反向引物如SEQ ID NO.12所示，NR2F2正向引物如SEQ ID NO.13所示，NR2F2反向引物如SEQ ID NO.14所示，IRF4正向引物如SEQ ID NO.15所示，IRF4反向引物如SEQ ID NO.16所示；处理48小时后WB检测孕激素受体(PR)表达水平。结果如图12A-C所示，A-B显示QRT-PCR结果，NrCAM(1000ng/ml)处理12h增加Ishikawa/ECC-1细胞PGR及其下游靶基因HAND2、NR2F2的转录水平，对IRF4的转录水平无明显影响；C显示WB结果，NrCAM(1000ng/ml)处理48h增加Ishikawa/ECC-1细胞PR蛋白水平，以上结果表明NrCAM能够上调孕激素受体的表达，并激活PGR下游基因的转录。

实施例13NrCAM通过上调TET1促进子宫内膜癌细胞DNA及PRB启动子区的羟甲基化水平

外源性添加NrCAM处理Ishikawa/ECC-1细胞24h，结果如图13A-E所示，A显示点杂交结果：NrCAM(1000ng/ml)处理Ishikawa/ECC-1细胞24h，DNA羟甲基化水平升高。B-C显示HmeDIP结果：NrCAM(1000ng/ml)处理Ishikawa/ECC-1细胞24h，PRB启动子羟甲基化水平升高。D显示QRT-PCR结果，NrCAM(1000ng/ml)促进TET1和PGR的转录。敲减Ishikawa细胞TET1后，NrCAM(1000ng/ml)促进PGR转录的作用被削弱。E显示HmeDIP结果：NrCAM(1000ng/ml)促进Ishikawa细胞PGR启动子区羟甲基化修饰，敲减TET1后，NrCAM(1000ng/ml)促进PGR启动子区羟甲基化修饰的作用消失。

QRT-PCR实验中TET1正向引物如SEQ ID NO.17所示，TET1反向引物如SEQ IDNO.18所示，敲减Ishikawa细胞TET1的干扰靶序列如SEQ ID NO.4所示。

以上结果表明：子宫内膜癌细胞DNA羟甲基化水平明显增加，HmeDIP实验表明PRB启动子区的羟甲基化水平增加。NrCAM增加了Ishikawa细胞中调控DNA羟甲基化修饰的关键酶羟甲基化转移酶TET1和PGR表达，当敲减TET1后，PGR表达降低，PRB启动子区羟甲基化水平降低，该结果说明NrCAM通过上调DNA羟甲基化转移酶促进子宫内膜癌细胞PGR启动子区羟甲基化修饰，激活PGR及下游靶基因HAND2,NR2F2的转录，上调PR表达，从而协助孕激素抑制子宫内膜癌细胞增殖。

实施例14NrCAM能够抑制裸鼠宫角移植瘤生长

(1)取Ishikawa对数期细胞，100ul单细胞悬液(5*10⁵个)裸鼠子宫角注射，构建裸鼠宫角移植瘤子宫内膜癌模型；

(2)种瘤2周后，随机分为四组，按如下方案给药，给药方式为腹腔注射和灌胃，各组每两天给药一次，给药时间持续两周，并检测肿瘤大小：1)空白对照组:腹腔注射等量生理盐水，等量玉米油灌胃；2)MPA组：MPA 100mg/kg体重，玉米油灌胃，腹腔注射等量生理盐水；3)NrCAM组：NrCAM 5mg/Kg体重，生理盐水溶解后腹腔注射，等量玉米油灌胃；4)NrCAM+MPA组:NrCAM 5mg/Kg体重,MPA 100mg/kg体重。

结果如图14所示，与对照组以及MPA单药组相比，NrCAM能够显著抑制肿瘤生长。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

序列表

<110> 复旦大学附属妇产科医院

<120> NrCAM在制备药物中的用途

<130> YT201397-03

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 817

<212> PRT

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 人NrCAM氨基酸序列

<400> 1

Gln Met Ile Ser Ala Leu Glu Val Pro Leu Asp Pro Lys Leu Leu Glu

1 5 10 15

Asp Leu Val Gln Pro Pro Thr Ile Thr Gln Gln Ser Pro Lys Asp Tyr

20 25 30

Ile Ile Asp Pro Arg Glu Asn Ile Val Ile Gln Cys Glu Ala Lys Gly

35 40 45

Lys Pro Pro Pro Ser Phe Ser Trp Thr Arg Asn Gly Thr His Phe Asp

50 55 60

Ile Asp Lys Asp Pro Leu Val Thr Met Lys Pro Gly Thr Gly Thr Leu

65 70 75 80

Ile Ile Asn Ile Met Ser Glu Gly Lys Ala Glu Thr Tyr Glu Gly Val

85 90 95

Tyr Gln Cys Thr Ala Arg Asn Glu Arg Gly Ala Ala Val Ser Asn Asn

100 105 110

Ile Val Val Arg Pro Ser Arg Ser Pro Leu Trp Thr Lys Glu Lys Leu

115 120 125

Glu Pro Ile Thr Leu Gln Ser Gly Gln Ser Leu Val Leu Pro Cys Arg

130 135 140

Pro Pro Ile Gly Leu Pro Pro Pro Ile Ile Phe Trp Met Asp Asn Ser

145 150 155 160

Phe Gln Arg Leu Pro Gln Ser Glu Arg Val Ser Gln Gly Leu Asn Gly

165 170 175

Asp Leu Tyr Phe Ser Asn Val Leu Pro Glu Asp Thr Arg Glu Asp Tyr

180 185 190

Ile Cys Tyr Ala Arg Phe Asn His Thr Gln Thr Ile Gln Gln Lys Gln

195 200 205

Pro Ile Ser Val Lys Val Ile Ser Ala Lys Ser Ser Arg Glu Arg Pro

210 215 220

Pro Thr Phe Leu Thr Pro Glu Gly Asn Ala Ser Asn Lys Glu Glu Leu

225 230 235 240

Arg Gly Asn Val Leu Ser Leu Glu Cys Ile Ala Glu Gly Leu Pro Thr

245 250 255

Pro Ile Ile Tyr Trp Ala Lys Glu Asp Gly Met Leu Pro Lys Asn Arg

260 265 270

Thr Val Tyr Lys Asn Phe Glu Lys Thr Leu Gln Ile Ile His Val Ser

275 280 285

Glu Ala Asp Ser Gly Asn Tyr Gln Cys Ile Ala Lys Asn Ala Leu Gly

290 295 300

Ala Ile His His Thr Ile Ser Val Arg Val Lys Ala Ala Pro Tyr Trp

305 310 315 320

Ile Thr Ala Pro Gln Asn Leu Val Leu Ser Pro Gly Glu Asp Gly Thr

325 330 335

Leu Ile Cys Arg Ala Asn Gly Asn Pro Lys Pro Arg Ile Ser Trp Leu

340 345 350

Thr Asn Gly Val Pro Ile Glu Ile Ala Pro Asp Asp Pro Ser Arg Lys

355 360 365

Ile Asp Gly Asp Thr Ile Ile Phe Ser Asn Val Gln Glu Arg Ser Ser

370 375 380

Ala Val Tyr Gln Cys Asn Ala Ser Asn Glu Tyr Gly Tyr Leu Leu Ala

385 390 395 400

Asn Ala Phe Val Asn Val Leu Ala Glu Pro Pro Arg Ile Leu Thr Pro

405 410 415

Ala Asn Thr Leu Tyr Gln Val Ile Ala Asn Arg Pro Ala Leu Leu Asp

420 425 430

Cys Ala Phe Phe Gly Ser Pro Leu Pro Thr Ile Glu Trp Phe Lys Gly

435 440 445

Ala Lys Gly Ser Ala Leu His Glu Asp Ile Tyr Val Leu His Glu Asn

450 455 460

Gly Thr Leu Glu Ile Pro Val Ala Gln Lys Asp Ser Thr Gly Thr Tyr

465 470 475 480

Thr Cys Val Ala Arg Asn Lys Leu Gly Met Ala Lys Asn Glu Val His

485 490 495

Leu Glu Ile Lys Asp Ala Thr Trp Ile Val Lys Gln Pro Glu Tyr Ala

500 505 510

Val Val Gln Arg Gly Ser Met Val Ser Phe Glu Cys Lys Val Lys His

515 520 525

Asp His Thr Leu Ser Leu Thr Val Leu Trp Leu Lys Asp Asn Arg Glu

530 535 540

Leu Pro Ser Asp Glu Arg Phe Thr Val Asp Lys Asp His Leu Val Val

545 550 555 560

Ala Asp Val Ser Asp Asp Asp Ser Gly Thr Tyr Thr Cys Val Ala Asn

565 570 575

Val Asp Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

580 585 590

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

595 600 605

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

610 615 620

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

625 630 635 640

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

645 650 655

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

660 665 670

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

675 680 685

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

690 695 700

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

705 710 715 720

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

725 730 735

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

740 745 750

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

755 760 765

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

770 775 780

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

785 790 795 800

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

805 810 815

Lys

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> PGR干扰靶序列

<400> 2

gcttcaagtt agccaagaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> NrCAM干扰靶序列

<400> 3

gaaggagtct atcagtgta 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> TET1干扰靶序列

<400> 4

gctcaaacga ggtccatta 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> GAPDH的正向引物

<400> 5

ggaagatggt gatgggatt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> GAPDH的反向引物

<400> 6

aacggatttg gtcgtattg 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> (PR/PGR正向引物

<400> 7

tctacccgcc ctatctcaac ta 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> PR/PGR反向引物

<400> 8

agaagacctt acagctccca ca 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> NrCAM 正向引物

<400> 9

agtgtgtgag tctcagcagg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> NrCAM 反向引物

<400> 10

tgttgggtga tggttggagg 20

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> HAND2正向引物

<400> 11

cctcttcgtc ggtcttc 17

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> HAND2反向引物

<400> 12

aagatcaaga cactgcgcct 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> NR2F2正向引物

<400> 13

cgggtggtcg cctttatgg 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> NR2F2反向引物

<400> 14

acaggcatct gaggtgaaca g 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> IRF4正向引物

<400> 15

gcggtgcgct ttgaacaag 19

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> IRF4反向引物

<400> 16

acactttgta cgggtctgag a 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> TET1正向引物

<400> 17

accccctgtc acctgctgag g 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> TET1反向引物

<400> 18

gcgatggcca ccccaccaat 20

Claims

1.神经细胞粘附分子(NrCAM)在制备药物中的用途，所述药物用于治疗子宫内膜癌。

2.如权利要求1所述的用途，其中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)具有如下功能的至少一种：

1)提高子宫内膜癌细胞DNA羟甲基化；

2)上调TET1基因的表达；

3)上调子宫内膜癌细胞孕激素受体表达；

4)上调HAND2基因和/或NR2F2基因的表达；

5)抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

3.如权利要求2所述的用途，其中，所述子宫内膜癌细胞DNA包括PRB基因的启动子区。

4.如权利要求2所述的用途，其中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)的序列如SEQ IDNO.1所示。

5.如权利要求1所述的用途，其中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)为所述药物的唯一有效成分。

6.神经细胞粘附分子(NrCAM)和孕激素的组合在制备药物中的用途，所述药物用于治疗子宫内膜癌，其中，所述孕激素为安宫黄体酮。

7.如权利要求6所述的用途，其中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)的序列如SEQ IDNO.1所示。

8.如权利要求6所述的用途，其中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)与所述孕激素被配置为同时向受试者施用。

9.如权利要求6所述的用途，其中，所述神经细胞粘附分子(NrCAM)与所述孕激素被配置为分别向受试者施用。