JP2021511831A - 脳由来神経栄養因子を発現する間葉系幹細胞およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
1)宿主細胞にhTERTおよび/またはc−Myc遺伝子を含むレンチウイルスを1次感染させる段階;
2)1次感染した宿主細胞にtTA遺伝子を含むレンチウイルスを2次感染させる段階;
3)2次感染した宿主細胞にBDNF遺伝子を含むレンチウイルスを3次感染させる段階。
実施例1.1.不死化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの製造
MSCを不死化させるために、不死化遺伝子であるc−Mycおよび/またはhTERTをそれぞれ含むレンチウイルスベクターを製造した。この際、Tet−offシステムを使用するために、tTAタンパク質を発現する遺伝子コンストラクトを共に挿入した。
前記実施例1.1.で製作されたレンチウイルスベクターを用いて、次のような方法で不死化遺伝子を含むレンチウイルスを生産した。
前記実施例1.2.で生産された不死化遺伝子を含むレンチウイルスを使用して、不死化したMSCを製造した。
実施例2.1.BDNF遺伝子を含むレンチウイルスベクターの製作
前記実施例1.1.で製作したpBDレンチウイルスベクターに、BDNF遺伝子(配列番号2)を挿入した。
前記実施例2.1で製作されたBDNF遺伝子を含むレンチウイルスベクターを用いて、前記実施例1.2.に記載されたことと同じ方法でレンチウイルスを生産した。生産されたレンチウイルスは、1.4×1012copies/mlの濃度で準備した。
前記実施例1.3.で製造した不死化したMSCに、前記実施例2.2.で生産したBDNF遺伝子を含むレンチウイルスを感染させて、BDNF遺伝子を発現する細胞を製造した。形質導入は、実施例1.3.に記載されたことと同じ方法で行った。感染後、細胞を安定化させた後、培養液に500μg/mlのG418を添加してpBD−4レンチウイルスが感染した細胞を選別した。選別された細胞は、1μg/mlのドキシサイクリン(doxycycline、631311、Clontech、米国)が添加された培地で培養することによって、培養中にBDNFタンパク質の発現を抑制させた。
遺伝子を挿入する前の骨髄由来MSCとBDNF遺伝子が挿入されたBM−01A細胞株の表面抗原タンパク質発現をヒトMSC分析キット(StemflowTM,Cat No 562245,BD)を用いて分析した。実験は、各キットに含まれているマニュアルによって行われ、実験結果を図6に示した。
前記実施例3.で確立したBM−01A細胞株の増殖率を確認した。
前記実施例3.で確立したBM−01A細胞株の継代培養による形態学的変形を確認するために、実験例1.でBM−01A細胞株の増殖率を確認し、顕微鏡で細胞の写真を撮影した。
前記実施例3.で確立したBM−01A細胞でBDNFタンパク質の発現をELISA分析方法で確認した。具体的に、BDNFタンパク質の発現水準は、ヒトBDNF DuoSet ELISAキットで確認した。実験は、各キットに含まれているマニュアルによって行われた。
前記実施例3.で製造したBM−01A細胞株に遺伝子が導入されたかを確認するためにPCRを行った。具体的に、前記BM−01A細胞株を9mlのPBSが含まれた15mlチューブに移した後、1,500rpmで5分間セルダウン(Cell Down)させた。PBSを完全に除去した後、1.5mlチューブに200μlのPBSでペレットを懸濁させた後に移した。その後、NucleoSpin(登録商標)Tissue(MN、740952.250)を用いてgDNAを準備し、下記表2のように混合物を作った後、下記表3の段階でPCRを行った。この際、陽性対照群として100ngのBM−01AプラスミドDNAを、陰性対照群として1μlの精製水を入れた。前記BM−01AプラスミドDNAは、韓国特許公開第2017−0093748号に記載された方法によって分離精製することができる。
実験例6.1.ハンチントン病誘発ラットの製作
神経毒素であるキノリン酸(quinolinic acid,QA)を右側の内側前脳束(AP+1.0、ML −2.5、DV −5.0)に120nmol/2μlの濃度で0.2μl/分の速度で注入して、急性ハンチントン病誘発ラットを製作した。製作された急性ハンチントン病動物モデルの確認のために、QA注入2週後にDARPP−32抗体(1:100、Cell Signaling)を使用して免疫染色を行った後、LVZ(lateral ventricle zone)の体積を測定した。
実験例6.1.で製作したハンチントン病誘発ラットの内側前脳束2部位(AP 1.5、ML −3.0、DV −5.5および−4.5)に1×106cells/1μlの濃度のBM−01A細胞株を0.2μl/分の速度で注入した。対照群には、培養培地を同じ用量で注入した。注入1週後にhNu免疫染色を実施して、BM−01A細胞株の存在を確認した。
BM−01A細胞株の注入によるハンチントン病誘発ラットの行動改善効果を確認するために、BM−01A注入3週前から1週間ラットを訓練させた。BM−01A注入2週間前に正常ラットの行動実験値を測定し、BM−01A注入1週間前にQAを注入してハンチントン病を誘発した。行動実験は、ロータロッド実験(Rota−rod test)、歩行実験(Stepping test)および階段実験(Staircase test)を実施した。
実験例6.2.で製作した10週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。ラットの脳に4%(v/v)パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタット(cryostat,Microm,Germany)を使用して40μmの凍結冠状切片(frozen coronal section)を準備した。
実験例6.2.で10週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。マウスの脳に4%(v/v)パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタットを使用して40μmの凍結冠状切片を準備した。
実験例6.2.で10週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。ラットの脳に4%(v/v)パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタットを使用して40μmの凍結冠状切片を準備した。DARPP−32抗体を使用して免疫染色した後、LVZの体積、線条体(striatum)内の欠失(deletion)部分の体積および線条体内の密度を測定した。その結果、BM−01Aを注入した実験群においてLVZの体積が減少した(図20および図21)。また、BM−01Aを注入した実験群においてQA注入で線条体内欠失部分の体積が減少し、線条体内の密度が増加したことを確認した(図22〜図24)。
実験例7.1.慢性脳卒中誘発ラットの製作
BM−01A細胞株の投与による慢性脳卒中誘発ラットの行動改善効果を確認するために、BM−01A投与5週間前から1週間マウスを訓練させた。BM−01A投与4週間前に正常ラットを対象として中大脳動脈閉塞症(middle carotid artery occlusion;MACo)実験を通じて脳卒中を誘発した。
BM−01A細胞株の注入による脳卒中誘発ラットの行動改善効果を確認するために、BM−01A注入3週前から1週間マウスを訓練させた。BM−01A注入3週および1週間前に2回にかけた行動実験を通じて正常マウスの行動実験値を測定し、行動実験を通じて脳卒中が誘発されたラットを選別し、BM−01Aを用量(dose)別に脳内投与した後、さらに4回の行動実験を実施して、総6回の行動実験を通じて行動実験値を測定した。行動実験は、ロータロッド実験(Rota−rod test)、歩行実験(Stepping test)および修正された神経学的重症度スコア実験(Modified neurological severity scores test;mNSS)を実施した。
16週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。ラットの脳に4%(v/v)パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタット(cryostat,Microm,Germany)を使用して40μmの凍結冠状切片(frozen coronal section)を準備した。
実験例8.1.試験管内(in vitro)BM−01A細胞株の腫瘍原性の確認
CytoSelectTM 96−well Cell Transformation Assayを用いて軟寒天ゲル(Soft Agar Gels)で骨髄由来MSC、BM−01A細胞株、陽性対照群(HeLa)および陰性対照群(NIH3T3)で非依存性増殖(Anchorage−independent Growth)によるコロニー形成の有無を確認し、MTS溶液で染色して、吸光度を測定することによって、細胞形質転換による腫瘍形成の有無を定量化した。
BM−01Aの生体内安全性を確認するために、実験例6.2.で10週目の実験群ラットを犠牲にさせてBM−01A細胞株の生存有無を確認した。具体的に、実験例6.2.で10週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。ラットの脳に4%(v/v)パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタットを使用して40μmの凍結冠状切片を準備した。抗−Human Nuclei抗体および細胞死滅マーカーである抗−Caspase3抗体を使用して免疫染色した。共焦点レーザー−走査顕微鏡イメージングシステムを使用して写真を撮影した。
実験例6.1.で製作したハンチントン病誘発ラットの内側前脳束2部位(AP 1.5、ML −3.0、DV −5.5および−4.5)に1×106cells/1μlの濃度のBM−01A細胞株を0.2μl/分の速度で注入した。対照群には、凍結剤形バッファーを同じ用量で注入した。注入1週後にhNu免疫染色を実施して、BM−01A細胞株の存在を確認した。
Claims (16)
- 脳由来神経栄養因子(brain−derived neurotrophic factor,BDNF)タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスベクター。
- 前記BDNFタンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
- 前記BDNFタンパク質をコードする遺伝子が配列番号2の塩基配列である、請求項1に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
- 前記ベクターがプロモーターを含むものである、請求項1に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
- 前記プロモーターがサイトメガロウイルス(CMV)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、ヒト伸長因子−1アルファ(human elongation factor−1 alpha,EF−1α)またはテトラサイクリン応答因子(tetracycline response elements;TRE)プロモーターである、請求項4に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
- BDNFタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルス。
- 前記レンチウイルスは、請求項1に記載のレンチウイルスベクター、パッケージングプラスミドおよびエンベローププラスミドで宿主細胞を形質転換させる段階;および形質転換された宿主細胞からレンチウイルスを分離する段階を通じて収得されるものである、請求項6に記載の組み換えレンチウイルス。
- 請求項6に記載の組み換えレンチウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、不死化した間葉系幹細胞である、請求項8に記載のトランスフェクションされた宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、hTERTおよび/またはc−Myc遺伝子が導入されたものである、請求項8に記載のトランスフェクションされた宿主細胞。
- 請求項6に記載の組み換えレンチウイルスを有効成分として含む神経疾患の予防または治療用薬学組成物。
- 前記神経疾患が、アルツハイマー病(Alzheimer’s disease,AD)、パーキンソン病(Parkinson’s disease,PD)、ルー・ゲーリック病(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)、脳梗塞、慢性脳損傷(chronic brain injury)、脊髄損傷、ハンチントン病(Huntington’s disease,HD)、レット症候群(Rett’s disease,RD)、虚血性脳疾患、脳卒中および外傷性脳損傷(Traumatic brain injury)、新生児虚血性脳症(Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy)、多発性硬化症よりなる群から選ばれるものである、請求項11に記載の神経疾患の予防または治療用薬学組成物。
- 請求項8に記載のトランスフェクションされた宿主細胞を有効成分として含む神経疾患の予防または治療用薬学組成物。
- 前記神経疾患が、アルツハイマー病(Alzheimer’s disease,AD)、パーキンソン病(Parkinson’s disease,PD)、ルー・ゲーリック病(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)、脳梗塞、慢性脳損傷(chronic brain injury)、脊髄損傷、ハンチントン病(Huntington’s disease,HD)、レット症候群(Rett’s disease,RD)、虚血性脳疾患、脳卒中および外傷性脳損傷(Traumatic brain injury)、新生児虚血性脳症(Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy)、多発性硬化症よりなる群から選ばれるものである、請求項13に記載の神経疾患の予防または治療用薬学組成物。
- 請求項6に記載の組み換えレンチウイルスまたは前記組み換えレンチウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞を個体に投与する段階を含む神経疾患の予防または治療方法。
- 請求項6に記載の組み換えレンチウイルスまたは前記組み換えレンチウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞の神経疾患の予防または治療用途。
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