CN117721083A

CN117721083A - 重编程和基因编辑在i型胶原变异致病成骨不全症治疗中的应用

Info

Publication number: CN117721083A
Application number: CN202211138499.3A
Authority: CN
Inventors: 赵秀丽; 曹一璇; 茅彬; 李璐璐; 周思基; 杨玉姣
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2022-09-19
Filing date: 2022-09-19
Publication date: 2024-03-19

Abstract

本发明涉及重编程和基因编辑在I型胶原变异致病成骨不全症治疗中的应用。具体地，本发明提供了一种源自成骨不全症患者的诱导性多能干细胞(iPSC)，其中的I型胶原α1亚单位的编码基因COL1A1中的致病突变被纠正、由所述iPSC诱导分化的间充质干细胞、以及其在治疗成骨不全症中的用途。

Description

重编程和基因编辑在I型胶原变异致病成骨不全症治疗中的应用

技术领域

本发明涉及基因治疗的技术领域。具体地，本发明涉及成骨不全症的基因治疗的技术领域。

背景技术

成骨不全症(Osteogenesis Imperfecta，OI)是一类由单基因突变导致I型胶原异常的遗传性骨病，约85％的患者由COL1A1(NC_000017.11,NM_000088.3)(chr17:50199753-50199947,GRCh38/hg38)和COL1A12(NC_000007.14，NM_000089.3)(Chr7:94394895-94431227,GRCh38/hg38)基因突变所致，患者临床表现为多发性骨折，重者骨骼变形，终身肢体残疾。该病严重危害患者身心健康，给其家庭造成沉重的经济负担，因此建立有效的OI诊疗体系具有重要的临床价值和社会意义。OI治疗的要点是减少骨折，增加骨密度，提高患者生活质量。目前OI的治疗主要包括药物治疗和手术干预。双磷酸盐类药物(Bisphosphonates，BPs)通过减少破骨细胞的骨吸收来治疗骨质疏松症[1]，该药被用于OI治疗，但疗效不及对骨质疏松的效果显著[2]；另一种常用的合成代谢类药物特立帕肽(一种甲状旁腺激素类似物)也被用于OI治疗[3]，但有研究表明该药高剂量可引发骨肉瘤[4]；最近TGF-β抑制剂和抗硬化蛋白(成骨细胞骨形成的负调控因子)被用于动物水平OI治疗[5-7]，但其疗效有待临床试验验证[8]。OI是一种单基因病，矫正基因变异可能是未来有前景的精准治疗方法。

目前基因治疗主要包括病毒载体介导的正常基因补充法，如慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)介导的基因治疗和以反义干预为主的基因治疗方法[9]。病毒介导的基因治疗主要是针对功能丧失的常染色体隐性或X连锁隐性遗传疾病，该方法有较高的转染效率，但病毒载体可能增加肿瘤发生和免疫反应的风险[9-11]；反义干预主要针对获得性功能变异的杂合子进行治疗，该方法虽然特异性干预突变等位基因表达，但疗效较短暂。

CRISPR/Cas9技术是一种强大的基因编辑工具[12]，近年来广泛应用于模式动物的制备和基因治疗，如在甲状腺素淀粉样变性、帕金森病和结直肠癌[13-15]等疾病中已有应用研究。基因重编程技术的发展和成熟，使得我们能够从患者体细胞获得患者来源的诱导性多能干细胞(iPSC)[16]。iPSCs特异性表达OCT4，SOX2和SSEA1等多潜能基因，这些标记分子可用于iPSCs的克隆鉴定；外源iPSCs在裸鼠皮下可以形成由三个胚胎胚层组成的畸胎瘤，通过三胚层组织化学分析，鉴定iPSCs的多能性；在体外培养条件下，iPSCs可条件性诱导成神经细胞、肠细胞、输尿管芽祖细胞样细胞、心肌细胞和间充质干细胞等[17-21]。通过患者来源iPSCs和基因编辑可获得经过基因修复的、无免疫排斥、具有一定干性的组织细胞，这种经过基因修复的患者来源细胞在单基因病的治疗中具有重要潜能。

发明内容

本发明人发现，体外纠正成骨不全症(OI)患者来源的iPSC细胞中的COL1A1基因突变，能够显著改善该细胞诱导的间充质干细胞(MSC)向成骨细胞的分化，与突变纠正前相比，显著提高了所述间充质干细胞(MSC)分化的成骨细胞数量以及其中的I型胶原蛋白的含量。

基于上述发现，在本发明的第一方面，提供了一种诱导性多能干细胞(iPSC)，所述iPSC源自成骨不全症患者，并且所述iPSC中的COL1A1基因中的致病突变被纠正了，优选地，所述COL1A1基因中的致病突变选自COL1A1第二外显子中的突变c.175C>T(Chr17:50199876,hg38)或c.187T>A(Chr17:50199864,hg 38)。

在本发明的一个实施方案中，纠正致病突变指的是将与疾病相关的突变核苷酸回复为野生型核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，提供的诱导性多能干细胞(iPSC)特异性表达OCT4、SOX2、SSEA1和SSEA4中的一个或多个基因，优选地，所述诱导性多能干细胞(iPSC)在小鼠中具有成瘤性。

在本发明的一个实施方案中，提供的诱导性多能干细胞(iPSC)源自成骨不全症患者的成纤维细胞，优选地，源自成骨不全症患者的皮肤的成纤维细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种间充质干细胞(MSC)，所述间充质干细胞(MSC)源自本发明上述的诱导性多能干细胞。

在一个实施方案中，根据本发明的间充质干细胞(MSC)为CD73⁺/CD90⁺/CD34^-/CD45^-，并且在特定条件下分化为碱性磷酸酶(ALP)阳性的成骨细胞。

在另一方面，本发明提供了根据本发明的诱导性多能干细胞和/或间充质干细胞在制备用于治疗成骨不全症患者的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供了制备诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提供源自成骨不全症患者的皮肤成纤维细胞，

2)将步骤1)中的患者皮肤成纤维细胞诱导为iPSC，优选地，采用仙台病毒重编程体系进行诱导，

3)通过CRISPR/Cas9基因编辑方法纠正COL1A1基因中的致病突变，优选地，纠正COL1A1第二外显子中的突变c.175C>T和/或c.187T>A，使其回复为野生型，和

4)获得基因编辑后的诱导性多能干细胞(iPSC)。

在另一方面，本发明提供了制备间充质干细胞的方法，所述方法包括将本发明的诱导性多能干细胞(iPSC)诱导分化成间充质干细胞的步骤。

在本发明的另一方面，提供了纠正COL1A1基因中的致病突变的试剂在制备用于治疗成骨不全症的药物中的用途，优选地，所述COL1A1基因中的致病突变选自COL1A1第二外显子中的突变c.175C>T或c.187T>A。

在本发明的一个实施方案中，所述纠正COL1A1基因中的致病突变的试剂是用于CRISPR/Cas9基因编辑方法中的试剂，优选地，所述试剂包含Cas9蛋白、电转缓冲液、gRNA和供体DNA(donor DNA)。

在一个实施方案中，本发明提供了使COL1A1基因第二外显子中c.187位的突变核苷酸A回复为野生型核苷酸T的试剂在制备用于治疗成骨不全症的药物中的用途，优选地，所述试剂是用于CRISPR/Cas9基因编辑方法中的试剂，优选地，所述试剂包含Cas9蛋白、电转缓冲液、gRNA和供体DNA。

在另一方面，本发明提供了一种治疗成骨不全症患者的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提供源自成骨不全症患者的皮肤成纤维细胞，

3)通过CRISPR/Cas9基因编辑方法纠正COL1A1基因中的致病突变，优选地，纠正COL1A1第二外显子中的突变c.175C>T和/或c.187T>A，使其回复为野生型，

4)获得基因编辑后的诱导性多能干细胞(iPSC)，

5)将步骤4)的诱导性多能干细胞(iPSC)诱导分化成间充质干细胞，和

6)将治疗有效量的步骤5)的间充质干细胞施用到受试者。

附图说明

图1.OI患者的临床表现及候选致病变异的鉴定。图1的A-D显示患者影像学临床表现；图1的E显示先证者及父母的Sanger测序验证；图1的F显示T克隆测序结果分析；图1的G显示两个突变位点的保守性分析。

图2.iPSC的鉴定。图2的A为iPSC克隆的免疫荧光鉴定；图2的B为裸鼠畸胎瘤试验及免疫组化分析验证iPSC的三胚层分化能力。

图3.基因编辑前后的基因型鉴定。

图4.编辑前后干细胞的核型分析。从上至下依次为编辑前的干细胞核型、两个突变位点均纠正的干细胞核型、c.187T>A得到纠正的干细胞核型以及c.175C>T得到纠正的干细胞核型。

图5.间充质干细胞(MSC)及成骨细胞的鉴定。图5的A显示诱导得到的MSC细胞的流式分析；图5的B显示MSC细胞进一步分化得到的成骨细胞的鉴定；四种iPSC克隆分化而来的成骨细胞的I型胶原蛋白(上)、碱性磷酸酶(中)及茜素红(下)染色结果。

具体实施方式

成骨不全症(OI)是一种先天性遗传疾病，根据基因突变可分成21种类型。主要病因是I型胶原纤维数量不足或结构异常，是一种全身性结缔组织疾病。I型胶原变异导致的成骨不全症可以分为4种亚型，均为常染色体显性遗传。约85％成骨不全症主要由I型胶原编码基因COL1A1和COL1A2致病突变引起。

本文所用的术语“致病突变”，指的是与患者疾病直接相关的致病变异，具体地，与患者骨折等成骨不全症症状相关的基因变异，具体地，本文中的术语“致病突变”是指COL1A1和COL1A2基因中与成骨不全症发生相关的突变，包括但不限于，COL1A1和COL1A2基因中的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，只要其发生与成骨不全症相关。

在本文中使用的术语“c.175C>T”指的是COL1A1第二外显子中(Genebank登录号：NC_000017.11)第175位的核苷酸C突变为T(Chr17:50199876)，“c.187T>A”指的是COL1A1第二外显子中(Genebank登录号：NC_000017.11)第187位的核苷酸T突变为A(Chr17:50199864)；c.[175C>T；187T>A]指的是COL1A1第二外显子中(Genebank登录号：NC_000017.11)第175位的核苷酸C突变为T(Chr17:50199876)、和COL1A1第二外显子中(Genebank登录号：NC_000017.11)第187位的核苷酸T突变为A(Chr17:50199864)。

如本文所述，“纠正”致病突变，是指将突变的核苷酸回复为野生型核苷酸。

本发明人在一例III型OI患者中检测到的致病变异COL1A1:c.[175C>T；187T>A]；p.[R59W；C63S(NP_000079)，基于此进行了致病机制和基于基因编辑的基因治疗研究。首先通过手术产生的废弃皮肤组织的培养获得该患者的皮肤成纤维细胞；通过仙台病毒重编程方法获得患者来源的iPSCs，并经过特异分子标志物的免疫荧光分析、畸胎瘤三胚层组织学分析和染色体核型、基因组测序分析进行iPSC克隆鉴定；通过CRISPR/Cas9基因编辑方法修正两个变异位点或只修复其中一个位点；将不同基因型的iPSCs诱导分化成MSCs和成骨细胞，并通过成骨活性、矿化能力、I型胶原表达水平等对基因编辑前后的细胞进行鉴定。本专利的实验证据表明，CRISPR/Cas9基因编辑结合iPSCs体系纠正致病变异是开发OI治疗新方法的有效策略。

本发明涉及患者来源皮肤细胞培养、iPSCs诱导和利用基因编辑技术纠正突变位点并诱导为间充质干细胞和成骨细胞的系列方法。本发明提供了从皮肤成纤维细胞、干细胞诱导到CRISPR/Cas9基因编辑纠正OI患者突变的新方法以及该过程获得的iPSC克隆和MSC克隆。

具体实施包括以下步骤：1)OI患者iPSCs诱导培养：通过患者术后残余皮肤组织培养，获得皮肤成纤维细胞，采用仙台病毒重编程体系将患者皮肤成纤维细胞诱导为iPSCs，通过iPSC标志物免疫荧光分析、畸胎瘤实验、染色体核型和全基因组测序进行iPSC克隆选择和鉴定；2)突变位点基因纠正：设计、合成gRNA及供体DNA，通过电转共转染CRISPR/Cas9基因编辑试剂和gRNA及供体DNA，鉴定单细胞克隆的挑取和靶序列基因型，通过编辑后iPSC克隆的核型分析和全基因组序列分析鉴定基因组稳定性，并排除脱靶效应；3)间充质干细胞(MSCs)诱导：对挑选好的不同基因型的iPSC克隆进行MSCs诱导培养和鉴定(流式细胞仪鉴定标志物)；将MSCs诱导分化成成骨细胞，并进行细胞功能鉴定。

本发明涉及将皮肤干细胞重编程，诱导成iPSCs：患者来源的皮肤成纤维细胞经CytoTune^TM-iPS 2.0仙台病毒重编程体系(Thermo Fisher Scientific，美国)重编程后诱导为iPSC。在Essential 8^TM完全培养基(Thermo Fisher Scientific，美国)中培养21天后可形成iPSC克隆。

本发明涉及iPSCs的分化潜能验证：诱导后的iPSCs通过免疫荧光染色，证实为SSEA4⁺/OCT4⁺的具有干性的多能干细胞。此外，利用裸鼠畸胎瘤实验，将iPSCs注射到SCID裸鼠腹部，免疫组化分析显示所获畸胎瘤呈现Nestin⁺/α-SMA⁺/AFP⁺，证实iPSC在裸鼠体内具有三胚层分化潜能。

本发明涉及gRNA及供体DNA的设计与合成。本发明聚焦在OI患者COL1A1中发现的两个顺式变异c.[175C>T；187T>A]，在确定致病变异的基础上获得可用于精准治疗的功能细胞。为实现上述目标，我们利用Benchling线上工具(www.benchling.com)根据需要编辑的核苷酸位置设计三条gRNAs，根据纠正后的基因型设计对应供体DNA。CRISPR/Cas9电转体系包括Cas9蛋白、电转缓冲液、gRNA、供体DNA及干细胞悬液。电转后通过接种至2个96孔板挑取单细胞克隆，在Essential 8^TM完全培养基中继续培养10天直至筛选出目的基因型单细胞克隆。

本发明涉及MSCs的诱导及成骨细胞的分化：利用STEMdiff^TM间充质祖细胞试剂盒(STEM CELL，加拿大)进行iPSC向MSCs的诱导。4天后，利用MesenCult^TM-ACF Plus培养基(STEM CELL，加拿大)培养MSCs细胞21天。经成骨细胞培养基培养后可分化为成骨细胞。本发明人已经观察到，由iPSCs分化而来的MSCs为CD73⁺/CD90⁺/CD34^-/CD45^-，因此具有MSCs特有标志物特性。MSCs可以在特定条件下分化为碱性磷酸酶(ALP)阳性的成骨细胞。

本发明具有以下几方面的优点：

1)细胞来源为OI患者术后皮肤组织，将来用于治疗不会造成免疫排斥。

2)使得从病因学角度根治OI成为可能，无需频繁用药，无需多次手术，从基因上彻底纠正导致OI的致病突变。

3)iPSCs具有强大的增殖能力，可获得足够量的细胞以用于后续研究和治疗。

4)本专利获得的用于治疗的细胞是MSCs，具有良好的生物安全性。

5)CRISPR/Cas9技术是一种较成熟的基因编辑技术，可广泛用于致病基因的编辑，对于点突变所致单基因病具有良好的可操作性。

本发明获得以下技术效果：

1)明确新突变的致病病因：本发明发现在COL1A1:c.[175C>T；187T>A]的两个顺式变异中，c.187T>A发生回复突变后改善细胞功能，c.175C>T发生回复突变后不能改善细胞功能，证实c.187T>A为OI致病变异。

2)采用OI患者来源iPSCs的突变修复，在基因层面彻底纠正致病根源。

3)本发明建立了基于患者来源iPSCs及基因编辑的OI基因治疗，建立了I型胶原编码基因突变致病OI的基因治疗体系，为其他点突变所致常染色显性遗传骨骼系统疾病的精准治疗提供了借鉴。

结合以下实施例进一步说明本发明，但是，这些实施例并不旨在限制本发明。在以下实施例中，如无具体说明，所有实验步骤均采用本领域技术人员已知的方法进行。

实施例：对一例含有COL1A1基因顺式双突变的III型OI患者进行多能干细胞诱导及基因编辑

1)OI病例的筛选：

结合患者临床表现及突变鉴定进行OI疾病诊断；经全外显子测序，筛选致病突变；运用PCR-Sanger测序进行突变验证；结合生物信息学分析确定致病性。

结果分析：根据该患者临床表型(反复骨折、骨骼变形、骨密度低下，图1的A-D)诊断该患者为III型OI。WES测序及Sanger测序验证证实该OI患者存在位于COL1A1第二外显子的顺式双突变：c.[175C>T；187T>A]；p.[R59W；C63S]；突变区域的T克隆Sanger测序已证实该突变为新生突变且位于同一等位基因(图1的E-F)。保守性分析进一步验证其致病性(图1的G)。

2)OI患者皮肤成纤维细胞培养：

取患者手术过程中废弃的皮肤组织约5×5mm²；剪碎后应用含有胎牛血清的F-12培养基进行皮肤成纤维细胞培养。

3)OI患者成纤维细胞诱导iPSC及iPSC的鉴定：

OI患者来源的皮肤成纤维细胞经CytoTune^TM-iPS 2.0仙台病毒重编程体系(Thermo Fisher Scientific，美国)重编程后将体细胞诱导为iPSC。运用仙台病毒载体，根据病毒滴度选择适宜的病毒剂量对皮肤成纤维细胞进行转染。相应的病毒体系为KOS(MOI＝5)，hc-Myc(MOI＝5)和hKlf4(MOI＝3)。7天后，将细胞接种于铺有Geltrex(ThermoFisher Scientific，美国)的培养皿中，并将皮肤成纤维细胞培养基更换为Essential 8^TM完全培养基(Thermo Fisher Scientific，美国)。继续培养21天直至出现iPSC集落。

结果分析：对iPSC集落进行干性特征分析和鉴定(图2)。诱导成功的iPSC应具有边缘清晰、细胞团平坦、鹅卵石形状的细胞集落形态。经免疫组化鉴定，iPSC为SSEA4阳性及OCT4阳性(图2的A)，表明其具有多能分化的潜能。此外，对免疫缺陷SCID小鼠进行畸胎瘤试验。收集1.5×10⁶iPSC稀释于50μL含有1:1混合有PBS和Matrigel(STEM CELLTechnologies，加拿大)的溶液中。对3只SCID小鼠右腹翼侧注射该50μL干细胞悬液，左侧腹翼侧注射同体积Matrigel作为对照。6周后可发现右侧长出畸胎瘤，左侧对照无变化，证明干细胞具有进一步分化潜能。进一步对畸胎瘤进行免疫组化分析，证实所获得畸胎瘤为巢蛋白⁺/α-SMA⁺/AFP⁺，表明所获得的iPSC具有三胚层分化潜能。

4)CRISPR/Cas9基因编辑纠正突变位点：

首先运用Benchling线上工具(www.benchling.com)设计3条gRNA(表1)并运用GeneArt^TM精准gRNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)完成合成，并针对突变位点设计三条供体DNA，分别将两个突变都进行纠正(供体DNA 1)、只纠正第二个突变位点c.187T>A(供体DNA 2)、以及只纠正第一个突变位点c.175C>T(供体DNA 3)(表1)。随后，运用CRISPR/Cas9基因编辑手段对突变位点进行编辑：制备包含2.5×10⁵iPSC细胞、gRNA、供体DNA、Cas9蛋白(Thermo Fisher Scientific，美国)和缓冲液R(Thermo FisherScientific，美国)的电转细胞悬液。以1200V，30ms，1pulse的条件下进行电转(NeonTMTransfection system，Invitrogen，MPK5000)。

表1.实施例中所应用的gRNA、供体DNA及验证引物序列信息

5)单细胞克隆筛选及目的基因型验证：

对获得的编辑后干细胞克隆进行单细胞克隆挑选：在经过胰酶将干细胞团消化为单个细胞后，以80个细胞/ml的密度接种于铺有rhLaminin-521(Thermo FisherScientific，美国)的2板96孔板，以获得单一基因型的单细胞克隆。在培养10天后提取每个单细胞克隆DNA，经PCR扩增后进行Sanger测序(引物见表1)，挑选目的基因型的单细胞克隆。

结果分析：该OI患者的iPSC细胞经基因编辑后，共收获3种基因型iPSC单细胞克隆(图3)。(1)克隆2：c.175C>T和c.187T>A两个突变均得到纠正，28％的细胞具有目的基因型；(2)克隆3：c.187T>A得到纠正，6％的细胞具有目的基因型；(3)克隆4：c.175C>T得到纠正，18％的细胞具有目的基因型。

对比编辑前、后iPSC克隆的核型及全基因组序列：1)通过G显带技术进行染色核型分析，具体如下：对需要进行核型分析的干细胞用0.2μg/ml的秋水仙素处理2.5小时，消化得到细胞沉淀；细胞经0.075mol/L KCl溶液37℃低渗处理20分钟，用新鲜固定液(甲醇和冰醋酸3:1混合)固定细胞20min，1500rpm离心8min；反复固定2次，获得0.5ml细胞悬液，取2-3滴细胞悬液滴片；成片染色体标本经2小时72度烤片后，经胰酶消化、生理盐水润洗和Giemsa染色，制成G显带样本，在显微镜下进行核型分析；2)编辑前后的干细胞克隆经全基因组测序(HiSeq 4000Illumina)，检验基因编辑是否造成脱靶效应。

结果分析：对比编辑前后干细胞的染色体核型，基因编辑未改变染色体核型(图4)。全基因组测序结果显示，基因编辑后3种基因型的细胞(克隆2、克隆3、克隆4)相较编辑前的细胞(克隆1)，证明基因编辑未造成基因脱靶效应。

6)间充质干细胞的诱导及验证：

iPSCs向MSCs的诱导可采用STEMdiff^TM间充质祖细胞试剂盒(STEM CELL，加拿大)进行诱导分化。将iPSCs培养于铺有Matrigel(康宁)的细胞培养皿中，在TeSR^TM-E8^TM(STEMCELL，加拿大)培养条件下适应2-3天；使用STEMdiff^TM-ACF间充质诱导培养基(STEM CELL，加拿大)替换TeSR^TM-E8^TM培养基，继续培养4天；使用MesenCult^TM-ACF Plus培养基(STEMCELL，加拿大)诱导间充质祖细胞2天；细胞传代后继续在MesenCult^TM-ACF Plus培养基中培养21天，直至形成成熟的MSCs。通过流式细胞分析检验所获得的细胞是否表达MSCs的特征因子。

结果分析：分别对克隆1-4诱导而来的MSC细胞进行CD70、CD90、CD34、CD45的标记并进行流式细胞分析。分析结果显示，所获得的细胞均为CD70⁺/CD90⁺/CD34^-/CD45^-(图5的A)，证明MSCs转化状态良好，复合后续研究要求。

7)成骨细胞的分化及验证：诱导培养得到的MSC在含有10％胎牛血清(Gibco)、1％双抗(Gibco)、10mMβ-甘油磷酸钠(Sigma，美国)、10nM地塞米松(索莱宝，中国)、50μg/ml抗坏血酸(索莱宝，中国)的DMEM(Gibco)培养基中进行成骨细胞分化，培养14天后可获得成熟的成骨细胞。所得成骨细胞经细胞固定后进行标志物染色鉴定。

结果分析：I型胶原蛋白免疫荧光鉴定显示，克隆2(两个突变位点均得到纠正)可得到较好的I型胶原蛋白形态，克隆3(c.187T>A得到纠正)可得到较多的成骨细胞，且I型胶原蛋白含量最高，克隆4(c.175C>T得到纠正)和克隆1(编辑前)分化而来的成骨细胞I型胶原蛋白表达量均较低(图5的B)；ALP染色及茜素红染色结果显示，克隆3(c.187T>A得到纠正)诱导获得的成骨细胞具有最高的ALP表达及骨矿化能力，其次为克隆2(两个突变位点均得到纠正)，但克隆4(c.175C>T得到纠正)不能缓解OI细胞的疾病表型，与克隆1(编辑前)的ALP和茜素红染色结果相似(图5的B)。

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Claims

1.一种诱导性多能干细胞(iPSC)，所述诱导性多能干细胞源自成骨不全症患者，并且所述诱导性多能干细胞中的COL1A1和/或COL1A2基因中的致病突变被纠正，优选地，所述COL1A1中的致病突变选自COL1A1第二外显子中的突变c.175C>T、c.187T>A或c.[175C>T；187T>A]，所述纠正致病突变指的是将与疾病相关的突变核苷酸回复为野生型核苷酸。

2.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞，其特异性表达OCT4、SOX2、SSEA1和SSEA4中的一个或多个基因，优选地，所述诱导性多能干细胞在小鼠中具有成瘤性。

3.根据权利要求1或2所述的诱导性多能干细胞，其源自成骨不全症患者的成纤维细胞，优选地，其源自成骨不全症患者的皮肤成纤维细胞。

4.一种间充质干细胞，所述间充质干细胞源自权利要求1-3中任一项所述的诱导性多能干细胞。

5.根据权利要求4所述的间充质干细胞，其为CD73⁺/CD90⁺/CD34^-/CD45^-的细胞，并且在特定条件下分化为碱性磷酸酶(ALP)阳性的成骨细胞。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的诱导性多能干细胞和/或根据权利要求4或5所述的间充质干细胞在制备用于治疗成骨不全症患者的药物中的用途。

7.一种制备诱导性多能干细胞(iPSC)的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提供源自成骨不全症患者的皮肤成纤维细胞，

4)获得基因编辑后的诱导性多能干细胞(iPSC)。

8.一种制备间充质干细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求1-3中任一项所述的诱导性多能干细胞、或通过权利要求7所述的方法制备的诱导性多能干细胞诱导分化成间充质干细胞的步骤。

9.纠正COL1A1基因中的致病突变的试剂在制备用于治疗成骨不全症的药物中的用途，优选地，所述COL1A1基因中的致病突变选自COL1A1第二外显子中的突变c.175C>T或c.187T>A，优选地，所述纠正COL1A1基因中的致病突变的试剂是用于CRISPR/Cas9基因编辑方法中的试剂，优选地，所述试剂包含Cas9蛋白、电转缓冲液、gRNA和供体DNA。

10.使COL1A1基因第二外显子中187位的突变核苷酸A回复为野生型核苷酸T的试剂在制备用于治疗成骨不全症的药物中的用途，优选地，所述试剂是用于CRISPR/Cas9基因编辑方法中的试剂，优选地，所述试剂包含Cas9蛋白、电转缓冲液、gRNA和供体DNA。