KR20200013753A - 뇌유래-신경영양인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도 - Google Patents

뇌유래-신경영양인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌유래-신경영양인자 단백질(BDNF)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스에 의해 형질 감염된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 BDNF 단백질을 발현하는 중간엽줄기세포는 불사화된 중간엽줄기세포에 BDNF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스로 형질 감염시킨 것이다. 상기 중간엽줄기세포는 BDNF 단백질을 발현하고, TRE 프로모터로 BDNF 단백질 발현을 조절할 수 있다. 그 결과, 형질 전환된 중간엽줄기세포를 증식시킨 후 단백질을 발현시킬 수 있다. 상기 중간엽줄기세포는 높은 세포 증식률 및 높은 BDNF 단백질 발현량을 나타내고, 안전성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 BDNF 단백질을 발현하는 중간엽줄기세포는 대량 생산이 가능하고, 동일한 효과를 유지할 수 있는 줄기세포치료제로서 다양한 신경질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

뇌유래-신경영양인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도{MESENCHYMAL STEM CELL EXPRESSING BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR GENE AND USE THEREOF}
본 발명은 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스에 의해 형질 감염된 세포에 관한 것이다.
BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor)는 우리 몸의 뇌, 망막, 운동 신경세포, 신장, 침, 전립선 등에서 발현되며, 뇌의 해마(hippocampus), 대뇌 피질(cerebral cortex), 시상하부(hypothalamus), 기부 전뇌(basal forebrain) 등에서 발현된다. BDNF는 장기기억(long-term memory)에 있어서 중요한 부분을 차지하는데, 학습이 일어난 동물에서 BDNF mRNA는 뇌의 해마 부위에서 높은 수준으로 발현하게 된다. 이러한 해마부위에서 발현이 증가하는 것은 학습 수준도 연관되는 것으로 보고되었다.
또한, BDNF는 신경세포의 생성을 촉진하는 뉴로트로핀에 대해 가장 우수한 활성을 보이는 물질이다. 실제로 BDNF가 유전적으로 완전히 제거된 쥐의 경우에는 출생 후 심각한 사망률을 보이며 소뇌, 후각 구근(olfactory bulb), 시각 피질(visual cortex)과 와우각(cochlear) 등에서 신경세포의 손실이 관찰된다. 반면에 부분적으로 BDNF 유전자가 제거된 경우에는 뉴로트로핀의 발현이 감소하며 해마부위의 장기강화(long-term potentiation, LTP)와 감각 및 통각 시스템의 변화가 관찰되며 행동학적인 문제와 더불어 정신학적인 문제까지 관찰된다.
한편, BDNF는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorder)을 치료하기 위한 약의 개발에 있어서 표적물질로 활용되고 있다. BDNF가 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파키슨병(Parkinson's disease, PD), 헌팅턴병(Huntington's disease, HD), 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 같은 신경퇴행성 질환에 관여한다는 실험적인 증거들은 1990년대 초반부터 보고되어 왔다. 다양한 연구들에서 BDNF의 유전자적 이상이 질병과 관련이 있다고 보고된바 있다. 실제로 이러한 신경퇴행성 질환을 겪고 있는 환자에서는 BDNF 양이 정상인보다 감소되어 있다. 특히, 헌팅턴병과 관련해서는 다양한 세포 및 동물실험을 통해서, 질환이 진행되면 BDNF 수송에 문제가 생긴다는 점이 보고 되었다. 감소한 BDNF를 외부로 공급해주는 방법을 통해서 질환을 치료하고자 하는 시도가 이뤄지고 있으나, 현재까지 효과적으로 BDNF를 뇌로 전달하기가 어렵다는 문제가 있다.
한편, 전 세계적으로 세포를 이용한 치료 방법이 개발되고 있으며, 성체줄기세포를 이용한 세포치료제에 대해 많은 연구가 진행 중이다. 성체줄기세포인 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem cell; MSC)는 뼈, 연골, 근육, 지방, 섬유아세포 등으로 분화할 수 있는 다능성(multipotent) 세포이다. 상기 MSC는 골수, 제대혈, 지방 등 다양한 성체조직에서 비교적 쉽게 얻을 수 있다. MSC는 염증 또는 손상부위로 이동하는 특이성이 있어, 치료 약물을 전달하기 위한 전달체로서도 큰 장점이 있다. 또한, T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 자연살해 세포와 같은 면역 세포의 기능을 억제하거나 활성화시켜, 인체의 면역기능을 조절할 수 있다. 그뿐 아니라, MSC는 시험관 내(in vitro)에서 비교적 쉽게 배양할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 특성으로 인해 MSC를 세포치료제로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 이와 같은 MSC의 장점에도 불구하고, 세포 치료제로서 임상에 사용할 수 있는 등급의 MSC를 생산하는데 다음과 같은 문제가 있다. 첫째, MSC의 증식에는 한계가 있어, 이를 대량으로 생산하기 어렵다. 둘째, 수득한 MSC는 다양한 종류의 세포가 혼합되어 있어, 생산시 동일한 효과를 유지하기 어렵다. 셋째, MSC만을 이용할 경우 치료 효과가 높지 않다. 마지막으로, 인체에 주입된 MSC가 체내에서 암세포로 될 가능성도 있다.
한편, 대한민국 등록특허 제1585032호에서는 하이드로겔에서 배양한 중간엽줄기세포를 함유하는 세포 치료제를 개시하고 있다. 상기 문헌에는 세포 치료제로 사용하기 위한 중간엽줄기세포를 분리하는 공정에서 전처리 과정을 단축하여 바로 투여 가능한 조성물을 제공하고 있으나, 상기와 같은 중간엽줄기세포의 문제점 및 이를 해소하기 위한 방안에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다. 따라서, 세포 치료제로 사용할 수 있는 안전하고 효과적인 중간엽줄기세포에 대한 연구가 필요한 실정이다.
특히, 뇌유래-신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)를 발현하도록, 아데노 바이러스를 이용하여 중간엽줄기세포를 형질전환시킨 연구가 수행된 바 있다(Kari Pollock et al., Molecular Therapy, vol.24 no.5: 965-977, 2016). 하지만, 상기 연구에서 사용된 중간엽줄기세포는 조직에서 수득한 일반적인 중간엽줄기세포로서 MSC의 증식에는 한계가 있어 대량 생산하기 어려운 문제점이 있다. 그뿐 아니라, BDNF 유전자의 발현 정도가 균일하지 않아, 생산시 동일한 효과를 기대하기 어렵다.
대한민국 등록특허 제1585032호
Kari Pollock et al., Molecular Therapy, vol.24 no.5: 965-977, 2016
이에 본 발명자들은 대량 생산이 가능하고, 동일한 효과를 유지할 수 있는 줄기세포치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 본 발명의 형질 감염된 MSC가 160일 이상 계대배양(증식)이 가능한 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 형질 감염된 MSC가 160일 이상 BDNF 유전자를 안정적으로 발현하고, 이러한 중간엽줄기세포가 신경세포의 보호 및 재생 등의 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BDNF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 BDNF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질 감염된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 형질 감염된 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 BDNF 단백질을 발현하는 중간엽줄기세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 대량 생산이 가능하고, 동일한 효과를 유지할 수 있는 줄기세포치료제로서 BDNF를 발현하여 신경세포의 보호 및 재생을 유도함으로써 뇌조직의 형성을 촉진시키고 신경계의 기능을 향상시킨다. 또한, 본 발명의 중간엽줄기세포는 불사화된 중간엽줄기세포로서 높은 세포 증식률을 가지면서, 비정상적인 분화 및 증식 가능성이 낮아 안전성이 높다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 불사화된 MSC(imMSC)와 불사화되지 않은 MSC(MSC)의 세포 증식률을 비교한 그래프이다:
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수(population doubling level, PDL).
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제조한 #1 내지 #50의 클론의 BDNF 단백질 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 BDNF 단백질 발현량이 우수한 클론의 독시사이클린 존재 유무에 따른 BDNF 단백질 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 BDNF 단백질 생산이 우수한 세포 클론인 #14, #22, #23 및 #41 클론의 염색체 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 BDNF 단백질을 생산하는 균주에서 선별한 #14, #22, #23 및 #41 클론의 140일 동안 누적된 세포집단배가수를 나타낸 그래프이다.
도 6은 BM-01A 세포주의 유전자 조작 이후의 MSC가 지닌 고유한 특성인 표면 항원 단백질 CD90, CD44, CD105, CD73 등의 발현과 골수 유래 MSC의 표면항원 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 형질 도입된 불사화된 MSC의 세포 증식률을 확인한 그래프이다:
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수(population doubling level, PDL).
도 8은 BM-01A 세포주의 140일 동안 계대배양시 형태학적으로 세포의 특성이 유지되는 것을 확인한 도면이다.
도 9는 독시사이클린 처리 유무에 따른 BM-01A 세포주의 BDNF 단백질 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 BM-01A 세포주의 계대배양시 각 계대별로 BDNF 단백질 발현량이 일정하게 유지되는 것을 나타낸 도면이다.
도 11은 BM-01A 세포주에 유전자가 도입된 것을 확인한 도면이다.
도 12는 퀴놀린산(QA) 주입에 따른 헌팅턴병 유발 래트 내측전뇌속(lateral ventricle zone, LVZ)의 부피 변화를 나타낸 도면이다.
도 13은 BM-01A 세포주를 헌팅턴병 유발 래트의 뇌에 주입하고 일주일 후, 뇌 내에 BM-01A 세포주가 존재하는지 확인한 도면이다.
도 14는 로타로드 실험(Rota-rod test)을 통해 BM-01A 세포주 주입에 따른 헌팅턴병 유발 래트의 행동 개선 효과를 확인한 그래프이다.
도 15는 보행 실험(Stepping test)을 통해 BM-01A 세포주 주입에 따른 헌팅턴병 유발 래트의 행동 개선 효과를 확인한 그래프이다.
도 16은 계단 실험(Staircase test)을 통해 BM-01A 세포주 주입에 따른 헌팅턴병 유발 래트의 행동 개선 효과를 확인한 그래프이다.
도 17은 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 뇌 조직 내 Iba-1 및 ED1을 면역 염색한 사진이다.
도 18은 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 뇌 조직 내 ED1 및 염증 마커인 iNOS를 면역 염색한 사진이다.
도 19는 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 뇌 조직 내 신경아교세포를 염색한 사진이다.
도 20은 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 LVZ의 부피를 촬영한 사진이다.
도 21은 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 LVZ의 부피를 측정한 그래프이다.
도 22는 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 선조체내의 결실 부분을 측정한 사진이다.
도 23은 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 선조체내의 결실 부분의 부피를 측정한 그래프이다.
도 24는 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 선조체내의 밀도를 측정한 도면이다.
도 25는 세포의 동결제형 버퍼 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 헌팅턴병 유발 래트의 뇌 조직 내 DCX를 면역 염색한 사진이다.
도 26은 로타로드 실험(Rota-rod test)을 통해 BM-01A 세포주 주입에 따른 뇌졸중 유발 래트의 행동 개선 효과를 확인한 그래프이다.
도 27은 보행 실험(Stepping test)을 통해 BM-01A 세포주 주입에 따른 뇌졸중 유발 래트의 행동 개선 효과를 확인한 그래프이다.
도 28은 수정된 신경학적 중증도 점수 실험(Modified neurological severity scores test)을 통해 BM-01A 세포주 주입에 따른 뇌졸중 유발 래트의 행동 개선 효과를 확인한 그래프이다.
도 29는 세포의 동결건조 제형(vehicle) 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 뇌졸중 유발 래트의 신경교질반흔 부위를 염색한 사진이다.
도 30은 세포의 동결건조 제형(vehicle) 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 뇌졸중 유발 래트의 피질과 선조체 부위에서의 반흔 면적 감소를 측정한 그래프이다.
도 31은 세포의 동결건조 제형(vehicle) 또는 BM-01A 세포주를 주입한 후, 뇌졸중 유발 래트의 피질과 선조체 부위에서의 반흔 두께 감소를 측정한 그래프이다.
도 32는 BM-01A 세포주의 유전자 조작 후에도 종양원성이 없음을 확인한 그래프이다.
도 33은 BM-01A 세포주를 주입한 10주차의 헌팅턴병 유발 래트의 뇌 조직 내 BM-01A 세포주의 생존 유무를 확인한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 BDNF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "뇌유래-신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)" 단백질은 뇌에 가장 풍부하게 분포되어 있는 뉴로트로핀(neurotrophin)이다. 이는 신경원(neuron)의 성장을 촉진하고, 신경전달물질의 합성, 대사, 유리 및 신경원의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한, BDNF 단백질은 우울증 환자의 전두엽 피질 또는 해마에서 감소되고, 이의 농도를 증가시켜 우울증을 치료할 수 있음이 알려져 있다.
본 발명에 따른 BDNF 단백질은 인간 유래의 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 BDNF 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 BDNF 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 BDNF 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2의 염기 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 일종이다. 상기 벡터는 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터로 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시킨다. 또한, 상기 벡터는 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 프로모터에 의해 이에 적재된 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개의 프로모터에 의해서 BDNF 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결된다.
일 실시예에 의하면, 상기 BDNF 단백질은 TRE 프로모터에 연결될 수 있다. 상기 TRE 프로모터는 tTA(tetracycline transactivator) 단백질에 의하여 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, tTA 단백질은 테트라사이클린(tetracycline) 또는 독시사이클린(doxycycline)이 존재하지 않을 때 TRE 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시킨다. 반면, 이들이 존재하는 경우에는 tTA 단백질이 TRE 프로모터에 결합하지 못하여 전사를 활성화시키지 못한다. 따라서, 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 여부의 따라 BDNF 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
상기 용어 "작동 가능하게 연결된"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터에 의해 유전자가 mRNA로 전사되어 단백질로 번역될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명은 BDNF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.
상기 재조합 렌티바이러스는 본 발명의 렌티바이러스 벡터, 패키징 (packaging) 플라스미드 및 엔벨로프(envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질 전환시키는 단계; 및 형질 전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득할 수 있다.
상기 용어 "패키징 플라스미드(packaging plasmid)" 및 "엔벨로프 플라스미드(envelope plasmid)"는 단백질을 코딩하는 유전자가 적재된 플라스미드이다. 이들 플라스미드는 렌티바이러스 벡터 이외에, 렌티바이러스를 생산하기 위해 필요한 헬퍼 구조물(예를 들어, 플라스미드 또는 단리된 핵산)을 제공할 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 패키징하는데 유용한 요소들을 함유한다. 상기 요소로는 GAG 전구체와 같은 구조 단백질; pol 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제, 외피 단백질, 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을 포함할 수 있다.
재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clonetech Laboratories사의 Lenti-X Lentiviral Expression System이나, Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드(예를 들어, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드(예를 들어, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등)를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질 감염된 숙주세포를 제공한다.
상기 용어 "형질도입(transduction)"은, 바이러스 감염을 통하여 재조합 렌티바이러스 벡터에 적재된 유전자를 전달하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 숙주세포는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cell, hES), 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC), 인간신경줄기세포(human neural stem cell, hNSC), 윤부줄기세포(limbal stem cell) 또는 경구점막상피세포(oral mucosal epithelial cell)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 숙주세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
상기 용어 "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 골세포, 연골세포 및 지방세포를 포함하는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 기질세포를 말한다. 중간엽줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포 및 근육세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 지방조직, 골수, 말초신경 혈액, 제대혈, 골막, 진피, 중배엽-유래 조직 등으로부터 분리 또는 정제될 수 있다.
본 발명에 따른 형질 감염된 숙주세포는 불사화된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 숙주세포는 hTERT 및/또는 c-Myc 유전자가 도입된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 형질 감염된 숙주세포는 티미딘키나아제(thymidine kinase, TK) 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "티미딘키나아제"란, ATP의 γ위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 티미딘은 삼인산 형태로 변형되면서 티미딜산을 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 변형된 티미딘은 DNA 복제에 사용될 수 없고, 따라서 이를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 TK 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용이 가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 TK 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 TK 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "hTERT"란, 텔로머라아제 역전사효소를 의미한다. 상기 텔로머라아제 역전사효소는 텔로머라아제의 RNA 주형을 상보적 DNA를 합성하여, RNA-DNA 하이브리드 형태가 이룬 다음, 이중고리의 DNA가 되어 숙주세포의 염색체에 삽입된다. 그러면 상기 숙주세포는 텔로미어 대신 텔로머라아제가 염색체 말단소립에 붙어 텔로미어를 계속 생성하게 되어 불멸화된 세포를 만들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "c-Myc"란, 사람의 8번 염색체에 위치한 전사인자를 코딩하는 유전자를 의미한다. 세포내 유전자 약 15%의 발현을 조절하는 c-Myc에 코딩된 단백질은 전사 조절인자(transcription factor)로, 상기 전사 조절인자가 과발현될 경우 세포활성 및 증식이 촉진된다.
상기 숙주세포는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 숙주세포에 hTERT 및/또는 c-Myc 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 1차 감염시키는 단계;
2) 1차 감염된 숙주세포에 tTA 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 2차 감염시키는 단계;
3) 2차 감염된 숙주세포에 BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 3차 감염시키는 단계.
상기 단계 1)에서 hTERT 및/또는 c-Myc은 숙주세포를 불사화시키는 유전자로서, 상기 hTERT 및/또는 c-Myc 이외에도 불사화 유전자로 알려진 다른 유전자도 사용 가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 hTERT 및 c-Myc 단백질은 각각 서열번호 7 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 hTERT 및 c-Myc 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 8 및 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 단계 2)에서 tTA는 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 유전자로, 테트라사이클린 트랜스액티베이터를 의미한다. 본 발명에서 사용된 Tet-off 시스템은, 상기 서술한 바와 같은 방법으로 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 유무에 따라 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
본 발명의 BDNF를 발현하는 중간엽줄기세포는 TRE 프로모터에 의해 ex vivo에서 독시사이클린 처리 전 대비 100배 이상, 110배 이상, 120배 이상, 150배 이상으로 BDNF 단백질을 발현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 서술한 바와 같은 재조합 렌티바이러스 또는 형질 감염된 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포는 BDNF의 발현을 통해 신경보호 효과를 나타낼 수 있기 때문에, 다양한 중추신경장애의 치료에 사용될 수 있다.
상기 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뇌경색, 만성 뇌손상(chronic brain injury), 허혈성 뇌질환, 척수손상, 헌팅턴병(Huntington's disease, HD), 렛트병(Rett's disease, RD), 뇌졸중, 다발성 경화증, 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury), 신생아 허혈성 뇌병증 (Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy) 및 발기부전으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 서술한 바와 같은 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내 투여가 있다.
상기 투여는 1회 이상, 1 내지 4회 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복 투여하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격, 1주, 2주 내지 4주 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 또는 1주 이상 간격으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 렌티바이러스의 경우, 성인 기준 1일 1.0x106 내지 1.0x1012 TU, 구체적으로 1.0x108 내지 1.0x1010 TU의 양으로 투여될 수 있다. 한편, 세포의 경우, 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1011 cells, 구체적으로 1.0x107 내지 1.0x109 cells의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 불사화된 중간엽줄기세포(MSC)의 제조
실시예 1.1. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조
MSC를 불사화시키기 위하여, 불사화 유전자인 c-Myc 및/또는 hTERT를 각각 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 이때, Tet-off 시스템을 사용하기 위해 tTA 단백질을 발현하는 유전자 컨스트럭트를 함께 삽입하였다.
먼저, pWPT 벡터(Addgene, 미국)의 발현 카세트 내에 EF 프로모터를 CMV 프로모터로 치환하고, 그 하위에 RSV 프로모터를 추가 연결하여 pBD 렌티바이러스 벡터를 제작하였다.
상기 pBD 렌티바이러스 벡터에, c-Myc 유전자(서열번호 6) 및 티미딘인산화효소(thymidine kinase, TK) 유전자(서열번호 4)를 IRES로 연결하여 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-1로 명명하였다.
한편, pBD 렌티바이러스 벡터에, hTERT 유전자(서열번호 8)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에, 지오신(zeocin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(ZeoR; 서열번호 14)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-2로 명명하였다.
또한, pBD 렌티바이러스 벡터에, tTA(tetracycline trans activator) 유전자(서열번호 10)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에 퓨로마이신(puromycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(PuroR; 서열번호 12)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-3으로 명명하였다.
실시예 1.2. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 1.1.에서 제작된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 생산하였다.
먼저, 렌티-X 세포(Clontech Laboratories, 미국)는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150 ㎜ 디쉬(dish)에 배양하였다. 한편, 렌티바이러스 벡터는 EndoFree Plasmin Maxi Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 DH5α 대장균 세포로부터 추출 및 정량하였다.
상기 배양된 렌티-X 세포를 PBS로 세척한 후, 3 ㎖의 TrypLE™ Select CTS™(Gibco, 미국)을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 약 5분 동안 방치한 뒤, 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50 ㎖ 튜브에 모아서 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재현탁하였다.
현탁된 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤, 150 ㎜ 디쉬에 1.2x107개의 세포가 되도록 분주하였다. 상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12 ㎍의 렌티바이러스 벡터, 12 ㎍의 psPAX(Addgene; gag-pol 발현, 패키징 플라스미드) 및 2.4 ㎍의 pMD.G 플라스미드(Addgene; vesicular stomatitis virus G protein, VSV-G 발현, 엔벨로프 플라스미드) 혼합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 돕기 위해, 리포펙타민(Invitrogen, 미국)과 플러스 리에이전트(Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 형질도입 6시간 후, 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 추가 배양한 뒤 상층액을 모았다.
상기 수득된 상층액을 렌티바이러스 농축키트(Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, 미국)와 혼합한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 수득하고, 이를 FBS가 포함되지 않은 0.5 ㎖의 DMEM에 재현탁하였다. 그 결과, pBD-1, pBD-2 및 pBD-3 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 렌티바이러스를 각각 4.0x108 TU/㎖, 2.0x108 TU/㎖ 및 1.2x109 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
실시예 1.3. 불사화된 중간엽줄기세포의 제조
상기 실시예 1.2.에서 생산된 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여, 불사화된 MSC를 제조하였다.
먼저, 골수유래 MSC를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로, 건강한 공여자(donor)의 장골능(iliac crest)에서 골수천자액(bone marrow aspirate)을 수득하였다. 이를 멸균 콘테이너에서 20 IU/㎖의 헤파린과 혼합하여 응고를 억제하였다. 상기 골수 혼합액을 4℃, 739 G의 조건으로 7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 10배 부피의 멸균된 물과 혼합하였다. 이를 동일한 조건으로 다시 원심분리하여 세포의 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 20%의 FBS 및 5 ng/㎖의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose(11885-084, Gibco, 미국) 배지에 현탁하여 배양 플라스크에 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양한 뒤, 새로운 배지로 교체하였다. 이를 3 내지 4일 간격으로 새로운 배지로 교체하면서 계대배양하였고, 배양 2주 후 형광세포분석기를 사용하여 MSC 여부를 확인하였다.
상기 실시예 1.2.에서 생산된 pBD-1 렌티바이러스로 상기 준비된 MSC를 레트로넥틴(Retronectin, Clontech Laboratories, 미국)을 사용하여 100 MOI로 감염시켰다. 감염된 세포에 상기 서술한 바와 동일한 방법으로, pBD-2 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 세포를 안정화시킨 후, 배양액에 500 ㎍/㎖의 지오마이신을 첨가하여 pBD-2 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
상기 선별된 세포에 pBD-3 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신을 첨가하여 pBD-3 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다. 그 결과, 불사화 유전자를 포함하는 MSC 및 그렇지 않은 MSC의 세포 증식률을 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는, 배양 120일 이후에도 높은 세포 증식률을 유지하였다. 반면, 정상 MSC 세포는 배양 40일 이후에는 세포 증식률이 급격히 감소하였다.
실시예 2. BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작
실시예 2.1. BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제작
상기 실시예 1.1.에서 제작한 pBD 렌티바이러스 벡터에, BDNF 유전자(서열번호 2)를 삽입하였다.
먼저, BDNF 발현에 미치는 프로모터의 영향을 확인하기 위하여 CMV 프로모터와 TRE 프로모터를 사용하여 BDNF 유전자가 발현되도록 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 이용하여 BDNF 유전자를 발현하는 MSC를 제조하였다. 그 결과, CMV 프로모터가 적용된 세포주의 경우, 장기 계대배양시 BDNF를 발현하는 MSC가 형태학적으로 변화하고, 계대배양이 진행될수록 BNDF의 발현율이 감소하는 것을 확인하였다.
이에, BNDF 유전자를 TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 삽입하였다. TRE 프로모터는 독시사이클린의 첨가 유무에 따라 상기 프로모터와 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
실시예 2.2. BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 2.1에서 제작된 BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 상기 실시예 1.2.에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 1.4x1012 copies/㎖의 농도로 준비하였다.
실시예 3. BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질 감염된 MSC의 제조
상기 실시예 1.3.에서 제조한 불사화된 MSC에, 상기 실시예 2.2.에서 생산한 BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시켜, BDNF 유전자를 발현하는 세포를 제조하였다. 형질도입은 실시예 1.3.에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행하였다. 감염 후, 세포를 안정화 시킨 후, 배양액에 500 ㎍/㎖의 G418을 첨가하여 pBD-4 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다. 선별된 세포는 1 ㎍/㎖의 독시사이클린(doxycycline, 631311, Clontech, 미국)이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 배양 중에 BDNF 단백질의 발현을 억제시켰다.
상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 인간 BDNF DuoSet ELISA 키트(R&D systems, DY248, 미국)로 BDNF 단백질 발현 유무를 확인하여 형성된 #1 내지 #50의 클론 중 BDNF 단백질을 발현하는 #10, #12, #14, #18, #20, #22, #23, #26, #29 및 #41 클론을 선별하였다(도 2). 그 후, 독시사이클린 처리시 BDNF 단백질을 발현하지 않는 #14, #22, #23 및 #41 클론을 선별하였다(도 3). 상기 네 개의 클론을 이원의료재단에 염색체 분석을 의뢰하여 확인하였다. 모두 정상적인 염색체 형태를 나타내었으며, 140일 동안 세포증식능을 확인하였다(도 4 및 도 5). 그 결과, 안정적인 증식패턴을 보이며 발현량이 가장 우수한 #41 클론을 BM-01A 세포주라고 명명하여 이후 실험을 진행하였다.
실험예 1. BM-01A 세포주에서 표면항원 단백질 발현 확인
유전자를 삽입하기 전의 골수유래 MSC와 BDNF 유전자가 삽입된 BM-01A 세포주의 표면항원 단백질 발현을 인간 MSC 분석 키트 (StemflowTM, Cat No 562245, BD)을 이용하여 분석하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었고, 실험 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, BM-01A 세포주는 BDNF를 발현시키기 위한 유전자 조작을 거친 후에도 MSC가 지니고 있는 고유한 특성인 표면항원 단백질인 CD90, CD44, CD105, 및 CD73의 발현이 골수유래 MSC와 유사함을 증명하였다.
실험예 2. BM-01A 세포주의 증식률 확인
상기 실시예 3.에서 확립한 BM-01A 세포주의 증식률을 확인하였다.
T175 플라스크에 1.2x106 내지 13.0x106 개의 BM-01A 세포주를 접종하여 3일 또는 4일 배양을 진행하며 PDL(Proliferation Doubling Level)과 세포 생존율을 측정하였다. PDL은 "PDL=X+3.222 (logY-logI)" 공식에 의해 계산하였으며, X는 초기 PDL, I는 혈관에 접종된 초기 세포 수, Y는 최종 세포 수를 나타내었다.
그 결과, 확립된 세포주의 증식률을 도 7에 나타내었다. 보이는 바와 같이 BM-01A 세포주는 배양 160일 이상까지 안정적으로 증식하였다.
실험예 3. 계대배양에 따른 BM-01A 세포주의 형태학적 확인
상기 실시예 3.에서 확립한 BM-01A 세포주의 계대배양에 따른 형태학적 변형을 확인하기 위해 실험예 1.에서 BM-01A 세포주의 증식률을 확인하며 현미경으로 세포의 사진을 촬영하였다.
그 결과, BM-01A 세포는 140일 이상 장기 계대배양을 하여도 형태학적으로 변화가 없는 것을 확인하였다(도 8).
실험예 4. BM-01A 세포주에서 BDNF 단백질의 발현 확인
상기 실시예 3.에서 확립한 BM-01A 세포에서 BDNF 단백질의 발현을 ELISA 분석 방법으로 확인하였다. 구체적으로, BDNF 단백질의 발현 수준은 인간 BDNF DuoSet ELISA 키트로 확인하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었다.
실험 결과, 독시사이클린을 제거한 배지와 독시사이클린을 제거하지 않은 배지에서 약 1x105개의 세포로부터 48시간 동안 발현이 유도된 BDNF 단백질의 발현 수준을 하기 도 9에 나타내었다. 독시사이클린이 있는 배지에서는 약 1.6 ng의 BDNF가 검출된 반면 독시사이클린을 제거한 배지에서는 약 380 ng의 BDNF가 검출되었다.
표적 단백질 발현 수준
BDNF 380 ng/105 cells
상기 표 1과 같이, 본 발명의 BM-01A 세포주에서 약 380 ng/105 cells의 BDNF 단백질이 발현되는 것을 확인하였다(표 1).또한, 확립된 BM-01A 세포주의 계대별 BDNF 단백질 발현량을 인간 BDNF ELISA 키트로 측정하였다. 그 결과, BDNF 단백질 발현량이 일정하게 유지되는 것을 확인하였다(도 10).
실험예 5. BM-01A 세포주에서 BDNF 도입유전자 확인
상기 실시예 3.에서 제조한 BM-01A 세포주에 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위해 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 상기 BM-01A 세포주를 9 ㎖ PBS가 포함된 15 ㎖ 튜브에 옮긴 후 1,500 rpm으로 5분간 셀 다운(Cell Down)시켰다. PBS를 완전히 제거한 뒤, 1.5 ㎖ 튜브에 200 ㎕ PBS로 펠렛을 현탁시킨 후 옮겼다. 그 후, NucleoSpin® Tissue (MN, 740952.250)를 이용하여 gDNA를 준비하고 하기 표 2와 같이 혼합물을 만든 후, 하기 표 3의 단계로 PCR을 수행하였다. 이때, 양성대조군으로 100 ng의 BM-01A 플라스미드 DNA를, 음성대조군으로 1 ㎕의 정제수를 넣었다. 상기 BM-01A 플라스미드 DNA는 대한민국 공개특허 제2017-0093748호에 기재된 방법에 따라 분리 정제할 수 있다.
정방향 프라이머(서열번호 17) (10 pmol/㎕, 마크로젠 합성) 1 ㎕
역방향 프라이머(서열번호 18) (10 pmol/㎕, 마크로젠 합성) 1 ㎕
검체 (100 ng/㎕) 1 ㎕
정제수 17 ㎕
총 부피 20 ㎕
단계 온도 시간 횟수
1 95℃ 5분 1
2 95℃ 30초 35
60℃ 30초
72℃ 1분
3 72℃ 7분 1
4 4℃ 무한정 1
1%(v/v) 아가로오스 겔을 전기영동 키트에 넣었다. 첫번째 웰에 10 ㎕의 DNA Size Marker를 로딩하였고, 다음 웰부터 음성대조군, 양성대조군, 3개의 BM-01A 검체 순서로 각각 10 ㎕씩 로딩하였다. 이후 100 V로 20분 동안 전기영동을 실시하였고, 겔 사진을 찍어 그 결과를 도 11에 나타내었다.도 11에 나타난 바와 같이, BM-01A 세포주 3개 모두 양성대조군과 동일한 사이즈 (1.0kb)의 PCR 프로덕트를 확인하였다.
실험예 6. BM-01A 세포주의 신경세포 보호 및 치료 효과 확인
실험예 6.1. 헌팅턴병 유발 래트 제작
신경독소인 퀴놀린산(quinolinic acid, QA)을 오른쪽 내측전뇌속(AP +1.0, ML -2.5, DV -5.0)에 120 nmol/2 ㎕ 농도로 0.2 ㎕/분 속도로 주입하여 급성 헌팅턴병 유발 래트를 제작하였다. 제작된 급성 헌팅턴병 동물모델의 확인을 위해 QA 주입 2주 후에 DARPP-32 항체(1:100, Cell Signaling)를 사용하여 면역염색을 한 후, LVZ(lateral ventricle zone)의 부피를 측정하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, QA 주입 후 뇌의 위축으로 인해 LVZ의 부피가 증가한 것을 확인하였다.
실험예 6.2. BM-01A 세포주 주입
실험예 6.1.에서 제작한 헌팅턴병 유발 래트의 내측전뇌속 2부위(AP 1.5, ML -3.0, DV -5.5 및 -4.5)에 1x106 cells/1 ㎕ 농도의 BM-01A 세포주를 0.2 ㎕/분 속도로 주입하였다. 대조군에는 배양배지를 동일한 용량으로 주입하였다. 주입 1주 후에 hNu 면역염색을 실시하여 BM-01A 세포주의 존재를 확인하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, BM-01A 세포주가 내측전뇌속에 존재하는 것을 확인하였다.
실험예 6.3. 행동개선 효과 확인
BM-01A 세포주 주입에 따른 헌팅턴병 유발 래트의 행동개선 효과를 확인하기 위해, BM-01A 주입 3주 전부터 1주간 래트를 훈련시켰다. BM-01A 주입 2주 전에 정상 래트의 행동 실험값을 측정하고, BM-01A 주입 1주 전에 QA를 주입하여 헌팅턴병을 유발하였다. 행동 실험은 로타로드 실험(Rota-rod test), 보행 실험(Stepping test) 및 계단 실험(Staircase test)를 실시하였다.
먼저, 기본적인 감각운동 능력을 확인하는 로타로드 실험을 진행하였다. 로타로드 실험은 점차 증가하는 속도로 회전하는 원통에서 마우스가 떨어지는데 걸리는 시간을 측정하는 방식으로 진행하였다. 또한, 로타로드 실험은 QA 주입 전, BM-01A 주입 직후, BM-01A 주입 후 2주, 4주, 6주, 8주, 10주째에 실시하였다. 그 결과, BM-01A 주입 2주 후부터 대조군 보다 BM-01A 세포주를 주입한 실험군이 원통에서 떨어지는데 더 오랜 시간이 걸렸으며, 시간이 경과함에 따라 대조군과 실험군의 떨어지는데 걸리는 시간의 차이가 증가하였다(도 14).
또한, 보행 실험은 래트의 한쪽 손을 고정한 후 다른 한쪽 손으로 테이블을 터치하는 횟수를 측정하는 방식으로 진행하였다. 보행 실험은 QA 주입 2주 전, BM-01A 주입 직후, BM-01A 주입 후 2주, 4주, 6주, 8주, 10주째에 실시하였다. 그 결과, BM-01A 주입 2주 후부터 대조군보다 BM-01A 세포주를 주입한 실험군의 테이블 터치 횟수가 많았으며, 시간이 경과함에 따라 대조군과 실험군의 테이블 터치 횟수의 차이가 증가하였다(도 15).
또한, 계단 실험은 계단이 설치된 정해진 박스 안에 먹이를 다섯 개씩 계단에 세팅한 후, 손을 사용하여 15분 동안 섭취하게 하고 남은 먹이 개수를 측정하여 섭취한 먹이의 개수를 계산하는 방식으로 진행하였다. 계단 실험은 QA 주입 2주 전, BM-01A 주입 직후, BM-01A 주입 후 2주, 4주, 6주, 8주, 10주째에 실시하였다. 그 결과, BM-01A 주입 2주 후부터 대조군보다 BM-01A 세포주를 주입한 실험군의 섭취한 먹이의 개수가 많았으며, 시간이 경과함에 따라 대조군과 실험군의 섭취한 먹이의 개수 차이가 증가하였다(도 16).
실험예 6.4. 항염증 효과 확인
실험예 6.2.에서 제작한 10주차의 대조군 및 실험군 래트를 희생시켰다. 래트의 뇌에 4%(v/v) 파라포름알데히드를 관류하여 고정시켰다. 크라이오스탯(cryostat, Microm, Germany)을 사용하여 40 ㎛의 동결 관상 절편(frozen coronal section)을 준비하였다.
상기 절편을 휴지기의 미세아교세포(microglia)와 활성화된 미세아교세포를 염색하기 위해 토끼-항-마우스 Iba-1 항체 및 Alexa-647이 표지된 염소-항-토끼 IgG 항체를 사용하여 염색하였다. 그 후, 활성화된 미세아교세포를 확인하기 위해 토끼-항-마우스 ED1(CD68) 항체 및 Alexa-488이 표지된 염소-항-토끼 IgG 항체(ED1)를 사용하여 염색하였다. 그 후, 이어서 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 염색한 후, 공초점 레이저-주사 현미경 이미징 시스템 (LSM510, Carl Zeiss, Inc.)을 사용해 사진을 촬영하였다. 그 결과, BM-01A 세포주를 주입한 실험군에서 대조군보다 적은 활성화된 미세아교세포가 관찰되었다(도 17).
또한, 상기 절편을 토끼-항-마우스 ED1(CD68) 항체 및 Alexa-488이 표지된 염소-항-토끼 IgG 항체(ED1)를 사용하여 염색하였다. 그 후, 활성화된 미세아교세포 중 염증 마커인 iNOS를 발현하는 세포를 확인하기 위해 토끼-항-마우스 iNOS 항체 및 Alexa-647이 표지된 염소-항-토끼 IgG 항체를 사용하여 염색하였다. 이어서, DAPI로 염색한 후, 공초점 레이저-주사 현미경 이미징 시스템을 사용해 사진을 촬영하였다. 그 결과, BM-01A 세포주를 주입한 실험군에서 활성화된 미세아교세포의 iNOS 발현량이 감소한 것을 확인하였다(도 18).
실험예 6.5. 신경아교증 감소 효과 확인
실험예 6.2.에서 10주차의 대조군 및 실험군 래트를 희생시켰다. 마우스의 뇌에 4%(v/v) 파라포름알데히드를 관류하여 고정시켰다. 크라이오스탯을 사용하여 40 ㎛의 동결 관상 절편을 준비하였다.
상기 절편을 신경아교세포가 특징적으로 발현하는 아교세포섬유산성단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)를 토끼-항-마우스 GFAP 항체 및 Alexa-488이 표지된 염소-항-토끼 IgG 항체를 사용하여 염색하였다. 이어서 DAPI로 염색한 후, 공초점 레이저-주사 현미경 이미징 시스템을 사용해 사진을 촬영하였다.
그 결과, BM-01A 세포주를 주입한 실험군에서 대조군보다 적은 신경아교세포가 관찰되었다(도 19).
실험예 6.6. 신경세포 보호 효과 확인
실험예 6.2.에서 10주차의 대조군 및 실험군 래트를 희생시켰다. 래트의 뇌에 4%(v/v) 파라포름알데히드를 관류하여 고정시켰다. 크라이오스탯을 사용하여 40 ㎛의 동결 관상 절편을 준비하였다. DARPP-32 항체를 사용하여 면역 염색한 후, LVZ의 부피, 선조체(striatum)내의 결실(deletion) 부분의 부피 및 선조체내의 밀도를 측정하였다. 그 결과, BM-01A를 주입한 실험군에서 LVZ의 부피가 감소하였다(도 20 및 도 21). 또한, BM-01A를 주입한 실험군에서 QA 주입으로 선조체내 결실 부분의 부피가 감소하였으며, 선조체내의 밀도가 증가한 것을 확인하였다(도 22 내지 도 24).
또한, 신경발생의 마커 단백질인 DCX(Doublecortin)의 발현량 변화를 확인하기 위해, 상기 준비한 절편에 토끼-항-마우스 DCX 항체 및 Alexa-647이 표지된 염소-항-토끼 IgG 항체를 사용하여 염색하였다. 공초점 레이저-주사 현미경 이미징 시스템을 사용해 사진을 촬영하였다. 그 결과, BM-01A 세포주를 주입한 실험군의 DCX 발현량이 증가한 것을 확인하였다(도 25).
실험예 7. 만성 뇌졸중 유발 실험동물에서 BM-01A 세포주의 신경세포 보호 및 치료 효과 확인
실험예 7.1. 만성 뇌졸중 유발 래트 제작
BM-01A 세포주 투여에 따른 만성 뇌졸중 유발 래트의 행동개선 효과를 확인하기 위해, BM-01A 투여 5주 전부터 1주간 마우스를 훈련시켰다. BM-01A 투여 4주 전에 정상 래트를 대상으로 middle carotid artery occlusion (MACo) 실험을 통해 뇌졸중을 유발하였다.
실험예 7.2. 행동개선 효과 확인
BM-01A 세포주 주입에 따른 뇌졸중 유발 래트의 행동개선 효과를 확인하기 위해, BM-01A 주입 3주 전부터 1주간 마우스를 훈련시켰다. BM-01A 주입 3주 및 1주 전에 2회에 걸친 행동 실험을 통해 정상 마우스의 행동 실험값을 측정하고, 행동 실험을 통해 뇌졸중이 유발된 래트를 선별하고, BM-01A를 dose별로 뇌내 투여한 다음 추가적으로 4회의 행동실험을 실시해 총 6회의 행동 실험을 통해 행동 실험값을 측정하였다. 행동 실험은 로타로드 실험(Rota-rod test), 보행 실험(Stepping test) 및 수정된 신경학적 중증도 점수 실험(Modified neurological severity scores test; mNSS)를 실시하였다.
먼저, 기본적인 감각운동 능력을 확인하는 로타로드 실험을 진행하였다. 로타로드 실험은 점차 증가하는 속도로 회전하는 원통에서 마우스가 떨어지는데 걸리는 시간을 측정하는 방식으로 진행하였다. 실험은 MCAo 모델링 1주전, MCAo 모델링 직후, 3주 후, BM-01A 투여 후 2주, 5주, 8주, 12주째에 실시하였다. 그 결과, BM-01A 주입 5주 후부터 대조군보다 1x106 개의 BM-01A 세포주를 투여한 실험군이 원통에서 떨어지는데 더 오랜 시간이 걸렸으며, 시간이 경과함에 따라 대조군과 실험군의 떨어지는데 걸리는 시간의 차이가 증가하였다(도 26).
또한, 보행 실험은 마우스의 한쪽 손을 고정한 후 다른 한쪽 손으로 테이블을 터치하는 횟수를 측정하는 방식으로 진행하였다. 보행 실험은 MCAo 모델링 1주전, MCAo 모델링 직후, 3주 후, BM-01A 투여 후 2주, 5주, 8주, 12주째에 실시하였다. 그 결과, BM-01A 주입 12주 후에는 대조군보다 1x106 개의 BM-01A 세포주를 주입한 실험군의 테이블 터치 횟수가 많았으며, 시간이 경과함에 따라 대조군과 실험군의 테이블 터치 횟수의 차이가 증가하였다(도 27).
또한, 수정된 신경학적 중증도 점수 실험(mNSS)은 운동능력, 감각기능, 평형 유지력, 반가기능 등을 종합적으로 평가하여 점수화하였다. 실험은 MCAo 모델링 1주전, MCAo 모델링 직후, 3주후, BM-01A 주입 후 2주, 5주, 8주, 12주째에 실시하였다(도 28). 그 결과, BM-01A 주입 5주후부터 대조군보다 1x106 개의 BM-01A 세포주를 주입한 실험군의 행동지수가 개선되었으며, 시간이 경과함에 따라 대조군과 실험군의 행동지수의 차이가 증가 및 유지하였다.
실험예 7.3. 항염증 효과 확인
16주차의 대조군 및 실험군 래트를 희생시켰다. 래트의 뇌에 4%(v/v) 파라포름알데히드를 관류하여 고정시켰다. 크라이오스탯(cryostat, Microm, Germany)을 사용하여 40 ㎛의 동결 관상 절편(frozen coronal section)을 준비하였다.
상기 절편에서 신경교질반흔(glial scar)의 형성을 확인하기 위해 신경아교세포가 특징적으로 발현하는 아교세포 섬유 산성 단백질(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)를 토끼-항-마우스 GFAP 항체 및 Alexa-488이 표지된 염소-항-토끼 IgG 항체를 사용하여 염색하였다. 이어서 공초점 레이저-주사 현미경 이미징 시스템(LSM510, Carl Zeiss, Inc.)을 사용해 사진을 촬영하였다.
그 결과, 반흔 면적을 측정하였을 때 피질 부위에서 대조군보다 1x106 개의 BM-01A 세포주를 투여한 실험군이 반흔 면적이 감소하였으며(도 29), 선조체 부위에서는 반흔 면적이 감소하였으나 통계적 유의성은 관찰되지 않았다(도 30). 다음으로 반흔 두께를 측정하였을 때 피질과 선조체 부위에서 대조군보다 1x106 개의 BM-01A 세포주를 투여한 실험군에서 반흔의 두께가 감소한 것이 관찰되었다(도 31).
실험예 8. BM-01A 세포주의 안전성 확인
실험예 8.1. 시험관 내( in vitro ) BM-01A 세포주의 종양원성 확인
CytoSelectTM 96-well Cell Transformation Assay를 이용해 연한천겔 (Soft Agar Gels)에서 골수유래 MSC, BM-01A 세포주, 양성대조군 (HeLa) 및 음성대조군 (NIH3T3)에서 비부착 증식 (Anchorage-independent Growth)에 의한 콜로니 형성 유무를 확인하였고, MTS 용액으로 염색하여 흡광도를 측정함으로써 세포 형질 전환에 의한 종양 형성 여부를 정량화하였다.
그 결과, 양성대조군에서 세포 형질전환에 의한 콜로니가 형성되었으며, 음성대조군, 골수유래 MSC 및 BM-01A 세포주는 콜로니가 형성되지 않은 것으로부터 세포배양 시 형질전환 능력이 없으며 시험관내(in vitro) 종양원성이 없음을 확인할 수 있었다(도 32).
실험예 8.2. 생체 내( in vivo ) BM-01A 세포주의 안전성 확인
BM-01A의 생체 내 안전성을 확인하기 위해, 실험예 6.2.에서 10주차의 실험군 래트를 희생시켜 BM-01A 세포주의 생존 유무를 확인하였다. 구체적으로, 실험예 6.2.에서 10주차의 대조군 및 실험군 래트를 희생시켰다. 래트의 뇌에 4%(v/v) 파라포름알데히드를 관류하여 고정시켰다. 크라이오스탯을 사용하여 40 ㎛의 동결 관상 절편을 준비하였다. 항-Human Nuclei 항체 및 세포사멸 마커인 항-Caspase3 항체를 사용하여 면역염색하였다. 공초점 레이저-주사 현미경 이미징 시스템을 사용해 사진을 촬영하였다.
그 결과, Human Nuclei는 사멸된 형태로 존재하였으며, Caspase 3가 염색된 부위가 동일하였다. 즉, BM-01A 세포주가 모두 사멸함을 입증하였으며 이를 통해 생체 내에서도 비정상적으로 분화하거나 증식하지 않아 안전성이 우수함을 확인하였다(도 33).
한국생명공학연구원 KCTC13778BP 20181214
<110> SLBIGEN Inc. <120> MESENCHYMAL STEM CELL EXPRESSING BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR GENE AND USE THEREOF <130> 1065041 <150> KR 10-2018-0008569 <151> 2018-01-24 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of BDNF <400> 1 Met Phe His Gln Val Arg Arg Val Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met 1 5 10 15 Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Ala 20 25 30 Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr Pro Gly Val Arg Thr His 35 40 45 Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys Ala Gly Ser Arg Gly Leu 50 55 60 Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val Ile Glu Glu Leu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu Asn Asn Lys Asp Ala Asp 85 90 95 Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro 100 105 110 Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala 115 120 125 Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly 130 135 140 Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp 145 150 155 160 Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu 165 170 175 Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr 180 185 190 Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp 195 200 205 Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg 210 215 220 Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg 225 230 235 240 Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 245 250 255 <210> 2 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of BDNF <400> 2 atgttccacc aggtgagaag agtgatgacc atcctgttcc tgaccatggt gatcagctac 60 ttcggctgca tgaaggctgc ccctatgaag gaggccaaca tcagaggaca gggcggcctg 120 gcctaccccg gcgtgagaac ccacggcacc ctggagagcg tgaacggccc caaggccggc 180 agcagaggcc tgaccagcct ggccgacacc ttcgagcacg tgatcgagga gctgctggac 240 gaggaccaga aggtgagacc caacgaggag aacaacaagg acgccgacct gtacaccagc 300 agagtgatgc tgagcagcca ggtgcccctg 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atcccagaag actggtgcag ctgctgagac agcacagcag cccctggcag 1380 gtgtacggct tcgtgagagc ctgcctgaga agactggtgc ctcccggcct gtggggcagc 1440 agacacaacg agagaagatt cctgagaaac accaagaagt tcatcagcct gggcaagcac 1500 gccaagctga gcctccagga gctgacatgg aagatgagcg tgagagactg cgcctggctg 1560 aggagaagcc ctggcgtggg ctgcgtgccc gccgccgagc acagactgag agaggagatc 1620 ctggccaagt ttctgcactg gctgatgagc gtgtacgtgg tggagctgct gagaagcttc 1680 ttctacgtga ccgagaccac attccagaag aacagactgt tcttttacag gaagagcgtg 1740 tggagcaagc tccagagcat cggcatcaga cagcacctga agagagtgca gctgagagag 1800 ctgagcgagg ccgaggtgag acagcacaga gaggccagac ccgccctgct gaccagcaga 1860 ctgagattca tccccaagcc cgatggcctg agacccatcg tgaacatgga ctacgtggtg 1920 ggagccagaa cctttagaag agagaagaga gccgagagac tgaccagcag agtgaaggcc 1980 ctgttcagcg tgctgaacta cgagagagcc agaagacccg gcctgctggg cgccagcgtg 2040 ctgggcctgg acgacatcca cagagcctgg agaaccttcg tgctgagagt gagagcccag 2100 gaccctcctc ccgagctgta cttcgtgaag gtggacgtga ccggcgccta cgacaccatc 2160 ccccaggaca gactgaccga ggtgatcgcc agcatcatca agccccagaa cacctactgc 2220 gtgagaagat acgccgtggt gcagaaggcc gcccacggcc acgtgagaaa ggccttcaag 2280 agccacgtga gcaccctgac cgacctccag ccctacatga gacagttcgt ggcccacctc 2340 caggagacca gccccctgag agatgccgtg gtgatcgagc agagctcttc cctgaacgag 2400 gcctccagcg gcctgttcga cgtgttcctg agattcatgt gccaccacgc cgtgagaatc 2460 agaggcaaga gctacgtgca gtgccagggc atcccccagg gcagcatcct gagcaccctg 2520 ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt tcgctggcat cagaagagac 2580 ggcctgctgc tgagactggt ggacgacttc ctgctggtga ccccccacct gacccacgcc 2640 aagaccttcc tgagaaccct ggtgagaggc gtgcccgagt acggctgcgt ggtgaacctg 2700 agaaagaccg tggtgaactt tcccgtggag gacgaggccc tgggcggcac cgccttcgtg 2760 cagatgcccg cccacggcct gtttccctgg tgcggcctgc tcctcgacac cagaaccctg 2820 gaggtgcaga gcgactacag cagctacgca agaaccagca tcagagccag cctgaccttc 2880 aacagaggct tcaaggccgg cagaaacatg agaagaaagc tgttcggcgt gctgagactg 2940 aagtgccaca gcctgttcct ggacctccag gtgaacagcc tccagaccgt gtgcaccaac 3000 atctacaaga tcctgctgct ccaggcctac agattccacg cctgcgtgct ccagctgccc 3060 ttccaccagc aggtgtggaa gaatcccacc ttcttcctga gagtgatcag cgacaccgcc 3120 agcctgtgct acagcatcct gaaggccaag aatgccggca tgagcctggg cgccaagggc 3180 gccgctggac ccctgcccag cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaggc cttcctgctg 3240 aagctgacca gacacagagt gacctacgtg cccctgctgg gcagcctgag aaccgcccag 3300 acccagctga gcagaaagct gcctggcaca accctgaccg ccctggaggc agccgcaaac 3360 cccgccctgc ccagcgactt caagaccatc ctggactag 3399 <210> 9 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of tTA <400> 9 Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu 1 5 10 15 Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln 20 25 30 Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys 35 40 45 Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ile Glu Met Leu Asp Arg His His 50 55 60 Thr His Phe Cys Pro Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg 65 70 75 80 Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly 85 90 95 Ala Lys Val His Leu Gly Thr Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr 100 105 110 Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu 115 120 125 Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys 130 135 140 Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr 145 150 155 160 Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu 165 170 175 Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu 180 185 190 Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Gly Pro 195 200 205 Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala 210 215 220 Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Ala Asp Ala Leu Asp Asp 225 230 235 240 Phe Asp Leu Asp Met Leu Pro Gly 245 <210> 10 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of tTA <400> 10 atgtcaaggc tggataaaag caaagtgatt aactccgctc tggaactgct gaacgaagtc 60 ggcattgagg ggctgaccac acgcaagctg gcacagaagc tgggagtgga gcagcccacc 120 ctgtactggc acgtgaagaa caagcgcgcc ctgctggacg ccctggccat cgagatgctg 180 gatcggcacc acacacactt ctgccctctg gagggcgaga gctggcagga cttcctgcgg 240 aacaatgcca agagctttag atgtgccctg ctgtcccaca gggatggagc aaaggtgcac 300 ctgggcacca gaccaacaga gaagcagtac gagaccctgg agaaccagct ggccttcctg 360 tgccagcagg gcttttctct ggagaatgcc ctgtatgccc tgagcgccgt gggacacttc 420 accctgggat gcgtgctgga ggaccaggag caccaggtgg ccaaggagga gagagagaca 480 cctaccacag actccatgcc ccctctgctg aggcaggcca tcgagctgtt tgatcaccag 540 ggcgccgagc cagccttcct gtttggcctg gagctgatca tctgcggcct ggagaagcag 600 ctgaagtgtg agtctggagg accagcagat gccctggacg atttcgacct ggatatgctg 660 cccgccgacg ccctggacga ttttgatctg gacatgctgc ctgctgatgc cctggatgat 720 tttgacctgg atatgctgcc tggataa 747 <210> 11 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of PuroR <400> 11 Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val 1 5 10 15 Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala 20 25 30 Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val 50 55 60 Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala 85 90 95 Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Pro His Arg Pro Lys Glu Pro Ala Trp Phe Leu Ala Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Pro Asp His Gln Gly Lys Gly Leu Gly Ser Ala Val Val 130 135 140 Leu Pro Gly Val Glu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Val Pro Ala Phe Leu 145 150 155 160 Glu Thr Ser Ala Pro Arg Asn Leu Pro Phe Tyr Glu Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Thr Val Thr Ala Asp Val Glu Val Pro Glu Gly Pro Arg Thr Trp Cys 180 185 190 Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala 195 <210> 12 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of PuroR <400> 12 atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta 60 cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac 120 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Tyr Ala Glu Trp Ser Glu 65 70 75 80 Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu 85 90 95 Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala 100 105 110 Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln Asp 115 120 <210> 14 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of ZeoR <400> 14 atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgatgtggc cggagcggtc 60 gagttctgga ccgaccggct cgggttcagc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180 aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360 gaggagcagg actaa 375 <210> 15 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of NeoR <400> 15 Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val 1 5 10 15 Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser 20 25 30 Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe 35 40 45 Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala 50 55 60 Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val 65 70 75 80 Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu 85 90 95 Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys 100 105 110 Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro 115 120 125 Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu 145 150 155 160 Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala 165 170 175 Arg Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys 180 185 190 Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp 195 200 205 Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala 210 215 220 Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe 225 230 235 240 Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe 245 250 255 Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 <210> 16 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of NeoR <400> 16 atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60 ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctaa 795

Claims (15)

  1. 뇌유래-신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 BDNF 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 BDNF 단백질을 코딩하는 유전자가 서열번호 2의 염기서열인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 벡터가 프로모터를 포함하는 것인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  6. BDNF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 렌티바이러스는 제1항의 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드로 숙주세포를 형질 전환시키는 단계; 및
    형질 전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득되는 것인, 재조합 렌티바이러스.
  8. 제6항의 재조합 렌티바이러스로 형질 감염된 숙주세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 숙주세포는 중간엽줄기세포인, 형질 감염된 숙주세포.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 숙주세포는 불사화된 것인, 형질 감염된 숙주세포.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 숙주세포는 hTERT 및/또는 c-Myc 유전자가 도입된 것인, 형질 감염된 숙주세포.
  12. 제6항의 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 신경질환이 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뇌경색, 만성 뇌손상(chronic brain injury), 척수손상, 헌팅턴병(Huntington's disease, HD), 렛트병(Rett's disease, RD), 허혈성 뇌질환, 뇌졸중 및 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury), 신생아 허혈성 뇌병증 (Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy), 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제8항의 형질 감염된 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 신경질환이 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 루게릭병(Amyotropic Lateral Sclerosis, ALS), 뇌경색, 만성 뇌손상(chronic brain injury), 척수손상, 헌팅턴병(Huntington's disease, HD), 렛트병(Rett's disease, RD), 허혈성 뇌질환, 뇌졸중 및 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury), 신생아 허혈성 뇌병증 (Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy), 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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