JP2024501098A - ビエッティ結晶性ジストロフィー治療用核酸分子およびその使用 - Google Patents

Abstract

【要約】本文は、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶポリペプチド２（ＣＹＰ４Ｖ２）を標的とするｇＲＮＡ、ヒトＣＹＰ４Ｖ２ヌクレオチド配列を含有するドナー核酸分子、およびビエッティ結晶性ジストロフィーを治療するための医薬の製造における前記ｇＲＮＡおよび前記ドナー核酸分子の使用を開示する。【選択図】なし

Description

本願はバイオ医薬分野に関し、より詳細には、ビエッティ結晶性ジストロフィーを遺伝子編集治療するためのｇＲＮＡとドナー核酸分子に関する。

ビエッティ結晶性ジストロフィー（（Ｂｉｅｔｔｉ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、ＢＣＤ）、結晶性網膜色素変性症、ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー（Ｂｉｅｔｔｉ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｃｏｒｎｅｏｒｅｔｉｎａｌ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、クリスタリン網膜症（Ｂｉｅｔｔｉ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、ビエッティの網膜ジストロフィー（Ｂｉｅｔｔｉ’ｓ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）と呼ばれることもある。）は失明に至る常染色体潜性遺伝性網膜変性疾患である。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子は現在発見されたＢＣＤの原因遺伝子の一つである（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．７４：８１７－８２６，２００）。ＣＹＰ４Ｖ２はシトクロムＰ４５０スーパーファミリーに属し、ヘム-チオレートタンパク質シトクロムＰ４５０サブファミリー４（ＣＹＰ４）のメンバーである。

現在、当該疾患のためにいくつかの治療法があり、例えば、ウイルストランスフェクションシステム、またはその他のトランスフェクションシステム（例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス、レトロウイルス）を利用して、ＣＹＰ４Ｖ２の野生型遺伝子を遺伝子変異の細胞にトランスフェクトすることで、遺伝子変異の細胞が野生型ＣＹＰ４Ｖ２を発現することができる遺伝子置換療法がある。この方法では、変異細胞の機能を部分的にしか回復させることができず、しかも治療の有効性が限られている。それは、変異型の遺伝子産物は仍然として細胞に存在し、これらの変異タンパク質は正常の遺伝子産物を競合的に阻害してしまう。そのため、より安全的かつ有効な治療方法の開発は期待されている。

当該背景技術の部分で開示された情報は、本願の一般的な背景に対する理解を深めるためのものにすぎず、それらの情報が当業者に公然知られた従来技術を形成するという承認またはいかなる形の示唆ではない。

本願は、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶポリペプチド２（ＣＹＰ４Ｖ２）を特異的に標的とするｇＲＮＡを提供するものであって、前記ｇＲＮＡはｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位を特異的に標的とし、前記ｇＲＮＡは前記変異部位に対して良好な切断効果を有するので、オリジナル変異のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子産物は細胞に存在しなくなる。また、本願はドナー核酸分子を提供し、前記ドナー核酸分子は、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位を含有しない正確なＣＹＰ４Ｖ２のヌクレオチド配列を含有し、前記ドナー核酸分子は、内在性ＣＹＰ４Ｖ２が前記ｇＲＮＡによって切断された後、遺伝子変異の細胞において、ＣＹＰ４Ｖ２の変異部位を修復することで、正常な機能を有するＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を作り、優れた修復効果を有する。本願は、前記ｇＲＮＡおよび／または前記ドナー核酸分子を含有するベクターを提供するものであって、ＣＹＰ４Ｖ２変異の細胞が正確にシトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶポリペプチド２を発現することを可能にし、良好な遺伝子の編集修復効率を有する。

一方、本願は、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶポリペプチド２（ＣＹＰ４Ｖ２）遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡを提供するものであって、前記ｇＲＮＡはｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流２００ｂｐ以内のヌクレオチド配列に特異的に結合する。

一実施形態において、前記ｇＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７８－８０、８２－８４のいずれかのヌクレオチド配列を含有する。

一実施形態において、前記ｇＲＮＡは５’－（Ｘ）ｎ－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７８－８０、８２－８４-バックボーン配列－３’を含有し、ＸはＡ、Ｕ、ＣおよびＧから選択されるいずれかの塩基であり、かつｎは０－１５のいずれの整数である。

一実施形態において、前記ｇＲＮＡは一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。

他方、本願は、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡをコードする、一種または複数種の単離された核酸分子を提供するものである。

他方、本願は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流８００ｂｐ以内の正常野生型のヌクレオチド配列を含有するドナー核酸分子を提供するものである。

一実施形態において、前記核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４－６６のいずれかのヌクレオチド配列を含有する。

他方、本願は、前記単離された核酸分子および／または前記ドナー核酸分子を含有する、ベクターを提供するものである。

一実施形態において、前記単離された核酸分子と前記ドナー核酸分子が同一ベクター上に存在する。

一実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。

他方、本願は、前記単離された核酸分子、前記ドナー核酸分子および／または前記ベクターを含有する、細胞を提供するものである。

一実施形態において、前記細胞はＨＥＫ２９３細胞、腎上皮細胞および／または人工多能性幹細胞を含む。

一実施形態において、前記細胞は修飾により分化能を有する。

一実施形態において、前記細胞は３Ｄ－網膜オルガノイドに分化することができる。

他方、本願は、前記ｇＲＮＡ、前記一種または複数種の単離された核酸分子、前記ドナー核酸分子、および／または前記ベクター、および薬学的に許容される担体を含有する、医薬組成物を提供するものである。

他方、本願は、疾患の治療のための医薬の製造における、前記ｇＲＮＡ、前記一種または複数種の単離された核酸分子、前記ドナー核酸分子、および／または前記ベクターの使用を提供するものであって、前記疾患はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子におけるｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異による疾患を含む。

一実施形態において、前記疾患はビエッティ結晶性ジストロフィーを含む。

他方、本願は、必要とする被験者に前記ｇＲＮＡ、前記一種または複数種の単離された核酸分子、前記ドナー核酸分子、および／または前記ベクターを導入する工程を含む、ビエッティ結晶性ジストロフィーを治療する方法を提供するものである。

一実施形態において、前記導入で、正常な機能を有するＣＹＰ４Ｖ２タンパク質が獲得される。

一実施形態において、前記導入は注射を含む。

一実施形態において、前記導入は網膜下注射を含む。

他方、本願は、細胞に前記ｇＲＮＡ、前記一種または複数種の単離された核酸分子、および／または前記ベクターを導入することを含む、細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の発現を調節する方法を提供するものである。

当業者なら以下の詳細な説明から本願の他の態様や利点を容易に了解する。以下の詳細な説明では、本願の例示的な実施形態のみを示し、説明している。当業者ならわかるように、本願の内容を理解すれば、当業者は本願発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることが可能である。したがって、本願の図面及び明細書の記載は、例示的なものに過ぎず、限定的なものではない。

本願発明の具体的な特徴は、添付の特許請求の範囲に示されている。以下で詳細に説明する例示的な実施形態と図面を参照することによって、より確実に理解されるだろう。図面に関して、以下のように簡単に説明する。

本願に記載のｓｇＲＮＡ１－２による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のｓｇＲＮＡ３－５による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のｓｇＲＮＡ６－８による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のｓｇＲＮＡ９－１１による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のｓｇＲＮＡ１２－１４による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のｓｇＲＮＡ１５による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のｓｇＲＮＡ１６－１９による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のｓｇＲＮＡ２０－２２による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のｓｇＲＮＡ２３による前記変異遺伝子のｄｓＤＮＡ切断結果を示す図である。 本願に記載のＡＡＶ-ｓａＣａｓ９-ｐｕｒｏベクターのプラスミドマップを示す図である。 ｓｇＲＮＡ８、ｓｇＲＮＡ１２、ｓｇＲＮＡ１３、ｓｇＲＮＡ１４、ｓｇＲＮＡ１６、ｓｇＲＮＡ１７、ｓｇＲＮＡ１８切断後の断片のＴ７Ｅ１酵素切断実験の結果を示す図である。 ｓｇＲＮＡ１３切断後のゲノムＤＮＡが切断部位を含むＰＣＲ断片の遺伝子配列決定結果を示す図である。 ｓｇＲＮＡ１７切断後のゲノムＤＮＡが切断部位を含むＰＣＲ断片の遺伝子配列決定結果を示す図である。 ｓｇＲＮＡ１８切断後のゲノムＤＮＡが切断部位を含むＰＣＲ断片の遺伝子配列決定結果を示す図である。 ｓｇＲＮＡ１３、ｓｇＲＮＡ１７、ｓｇＲＮＡ１８、ｓｇＲＮＡ１３+１７、ｓｇＲＮＡ１３+１８の２９３Ｔ細胞中の切断効率の柱状図を示す図である。 ドナー配列の設計図を示す図である。

以下では、特定の具体的な実施例を参照して本発明の実施形態を説明するが、本発明の他の利点および効果は、本願明細書で開示される内容から、当業者には容易に理解されると思われる。

用語の定義

本願において、用語「ＣＹＰ４Ｖ２」とは、一般的に、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶメンバー２であるタンパク質を指す。用語「シトクロムＰ４５０」とは、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０またはＣＹＰ４５０と呼ばれてもよく、一般的に、内在性物質または薬物、環境化合物を含む外在性物質の代謝に関与する、モノオキシゲナーゼの一種類である、一類のヘムタンパク質ファミリーを指す。アミノ酸配列の相同性により、そのメンバーはそれぞれ、ファミリー、サブファミリーおよび酵素個体という三つに分類される。シトクロムＰ４５０酵素系はＣＹＰと略記されることができ、ただし、ファミリーはアラビア数字で、サブファミリーはアルファベットの大文字で、酵素個体はアラビア数字で表され、例えば本願におけるＣＹＰ４Ｖ２のように示される。ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子（ＨＧＮＣ：２３１９８；ＮＣＢＩ ＩＤ：２８５４４０）は、通常全長が１９．２８ｋｂであり、４ｑ３５に位置し、１１個のエクソンを有し、脂肪酸代謝に重要な役割を果たす（Ｋｕｍａｒ Ｓ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０１１，７：３６０－３６５）。本願に記載のＣＹＰ４Ｖ２は、その機能的変異体、断片、ホモログ等を含むことができる。ＣＹＰ４Ｖ２は、ほぼすべての組織で発現するが、網膜および網膜色素上皮では高レベルで、角膜組織ではやや低レベルで発現している。ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異は、ビエッティ結晶性ジストロフィーおよび／または網膜色素変性と関連している可能性がある。

本願において、用語「ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ」は、比較的に一般的なＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異であり、イントロン６の３’末端とエクソン７の５’末端の１７対の塩基対の除去に属し、それによってエクソン７の欠失をもたらし、転写タンパク質の構造と活性変化をもたらす。例示的な野生型ＣＹＰ４Ｖ２のイントロン６とエクソン７との間の配列は、ｃａａａｃａｇａａｇｃａｔｇｔｇａｔｔａｔｃａｔｔｃａａａＴＣＡＴＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＣＴｇａａｃｇｇｇｃｃａａｔｇａａａｔｇａａｃｇｃｃａａｔｇａ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９０)で示すことができる。例示的なｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌｌ７ｉｎｓＧＣ変異配列は、以下のように示すことができる。イントロン６配列とエクソン７との間の配列において、１７ｂｐが欠失（野生型では大文字で表される配列）され、ＧＣ（大文字で表される）が挿入された：ｃａａａｃａｇａａｇｃａｔｇｔｇａｔｔａｔｃａｔｔｃａａａＧＣｇａａｃｇｇｇｃｃａａｔｇａａａｔｇａａｃｇｃｃａａｔｇａ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９１)。（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ. ４０９:１８１-６, ２０１１； Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４, Ｍｏｌ. Ｖｉｓ., ２０:１８０６-１４； Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ. １３９:８９４-９, ２００５； Ｊｉａｏ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ (２０１７) ２５, ４６１-４７１．）。本願において、前記「ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１で示されるヌクレオチド配列において欠失している部分、またはＣＧを増加させた位置に存在してもよい。「ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流８００ｂｐ内」は、ｃａａａｃａｇａａｇｃａｔｇｔｇａｔｔａｔｃａｔｔｃａａａＴＣＡＴＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＧＣＴｇａａｃｇｇｇｃｃａａｔｇａａａｔｇａａｃｇｃｃａａｔｇａ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:９０)において、大文字で標記されるヌクレオチド配列のＮ末端と結合された塩基（すなわち「ａ」）から、５’末端方向への約８００ｂｐ以内のヌクレオチド、または、大文字で標記されるヌクレオチド配列のＣ末端と結合された塩基（すなわち「ｇ」）から、３’末端方向への約８００ｂｐ以内のヌクレオチドを含むことができる。

本願において、用語「変異」とは、一般的に、特定のタンパク質または核酸（遺伝子、ＲＮＡ）の野生型タンパク質または核酸のアミノ酸または核酸配列に対する差異を指す。変異されたタンパク質または核酸は、遺伝子の１つの対立遺伝子（ヘテロ接合）または２つの対立遺伝子（ホモ接合）によって発現されてもよく、またはその中で発見されてもよい。変異には、欠失変異、切断、不活性化、破壊、置換変異または転位が含まれる。これらの種類の変異は当該技術分野でよく知られている。本願において、ＣＹＰ４Ｖ２に関連する変異は、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子のミスセンス（ｍｉｓｓｅｎｓｅ）、反復、スプライシング位置、フレームシフト、削除、挿入、挿入または欠失（ｉｎｄｅｌ）、ナンセンス、多型（例えば、一塩基多型）、および早期終了（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）、およびＣＹＰ４Ｖ２遺伝子全体の欠失が含まれているが、これらに限定されない。

本願において、用語「単離された核酸分子」とは、前記核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されるものを指す。このような単離された核酸分子は、その通常または天然環境から除去されまたは分離され、あるいは前記分子はその通常または天然環境に存在しない方法で製造され、通常または天然環境におけるポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、他のポリヌクレオチドその他物質から分離されるものである。本願の単離された核酸分子はＲＮＡをコードすることができ、例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡをコードすることができる。

本願において、用語「ドナー核酸分子」とは、一般的に、レシピエント（例えば、レシピエント核酸分子）に異種核酸配列を提供する核酸分子を指す。

本願において、用語「バックボーン配列」とは、一般的に、ｇＲＮＡにおける、標的配列を認識またはハイブリダイズする部分以外の部分を指し、ｓｇＲＮＡにおけるｇＲＮＡペアリング配列と転写ターミネーターの間の配列を含んでもよい。バックボーン配列は一般的に標的配列の変化によって変化することはなく、ｇＲＮＡが標的配列を認識することにも影響を与えない。そのため、バックボーン配列は従来技術における利用可能な任意の配列である。バックボーン配列の構造について、文献Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６。４４：９５５５－９５６４のＦｉｇｕｒｅ １（図１）におけるＡとＢ、Ｆｉｇｕｒｅ ３（図３）におけるＡ、Ｂ、Ｃ、およびＦｉｇｕｒｅ ４（図４）おけるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに記載のスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）以外の部分を参照してもよい。

本願において、用語「ベクター」とは、一般的に、適切な宿主中で自己複製することができる核酸分子を指し、これは挿入された核酸分子（例えば、外在性配列）を宿主細胞中および／または宿主細胞間に移すことができる。前記ベクターは、主にＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入するためのベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡを複製するためのベクター、および主にＤＮＡまたはＲＮＡの転写および/または翻訳の発現のためのベクターを含むことができる。前記ベクターは、また複数種の上記機能を有するベクターを含む。前記ベクターは、適切な宿主細胞を導入する際にポリペプチドに転写および翻訳できるポリヌクレオチドであってもよい。通常、前記ベクターを含む適切な宿主細胞を培養することにより、前記ベクターは所望の発現産物を生成することができる。本願に記載のベクターは、例えば、発現ベクター、ウイルスベクター（レンチウイルスベクターおよび／またはレトロウイルスベクター）、ファージベクター、ファージミド、粘粒、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）、人工染色体（酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ））、および／またはプラスミドを含むことができる。

本願において、用語「ｇＲＮＡ」とは、一般的に、ＲＮＡ分子であるガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を指す。自然界では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは通常、２つの別々のＲＮＡ分子として存在し、ｇＲＮＡを構成している。用語「ｃｒＲＮＡ」とは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと呼ばれてもよく、一般的に、標的化された標的ＤＮＡに相補的なヌクレオチド配列のストレッチを指し、用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」とは、一般的に、Ｃａｓヌクレアーゼに結合できる足場型のＲＮＡを指す。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃＲＮＡはまた、一本鎖に融合されてもよく、その場合、ｇＲＮＡは一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ｓｇＲＮＡは当業者がＣＲＩＳＰＲ技術で使用するｇＲＮＡの最も一般的な形態となっているため、用語「ｓｇＲＮＡ」と「ｇＲＮＡ」は本願において同じ意味を有する場合がある。ｓｇＲＮＡは人工的に合成されるか、ＤＮＡテンプレートからインビトロでまたはインビボで製造されることが可能である。ｓｇＲＮＡはＣａｓヌクレアーゼに結合することができ、また、標的ＤＮＡを標的化して、Ｃａｓヌクレアーゼに、ｇＲＮＡに相補的なＤＮＡ部位を切断するように指示することができる。

本願において、用語「特異的に標的とする」とは、一般的に両種分子（例えば、分子Ａと分子Ｂ）間の相互作用（例えば、分子Ａが分子Ｂを特異的に識別および／または結合する（例えば、標的））を指す。他の非Ｂ分子との相互作用と比較して、分子Ａは統計学的に有意な程度で分子Ｂと相互作用する。前記相互作用は共有結合であっても非共有結合であってもよい。ポリヌクレオチドに関する場合、特異的に標的とするとは、分子Ａ（またはその１本鎖）と分子Ｂ（またはその１本鎖）が塩基相補的なペアリングの関係を有することを指すことができる。本願において、「特異的に標的とする」とは、ｇＲＮＡが標的配列を識別および／または結合するプロセスを指すことができる。

本願において、用語「標的核酸」、「標的核酸」、「標的配列」及び「標的領域」は交換的に使用されてもよく、通常はｇＲＮＡによって識別されてもよい核酸配列を指し、前記標的核酸は二本鎖核酸を指してもよく、１本鎖核酸を指してもよい。

本願において、用語「３Ｄ－網膜オルガノイド」とは、一般的に、三次元構造を有し、自己再生、自己組織化が可能であり、網膜の基本機能（例えば、光感受性）を示す人工的に培養された網膜を指す。３Ｄ－網膜オルガノイドは、一次組織または幹細胞（例えば、多能性幹細胞）から分化してなることができ、光に反応し、脳へ信号を送るために必要な網膜のすべての細胞を備える。

本願において、用語「ビエッティ結晶性ジストロフィー」とは、一般的に、一群の常染色体潜性遺伝性眼疾患を指す。主な症状として、角膜における結晶（透明な被膜）、網膜の光感受性組織に沈着した微細な黄色または白色の結晶性沈着物、ならびに網膜、脈絡膜毛細血管および脈絡膜の進行性萎縮を含む。ビエッティ結晶性ジストロフィーはＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異に起因する疾患を含むことができる。

本願において、用語「網膜下注射」とは、一般的に、光受容細胞と網膜色素上皮（ＲＰＥ）層との間に、導入される物質を導入することを指す。網膜下注射の間、物質（例えば、本願に記載のｇＲＮＡ、本願に記載の一種または複数種の単離された核酸分子、本願に記載のドナー核酸分子、本願に記載のベクター、および薬学的に許容される担体）は光受容細胞と網膜色素上皮（ＲＰＥ）層との間に導入され、その間に空間が形成される。

本願において、用語「細胞」は、当該技術分野において一般的に認められた意味を有する。当該用語は、その通常の生物学的意味で用いられており、完全な多細胞生物、例えば具体的にはヒトを指すものではない。細胞は、鳥類、植物および哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌおよびネコなどの生物体に存在することができる。細胞は、前核（例えば、細菌細胞）であってもよく、真核（例えば、哺乳動物または植物細胞）であってもよい。細胞は、体細胞起源または生殖細胞起源、全能性または多能性、分裂または非分裂でありうる。細胞は、配偶子もしくは胚、幹細胞、または完全に分化した細胞に由来するものであってもよく、それらを含んでもよい。

本願において、用語「人工多能性幹細胞」とは、一般的に、体細胞が一定の条件下で全能性状態に戻った細胞を指す。前記全能性とは、それが持つ、生体のあらゆる種類の細胞に分化し、完全な胚を形成したり、さらに新しい個体に成長したりする能力を指す。例えば、本願において、前記人工多能性幹細胞は、腎上皮細胞を培養することにより得られる、網膜細胞に分化する能力を有するものを含む。

本願において、用語「ＨＥＫ２９３細胞」とは、一般的に、「ヒト胚性腎細胞２９３」を指し、ヒト胚性腎細胞に由来する細胞であり、培養が容易であり、トランスフェクション効率が高いという特徴を持ち、外在性遺伝子の研究にあたり、当該技術分野で一般的に用いられている細胞株である。本願において、用語「２９３Ｔ細胞」または「ＨＥＫ２９３Ｔ細胞」は、「ＨＥＫ２９３細胞」に由来する細胞であり、当技術分野で一般的に使用される細胞株である。

本願において、用語「腎上皮細胞」とは、一般的に、ヒト尿から採取される腎臓の上皮細胞を指す。本願において、それは人工多能性幹細胞の供給源となってもよい。当該技術分野では、尿における腎上皮細胞を用いて多能性幹細胞を誘導することは、費用対効果が高く、汎用性があり、様々な年齢、性別および人種に対応することができる。この技術では、他の既存の方法より、患者の検体を大量に取得することはかなり容易かつ経済的になる。

本願において、用語「医薬組成物」とは、一般的に、必要とする被験者への投与に適した組成物を指す。例えば、本願に記載の医薬組成物は、本願に記載のｇＲＮＡ、本願に記載の一種または複数種の単離された核酸分子、本願に記載のドナー核酸分子および／または本願に記載のベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含有してもよい。用語「被験者」または「個体」または「動物」または「患者」は、本願において、本願の医薬組成物の投与を需要とする被験者、例えば哺乳動物被験者を指すために互換的に使用される。動物被験者には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、黄牛、乳牛等、例えばマウスが含まる。一実施形態において、医薬組成物は、網膜下、非経口、経皮、腔内、動脉内、膜内および／または鼻腔内投薬あるいは組織に直接注射するための組成物を含む。例えば、前記医薬組成物は網膜下注射によって被験者に投薬される。

本願に記載の特定のタンパク質とヌクレオチドに加えて、本願では変異体、誘導体、類似体、ホモログおよびその断片の使用を含むことができる。

本願の文脈において、任意の所与の配列の変異体とは、前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが少なくとも一つの内在性機能を基本的に保持するように、残基の特定の配列（アミノ酸残基またはヌクレオチド残基のいずれか）が修飾されている配列を指す。変異体配列は、天然に存在するタンパク質および／またはポリヌクレオチドに存在する少なくとも一つのアミノ酸残基および／またはヌクレオチド残基の付加、欠失、置換、修飾、代替および／または変異によって得ることができる。

本願において、用語「誘導体」とは、一般的に、本願のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、得られるポリペプチドまたはポリヌクレオチドはその少なくとも一つの内在性機能を基本的に保持する限り、配列からの／への一つ（または複数）のアミノ酸残基のいかなる置換、変異、修飾、代替、欠失および／または付加を含むものを指す。

本願において、用語「類似体」とは、一般的に、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいかなる模倣体、すなわち、当該模倣体が模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも一種内在性機能を有する化学化合物を含むものを指す。

通常、修飾された配列は所望の活性または能力を基本的に保持する限り、例えば少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または２０個以上）のアミノ酸置換を行うことができる。アミノ酸置換は、非天然に存在する類似体を使用することができる。

本願で使用されるタンパク質またはポリペプチドはまた、前記アミノ酸残基に非表現の変化を生じ、機能的に等同のタンパク質をもたらすアミノ酸残基の欠失、插入または置換を有してもよい。内在性機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負の電荷を帯びたアミノ酸としてはアスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられ、正の電荷を帯びたアミノ酸としてはリジンとアルギニンが挙げられ、また、電気的に極性のある頭部基を持たない親水性の値が類似したアミノ酸としてはアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンとチロシンが挙げられる。

本願において、用語「ホモログ」とは、一般的に、野生型アミノ酸配列と野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。用語「相同性」は「同一性」と等同に理解してもよい。相同配列は、主題配列（ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と少なくとも７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９９.１%、９９.２%、９９.３%、９９.４%、９９.５%、９９.６%、９９.７%、９９.８%または９９.９%が相同なアミノ酸配列を含むことができる。通常、ホモログは主題アミノ酸配列(ｓｕｂｊｅｃｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ)と相同な活性部位等を含有する。相同性は、類似性（すなわち、類似する化学性質／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮してもよく、配列の同一性の観点から相同性を表現してもよい。本願において、言及されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいずれか一項においてパーセント同一性を有する配列とは、言及されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯの全長にわたり、前記パーセント同一性を有する配列を指す。

配列同一性を決定するために、配列アラインメントを行うことができる。これは当業者に公知の様々な方法で行われ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等を使用することができる。当業者は、比較される全長配列にわたって最適なアラインメントを実現するために必要ないかなるアルゴリズムを含む、アライメントのための適切なパラメータを決定することができる。

本願において、用語「および／または」、選択肢のいずれか一方、又は選択肢の両方を意味すると理解されるべきである。

本願において、用語「含有する」とは、一般的に、明示的に指定された特徴を含むが、他の要素を除外することを意図していないことを指す。

本願において、用語「約」とは、一般的に、指定される数値以上または以下０．５％－１０％の範囲内で変化すること、例えば、指定される数値以上または以下０.５%、１%、１.５%、２%、２.５%、３%、３.５%、４%、４.５%、５%、５.５%、６%、６.５%、７%、７.５%、８%、８.５%、９%、９.５%、または１０％の範囲内で変化することを指す。

発明の詳細な説明

ｇＲＮＡ

一方、本願は、シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶポリペプチド２の遺伝子（ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子）を特異的に標的とするｇＲＮＡを提供するものであって、前記ｇＲＮＡはＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異部位を特異的に標的とする。

特定の実施態様において、ＣＹＰ４Ｖ２の一個または複数個イントロンおよびエクソンには、異なる数（例えば、１対、２対、３対、４対、１０対、２０対、５０対、１００対）の塩基対の除去または増加、ヌクレオチドの変異または代替が生じられ、それによってＣＹＰ４Ｖ２タンパク質構造の変化と機能の損失をもたらす。例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異部位は、表１に示す変異部位を含むことができる。

特定の実施態様において、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異部位はｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣを含む。本願において、用語「ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ」は、比較的に一般的なＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異であり、イントロン６の３’末端とエクソン７の５’末端の１７対の塩基対の除去に属し、それによってエクソン７の欠失をもたらし、転写タンパク質の構造と活性変化をもたらす。特定の実施態様において、前記ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣはまた、ｃ.９９２Ａ>Ｃ（ｐ.Ｈ３３１Ｐ）、ｃ.１０９１-２Ａ>Ｇ（Ｅｘｏｎ ９ｄｅｌ）などの他の種類の変異と合併することができる。

特定の実施態様において、前記ｇＲＮＡはｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流１００ｂｐ、１２０ｂｐ、１４０ｂｐ、１６０ｂｐ、１８０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐまたは５００ｂｐのヌクレオチド配列に特異的に結合することができる。特定の実施態様において、前記ｇＲＮＡは、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流２００ｂｐのヌクレオチド配列に特異的に結合することができる。特定の実施態様において、前記ｇＲＮＡは、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流２００ｂｐのヌクレオチド配列と少なくとも７０%（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列に特異的に結合することができる。

特定の実施態様において、前記ｇＲＮＡは、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流１００ｂｐ、１００ｂｐ、１２０ｂｐ、１４０ｂｐ、１６０ｂｐ、１８０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列に特異的に結合することができる。特定の実施態様において、前記ｇＲＮＡは、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流２００ｂｐ配列に相補的なヌクレオチド配列に特異的に結合することができる。特定の実施態様において、前記ｇＲＮＡは、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流２００ｂｐ配列に相補的なアミノ酸配列と少なくとも７０%（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列に特異的に結合することができる。

本願に記載のｇＲＮＡは、目標の標的核酸（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異部位）中の配列に結合することができる。ｇＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基ペアリング）により、配列特異的に標的核酸と相互作用することができる。ｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、目標の標的核酸の配列に応じて変化することができる。

本願において、前記ｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８４のいずれかのヌクレオチド配列を含むことができる。本願において、前記ｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８４のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。

本願において、前記ｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８４のいずれかのヌクレオチド配列を含むことができる。本願において、前記ｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８４のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。

本願において、前記ｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８４のいずれかのヌクレオチド配列を含むことができる。本願において、前記ｇＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:８４のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。

本願において、前記ｇＲＮＡは、５’端から３’端まで、（Ｘ）ｎ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７８－８０、８２-８４のいずれかのヌクレオチド配列とバックボーン配列を含有することができ、ただし、ＸはＡ、Ｕ、ＣおよびＧから選択されるいずれかの塩基であり、かつｎは０－１５のいずれの整数である。本願において、前記ｇＲＮＡは、５’－（Ｘ）ｎ－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７８-８０、８２-８４のいずれかのヌクレオチド配列－バックボーン配列－３’ を含有することができ、ただし、ＸはＡ、Ｕ、ＣおよびＧから選択されるいずれかの塩基であり、かつｎは０－１５のいずれの整数である。例えば、本願に記載のバックボーン配列は、ＡＡＶ-ｓａＣａｓ９-ｐｕｒｏに由来するバックボーン配列を含むことができる。

特定の実施態様において、前記ｇＲＮＡは一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。

また、本願はｓｇＲＮＡ組み合わせを提供し、前記ｓｇＲＮＡ組み合わせは本願に記載のｓｇＲＮＡを含むことができる。例えば、前記ｓｇＲＮＡは、２つまたは２つ以上の本願に示されたｓｇＲＮＡを含むことができる。例えば、前記ｓｇＲＮＡの組み合わせは、ｓｇＲＮＡ１３とｓｇＲＮＡ１７とを含むことができ、また例えば、前記ｓｇＲＮＡの組み合わせは、ｓｇＲＮＡ１３とｓｇＲＮＡ１８とを含むことができ、また例えば、前記ｓｇＲＮＡの組み合わせは、ｓｇＲＮＡ１７とｓｇＲＮＡ１８とを含むことができ、また例えば、前記ｓｇＲＮＡの組み合わせは、ｓｇＲＮＡ１３、ｓｇＲＮＡ１７、およびｓｇＲＮＡ１８を含むことができる。

本願は、一種または複数種の単離された核酸分子を提供するものであって、前記単離された核酸分子は上述したＣＹＰ４Ｖ２変異遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡをコードすることができる。例えば、前記単離された核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１８のいずれかのヌクレオチド配列を含有することができる。

本願において、前記ｇＲＮＡ配列は、Ｃａｓヌクレアーゼによって認識可能なＰＡＭ配列の近傍で標的核酸にハイブリダイズするように設計することができる。前記ｇＲＮＡは、標的配列と完全に相補的であっても、不完全に相補的であってもよい。ｇＲＮＡとそれに対応する標的配列との相補性の程度は、少なくとも５０％（例えば、少なくとも約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれ以上）である。前記「Ｃａｓヌクレアーゼ」とは、一般的に、ＣＲＩＳＰＲ配列（例えば、ｇＲＮＡ）をガイドとして、特定のＤＮＡ鎖を認識・切断する能力を有するものを指す。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２が挙げられる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは通常ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインを含み、それぞれは二本鎖ＤＮＡ分子の二つの異なる鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはこれまで、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｊｉｎｅｋ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１１）などの異なるバクテリア種で確認されてきた。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２に；ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ａ１ＩＱ６８に；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｑ０３ＬＦ７に；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９タンパク質（例えば、本願に記載のベクターにおけるＳａＣａｓ）のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔデータベースアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５に示されている。Ｃａｓヌクレアーゼは通常、ＤＮＡから特定のＰＡＭ配列を認識することができる。前記「ＰＡＭ」とは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）を指し、それはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって切断部位として識別され、ＰＡＭはヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆｌなど）によって変化する。プロトスペーサー要素配列は通常、ＰＡＭ部位の上流に直接位置している。例えば、前記ＰＡＭはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４－３８のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含有することができる。

本願に記載のｇＲＮＡおよび／または単離された核酸分子はベクターを使って運搬することができる。本願において、前記ベクター（例えばｐＸ６０１）はＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸を含有してもよいし、それを含有しなくてもよい。本願において、Ｃａｓヌクレアーゼは一種または複数種のポリペプチドとして別々に運搬されることができる。または、前記Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸分子は、一種または複数種のガイドＲＮＡ、または一種または複数種のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと、別々に運搬してもよいし、またはそれらを複合体にしておいてから運搬してもよい。例えば、前記本願の核酸分子（例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡをコードする単離された核酸分子）とＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸分子は、同一ベクター（例えば、プラスミド）に存在することができる。前記ベクターは当該技術分野では公知のウイルス性または非ウイルスベクターを含むことができる。

非ウイルス性運搬ベクターとしては、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正の電荷を帯びたペプチド、低分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラとＲＮＡ融合タンパク質複合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本願において、前記単離された核酸分子および／または前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子はプラスミドを通じて運搬されることができる。

特定の実施態様において、前記ベクターはウイルスベクターであってもよく、例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよび肝炎ウイルスが挙げられる。ベクターゲノムの一部として核酸分子（例えば、本願に記載の単離された核酸分子）を含有するウイルスベクターを製造する方法は当該技術分野では公知のものであり、当業者には過度の実験なくとも実行することができる。他の実施態様において、前記ベクターは、本願に記載の核酸分子をパッケージした組換えＡＡＶウイルス粒子であってもよい。前記組換えＡＡＶを製造する方法として、本願に記載の核酸分子をパッケージング細胞株に導入し、ＡＡＶを発現するｒｅｐとｃａｐ遺伝子のパッケージングプラスミドを細胞株に導入し、およびパッケージング細胞株上清から組換えＡＡＶを収集することを含むことができる。パッケージング細胞株は様々な種類の細胞であってもよい。例えば、使用可能なパッケージング細胞株として、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

特定の実施態様において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であってもよい。本願において、用語「アデノ随伴ウイルス」とは、一般的に、天然に存在し、かつ有用なアデノウイルス及び人工ＡＡＶに由来するベクターを指す。前記ＡＡＶは、異なる血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３、および任意のＡＡＶ変異体または混合物を含むことができる。ＡＡＶゲノムの両端には、一般的に末端逆位反復配列（ＩＴＲ）があり、用語「ＩＴＲ」または「末端逆位反復」とは、ＡＡＶおよび／または組換えＡＡＶ中に存在する核酸配列セグメントを指し、それはＡＡＶの溶解および潜伏ライフサイクルを完了するのに必要なＴ字形回文構造を形成することができる。ＡＡＶベクターを製造する技術は、当技術分野の標準技術であり、運搬されるポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびウイルス機能を補助するパッケージングされるＡＡＶゲノムを細胞に提供することを含む。ＡＡＶベクターの生産は、通常、単一細胞（ここではパッケージング細胞と呼ぶ）内に以下の成分が存在する必要がある：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから単離された（例えば、そこには存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、および補助ウイルス。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、本文に記載のＡＡＶ血清型を含むが、これらに限定されず、任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、またＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。

ドナー核酸分子とベクター

他方、本願はドナー核酸分子を提供するものである。本願において、用語「ドナー核酸分子」とは、一般的に、レシピエント（例えば、レシピエント核酸分子）に異種核酸配列を提供する核酸分子を指す。特定の実施態様において、前記ドナー核酸分子はレシピエント細胞に導入されることで、前記単離された核酸分子によって切断されたＤＮＡ断片（例えば、断片化した二本鎖ＤＮＡ）を修復することができる。他の特定の実施態様において、断片化したＤＮＡはドナー核酸分子を通じて修復されることができる。修復の方法として、ＤＮＡ相同性に依存する相同組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＨＲ）による修復と非相同末端結合（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）による修復方法があるが、これらに限定されるものではない。

特定の実施態様において、ＨＤＲを用いて外在性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入することができる。外在性ポリヌクレオチド配列は、ドナーポリヌクレオチド（またはドナー、またはドナー配列、またはポリヌクレオチドドナーテンプレート）と呼ばれる。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピーまたはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を標的核酸切断部位に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、標的核酸切断部位に天然に存在する配列ではなく、外在性ポリヌクレオチド配列であってもよい。ＨＤＲは、相同配列またはドナー配列（例えば、前記ドナー核酸分子）をテンプレートとして用いて、特定のＤＮＡ配列を切断部位に挿入する方法である。相同配列は、例えば姉妹染色分体（ｓｉｓｔｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｉｄ）のような内在性ゲノムに存在してもよい。または、前記ドナーは、例えばプラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルスのような外在性核酸であってもよい。それらの外在性核酸は、与ＤＮＡヌクレアーゼによって切断される遺伝子座と相同性の高い領域を含有することができ、さらに追加の配列または配列変化（切断された標的遺伝子座に組み込むことができる欠失を含む）を含有することができる。例えば、本願では、ホモログアームを用いて、このホモログアームに結合された外在性遺伝子断片（例えば、本願に記載のドナー核酸分子）を標的部位（例えば、本願に記載のｇＲＮＡが標的とする部位）に挿入することができる。本願に記載の「ホモログアーム」とは、一般的に、ＤＮＡ切断所のヌクレオチド配列と相同性を有するヌクレオチド配列を指す。

外在性ドナーテンプレートを利用して、相同フランキング領域の間に追加の核酸配列（例えば、前記標的化ベクター）または修飾（例えば単一または複数の塩基改変または欠失）を導入することで、追加のまたは改変された核酸配列を目標遺伝子座に組み込むことができる。外在性ドナーはプラスミドベクター、例えば、ＡＡＶベクターおよび／またはＴＡクローニングベクター（例えば、ＺＴ４ベクター）によって運搬されることができる。

本願に記載のドナー核酸分子に関して、ドナー核酸分子は野生型のヒトＣＹＰ４Ｖ２のヌクレオチド配列、遺伝子断片、グであってもよい。例えば、前記ドナー核酸分子はｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流５００ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、５０００ｂｐ以内のヌクレオチド配列を含有することができる。特定の実施態様において、前記ドナー核酸分子は、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流８００ｂｐを含有することができる。特定の実施態様において、前記ドナー核酸は、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流８００ｂｐと少なくとも５０%（例えば、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含有することができる。本願に記載のＣＹＰ４Ｖ２ヌクレオチド配列を含有することができる「核酸分子」と本願に記載のＣＹＰ４Ｖ２を特異的に標的とするｇＲＮＡまたは「単離された核酸分子」とは別のものである。

例えば、本願において、前記ドナー核酸分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４－６６のいずれかのヌクレオチド配列を含有することができる。また例えば、前記ドナー核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４－６６のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも５０%（例えば、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％）配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。

他方、本願は、前記単離された核酸分子（例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡをコードする単離された核酸分子）および／または前記ドナー核酸分子（例えば、前記ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子をコードするヌクレオチド分子）を含有するベクターを提供するものである。

特定の実施態様において、前記単離された核酸分子と前記ドナー核酸分子は異なるベクター上に存在してもよい。他の特定の実施態様において、前記単離された核酸分子と前記ドナー核酸分子は同一ベクター上に存在することができる。本願において、前記単離された核酸分子を含有するベクターと前記ドナー核酸分子を含有するベクターが同時に細胞に導入されると、Ｃａｓヌクレアーゼはドナー核酸分子と細胞ゲノムＤＮＡを切断し、ドナー核酸分子を細胞ゲノムの正確な位置（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子断片）に挿入する。

本願において、前記ベクターは一個または複数個の前記ｓｇＲＮＡを含むことができる。例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または７個以上の本願に記載のｓｇＲＮＡを含むことができる。特定の実施態様において、複数個のｓｇＲＮＡを使用する場合、前記複数個のｓｇＲＮＡは１つまたは複数のベクター中に存在してもよく、同時にまたは前後に投与されてもよい。例えば、前記ｓｇＲＮＡはそれぞれ異なるベクターに存在して投与されてもよく、同一ベクターに存在して投与されてもよい。例えば、前記ｓｇＲＮＡは同一ＡＡＶベクターに存在して投与されてもよい。例えば、前記ｓｇＲＮＡは異なるベクターに位置して同時に投与されてもよい。例えば、前記ｓｇＲＮＡは同一ベクターに位置して、前後に投与されてもよい。

一実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。例えば、ＡＡＶ、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスと肝炎ウイルスが挙げられる。ベクターゲノムの一部として核酸分子（例えば、本願に記載の単離された核酸分子）を含有するウイルスベクターを製造する方法は、当該技術分野では公知のものであり、当業者には過度の実験なくとも実行することができる。

細胞、医薬組成物、用途および方法

本願は、細胞を提供するものであって、前記細胞は前記単離された核酸分子および／または前記ドナー核酸分子を含有することができる。本願に記載の細胞はｓｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼを発現することができ、優れたＤＮＡ切断効果を有する。本願に記載の細胞は、正常な機能を有するＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を発現することができる。前記細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒトに由来する細胞を含むことができる。例えば、前記細胞はＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－１細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ０細胞または骨髄腫細胞、幹細胞（例えば、多能性幹細胞および／または全能性幹細胞）、および／または上皮細胞（例えば、腎上皮細胞および／または網膜上皮細胞）を含むことができる。本願において、前記細胞は、ＨＥＫ２９３細胞および／または尿中腎上皮細胞を含むことができる。本願において、前記細胞は修飾により分化能を有することができる。前記分化能は、生体のあらゆる種類の細胞（神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、網膜上皮細胞、表皮、毛髪とケラチノサイト、肝細胞、β細胞、腸上皮細胞、肺泡細胞、造血細胞、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、腎細胞、脂肪細胞、軟骨細胞および／または骨細胞）に分化する能力を含むことができる。例えば、前記細胞は、重要な初期化遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８）が過剰発現した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に初期化することができる。

本願に記載の細胞は、遺伝子編集療法に必要な物質（例えば、ｓｇＲＮＡとドナー核酸分子）の有効性および安全性を評価するために使用することができる。また、本願は正確なヒトＣＹＰ４Ｖ２ ｃＤＮＡを含有する３Ｄ－網膜オルガノイドを含むことができる組織モデルを提供する。前記細胞と前記組織モデルは、遺伝子編集療法に必要な物質（例えば、ｓｇＲＮＡとドナー核酸分子）の有効性および安全性を評価するために使用することができる。例えば、前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、前記ドナー核酸分子および／またはベクターを前記細胞および／または前記組織モデルに導入した後、例えば、ＰＣＲ配列決定又はゲル電気泳動を用いて、ｇＲＮＡ、正確なＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の発現を検査することができ、あるいは、該当細胞および／または組織モデルは免疫拒絶反応、毒性を産生せず、および／または、導入された物質は前記細胞および／または前記組織モデルの他の機能に影響を与えない。例えば、遺伝子編集の有効性を評価する指標として修復効率検査を使用することができ、例示的な方法は実施例４に示されている。例えば、遺伝子編集の安全性を評価する指標として脱標的効率を検査することができ、例えば、全ゲノム配列決定法を用いて脱標的効率を検査することができる。

本願は、疾患の治療のための医薬の製造における、前記ｇＲＮＡ、前記一種または複数種の単離された核酸分子、前記ドナー核酸分子、および／または前記ベクターの使用を提供するものであって、前記疾患はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子変異による疾患を含む。例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子におけるｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異による疾患である。例えば、前記疾患は網膜色素変性を含むことができる。例えば、前記疾患は結晶性網膜色素変性症を含むことができる。

本願は、医薬組成物を提供するものであって、前記医薬組成物は前記ｇＲＮＡ、前記一種または複数種の単離された核酸分子、前記ドナー核酸分子、前記ベクター、および薬学的に許容される担体を含有する。前記担体は非毒性であり、有効成分の効果を妨げてはならない。

本願に記載の医薬組成物は、様々な方法によって導入することができ、例えば、硝子体内注射（例えば、前方、内側または後方の硝子体内注射）、結膜下注射、前房内注射、側頭縁部を介する前眼房への注射、基質内注射、脈絡膜下空間への注射、角膜内注射、網膜下注射と眼内注射により、眼に局所投予することが挙げられるが、それらに限定するものではない。前記導入は、網膜下腔すなわち感覚神経網膜の下への注射である網膜下注射を含むことができる。網膜下注射の間、注射される（例えば、前記標的化ベクター、前記ｇＲＮＡ、および／または前記プラスミド）を光受容細胞と網膜色素上皮（ＲＰＥ）層の間に直接導入し、その間に空間を形成する。

本願は、必要とする被験者に前記ｇＲＮＡ（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡ）、前記一種または複数種の単離された核酸分子（前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡをコードする単離された核酸分子）、前記ドナー核酸分子（前記ヒトＣＹＰ４Ｖ２遺伝子をコードするヌクレオチド分子）、および／または前記ベクター、を導入する工程を含むビエッティ結晶性ジストロフィーを治療する方法を提供するものである。そのうち、前記導入により、被験者は正常な機能を有するＣＹＰ４Ｖ２タンパク質を獲得する。

本願に記載の方法は、エクスビボ法（ｅｘ ｖｉｖｏ）を含むことができる。特定の実施態様において、被験者特異的な人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を獲得することができる。次に、本願に記載の方法を使って、これらのｉＰＳＣ細胞のゲノムＤＮＡを編集することができる。例えば、当該方法は、ｉＰＳＣのＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異部位内またはその近傍を、変異を有するＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードしないように編集することを含むことができる。次に、遺伝子編集されたｉＰＳＣを、例えば光受容細胞または網膜祖細胞などの他の細胞に分化することができる。最後に、分化された細胞（例えば光受容細胞または網膜祖細胞）を被験者体内に移植することができる。

特定の実施態様において、被験者特異的な人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を獲得することができる。さらに、人工多能性幹細胞をあらゆる種類の細胞、例えば光受容細胞または網膜祖細胞に分化させることができる。本願においては、３Ｄ網膜オルガノイドであってもよい。次に、本願に記載の方法を使って、これらの３Ｄ網膜オルガノイド細胞のゲノムＤＮＡを編集することができる。例えば、当該方法は、３Ｄ網膜オルガノイド細胞のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異部位内またはその近傍を、変異を有するＣＹＰ４Ｖ２タンパク質をコードしないように編集することを含むことができる。最後に、３Ｄ網膜オルガノイド細胞を被験者体内に移植することができる。

他の特定の実施態様において、被験者から光受容細胞または網膜祖細胞を分離することができる。次に、本願に記載の方法を使って、これらの光受容細胞または網膜祖細胞のゲノムＤＮＡを編集することができる。例えば、当該方法は、光受容細胞または網膜祖細胞のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の変異部位内またはその近傍を、変異を有するＣＹＰ４Ｖ２をコードしないように編集することを含むことができる。最後に、遺伝子編集された光受容細胞または網膜祖細胞を被験者体内に移植することができる。

前記方法、投薬する前に、治療薬に対する全面的な分析をすることを含むことができる。例えば、校正細胞に対して全ゲノム配列決定を行い、被験者への最小限のリスクと関連するゲノム位置にオフターゲット効果（もしあれば）がないことを保証することができる。さらに、移植する前に、クローン細胞集団を含む特定の細胞の集団を分離することができる。

本願に記載の方法は、部位特異的ヌクレアーゼを使って、ゲノムにおいて正確な標的位置でＤＮＡを切断することで、ゲノムにおける特定の位置に一本鎖または二本鎖ＤＮＡの切断を生成する方法を含むことができる。このような切断は、内在性細胞プロセス、例えば相同組換え、非相同末端結合によって周期的に修復することができる。

本願に記載の方法は、目標遺伝子座において標的配列の近傍の位置に一つまたは二つのＤＮＡの切断を生成することを含むことができ、二つのＤＮＡの切断は二本鎖切断または二つの一本鎖切断であってもよい。前記切断は、部位特異的（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ポリペプチドによって実現することができる。部位特異的ポリペプチド（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ）は、核酸（例えばゲノムＤＮＡ）に二本鎖切断または一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内在性ＤＮＡ修復経路、例えば、ＨＲ、ＮＨＥＪを刺激することができる。

外在性ドナーテンプレートを利用して、相同フランキング領域の間に追加の核酸配列（例えば、前記標的化ベクター）または修飾（例えば単一または複数の塩基改変または欠失）を導入することで、追加のまたは改変された核酸配列を目標遺伝子座に組み込むことができる。外在性ドナーはプラスミドベクター、例えば、ＡＡＶベクターおよび／またはＴＡクローニングベクター（例えば、ＺＴ４ベクター）によって運搬されることができる。

本願は、細胞に、前記ｇＲＮＡ、前記一種または複数種の単離された核酸分子、および／または前記ベクターを導入することを含む、細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の発現を調節する方法を提供するものである。

本願において、前記方法は、前記ｇＲＮＡを前記細胞に導入することであってもよい。例えば、前記ｇＲＮＡは、レシピエント細胞のゲノムのＣＹＰ４Ｖ２遺伝子断片を標的化し、ヌクレアーゼによってそれを切断することで、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子がタンパク質に翻訳される機会が少なくなり、翻訳されたタンパク質は正常な機能を発揮できなくなるという効果をもたらす。

本願において、前記方法は、前記一種または複数種の単離された核酸分子前記細胞に導入することであってもよい。例えば、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を特異的に標的とするｓｇＲＮＡをコードする単離された核酸分子は、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子断片を破坏させることで、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子がタンパク質に翻訳される機会が少なくなり、翻訳されたタンパク質は正常な機能を発揮できなくなるという効果をもたらす。

本願において、前記方法は、前記ベクターを前記細胞に導入することであってもよい。前記ベクターは、前記単離された核酸分子および／または前記ドナー核酸分子を含有する。特定の実施態様において、前記ベクターは、前記単離された核酸分子と前記ドナー核酸分子を含有することで、前記細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子は前記ドナー核酸分子に代替されて、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子がタンパク質に翻訳される機会の変化（例えば、ＣＹＰ４Ｖ２タンパク質の発現がない状態から正常な発現の量へ変化する）、翻訳されたタンパク質の機能が異常から正常になる効果をもたらす。特定の実施態様において、前記ベクターは前記単離された核酸分子を含有することで、前記ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子断片が破坏されて、ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子がタンパク質に翻訳される機会が少なくなり、翻訳されたタンパク質は正常な機能を発揮できなくなるという効果をもたらす。他の特定の実施態様において、前記ベクターは前記ドナー核酸分子を含有することで、前記細胞内により多くのＣＹＰ４Ｖ２遺伝子断片を含有し、より多くのＣＹＰ４Ｖ２タンパク質に転写および翻訳することができる。

特定の理論に縛られることを望むものではないが、以下の実施例は、本願発明の核酸分子、タンパク質、製造方法、用途等を説明することのみを意図しており、本願発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１ ｓｇＲＮＡの合成
１、ｓｇＲＮＡの標的部位
ＣＹＰ４Ｖ２変異遺伝子の変異部位ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣに対して、ｓｇＲＮＡを設計する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて、１本染色体中のＣＹＰ４Ｖ２変異遺伝子を変異細胞からノックアウトし、２本染色体中の変異が同じであれば、２本染色体中の変異を同時にノックアウトすることができる。

２、ｓｇＲＮＡの設計
ＣＹＰ４Ｖ２の変異部位領域に、ＰＡＭ配列がＮＮＧＲＲＴおよびＮＮＧＲＲ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌、ＳＡ；ＳａＣａｓ９）であり、長さが２１ｂｐであるｓｇＲＮＡ配列を設計した。設計された２３本ｓｇＲＮＡ配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７～８９に記載される。前記ｓｇＲＮＡをコードする核酸配列を表２に示す。

３、ｓｇＲＮＡインビトロ編集有効性検査
（１）ｓｇＲＮＡのインビトロ転写：

１） ｓｇＲＮＡのインビトロ転写のプライマー設計を表３に示す。

２） ｓｇＲＮＡのインビトロ転写テンプレートの構築
ＰＣＲ反応系は、以下のとおりである。

ＰＣＲ反応プログラムは、以下のとおりである。

３）２.０%ＤＮＡゲル電気泳動を用い、ＯＭＥＧＡゲル回収キットを用いて、ｇＲＮＡインビトロ転写テンプレートゲルを回収する工程は以下のとおりである：

ａ）ＰＣＲ反応産物に等体積の膜結合液を加え、ゲルカットからの回収は１ｍｇあたり１μＬの膜結合液を加える必要があり、すべてのゲルが完全に溶解するまで５０－６０℃で７ｍｉｎ加熱し、ボルテックスにより混合し、カラムで回収した。
ｂ）上記の液体を回収用カラムに入れ、１００００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、ろ液を除去した。
ｃ）７００μＬの洗浄バッファーを加え、>１３０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、ろ液を除去した。
ｄ）工程ｃ）を繰り返した。

ｅ）空管を用いて>１３０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。
ｆ）遠心カラムを新しい１．５ｍＬのＥＰチューブに移し、マークし、２０－３０μＬの溶出バッファーまたはｄｄＨ２Ｏを加え、室温で２ｍｉｎ静置した。
ｇ）>１３０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、吸着カラムを除去し、ＤＮＡを２－８℃で保存し、濃度を測定・記録し、－２０℃で長期保存した。

４）ｓｇＲＮＡのインビトロ転写（２０μＬ系）：

注：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ混合物を最後に入れ、混合した後、３７℃の恒温インキュベータに置き、反応させた。反応終了後、２μＬ ＤＮＡ酵素Ｉを加え、３７℃で３０ｍｉｎ反応した後、電気泳動した。

５）ＯＭＥＧＡゲル回収キット説明書に従って、ｇＲＮＡを回収し、工程は上記と同じである。

（２）ＣＹＰ４Ｖ２ ｓｇＲＮＡの切断テンプレートの製造
ＣＹＰ４Ｖ２ ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣホモ接合された患者由来のｉＰＳＣｓのＤＮＡを抽出し、これをテンプレートとして、ＣＹＰ４Ｖ２ ｓｇＲＮＡ切断テンプレートｄｓＤＮＡを製造した。

１）ゲノムＤＮＡの抽出：
ａ）４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し細胞を収集し、上清を除去した。２２０μＬのＰＢＳ（リン酸バッファー）、１０ｍＬのＲＮａｓｅ溶液と２０μＬのＰＫワーキング溶液をサンプルに加え、細胞を再懸濁させた。室温で１５ｍｉｎ以上静置した。

ｂ）２５０μＬのＧＢバッファーを細胞再懸濁液に加え、ボルテックスにより混合し、６５℃で１５－３０ｍｉｎ水浴し、カラムで精製した。
ｃ）２５０μＬの無水エタノールを消化液に加え、ボルテックスにより１５－２０ｓ混合した。

ｄ）ｇＤＮＡ吸着カラムを２ｍＬ収集試験管にセットした。前工程で得られた混合液（沈殿物を含む）を吸着カラムに移した。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。カラムの閉塞現象が生じた場合は、再び１４０００×ｇで３－５ｍｉｎ遠心分離する。混合液が７５０μＬを超える場合は、数回でカラムに供した。

ｅ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。５００μＬの洗浄バッファーＡを吸着カラムに加えた。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。
ｆ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。６５０μＬの洗浄バッファーＢを吸着カラムに加えた。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。
ｇ）工程４を繰り返した。
ｈ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。１２０００×ｇ空管で２ｍｉｎ遠心分離した。

ｉ）吸着カラムを新しい１．５ｍＬ遠心チューブにセットした。３０－１００μＬの７０℃に予熱した溶出バッファーを吸着カラムの膜中央に加え、室温で３ｍｉｎ静置した。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。
注：ＤＮＡ含量が多い組織は、３０－１００μＬの溶出バッファーをさらに加えて溶出を繰り返すことができる。
吸着カラムを除去し、ＤＮＡを２－８℃で保存し、濃度を測定・記録し、－２０℃で長期保存した。

２）ＰＣＲプロセスで使用されたプライマーを表４に示す：

３）ＰＣＲ反応系は、以下のとおりである。

ＰＣＲ反応プログラムは、以下のとおりである。

４）１.５%ＤＮＡゲル電気泳動を用い、ＯＭＥＧＡゲル回収キットを用いて、ＰＣＲ産物を回収し、工程は上記と同じである。

（３）ＳａＣａｓ９-ＳｇＲＮＡインビトロ酵素切断反応：
反応系は、以下のとおりである。

十分に混合し、３７℃で３０ｍｉｎ反応し、３μＬのＤＮＡローディングバッファーを加えて混合した後、６５℃で５ｍｉｎ煮て、２%アガロースゲル分析によって酵素切断結果を分析した。

理論切断断片の長さを表５に示し、実験結果を図１Ａ-１Ｉに示す。結果は、以下のことを示している。ｓｇＲＮＡ８、ｓｇＲＮＡ１２、ｓｇＲＮＡ１３、ｓｇＲＮＡ１４、ｓｇＲＮＡ１６、ｓｇＲＮＡ１７、ｓｇＲＮＡ１８は、すべて目標断片に対して良い切断効果を持ち、ｄｓＤＮＡを相応の長さの断片に切断することができる。しかし、他のｓｇＲＮＡは、ｄｓＤＮＡを対応する断片に切断することができない。

実施例２ 細胞レベルｓｇＲＮＡ標的部位検証
１、ｓｇＲＮＡの合成
インビトロ切断実験に基づいて、有効なｓｇＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ８; ｓｇＲＮＡ１２; ｓｇＲＮＡ１３; ｓｇＲＮＡ１４; ｓｇＲＮＡ１６; ｓｇＲＮＡ１７; ｓｇＲＮＡ１８を選択した。酵素切断部位Ｂｂｓ１の配列に基づいて、設計されたｓｇＲＮＡの上流と下流にＢｂｓ１酵素切断部位（大文字）を付加し、前記ｓｇＲＮＡをコードする核酸分子を表６に示す。

２、ｓｇＲＮＡベクターの構築とプラスミドの抽出
（１）ｓｇＲＮＡのアニーリング
上記で合成されたそれぞれのｓｇＲＮＡ（Ｆ、Ｒ）を５０μｍｏｌに希釈し、ｓｇＲＮＡ Ｆ.Ｒをそれぞれ５μＬ採取し、ｓｇＲＮＡ混合物１－７を調製した。
Ｔ４ ＰＮＫおよび１０×Ｔ４ライゲーションバッファーを、使用可能な状態まで氷上で解凍しておいた。以下の反応系を調製した。

第５工程で調製した反応系をＰＣＲ装置に設置し、以下の反応プログラムを開始した。
反応産物を回収した。

（２）ベクターゼ酵素切断
ｓｇＲＮＡベクターを構築し、使用したプラスミドはＡＡＶ-ｓａＣａｓ９-ｐｕｒｏベクターであった。プラスミドマップを図２に示す。

ＢｂｓＩ酵素切断を用いて、ｓｇＲＮＡの結合部位を放出させ、１．５ｍＬのＰＣＲチューブで以下の酵素切断反応系を調製した。

１－２ｈの酵素切断（または４℃での一晩の酵素切断）を行い、生成物を回収・精製し、濃度を測定し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。

（３）ライゲーション
前工程で回収したベクターとアニーリングしたｓｇＲＮＡを使って、以下のようなライゲーション系（２００μＬ ＰＣＲチューブ）を調製した。

前工程におけるライゲーション反応系を３７℃に置いて約１－２ｈライゲートし、ｓｇＲＮＡベクターの構築を完成させた。

（４）プラスミド形質転換

（１）ＴｒａｎｓＳｔｂｌ３ケミカルコンピテントセル（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ。北京全式金生物技術有限公司ＣＤ－５２１－０２）を取り出して、氷上で解凍しておきた。
（２）１μＬのライゲーション産物を５０μＬのコンピテントセルに添加し、氷上で３０分インキュベートし、４２℃で９０ｓヒートショックし、氷上で２ｍｉｎ静置した。
（３）非抗菌性培養液５００μＬを加え、３７℃、２００ｒｐｍで１ｈ振とうした。
（４）８００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去して約１００μＬを得て、アンピシリン含有のＬＢ寒天培地を用いてポジティブクローンをスクリーニングした。
（５）翌日に、スクリーニングされたポジティブクローン菌（培地５００μＬ）を３－４時間振とうし、２００μＬのサンプルに対して配列決定を行った。

５．プラスミドの抽出（Ｏｍｅｇａ社Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔによる）

１）配列決定で正確とされたプラスミドを一晩振とうし（５０－２００ｍＬ）、３７℃で１２－１６ｈ振とう培養してプラスミドを増幅させて、翌日に抽出した（振とう時間は１６ｈ未満である）。

２）菌液を５０－２００ｍＬ取り出して、室温下で４０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離して、菌体を収集した。

３）培地を廃棄した。沈殿物に１０ｍＬの溶液Ｉ／ＲＮＡ酵素混合液を加え、ピペッティングまたはボルテックスにより、細胞を完全に再懸濁させた。

４）１０ｍＬの溶液ＩＩを加え、蓋を締め、遠心チューブを８－１０回軽く上下をひっくり返して透明なライセートを得た。

５）予め冷却したＮ３バッファーを５ｍＬ加え、盖を締め、白色の凝集沈殿物が形成するまで、遠心チューブを１０回軽く上下をひっくり返した。室温下で２ｍｉｎ静置してインキュベートしてもよい。

６）シリンジフィルターを用意し、シリンジの中のピストンを引き抜き、シリンジを適切な試験管ラックに垂直に置き、インジェクター下端の出口に収集試験管を置き、シリンジの開口部を上向きにした。ライセートを直ちにフィルターのシリンジに注ぎ込んだ。細胞ライセートをシリンジ内で５ｍｉｎ静置した。そして、ライセートの表面には白色の凝集物が浮くようになる。細胞ライセートはろ過インジェクターの出口から流れ出した可能性がある。新しい５０ｍＬの試験管で細胞ライセートを収集した。慎重にインジェクターピストンをシリンジに軽く挿入し、ライセートが収集試験管に流れ込むように、ピストンをゆっくりと押した。

７）流れ出したろ過ライセートに０．１倍体積のＥＴＲ溶液（青色）を加え、試験管を１０回ひっくり返して、氷浴中で１０ｍｉｎ静置した。

８）上記ライセートを４２℃下で５ｍｉｎ水浴させた。ライセートには混濁が再度出た。そこで、２５℃、４０００×ｇで５ｍｉｎの遠心分離をし、ＥＴＲバッファーは試験管の底部に青色の層が形成した。

９）上清を別の新しい５０ｍＬ試験管に移し、０．５倍体積の室温の無水エタノールを加え、試験管を６－７回軽くひっくり返して、室温で１－２ｍｉｎ静置した。

１０）ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを５０ｍＬの収集試験管にセットし、２０ｍＬのろ液をＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムに加えた。室温下で、４０００×ｇで３ｍｉｎ遠心分離を行った。ろ液を廃棄した。

１１）ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを同一の収集試験管にセットし、残りのろ液が全部ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムに結合するまで、工程１０を繰り返して、同じ条件で遠心分離を行った。

１２）ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを同一の収集試験管にセットし、ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムに１０ｍＬのＨＢＣバッファーを加え、室温下で４０００×ｇで３ｍｉｎ遠心分離を行って、ろ液を廃棄した。

１３）ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを同一の収集試験管にセットし、ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムに１５ｍＬのＤＮＡ洗浄液（無水エタノールで希釈したもの）を加え、室温下で４０００×ｇで３ｍｉｎ遠心分離を行って、ろ液を廃棄した。

１４）ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを同一の収集試験管にセットし、ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムに１０ｍＬのＤＮＡ洗浄液（無水エタノールで希釈したもの）を加え、室温下で４０００×ｇで３ｍｉｎ遠心分離を行って、ろ液を廃棄した。

１５）最高速度（６０００×ｇ未満）で回転させて、ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムのマトリックスを１０ｍｉｎ乾燥させた。

１６）（オプション）さらにＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを風乾燥させる。（任意に）以下のいずれかの方法でＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムをさらに乾燥させた後，ＤＮＡの溶出を行う（必要に応じて）：

ａ）ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを真空容器に１５ｍｉｎ静置してエタノールを乾燥させる：室温下で、カラムを真空チャンバーに移して、真空チャンバーの全ての装置を接続する。真空チャンバーを密閉させ、１５ｍｉｎの真空を行う。ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを移動して、次の工程に供する。ｂ）真空オーブンでカラムを乾燥させまたは６５℃で１０－１５ｍｉｎ乾燥させる。ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを移動して、次の工程に供する。

１７）ＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムを清潔な５０ｍＬの遠心チューブにセットし、１－３ｍＬのエンドトキシンフリーの溶出バッファーをＨｉＢｉｎｄ（登録商標） ＤＮＡ Ｍａｘｉ結合カラムのマトリックスに直接加え（その量は目の最終製品の濃度による）、室温で５ｍｉｎ静置した。

１８）４０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離して、ＤＮＡを溶出させた。
１９）カラムを廃棄して、ＤＮＡ産物を－２０℃で保存した。
２０）構築されたプラスミドが正確であることを保証するために、抽出されたプラスミドに対して、再度配列決定を行った。

３、２９３Ｔ細胞でのｓｇＲＮＡの有効性の検証
（１）２９３Ｔ細胞の培養
１）凍結保存細胞の融解

ａ）恒温水槽の温度を３７℃に調節し、液体窒素から凍結保存細胞を取り出して、ピンセットで盖を保持して、水中ですばやく振とうした。

ｂ）凍結保存液を１５ｍＬ目盛付の遠心チューブに移し、ゆっくりと１０ｍＬの細胞の培養液を加え、軽く振とうして液体を混合させた。蓋を締め、火入れを行い、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで３ｍｉｎ遠心分離を行った。

ｃ）火入れを行い、適量の培養液を加え、底部の細胞沈殿物を軽くピペッティングした後、細胞を培養瓶に移してインキュベーターで培養した。２９３Ｔ細胞は、使われる培地が１０％ウシ胎児血清と１００Ｕ／ｍＬ二重抗体を添加した高グルコースＤＭＥＭであり、３７℃、５%ＣＯ_２で培養された。

２）細胞の継代
ａ）倒立顕微鏡で細胞の形態と密度を観察し、培養瓶内の細胞のコンフルエントが８０％－９０％に達した時点で、細胞の継代を開始した。

ｂ）細胞培養瓶の中の古い培養液を洗い出し、ＰＢＳで３回洗浄した。培養瓶に５００μＬのＥＤＴＡ含有のトリプシンを加え、インキュベーターに置いて１ｍｉｎくらいインキュベートして、細胞の隙間が大きくなり、細胞が丸くなったら、直ちに培養瓶に１ｍＬの培養液を加えて消化をとめ、吸引管で細胞を軽くピペッティングし、瓶の底から細胞が全部浮いてから、培養瓶の中の液体を遠心チューブに移し、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで２ｍｉｎ遠心分離した。

ｃ）上清を除去し、遠心チューブに２ｍＬの培地を加えて、沈殿物の細胞を再懸濁させた。細胞浮遊液をそれぞれ４つの新しい培養瓶に入れ、それぞれに４ｍＬの培養液を加え、培養瓶を軽く振とうし、細胞を混合し、それを培養瓶に均一に広げた後、細胞のインキュベーターに置いて培養を行った。

ｄ）トランスフェクションの１日前に、１ウェルあたり、密度８０％、細胞伸展、細胞の隙間が均一である２９３Ｔ細胞１００ｗを加え、翌日に細胞のコンフルエントが８０－９０％に達した時点でプラスミドトランスフェクションを行った。

(２）ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）法による２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
１）１．５ｍＬのＥＰチューブを取って、上記の順番で番号付けて、チューブごとに２５０μＬのＤＭＥＭ培地（血清なし）を加え、それぞれ１．５μｇのＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２- ｓｇＲＮＡ８、ｓｇＲＮＡ１２、ｓｇＲＮＡ１３、ｓｇＲＮＡ１４、ｓｇＲＮＡ１６、ｓｇＲＮＡ１７、ｓｇＲＮＡ１８プラスミドとエンプティープラスミドを加え、ボルテックスにより十分に混合した後、チューブごとに７．５μＬのＰＥＩトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスにより混合し、室温で２０ｍｉｎ静置した後トランスフェクションを行った。また、ネガティブコントロールを設置した。

２）培地（６ウェルプレート培地、血清なしＤＭＥＭ＝２ｍＬ／ウェル）に滴下し、インキュベーターで培養し、１２－１８ｈで培地の半分量を交換した。翌日に、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現状況を観察して、トランスフェクション効率を評価し、トランスフェクション効率が良好であれば、トランスフェクトされたプラスミドの培養を継続した。

３）耐性細胞のスクリーニング
ａ）液の調製：１０ｍｇ／ｍＬ（母液）を１μｇ／ｍＬに希釈したピューロマイシン、スクリーニングされた細胞。

ｂ）液の交換：トランスフェクションの２日後に、（ネガティブコントロールを含めて）１ウェルあたり３ｍＬのピューロマイシン含有の２９３Ｔ細胞培地を加え、トランスフェクションポジティブの細胞のスクリーニングを開始し、その後毎日細胞の生存状況を観察し、２日ごとに液の交換をし、液を交換する時に、対応する量のピューロマイシンを加えた。ネガティブコントロールのウェルの細胞が完全に死滅し、実験グループとコントロールグループの細胞は生存している場合（トランスフェクションが成功したことを示す）、抗生物質によるスクリーニングを中止し、代わりに通常の培地を使用した。

（３）２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡの抽出

（１）６ウェルプレートの細胞のコンフルエントが８０－９０％に達した後、６ｃｍ培養皿に継代して培養した。

（２）細胞のコンフルエントが８０－９０％に達した後、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡの抽出の準備をする。全工程は７－１０日くらいである。ゲノムの抽出は、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の細胞抽出キットを使用し、実験工程は以下のとおりである：

ａ）４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し細胞を収集し、上清を除去した。２２０μＬのＰＢＳ、１０ｍＬのＲＮａｓｅバッファーと２０μＬのＰＫワーキング溶液をサンプルに加え、細胞を再懸濁させた。室温で１５ｍｉｎ以上静置した。

ｂ）２５０μＬのＧＢバッファーを細胞再懸濁液に加え、ボルテックスにより混合し、６５℃で１５－３０ｍｉｎ水浴し、カラムで精製した。
ｃ）２５０μＬの無水エタノールを消化液に加え、ボルテックスにより１５－２０ｓ混合した。

ｄ）ｇＤＮＡ吸着カラムを２ｍＬ収集試験管にセットした。前工程で得られた混合液（沈殿物を含む）を吸着カラムに移した。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。カラムの閉塞現象が生じた場合は、再び１４０００×ｇで３－５ｍｉｎ遠心分離する。混合液が７５０μＬを超える場合は、数回でカラムに供した。

ｅ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。５００μＬの洗浄バッファーＡを吸着カラムに加えた。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。
ｆ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。６５０μＬの洗浄バッファーＢを吸着カラムに加えた。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。
ｇ）工程４を繰り返した。
ｈ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。１２０００×ｇ空管で２ｍｉｎ遠心分離した。

ｉ）吸着カラムを新しい１．５ｍＬ遠心チューブにセットした。３０－１００μＬの７０℃に予熱した溶出バッファーを吸着カラムの膜中央に加え、室温で３ｍｉｎ静置した。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。
注：ＤＮＡ含量が多い組織は、３０－１００μＬの溶出バッファーをさらに加えて溶出を繰り返すことができる。

ｊ）吸着カラムを除去し、ＤＮＡを２－８℃で保存し、濃度を測定・記録し、－２０℃で長期保存した。

（４）Ｔ７Ｅ１酵素切断実験
１）上記のＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２- ｓｇＲＮＡ８、ｓｇＲＮＡ１２、ｓｇＲＮＡ１３、ｓｇＲＮＡ１４、ｓｇＲＮＡ１６、ｓｇＲＮＡ１７、ｓｇＲＮＡ１８プラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、標的部位の近傍で、上流と下流のプライマーを利用して抽出されたゲノムＤＮＡを増幅させ、ＤＮＡ断片のＰＣＲを行った。プライマー配列を表７に示す。

２）液体回収キット（ＯＭＥＧＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（２００）Ｄ２５００－０２）を使って、上記のＰＣＲ産物に対して液体ＤＮＡの回収を行った。ＤＮＡ回収工程は以下のとおりである：

ａ）ＰＣＲ反応産物に等体積の膜結合液を加え、ゲルカットからの回収は１ｍｇあたり１μＬの膜結合液を加える必要があり、すべてのゲルが完全に溶解するまで５０－６０℃で７ｍｉｎ加熱し、ボルテックスにより混合し、カラムで回収した。
ｂ）上記の液体を回収用カラムに入れ、１００００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、ろ液を除去した。
ｃ）７００μＬの洗浄バッファーを加え、>１３０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、ろ液を除去した。
ｄ）工程ｃ）を繰り返した。
ｅ）空管を用いて>１３０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。
ｆ）遠心カラムを新しい１．５ｍＬのＥＰチューブに移し、マークし、２０－３０μＬの溶出バッファーまたはｄｄＨ_２Ｏを加え、室温で２ｍｉｎ静置した。
ｇ）>１３０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、吸着カラムを除去し、ＤＮＡを２－８℃で保存し、濃度を測定・記録し、－２０℃で長期保存した。

３）Ｔ７Ｅ１酵素切断実験によるｓｇＲＮＡの効率の検証
上記で獲得したＰＣＲ回収またはゲルカット回収産物に対して、Ｔ７Ｅ１酵素切断反応を行った。

前記反応系を３７℃で２０ｍｉｎインキュベートした。

ｄ）酵素切断産物の電気泳動
ゲルの作成：２．５％ゲル、２倍の染料
電気泳動のプログラム：１４０Ｖ、２０ｍｉｎから３０ｍｉｎ

ｅ）電気泳動の結果の確認
酵素切断結果を図３に示し、各断片切断後の断片長さを表８に示す。

その結果、ｓｇＲＮＡ８、ｓｇＲＮＡ１３、ｓｇＲＮＡ１７、ｓｇＲＮＡ１８は、いずれも標的部位に対して切断効果があり、切断後の断片は表８に示すものと一致した。

（５）ゲノムＤＮＡにおける切断部位を含有するＰＣＲ断片の遺伝子配列決定、マルチピークテスト
上記のＤＮＡ増幅断片に対して配列決定し、配列決定スペクトルは図４Ａ-Ｃに示されている。その結果、ｓｇＲＮＡ１３、ｓｇＲＮＡ１７、ｓｇＲＮＡ１８の切断効率は高く、ｓｇＲＮＡ切断部位近傍にはマルチピークが出現した。

４、ダブルｓｇＲＮＡ切断効率有効性の検証
（１）ダブルｓｇＲＮＡ-ＡＡＶ-ｓａＣａｓ９-ｐｕｒｏプラスミドの構築、抽出

上記の実験結果によると、ｓｇＲＮＡ１３.１７.１８の切断効率は高い。上記実験で構築されたＡＡＶ-ｓａＣａｓ９-ｓｇＲＮＡ１３プラスミドにおいて、ｓａ-ｇＲＮＡ ＳｃａｆｆｏｌｄとＡＡＶ ＩＴＲ領域の間をＮｏｔＩ酵素で切断処理した後、Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（プロモーター）－ｓｇＲＮＡ１７-ｓａＳｃａｆｆｏｌｄ（ｓａ足場）断片とＵ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｓｇＲＮＡ１８-ｓａ-ｇＲＮＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄをそれぞれ挿入し、ＡＡＶ-ｓａＣａｓ９-ｓｇＲＮＡ１３-ｓｇＲＮＡ１７、ＡＡＶ-ｓａＣａｓ９-ｓｇＲＮＡ１３-ｓｇＲＮＡ１８プラスミドを構築した。

１）Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ-ｓｇＲＮＡ１７-ｓａＳｃａｆｆｏｌｄ断片とＵ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒ-ｓｇＲＮＡ１８-ｓａ-ｇＲＮＡ Ｓｃａｆｆｏｌｄ断片ＰＣＲプライマー配列を表９に示す。

ＰＣＲ反応系は、以下のとおりである。

ＰＣＲ反応プログラムは、以下のとおりである。

２）２.０%ＤＮＡゲル電気泳動を用い、ＯＭＥＧＡゲル回収キットを用いて、ｇＲＮＡインビトロ転写テンプレートゲルを回収する工程は以下のとおりである：

ａ）ＰＣＲ反応産物に等体積の膜結合液を加え、ゲルカットからの回収は１ｍｇあたり１μＬの膜結合液を加える必要があり、すべてのゲルが完全に溶解するまで５０－６０℃で７ｍｉｎ加熱し、ボルテックスにより混合し、カラムで回収した。
ｂ）上記の液体を回収用カラムに入れ、１００００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、ろ液を除去した。
ｃ）７００μＬの洗浄バッファーを加え、>１３０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、ろ液を除去した。
ｄ）工程ｃ）を繰り返した。

ｅ）空管を用いて>１３０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。
ｆ）遠心カラムを新しい１．５ｍＬのＥＰチューブに移し、マークし、２０－３０μＬの溶出バッファーまたはｄｄＨ_２Ｏを加え、室温で２ｍｉｎ静置した。
ｇ）>１３０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離し、吸着カラムを除去し、ＤＮＡを２－８℃で保存し、濃度を測定・記録し、－２０℃で長期保存した。

３）酵素切断ベクター
ＮｏｔＩ酵素切断を使って、部位を放出させ、１．５ｍＬのＰＣＲチューブで以下のような酵素切断反応系を調製した。

１－２ｈの酵素切断（または一晩の酵素切断）を行い、生成物を回収・精製し、濃度を測定し、５０ｎｇ／μＬに希釈した。

４）ライゲーション
前工程で回収したベクターとアニーリングしたｓｇＲＮＡを使って、以下のようなライゲーション系（２００μＬ ＰＣＲチューブ）を調製した。

前工程におけるライゲーション反応系を３７℃に置いて約１－２ｈライゲートし、ｓｇＲＮＡベクターの構築を完成させた。

５）プラスミド形質転換
ａ）ＴｒａｎｓＳｔｂｌ３ケミカルコンピテントセルを取り出して、氷上で解凍した。
ｂ）１μＬのライゲーション産物を取って、５０μＬコンピテントセルに加え、氷上で３０分インキュベートし、４２℃で９０ｓヒートショックし、氷上で２ｍｉｎ静置した。
ｃ）非抗菌性培養液５００μＬを加え、３７℃、２００ｒｐｍで１ｈ振とうした。
ｄ）８００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去して約１００μＬを得て、アンピシリン含有のＬＢ寒天培地を用いてポジティブクローンをスクリーニングした。
ｅ）翌日に、スクリーニングされたポジティブクローン菌（培地５００μＬ）を３－４時間振とうし、２００μＬのサンプルに対して配列決定を行った。

６）プラスミドの抽出（Ｏｍｅｇａ社Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔによる）工程は上記と同じである。

（２）２９３Ｔ細胞でのダブルｓｇＲＮＡとシングルｓｇＲＮＡの有効性の検証
１）２９３Ｔ細胞の培養
ａ）凍結保存細胞の融解
ｉ）恒温水槽の温度を３７℃に調節し、液体窒素から凍結保存細胞を取り出して、ピンセットで盖を保持して、水中ですばやく振とうした。
ｉｉ）凍結保存液を１５ｍＬ目盛付の遠心チューブに移し、ゆっくりと１０ｍＬの細胞の培養液を加え、軽く振とうして液体を混合させた。蓋を締め、火入れを行い、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで３ｍｉｎ遠心分離を行った。
ｉｉｉ）火入れを行い、適量の培養液を加え、底部の細胞沈殿物を軽くピペッティングした後、細胞を培養瓶に移してインキュベーターで培養した。２９３Ｔ細胞は、使われる培地が１０％ウシ胎児血清と１００Ｕ／ｍＬ二重抗体を添加した高グルコースＤＭＥＭであり、３７℃、５%ＣＯ_２で培養された。

ｂ）細胞の継代
ｉ）倒立顕微鏡で細胞の形態と密度を観察し、培養瓶内の細胞のコンフルエントが８０％－９０％に達した時点で、細胞の継代を開始した。

ｉｉ）細胞培養瓶の中の古い培養液を洗い出し、ＰＢＳで３回洗浄した。培養瓶に５００μＬのＥＤＴＡ含有のトリプシンを加え、インキュベーターに置いて１ｍｉｎくらいインキュベートして、細胞の隙間が大きくなり、細胞が丸くなったら、直ちに培養瓶に１ｍＬの培養液を加えて消化をとめ、吸引管で細胞を軽くピペッティングし、瓶の底から細胞が全部浮いてから、培養瓶の中の液体を遠心チューブに移し、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで２ｍｉｎ遠心分離した。

ｉｉｉ）上清を除去し、遠心チューブに２ｍＬの培地を加えて、沈殿物の細胞を再懸濁させた。細胞浮遊液をそれぞれ４つの新しい培養瓶に入れ、それぞれに４ｍＬの培養液を加え、培養瓶を軽く振とうし、細胞を混合し、それを培養瓶に均一に広げた後、細胞のインキュベーターに置いて培養を行った。

ｉｖ）トランスフェクションの１日前に、１ウェルあたり、密度８０％、細胞伸展、細胞の隙間が均一である２９３Ｔ細胞１００ｗを加え、翌日に細胞のコンフルエントが８０－９０％に達した時点でプラスミドトランスフェクションを行った。

(２）ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）法による２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
ａ）１．５ｍＬのＥＰチューブを取って、上記の順番で番号付けて、チューブごとに２５０μＬのＤＭＥＭ培地（血清なし）を加え、順に１．５ｍｇのＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３プラスミド、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１７プラスミド、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１８プラスミド、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ １３-ｓｇＲＮＡ１７プラスミド、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ １３-ｓｇＲＮＡ１８プラスミドとエンプティープラスミドを加え、ボルテックスにより十分に混合した後、チューブごとに７．５μＬのＰＥＩトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスにより混合し、室温で２０ｍｉｎ静置した後トランスフェクションを行った。また、ネガティブコントロールを設置した。

ｂ）培地（６ウェルプレート培地、血清なしＤＭＥＭ＝２ｍＬ／ウェル）に滴下し、インキュベーターで培養し、１２－１８ｈで培地の半分量を交換した。翌日に、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現状況を観察して、トランスフェクション効率を評価し、トランスフェクション効率が良好であれば、トランスフェクトされたプラスミドの培養を継続した。

ｃ）耐性細胞のスクリーニング
ｉ）液の調製：１０ｍｇ／ｍＬ（母液）を１μｇ／ｍＬに希釈したピューロマイシン、スクリーニングされた細胞
ｉｉ）液の交換：トランスフェクションの２日後に、（ネガティブコントロールを含めて）１ウェルあたり３ｍＬのピューロマイシン含有の２９３Ｔ細胞培地を加え、トランスフェクションポジティブの細胞のスクリーニングを開始し、その後毎日細胞の生存状況を観察し、２日ごとに液の交換をし、液を交換する時に、対応する量のピューロマイシンを加えた。ネガティブコントロールのウェルの細胞が完全に死滅し、実験グループとコントロールグループの細胞は生存している場合（トランスフェクションが成功したことを示す）、抗生物質によるスクリーニングを中止し、代わりに通常の培地を使用した。

３)２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡの抽出
ａ）６ウェルプレートの細胞のコンフルエントが８０－９０％に達した後、６ｃｍ培養皿に継代して培養した。

ｂ）細胞のコンフルエントが８０－９０％に達した後、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡの抽出の準備をする。全工程は７－１０日くらいである。ゲノムの抽出は、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の細胞抽出キットを使用し、実験工程は以下のとおりである：

ｉ）４００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し細胞を収集し、上清を除去した。２２０μＬのＰＢＳ、１０ｍＬのＲＮａｓｅ溶液と２０μＬのＰＫワーキング溶液をサンプルに加え、細胞を再懸濁させた。室温で１５ｍｉｎ以上静置した。
ｉｉ)２５０μＬのＧＢバッファーを細胞再懸濁液に加え、ボルテックスにより混合し、６５℃で１５－３０ｍｉｎ水浴し、カラムで精製した。
ｉｉｉ）２５０μＬの無水エタノールを消化液に加え、ボルテックスにより１５－２０ｓ混合した。
ｉｖ）ｇＤＮＡ吸着カラムを２ｍＬ収集試験管にセットした。前工程で得られた混合液（沈殿物を含む）を吸着カラムに移した。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。カラムの閉塞現象が生じた場合は、再び１４０００×ｇで３－５ｍｉｎ遠心分離する。混合液が７５０μＬを超える場合は、数回でカラムに供した。
ｖ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。５００μＬの洗浄バッファーＡを吸着カラムに加えた。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。

ｖｉ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。６５０μＬの洗浄バッファーＢを吸着カラムに加えた。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。
ｖｉｉ）工程４を繰り返した。
ｖｉｉｉ）ろ液を廃棄し、吸着カラムを収集試験管にセットした。１２０００×ｇ空管で２ｍｉｎ遠心分離した。
ｉｘ）吸着カラムを新しい１．５ｍＬ遠心チューブにセットした。３０－１００μＬの７０℃に予熱した溶出バッファーを吸着カラムの膜中央に加え、室温で３ｍｉｎ静置した。１２０００×ｇで１ｍｉｎ遠心分離した。
注：ＤＮＡ含量が多い組織は、３０－１００μＬの溶出バッファーをさらに加えて溶出を繰り返すことができる。
ｘ）吸着カラムを除去し、ＤＮＡを２－８℃で保存し、濃度を測定・記録し、－２０℃で長期保存した。

４）ゲノムＤＮＡにおける切断部位を含有するＰＣＲ断片の遺伝子配列決定、マルチピークテスト
ａ）前記ＤＮＡの切断標的部位に基づいて、プライマーを設計し、断片を増幅した。プライマー配列を表１０に示す。

ｂ）ベクター線状化及びライゲーション
プラスミドベクターはＰＭＤ-１９Ｔ-ＭＣＳベクターであり、ベクター線状化方法は上記と同じであり、使用された酵素はＭｌｕＩ酵素とＫｐｎＩ酵素であり、ここでは贅言しない。ＰＣＲ産物を回収して精製し、配列決定し、ＰＭＤ-１９Ｔ-ＭＣＳ線状化ベクターにライゲーションした。方法は上記と同じであり、ここでは贅言しない。

ｃ）プラスミド形質転換
ｉ）ＴｒａｎｓＳｔｂｌ３ケミカルコンピテントセルを取り出して、氷上で解凍した。
ｉｉ）１μＬのライゲーション産物を取って、５０μＬコンピテントセルに加え、氷上で３０分インキュベートし、４２℃で９０ｓヒートショックし、氷上で２ｍｉｎ静置した。
ｉｉｉ）非抗菌性培養液５００μＬを加え、３７℃、２００ｒｐｍで１ｈ振とうした。
ｉｖ）８００ｒｐｍ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去して約１００μＬを得て、アンピシリン含有のＬＢ寒天培地を用いてポジティブクローンをスクリーニングした。
ｖ）翌日に、スクリーニングされたポジティブクローン菌をそれぞれ８０個ずつ摘み取って、配列決定に供した。

ｄ）陽性率分析
配列決定スペクトルを計算した結果、陽性率は以下のとおりである：
ｓｇＲＮＡ１３陽性率は５４%、ｓｇＲＮＡ１７陽性率は４８.５%、ｓｇＲＮＡ１８陽性率は６２.５%、ｓｇＲＮＡ１３+１７陽性率は６４%、ｓｇＲＮＡ１３+１８陽性率は５１.２%であった。
ある程度、ダブルｓｇＲＮＡ陽性率は上昇することが分かった。
実験結果を図５に示す。

実施例３ Ｄｏｎｏｒ（ドナー核酸分子）のスクリーニング
１、Ｄｏｎｏｒ設計
Ｄｏｎｏｒ設計は、ＨＤＲ方法を採用した。ｓｇＲＮＡ１３の切断部位がイントロン６にあり、ｓｇＲＮＡ１７、ｓｇＲＮＡ１８の切断部位がエクソン７にあることを考慮し、ｓｇＲＮＡ１７とｓｇＲＮＡ１８切断部位の間に（具体的にはエクソン７：ｃ.８０２+４２部位）ＥＧＦＰ遺伝子を選択して挿入し、同時にＥＧＦＰ遺伝子の左右に８００ｂｐのホモログアームを追加した。
Ｄｏｎｏｒ設計図を図６に示す。
Ｄｏｎｏｒ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４-６６のいずれかに記載されている。

２、ＰＭＤ１９-Ｔ-ｄｏｎｏｒプラスミドの構築、抽出工程は上記と同じであり、ここでは贅言しない。

３、２９３Ｔ細胞でのｄｏｎｏｒの有効性の検証
（１）２９３Ｔ細胞の培養
工程は上記と同じであり、ここでは贅言しない。

(２）ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）法による２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
１）１．５ｍＬのＥＰチューブを取って、上記の順番で番号付けて、チューブごとに２５０μＬのＤＭＥＭ培地（血清なし）を加え、順に１．５μｇのＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３プラスミド、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１７プラスミド、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１８プラスミド、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３-ｓｇＲＮＡ１７プラスミド、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３-ｓｇＲＮＡ１８プラスミドとエンプティープラスミドを加え、ボルテックスにより十分に混合した後、チューブごとにそれぞれ対応する１.５μｇの ＰＭＤ１９-Ｔ-ｄｏｎｏｒプラスミド（対応関係は以下の表を参照）を加え、混合した後、７．５μＬのＰＥＩトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスにより混合し、室温で２０ｍｉｎ静置した後トランスフェクションを行った。また、ネガティブコントロールを設置した。

２）培地（６ウェルプレート培地、血清なしＤＭＥＭ＝２ｍＬ／ウェル）に滴下し、インキュベーターで培養し、１２－１８ｈで培地の半分量を交換した。翌日に、蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現状況を観察して、トランスフェクション効率を評価し、トランスフェクション効率が良好であれば、トランスフェクトされたプラスミドの培養を継続した。

３）耐性細胞のスクリーニング
ａ）液の調製：１０ｍｇ／ｍＬ（母液）を１μｇ／ｍＬに希釈したピューロマイシン、スクリーニングされた細胞。

ｂ）液の交換：トランスフェクションの２日後に、（ネガティブコントロールを含めて）１ウェルあたり３ｍＬのピューロマイシン含有の２９３Ｔ細胞培地を加え、トランスフェクションポジティブの細胞のスクリーニングを開始し、その後毎日細胞の生存状況を観察し、２日ごとに液の交換をし、液を交換する時に、対応する量のピューロマイシンを加えた。ネガティブコントロールのウェルの細胞が完全に死滅し、実験グループとコントロールグループの細胞は生存している場合（トランスフェクションが成功したことを示す）、抗生物質によるスクリーニングを中止し、代わりに通常の培地を使用した。

４）フローサイトメトリースクリーニング
抗生物質によるスクリーニング後の細胞（約７日）を以下の工程でフローサイトメトリースクリーニングした。

ａ）６ウェルプレート中の培地を吸引除去し、ＤＰＢＳ（ＤｕＬｂｅｃｃｏ'ｓリン酸塩バッファー）で２回洗浄した。
ｂ）５００μＬの０.０５%トリプシンを加え、３７℃で４ｍｉｎインキュベート消化した。
ｃ）３-５倍体積のＤＭＥＭ中和トリプシンを加え、８００ｒ/ｍｉｎで２ｍｉｎ遠心分離した。
ｄ）上清を吸引除去し、ＰＢＳ重懸濁細胞、８００ ｒ/ｍｉｎ、２ ｍｉｎ遠心分離を加え、１回繰り返す、
ｅ）上清を吸引除去し、２００μＬの２%ＦＢＳを含むＰＢＳ再懸濁細胞を加えた。
ｆ）上記工程で得られた液体をろ過チューブに加えて、全部をろ過網に通させた。
ｇ)上機し、スクリーニング後の陽性細胞を１２ウェルプレートまたは６ウェルプレートに移して培養した。

５)２９３Ｔ細胞ゲノムＤＮＡの抽出
ａ）６ウェルプレートの細胞のコンフルエントが８０－９０％に達した後、６ｃｍ培養皿に継代して培養した。
ｂ）細胞のコンフルエントが８０－９０％に達した後、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡの抽出の準備をする。全工程は７－１０日くらいである。ゲノムの抽出は、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｖａｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の細胞抽出キットを使用し、実験工程は上記と同じであり、ここでは贅言しない。

６）目的断片配列決定
ａ）ｄｏｎｏｒの上流と下流で、プライマーを設計し、同時にプライマーの上流と下流に酵素切断部位を添加した。

ｂ）ベクター線状化及びライゲーション
プラスミドベクターはＰＭＤ-１９Ｔ-ＭＣＳベクターであり、ベクター線状化方法は上記と同じであり、使用された酵素はＭｌｕＩ酵素とＫｐｎＩ酵素であり、ここでは贅言しない。ＰＣＲ産物を回収して精製し、配列決定し、ＰＭＤ-１９Ｔ-ＭＣＳ線状化ベクターにライゲーションした。方法は上記と同じであり、ここでは贅言しない。

ｃ）プラスミド形質転換
方法は上記と同じである。

ｄ）配列決定
各プラスミドを摘み取って配列決定に供し、配列決定結果を統計した。

実施例４ 患者の３Ｄ網膜組織を使用したｓｇＲＮＡの遺伝子編集効率のインビトロ検証
１、患者の腎上皮細胞の抽出と培養
北京賽貝社が提供する腎上皮細胞分離と培養キットを使用して行った。実験工程は以下のとおりである：

１）ＵｒｉｎＥａｓｙ分離完全培地、添加剤、ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）、洗浄液を細胞培養室に持ち込んだ。
２）紫外線ランプをつけ、１２ウェルプレート、５０ｍＬ遠心チューブ、１５ｍＬ遠心チューブ、電動ピペット、ピペット、吸引管、５ｍＬマイクロピペットおよびチップ、１ｍＬマイクロピペットおよびチップを用意した。３７℃の水槽を開けた。
３）採尿：手袋を着用し、消毒し、中間尿を採取し、シールフィルムで密封した。
４）７５０μＬ／ウェルでゼラチンを、皿（３つのウェル）の底に塗布して、３０分超えで、３７℃で静置した。
５）７５％アルコールで尿瓶の外表面を消毒し、５０ｍＬ円錐底型遠心チューブに小分けしてシールし、４００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。

６）ＵｒｉｎＥａｓｙ分離完全培地と添加剤を取り出して調製した（０．５ｍＬの添加剤あたり、５ｍＬの基礎培地と混合）。
７）最小限の速度で上部の液面に沿ってピペットを動かし、上清を１ｍＬになるまでゆっくりと吸引した。
８）再懸濁させて、１５ｍＬ遠心チューブに入れ、１０ｍＬの洗浄液を加えて混合し、２００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。
９）１２ウェルプレートを取り出し、ゼラチンを吸引除去し、洗浄液で一回（５００μＬ）洗浄し、１ウェルあたり７５０μＬのＵｒｉｎＥａｓｙ分離完全培地を加え、３７℃で静置した。
１０）１５ｍＬ遠心チューブを取り出して、０．２ｍＬの細胞ペレットが残った。
１１）ＵｒｉｎＥａｓｙ分離完全培地で細胞ペレットを再懸濁させた：男性のものは１ウェル、女性のものは２ウェルとして、Ｄ０（０日目）とした。

１２）観察：
１日目：汚染の有無の観察；
２日目：分離培地の補充－女性：５００μＬ／ウェル；男性：２５０μＬ／ウェル；
４日目：付着がない場合：培地の半分量を交換し、２日ごとに液を交換し、表面に沿って１ｍＬの分離完全培地を加えた。

１３）付着が出た後：細胞が表面に付着したら（３～７日または９～１０日）、ＵｒｉｎＥａｓｙ増幅完全培地で培養を行い、２日間の培養後、５００μＬの培養液で全量を交換した。
表面に付着した後、約９～１２日（未満１４日）で、コンフルエントが８０～９０%に達したときに継代し、順に６ウェルプレート、６ｃｍ培養皿と１０ｃｍ培養皿に継代し、後で使用するために凍結保存した。

（２）ｉＰＳＣｓの誘導
患者由来の（ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ）腎上皮細胞をｉＰＳＣｓに誘導し、工程は以下のとおりである：

１）体細胞のコンフルエントが７０－９０％に達したら、消化・継代を行うことができる。細胞を９６ウェルプレートに播種し；播種密度は５０００-１５０００個／ウェルとなるようにコントロールし、細胞の状況に応じて３つの密度勾配を設定でき、各勾配ではトリプルウェルを設置した。細胞播種の当日は－１日目とした。

２）０日目：細胞のコンフルエントおよびその状態を鏡下観察し、異なる勾配のマルチウェルに対して消化・計数を行って、細胞の量が１００００－２００００個に達したウェルに対して初期化を行った。初期化培地Ａの配合は、以下のとおりである：

３）初期化添加剤ＩＩを遠心分離しておいて、９７μＬの初期化培地Ａを初期化添加剤ＩＩの試験管に加え、均一に混合して初期化培地Ｂとして、９６ウェルプレートから選定された条件を満たしたウェルに１００μＬの初期化培地Ｂを加え、培養プレートをインキュベーターに戻した。

４）１－２日目：鏡下観察を行い、細胞の形態の変化を写真で記録した。細胞の形態が明らかに変化している場合は、初期化培地Ｂを除去し、代わりに、初期化培地Ａで培養を継続した。形態変化が明らかでない場合は、液の交換を行わなくても良い。

５）３日目：最初の２日間で細胞の形態が明らかに変化しており、かつ細胞の増殖速度が速い場合に、トリプシン消化で継代を行うことができる。細胞の状態とその量に従って、細胞を６ウェルプレートの２つ－６つのウェルに継代し、初期化培地Ｃを加え、可能な限り単一の細胞の付着を形成させる。初期化培地Ｃの配合は、以下のとおりである：

６）４日目：細胞の容器に付着する状況を観察し、大部分の細胞が良好に容器に付着してれば、新鮮な体細胞培地に交換して、培養を継続した。

７）５日目：鏡下観察し、小クラスターのクローン（細胞が四つ以上のクローン集団）が形成したら、体細胞培地をＲｅｐｒｏｅａｓｙヒト体細胞初期化培地に変更する。小クラスターのクローンがまだ形成していなければ、１～２日間観察を継続して、Ｒｅｐｒｏｅａｓｙヒト体細胞初期化培地に交換することができる。

８）６－８日目：鏡下観察し、小クラスターのクローンが大きくなり、一つのクローン細胞集団は１０個以上の細胞有すれば、Ｒｅｐｒｏｅａｓｙヒト体細胞初期化培地をＰＳＣｅａｓｙヒト多能性幹細胞培地（またはＰＧＭ１ヒト多能性幹細胞培地）に直接変更することができる。液を交換する前の観察では、死滅した細胞が多ければ、室温で平衡させたＰＢＳで洗浄した後、液の交換をすることができる。

９）９－２０日目：鏡下観察し、細胞の形態変化を写真で記録した。室温で平衡させた新鮮なＰＳＣｅａｓｙヒト多能性幹細胞培地に毎日交換した。

１０）２１日目：鏡下観察し、単独の細胞クローンが１０倍視野全体を満たした場合、１ｍＬの注射針（またはガラス針などの器具）でクローンを切り、予めマトリゲルでコーティングされた４８ウェルプレートに摘み取った（クローンの状態がよく、細胞が厚くかつ増殖が早い場合、２４ウェルプレートに直接摘み取ることができる）。

１１）クローンを摘み取った後、ＰＳＣｅａｓｙヒト多能性幹細胞融解培地に播種し、細胞付着後は、ＰＳＣｅａｓｙヒト多能性幹細胞培地に交換し、必要な世代数になるまで培養を継続した。

（３）患者由来の３Ｄ網膜細胞の誘導
具体的な工程を表１２に示す。

（４）ＡＡＶ８ウイルスの構築とコーティング
１）プラスミド増幅。構築されたＡＡＶベクター（ｓｇＲＮＡとドナーはいずれもプラスミドｐＸ６０１-ＡＡＶ-ＣＭＶ-ＳａＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ #６１５９１）から改造され、説明の便宜上、以下にｓｇＲＮＡのプラスミドをＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡと命名し、ドナープラスミドをＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒと命名し、ここでＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒは一部のＥＧＦＰ配列を含み、上述のＰＭＤ-１９Ｔ-ｄｏｎｏｒ配列と同じである）、パッケージングプラスミドと補助プラスミドは、大量のエンドトキシンフリー抽出を経なければならず、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いてプラスミドの大量抽出を行い、工程は上記と同じである。

２）ＡＡＶ８-２９３Ｔ細胞のトランスフェクション。トランスフェクション当日の細胞密度を観察し、８０－９０％に達したとき、ベクタープラスミド、パッケージングプラスミドと補助プラスミドをトランスフェクトすることができる。
３）ＡＡＶ８ウイルスの収集：ウイルス粒子はパッケージング細胞と培養上清に同時存在する。最良の収率を得るために、細胞と培養上清を収集することができる。
４）ＡＡＶの精製、－８０℃での長期保存。

（５）３Ｄ網膜組織を用いたインビトロでのｓｇＲＮＡ遺伝子の編集効率の検証
１）ＡＡＶ８を用いて、３Ｄ Ｒｅｔｉｎａ（網膜）組織を感染した。
２）遺伝子編集効率を検証した。

１）Ｔ７Ｅ１酵素切断実験
工程は上記と同じである。

２）ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニング
ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒの編集効率を定量化し、実験グループとコントロールグループの切断効率に対して統計解析をするために、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキットで実験を行い、菌体選択後サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）で配列決定を行った。

ａ）３Ｄ網膜組織にＡＡＶウイルスを感染させた後に獲得したＤＮＡを増幅テンプレートとして、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｌａｔｉｎｕｍ ＳｕｐｅｒＦｉ（登録商標）シリーズのＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行った。

ｂ）タッチダウンＰＣＲ（Ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ ＰＣＲ）プログラム：
工程は上記と同じである。

ｃ）ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングの反応系は以下のとおりである。

上記反応系を調製して、軽く混合し、室温で５ｍｉｎ静置した。
氷上に置き、コンピテントセルを除去し、形質転換に備えた。

ｄ）ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニング反応によるコンピテントセルの形質転換
コンピテントセルを５０または１００μＬを取り、２μＬの上記ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニング反応液を加え、氷上で５－３０ｍｉｎを静置し；振とうせずに、４２℃で３０ｓヒートショックし；速やかに反応系を氷上に移し、２５０μＬのＳ．Ｏ．Ｃ．培地を加え；３７℃で２００ｒｐｍで１ｈ振とう・融解し；対応する量のＬＢ培養プレート（２５μｇ／ｍＬのブレオマイシン（Ｚｅｏｃｉｎ）を添加）を取り出し、１００μＬの上記菌液をプレートに塗布し、３７℃のインキュベーターで一晩培養した。

ｅ）選択された菌体に対するＳａｎｇｅｒ配列決定。
翌朝、菌体プレートを取り出し、各プレートから８０個の菌体を選択し；３７℃で２００ｒｐｍで３－４ｈ振とうし；各菌体サンプルに対して２００μＬを採用しサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定を行った。

実施例５ ヒト化マウスモデルにおける遺伝子編集効率の検証
１、ヒト化マウスモデルにおける遺伝子編集効率の検証
１）ヒト化マウスの構築
ヒト化マウスの構築は、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．が実施した。
ヒト変異部位について、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に依頼して、ＣＹＰ４Ｖ２ヒト化マウスモデルを構築してもらった。

２）技術の内容：
ａ）標的配列を認識するためのｓｇＲＮＡの設計・構築；
ｂ）標的遺伝子の切断を引き起こすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築；
ｃ）ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の活性検査；
ｄ）ノックインターゲティングベクターの設計・構築、設計に従ってエクソン６－８（イントロン配列を含む）の置換；
インビトロ転写によるｓｇＲＮＡ/Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ；

ｅ）マウス受精卵へのｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとターゲティングベクターの注射；
ｆ）ＣＹＰ４Ｖ２ノックインＦ０マウスの検査及び増殖；
ｇ）ＣＹＰ４Ｖ２ノックインＦ１ヘテロ接合体マウスの獲得とジェノタイピング（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＤＮＡハイブリダイズ）検定。外在性及内在性プローブを１つずつ含む）。

３）技術の方法：
ａ）マウスゲノムの標的配列の増幅と配列決定を行い、標的配列を狙ったＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクタープラスミドを設計と構築し、活性検査を行った。
ｂ）マウスゲノムＤＮＡを抽出し、標的配列を認識するｓｇＲＮＡを増幅した。
ｃ）標的遺伝子の切断を引き起こすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクタープラスミドを設計と構築した。

ｄ）利用Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ （Ｂｅｉｊｉｎｇ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．が独自に開発した検査キットでｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９に対して活性検査を行った。
ｅ）活性の高いｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位配列情報を選択し、ＣＹＰ４Ｖ２ノックインターゲティングベクターを設計・構築した。

ｆ）マウス受精卵前核にｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとターゲティングベクターを注射し、Ｆ０／Ｆ１陽性マウスを得た。この実験は主に以下のような内容を含む。
ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのインビトロ転写；
マウス受精卵の収集；
マウス受精卵へのＲＮＡとターゲティングベクターの注射；
代理母マウスの輸卵管への受精卵の移植；
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ヒト化で点変異のＦ０マウスのジェノタイピングおよび増殖；
ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ヒト化で点変異のＦ１マウスの獲得及びジェノタイピング（ＰＣＲ検査とｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇハイブリダイズ検定を含有する）。

（２）飼育と繁殖
両種類のヒト化マウスを獲得した後、Ｆ１ヘテロ接合体マウスにインタークロスさせ、ＡＡＶウイルス注射のために、できるだけ早く十分な数のＦ２またはＦ３ホモ接合体のヒト化マウスを得た。

（３）マウス網膜下腔へのＡＡＶウイルス注射
ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ（ＳａＣａｓ９を提供）とＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒベクターをアデノ随伴ウイルスにパッケージし、ＣＹＰ４Ｖ２変異モデルマウスの網膜に注射し、設計されたｓｇＲＮＡとＤｏｎｏｒがインビボにおける編集と修復効率を検証した。ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３+ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒ１３を例にすると、具体的な工程は以下のとおりである。ｓｇＲＮＡ１７－１８のグループの実験方法についても同様である。

１）実験の設計
ａ）ブランクコントロールグループ：生理塩水。
ｂ)実験グループ：ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３（ＳａＣａｓ９を提供）とＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒ１３。

２）ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）血清型の選択
網膜への嗜好性がより良いＡＡＶ２／８血清型を選択した。

３）ウイルスパッケージング
ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒ１３、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３ベクターを、それぞれＡＡＶ２／８、ＡＡＶ－ｈｅｌｐｅｒで、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）にパッケージした。

４）マウスへの注射実験
２０匹のＣＹＰ４Ｖ２変異モデルマウスを取り、１グループ５匹で４つのグループに分けて実験を行った。

実験の計画は以下のとおりである。
ａ）ブランクコントロールグループ：マウスの片目あたりに２μＬの生理塩水を注射した。
ｂ）実験グループ：パッケージされたＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３とＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒ１３ウイルスを、１：１の割合で等量混合し、マウスの片目あたりに２μＬ（１Ｅ１０ｖｇ）注射した。
ｃ）一ヶ月後に治療効果を検査した。

実験の工程は以下のとおりである：
ａ）注射の３０分前に、１％アトロピンで散瞳し；麻醉前に再度の散瞳を行った。

ｂ）ケタミン８０ｍｇ／ｋｇとキシラジン８ｍｇ／ｋｇをマウスに腹腔内注射し、マウスを麻酔した後、マウスを眼科手術用顕微鏡の動物実験台の前に置き、マウスの眼に一滴の０．５%のプロパラカインを滴下し、局所麻酔を行った。１００：１の割合で、ＡＡＶウイルスにフルオレセインナトリウムの原液を加え、低速で遠心混合した。

ｃ）インスリン注射針でマウスの眼球球の毛様体平面部に小孔を予め刺し、その小孔にマイクロインジェクターの針を通し、マウスの眼球の硝子体腔に入り、そのとき、鏡下でマウスの眼球底がはっきり見えるように、マウスの眼球に適量の２％ヒドロキシメチルセルロースを滴下し、硝子体を避けながら、反対側の網膜周辺部に針を刺し、フルオレセインナトリウム含有のＡＡＶウイルスをゆっくりと押し出し、片目あたりの注射量は１μＬであり、フルオレセインナトリウムを指示薬として、網膜下腔へ注入したかどうかの判断をした。

ｄ）術後、マウスに異常がないか観察し、感染予防のためネオマイシン眼軟膏を投与した。

５)遺伝子編集療法の効果の評価
実験結果では、各実験グループの治療効果は基本的に一致しているため、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３とＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒ１３ウイルスグループを代表として、遺伝子編集療法の効果を説明する。

（４）ヒト化マウスにおけるＡＡＶ８- ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡの編集効率の評価
検証方法は、「実施例４中の(５)３Ｄ網膜組織を用いたインビトロでのｓｇＲＮＡ遺伝子の編集効率の検証」を参照する。

実験結果では、各実験グループの治療効果は基本的に一致しているため、ＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｓｇＲＮＡ１３とＡＡＶ-ＣＹＰ４Ｖ２-ｄｏｎｏｒ１３ウイルスグループを代表として、遺伝子編集療法の効果を説明する。

治療後のマウス機能改変をＥＲＧ（網膜電生理）により評価したところ、治療後、変異マウスモデルの網膜機能が改善された。

サンプルを切片した後、ＨＥ染色でマウス網膜の形態変化を観察したところ、野生型マウスの網膜状態に近い形態であった。

免疫蛍光染色により、遺伝子編集治療用ベクターが網膜の対応位置で発現しているかどうかを観察したところ、遺伝子編集治療用ベクターは網膜の対応位置で発現した。

網膜組織の形態変化を特殊な網膜Ｍａｒｋｅｒの一連の染色跡を通して観察したところ、治療後、マウスの網膜組織の形態が改善されていることが認められる。

最後に、以下の点に留意すべきである：上記の実施例は、本願の技術的思想を説明するために使用されただけであり、これを限定するものではない。前述した実施例を参照して本願を詳細に説明したものの、当業者なら本願発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、前述の実施例に記載の技術的思想を修正し、またはいくつかの技術的特徴を均等に置換することができることを、当業者は理解すると思われる。

Claims (22)

1. シトクロムＰ４５０ファミリー４サブファミリーＶポリペプチド２（ＣＹＰ４Ｖ２）遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡであって、ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流２００ｂｐ以内のヌクレオチド配列に特異的に結合する、前記ｇＲＮＡ。
2. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７８－８０、８２－８４のいずれかのヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載のｇＲＮＡ。
3. ５’－（Ｘ）ｎ－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７８－８０、８２－８４バックボーン配列－３’を含有し、ＸはＡ、Ｕ、ＣおよびＧから選択されるいずれかの塩基であり、かつｎは０－１５のいずれの整数である、請求項１から２のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
4. 前記ｇＲＮＡは一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１から３のいずれかに記載のｇＲＮＡ。
5. 請求項１から４のいずれかに記載のＣＹＰ４Ｖ２遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡをコードする、一種または複数種の単離された核酸分子。
6. ＣＹＰ４Ｖ２遺伝子ｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異部位の上流および／または下流８００ｂｐ以内の正常野生型のヌクレオチド配列を含有する、ドナー核酸分子。
7. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４-６６のいずれかのヌクレオチド配列を含有する、請求項６に記載の核酸分子。
8. 請求項５に記載の単離された核酸分子および／または請求項６から７のいずれかに記載のドナー核酸分子を含有する、ベクター。
9. 前記単離された核酸分子と前記ドナー核酸分子が同一ベクター上に存在する、請求項８に記載のベクター。
10. 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項８から９のいずれかに記載のベクター。
11. 請求項５に記載の単離された核酸分子、請求項６から７のいずれかに記載のドナー核酸分子および／または請求項８から１０のいずれかに記載のベクターを含有する、細胞。
12. 前記細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、腎上皮細胞および／または人工多能性幹細胞を含む、請求項１１に記載の細胞。
13. 前記細胞は、修飾により分化能を有する、請求項１１から１２のいずれかに記載の細胞。
14. 前記細胞は、３Ｄ－網膜オルガノイドに分化することができる、請求項１１から１３のいずれかに記載の細胞。
15. 請求項１から４のいずれかに記載のｇＲＮＡ、請求項５に記載の一種または複数種の単離された核酸分子、請求項６から７のいずれかに記載のドナー核酸分子、および／または請求項８から１０のいずれかに記載のベクター、および薬学的に許容される担体を含有する、医薬組成物。
16. 疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１から４のいずれかに記載のｇＲＮＡ、請求項５に記載の一種または複数種の単離された核酸分子、請求項６から７のいずれかに記載のドナー核酸分子、および／または請求項８から１０のいずれかに記載のベクターの使用であって、前記疾患はＣＹＰ４Ｖ２遺伝子におけるｃ.８０２-８_８１０ｄｅｌ１７ｂｐｉｎｓＧＣ変異による疾患を含む、前記使用。
17. 前記疾患はビエッティ結晶性ジストロフィーを含む、請求項１６に記載の使用。
18. 請求項１から４のいずれかに記載のｇＲＮＡ、請求項５に記載の一種または複数種の単離された核酸分子、請求項６から７のいずれかに記載のドナー核酸分子、および／または請求項８から１０のいずれかに記載のベクターを必要とする被験者に導入する工程を含む、ビエッティ結晶性ジストロフィーの治療方法。
19. 前記導入で正常な機能を有するＣＹＰ４Ｖ２タンパク質が獲得される、請求項１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記導入は注射を含む、請求項１８から１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記導入は網膜下注射を含む、請求項１８から２０のいずれかに記載の方法。
22. 細胞におけるＣＹＰ４Ｖ２遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞に請求項１から４のいずれかに記載のｇＲＮＡ、請求項５に記載の一種または複数種の単離された核酸分子、および／または請求項８から１０のいずれかに記載のベクターを導入することを含む、前記方法。