CN116745407A - 间充质干细胞、抗炎症剂及神经疾病治疗剂 - Google Patents

间充质干细胞、抗炎症剂及神经疾病治疗剂 Download PDF

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斯姆瑞蒂·阿瑞亚
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Abstract

本发明的目的在于，在上述那样的状况下，提供使用间充质干细胞的新颖的抗炎症剂及神经疾病治疗剂。本发明为一种间充质干细胞，其特征在于，高表达SIRT1。另外，还包括一种间充质干细胞，其特征在于，高表达BDNF。进而，包含这些的抗炎症剂及神经疾病治疗剂也包括在本发明中。

Description

间充质干细胞、抗炎症剂及神经疾病治疗剂
技术领域
本发明涉及间充质干细胞、抗炎症剂及神经疾病治疗剂。
背景技术
间充质干细胞是1982年由Friedenstein首次从骨髓分离出的具有多分化能力的祖细胞(参照非专利文献1)。已经明确的是间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种各样的组织中，间充质干细胞移植有望成为针对各种难治性疾病的新颖治疗方法。最近获知，在脂肪组织、胎盘、脐带、卵膜等的基质细胞中存在具有同等功能的细胞。因此，有时也将间充质干细胞称为基质细胞(Mesenchymal Stromal Cell，间充质基质细胞)。
再生医疗中，使用干细胞制品的临床研究正在各个领域中进行。在自体细胞及异体细胞的移植中，几乎没有发生安全问题的报道，安全性高是众所周知的。这些之中，使用间充质干细胞的临床试验也进行了很多，最近，关于大肠炎、心脏修复、急性肾损伤、缺血性脑卒中、ARDS(急性呼吸窘迫综合征)、重症下肢缺血及MS(多发性硬化)的临床试验以失败告终(非专利文献2)，从而逐渐获知间充质干细胞在有效性方面存在课题。因此，正在研究向间充质干细胞导入特定基因、细化培养条件、给予前的预先调整等。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Pittenger F.M.et al.Science，(1999)，284，pp.143-147
非专利文献2:Cell Stem Cell，(2015)，vol.17(1)，pp.11-22
发明内容
发明要解决的问题
在上述那样的状况下，本发明的目的在于，提供使用间充质干细胞的新颖的抗炎症剂及神经疾病治疗剂。
用于解决问题的方案
为了解决上述课题进行了深入研究，结果本发明人们发现，特征在于高表达SIRT1的间充质干细胞(mesenchymal stem(stromal)cell；MSC)对于炎症性疾病及神经疾病的治疗有效，从而完成了本发明。根据本发明，可以提供对于治疗炎症性疾病及神经疾病有效的治疗剂。即，本发明的主旨如以下所述。
[1]一种间充质干细胞，其特征在于，高表达SIRT1。
[2]一种间充质干细胞，其特征在于，高表达BDNF。
[3]根据[1]或[2]所述的间充质干细胞，其源自脐带组织。
[4]一种抗炎症剂，其含有[1]至[3]中任一项所述的间充质干细胞。
[5]一种神经疾病治疗剂，其含有[1]至[3]中任一项所述的间充质干细胞。
发明的效果
根据本发明，可以提供新颖的抗炎症剂及神经疾病治疗剂、以及新颖的炎症性疾病及神经疾病的治疗方法。
附图说明
图1为示出脐带来源间充质干细胞(Ctrl)及转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1)的SIRT1表达的图。
图2为示出脐带来源间充质干细胞(MSC组)或转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1MSC组)与THP1细胞的共培养所带来的、THP1细胞内TNFα基因表达抑制效果的图。
图3为示出脐带来源间充质干细胞(MSC组)或转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1MSC组)与THP1细胞的共培养所带来的、THP1细胞内TNFα基因表达抑制效果的图。
图4为脐带来源间充质干细胞(MSC组)或转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1MSC组)与THP1细胞的共培养所带来的、THP1细胞内TNFα浓度降低效果的图。
图5为示出将转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1MSC组)与THP1共培养时的上清中的TNFα浓度的图。
图6为示出脐带来源间充质干细胞(MSC组)或转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1MSC组)与THP1细胞的共培养所带来的、THP1细胞内TNFα基因表达抑制效果的比较的图。
图7为示出将脐带来源间充质干细胞(MSC组)或转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1MSC组)与THP1共培养时的上清中的BDNF浓度的图。横轴(h)表示转染后的时间。
图8为示出脂肪来源间充质干细胞(ADMSC组)或转染了SIRT1的脂肪来源间充质干细胞(SIRT1ADMSC组)与THP1细胞的共培养所带来的、THP1细胞内CD206基因表达的比较的图。
图9为示出在无血清培养基中培养的脐带来源间充质干细胞(Ctrl)及转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1)的转染24小时后的SIRT1表达的图。
图10为示出在无血清培养基中培养的脐带来源间充质干细胞(Ctrl)及转染了SIRT1的脐带来源间充质干细胞(SIRT1)的转染72小时后的SIRT1表达的图。
具体实施方式
以下对本发明的间充质干细胞、抗炎症剂及神经疾病治疗剂进行详细说明。
＜间充质干细胞＞
(SIRT1高表达间充质干细胞)
本发明的间充质干细胞的特征在于，高表达SIRT1(Sirtuin1、沉默信息调节因子1)。SIRT(Sirtuin，沉默信息调节因子)属于HDAC(组蛋白脱乙酰化酶)的类别III，是对蛋白的赖氨酸残基进行NAD+依赖性脱乙酰化的酶。已知人SIRT1在基因组的稳定性、DNA修复、p53介导凋亡的诱导、脂肪生成、老化等细胞的多种重要过程有关。
本发明中，SIRT1的来源为人、猴、猪、马、牛、兔、绵羊、山羊、猫、狗、豚鼠等哺乳类，其中，优选源自人、猴、小鼠，更优选源自人。
本发明的间充质干细胞的一个实施方式只要为与其它细胞相比高表达SIRT1的基因和/或蛋白的间充质干细胞即可，具体而言本发明的间充质干细胞与以往的间充质干细胞相比高表达SIRT1基因和/或蛋白即可，优选与以往的间充质干细胞相比SIRT1基因表达高10倍以上、优选高100倍以上、更优选高1000倍以上、进一步优选高5000倍以上即可。本发明的间充质干细胞与以往的间充质干细胞相比SIRT1蛋白表达高1.2倍以上、优选高1.5倍以上、更优选高2倍以上、进一步优选高5倍以上即可。在此，以往的间充质干细胞是指在以往的培养条件下(例如利用含有10％FBS的DMEM培养基的培养)得到的间充质干细胞。另外，本发明的间充质干细胞与其它细胞相比高表达SIRT1即可，例如本发明的间充质干细胞与人非小细胞肺癌细胞、人胎儿肺来源正常成纤维细胞或人小气道上皮细胞相比只要高表达SIRT1基因即可，优选地，与人非小细胞肺癌细胞、人胎儿肺来源正常成纤维细胞或人小气道上皮细胞相比高10倍以上、优选高100倍以上、更优选高1000倍以上即可。本发明的间充质干细胞与人非小细胞肺癌细胞、人胎儿肺来源正常成纤维细胞或人小气道上皮细胞相比SIRT1蛋白表达高1.2倍以上、优选高1.5倍以上、更优选高2倍以上、进一步优选高5倍以上即可。
本发明的间充质干细胞的一个实施方式为导入了SIRT1基因的间充质干细胞。本发明的间充质干细胞的特征在于，为通过从外部人工导入SIRT1基因并强制表达、从而变得高表达SIRT1的细胞。在此，SIRT1基因在间充质干细胞中可以是瞬时表达，也可以是稳定表达。
本发明中，导入间充质干细胞的SIRT1基因源自人、猴、猪、马、牛、兔、绵羊、山羊、猫、狗、豚鼠等哺乳类，其中优选源自人、猴、小鼠，更优选源自人。具体而言，可列举在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Infomation，NCBI)的基因数据库中作为SIRT1基因而登录的基因，例如，作为优选例子，可列举作为NM＿012238.4登录的人SIRT1基因。导入间充质干细胞的SIRT1基因可以具有在间充质干细胞中表达所需的启动子序列等。
作为向间充质干细胞导入SIRT1基因的方法，没有特别限制，例如可列举使用合成的mRNA的方法、使用载体的方法等。
作为将合成的mRNA导入间充质干细胞的方法，可以使用本领域技术人员公知的方法，例如可列举使用脂质体的方法(用于该方法的转染试剂有多种在销售)、电穿孔法等。
作为使用上述载体的方法中的载体，可以根据目的适宜选择，例如可列举病毒载体、非病毒载体等。作为上述病毒载体的具体例，可列举逆转录病毒载体、慢病毒载体等。作为上述非病毒载体的具体例，可列举质粒载体、附加型载体等。作为将载体导入间充质干细胞的方法，没有特别限制，可以根据目的适宜选择公知方法。
上述载体可以包含用于确认SIRT1基因的导入的标记物基因。上述标记物基因是指：通过将该标记物基因导入细胞而能够进行细胞的筛选、选择的基因。作为上述标记物基因的具体例，可列举药剂抗性基因、荧光蛋白基因、发光酶基因、显色酶基因等。这些可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
作为上述药剂抗性基因的具体例，可列举新霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、吉欧霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等。作为上述荧光蛋白基因的具体例，可列举绿色荧光蛋白(GFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)基因等。作为上述发光酶基因的具体例，可列举萤光素酶基因等。作为上述显色酶基因的具体例，可列举β半乳糖苷酶基因、β葡糖醛酸糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因等。
本发明的间充质干细胞的一个实施方式为通过在特定条件下培养等而增强了SIRT1基因和/或蛋白的表达的间充质干细胞。例如，通过进行用白藜芦醇等多酚诱导SIRT1的表达之类的、能够诱导SIRT1的表达的特定培养方法或利用特定培养基等的培养，也可以诱导间充质干细胞中的SIRT1的表达，取得SIRT1的表达高的间充质干细胞。另外，通过利用使用细胞分选器、磁珠等的免疫学方法对SIRT1基因和/或蛋白的表达得到增强的间充质干细胞进行选择性分离，可以取得SIRT1的表达更高的间充质干细胞。
(BDNF高表达间充质干细胞)
本发明的间充质干细胞的特征在于，高表达BDNF(brain-derived neurotrophicfactor，脑源性神经营养因子)。BDNF为脑源神经营养因子，为属于神经营养因子家族的神经营养因子。已经明确神经营养因子、特别是BDNF不仅沿着轴突逆行性输送，也沿着轴突顺行性输送，从神经末梢释放而对突触后细胞产生影响。
本发明中，BDNF的来源为人、猴、猪、马、牛、兔、绵羊、山羊、猫、狗、豚鼠等哺乳类，其中，优选源自人、猴、小鼠，更优选源自人。
本发明的间充质干细胞的一个实施方式只要为与其它细胞相比高表达BDNF的基因和/或蛋白的间充质干细胞即可，具体而言本发明的间充质干细胞与以往的间充质干细胞相比高表达BDNF的基因和/或蛋白即可，优选与通过以往的间充质干细胞得到的间充质干细胞相比BDNF基因表达高10倍以上、优选高100倍以上、更优选高1000倍以上、进一步优选高5000倍以上即可。另外，本发明的间充质干细胞与以往的间充质干细胞相比BDNF蛋白表达高1.1倍以上、更优选高1.2倍以上、进一步优选高1.5倍以上即可。在此，以往的间充质干细胞是指在以往的培养条件下(例如利用含有10％FBS的DMEM培养基的培养)得到的间充质干细胞。
本发明的间充质干细胞的一个实施方式为通过高表达SIRT1基因和/或蛋白、从而与其相关的BDNF基因和/或蛋白高表达的间充质干细胞。这样的间充质干细胞可以为从外部人工导入SIRT1基因且使其强制表达的细胞，也可以是通过以特定培养条件等进行培养而增强了SIRT1基因和/或蛋白的表达的细胞，还可以是原SIRT1基因和/或蛋白的表达得到增强的细胞。通过利用使用细胞分选器、磁珠等的免疫学方法对BDNF基因和/或蛋白的表达得到增强的间充质干细胞进行选择性分离，可以取得BDNF的表达更高的间充质干细胞。
本发明的间充质干细胞的一个实施方式为导入了BDNF基因的间充质干细胞。本发明的间充质干细胞的特征在于，为通过从外部人工导入BDNF基因并使其强制表达、从而变得高表达BDNF的细胞。在此，BDNF基因在间充质干细胞中可以是瞬时表达，也可以是稳定表达。需要说明的是，关于BDNF基因的导入方法，可以使用与上述的SIRT1基因的导入方法同样的方法。需要说明的是，本发明中，导入间充质干细胞的BDNF基因源自人、猴、猪、马、牛、兔、绵羊、山羊、猫、狗、豚鼠等哺乳类，其中优选源自人、猴、小鼠，更优选源自人。具体而言，可列举在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基因数据库中作为BDNF基因而登录的基因，例如，作为优选的例子，可列举作为NM＿170731而登录的人BDNF基因。
上述SIRT1的基因和/或蛋白的表达高的细胞也可以称为相关的LURAP1L、ACTA2、SQSTM1、COX4I1、PXN、RAC2、EFHD2、HMGA2、FOSL1、CD44、SPARC、SERPINH1、MTRNR2L8、HMGA1、FTH1或FTL的基因和/或蛋白高表达的细胞、或者这些的活性高的细胞。因此，本发明还包括LURAP1L、ACTA2、SQSTM1、COX4I1、PXN、RAC2、EFHD2、HMGA2、FOSL1、CD44、SPARC、SERPINH1、MTRNR2L8、HMGA1、FTH1或FTL的基因和/或蛋白高表达的间充质干细胞、或者这些的活性高的间充质干细胞。
关于LURAP1L、ACTA2、SQSTM1、COX4I1、PXN、RAC2、EFHD2、HMGA2、FOSL1、CD44、SPARC、SERPINH1、MTRNR2L8、HMGA1、FTH1或FTL的基因和/或蛋白高表达、或者这些的活性高，也可以与上述SIRT1、BDNF同样地规定，本发明的间充质干细胞只要与以往的间充质干细胞相比高表达LURAP1L、ACTA2、SQSTM1、COX4I1、PXN、RAC2、EFHD2、HMGA2、FOSL1、CD44、SPARC、SERPINH1、MTRNR2L8、HMGA1、FTH1或FTL的基因和/或蛋白、以及/或者LURAP1L、ACTA2、SQSTM1、COX4I1、PXN、RAC2、EFHD2、HMGA2、FOSL1、CD44、SPARC、SERPINH1、MTRNR2L8、HMGA1、FTH1或FTL蛋白为高活性即可。优选与以往的间充质干细胞相比高表达和/或活性亢进2倍以上。在此，以往的间充质干细胞是指在以往的培养条件下(例如利用含有10％FBS的DMEM培养基的培养)得到的间充质干细胞。
LURAP1L(leucine rich adaptor protein 1like，富含亮氨酸的衔接体蛋白1类似物)在胎盘、肺中表达，已知参与NFκB信号通路的控制。
ACTA2(α-smooth muscle actin，α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白)属于肌动蛋白家族。已知肌动蛋白是与各种细胞运动性相关的高度保守的蛋白，主要在血管平滑肌中表达。
SQSTM1(sequestosome1，螯合体1)已知为构成螯合体(sequestosome)的主要蛋白。
COXIV(COX-4、细胞色素C氧化酶的亚基IV)已知是作为人线粒体呼吸链酶之一的细胞色素C氧化酶(COX)，是由核基因组编码的亚基。
PXN(Paxillin，桩蛋白)为黏着斑(focal adhesion)基因之一，已知作为参与局部性的肌动蛋白膜对胞外基质的附着的细胞骨架成分而与多种结构分子及调节蛋白发生相互作用，并改变肌动蛋白的动力学。
RAC2(ras-related C3 botulinum toxin substrate 2，Ras相关的C3肉毒素底物2)为Rho家族，在细胞外信号的下游控制各种细胞功能。
EFHD2(EF-Hand Domain Family Member D2(EF手形蛋白结构域家族成员D2)、swiprosin-1)为2004年首次报道的较新的细胞内蛋白，与T细胞内信号有关，据说关系到B细胞的寿命。已知还为Canonical NFκB通路的负调节物。
HMGA2(High Mobility Group AT-Hook 2，高迁移率族AT Hook蛋白2)为与各种基因的表达调节有关的非组蛋白染色质蛋白，已知为癌基因。
FOSL1还作为FOS相关抗原1(FRA-1)而为人所知，已知为亮氨酸拉链(bZIP)转录因子，为Fos家族蛋白。
CD44为单次跨膜型糖蛋白，由4个功能性结构域构成，已知参与包括细胞凝集、细胞周围基质的保持、基质-细胞间的信号传递、受体介导的透明质酸的摄入/分解、细胞迁移等在内的各种细胞功能。
SPARC(Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)一般认为与细胞内-胞外基质(ECM)相互作用和肿瘤的癌变有关，已知SPARC基因编码与组织的发育、重建及纤维化有关的多功能糖蛋白。
SERPINH1(Serpin Family H Member 1，丝酶家族H成员1)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitors)的丝酶抑制蛋白(Serpin)超家族，其表达可被热休克(heat shock)诱导。SERPINH1蛋白局部存在于内质网内腔，与胶原蛋白结合。一般认为是与胶原蛋白分子的成熟有关的分子伴侣。
MTRNR2L8(MT-RNR2 Like Protein 8，MT-RNR2样蛋白8)属于护脑素(humanin)家族，已知作为神经保护及抗凋亡因子起作用。
HMGA1(High mobility group protein isoform I，高迁移率组蛋白亚型I)为非组蛋白染色质蛋白(non-histone chromatin proteins)，已知为结构性转录因子，可通过改变染色质结构、与转录因子相互作用而调节几种基因的转录。
FTH1(Ferritin Heavy Chain 1，铁蛋白重链1)编码细胞内主要储铁蛋白-铁蛋白的特有重链(Heavy Chain Subunit)，一般认为对各种组织内的铁摄取和释放的速度有影响。
FTL(Ferritin light chain，铁蛋白轻链)为铁代谢调节因子之一，已知在神经胶质瘤中过量表达。
本发明中，间充质干细胞是指：具有分化为属于间充质的一种以上细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)的分化能力，并能够在维持该能力的状态下增殖的细胞。本发明中使用的间充质干细胞的术语是指与基质细胞相同的细胞，不对两者进行特别区分。另外，还有时简记为间充质类细胞。作为包含间充质干细胞的组织，可列举例如：脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等。例如脂肪组织来源间充质干细胞是指脂肪组织中含有的间充质干细胞，还可称为脂肪组织来源基质细胞。其中，从对抗炎症治疗及神经疾病治疗的有效性的观点、获得容易性的观点等出发，优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、牙髄来源间充质干细胞，更优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞，最优选脐带来源间充质干细胞。
本发明中的间充质干细胞可以是与被处置的对象(被检体)为同种来源或异种来源。作为本发明中的间充质干细胞的种属，可列举出：人、马、牛、绵羊、猪、狗、猫、兔、小鼠、大鼠，优选为与被处置的对象(被检体)为同种来源细胞。本发明中的间充质干细胞可以源自被处置的对象(被检体)、即为自体细胞，或可以源自同种的其它对象、即为异体细胞。优选为异体细胞。
由于间充质干细胞对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此可以使用对预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存后的细胞，作为本发明的疾病治疗剂中的间充质干细胞。因此，与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比，商品化容易且容易稳定地得到一定效果，从这样的观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异体。
本发明中，间充质干细胞是指：包含间充质干细胞的任意的细胞群。该细胞群的至少20％以上，优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为间充质干细胞。
本发明中，脐带是连接胎儿和胎盘的白色的管状组织，由脐带静脉、脐带动脉、胶状组织(华顿氏胶；Wharton’s Jelly)、脐带基质本身等构成，富含间充质干细胞。脐带优选从与使用本发明的疾病治疗剂的被检体(给予对象)为同种的动物获得，考虑到将本发明的疾病治疗剂对人给予，更优选为人的脐带。
本发明中，脂肪组织是指：含有脂肪细胞和包含微血管细胞等的基质细胞的组织，例如，是将哺乳动物的皮下脂肪手术切除或吸取哺乳动物的皮下脂肪而得到的组织。脂肪组织可以由皮下脂肪获得。优选从与后述的脂肪组织来源间充质干细胞的给予对象为同种的动物获得，考虑到对人给予，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可以是存活或死亡的，但本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体采集的组织。从个体采集时，吸脂例如可示例出：PAL(动力辅助)吸脂、Erchonia激光吸脂或Body-jet吸脂等，从维持细胞的状态这样的观点出发，优选不使用超声波。
本发明中，骨髓是指填充骨的内腔的实质组织(parenchyma)，为造血器官。骨髓中存在骨髓液，将存在于其中的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞中除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外还包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞例如可以由人髂骨、长骨或其它骨采集。
本发明中，所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞之类的各组织来源间充质干细胞是指：分别包含脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞之类的各组织来源间充质干细胞的任意的细胞群。该细胞群的至少20％以上，优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞之类的各组织来源间充质干细胞。
本发明中的间充质干细胞除了SIRT1或BDNF的基因和/或蛋白的表达量高之外，例如还可以利用生长特征(例如，从传代至老化为止的群体的倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常的核型、母体系统或新生儿系统)、通过流式细胞仪(例如，FACS分析)进行的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、上述基因表达谱(例如，基因芯片阵列；逆转录PCR、实时PCR、传统型PCR等聚合酶链式反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝血解析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢组学解析)、本领域中已知的其它方法等进行表征。
(间充质干细胞的制备方法)
SIRT1的表达量高的本发明的间充质干细胞的制备方法没有特别限定，例如可以如以下那样制备。即，从脂肪、脐带、骨髄等组织中，按照本领域技术人员公知的方法来分离并培养间充质干细胞，导入SIRT1基因，由此可以取得SIRT1的表达量高的细胞。关于向间充质干细胞导入SIRT1基因的方法，可以适用“SIRT1高表达间充质干细胞”项中的说明。另外，也可以通过使用白藜芦醇等多酚等特定培养基的培养来取得SIRT1的表达量高的间充质干细胞。
在该通过基因导入或诱导而得到的细胞群中，优选细胞群的50％以上为SIRT1的表达量高的细胞，更优选70％以上为SIRT1的表达量高的细胞，进一步优选80％以上为SIRT1的表达量高的细胞，特别优选90％以上为SIRT1的表达量高的细胞，最优选实质上为SIRT1的表达量高的细胞的均一细胞群。以下具体说明SIRT1的表达量高的间充质干细胞的制备方法。
本发明的间充质干细胞在具有上述特性(SIRT1基因和/或蛋白的高表达等)的基础上，还可以定义为具有下述特性的细胞；
(1)在标准培养基中的培养条件下，对塑料显示出粘附性、
(2)表面抗原CD44、CD73、CD90为阳性，CD31、CD34、CD45为阴性、及
(3)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
[抗炎症剂及神经疾病治疗剂]
本发明的抗炎症剂及神经疾病治疗剂含有上述本发明的SIRT1高表达间充质干细胞和/或BDNF高表达间充质干细胞。根据本发明的抗炎症剂，可以预防、抑制或治疗炎症。另外，根据本发明的神经疾病治疗剂，可以预防、抑制或治疗神经疾病。关于本发明的抗炎症剂及神经疾病治疗剂所含有的间充质干细胞，可以应用上述间充质干细胞项的说明。
本发明的抗炎症剂及神经疾病治疗剂对对象的给予途径可列举：经口给予、皮下给予、肌肉内给予、静脉内给予、动脉内给予、脐带静脉内给予、脑室内给予、髄腔内给予、腹腔内给予、舌下给予、经直肠给予、经阴道给予、眼内给予、经鼻给予、吸入、经皮给予、埋入、向器官表面的喷雾及通过粘贴片状物等进行的直接给予等，从本发明的抗炎症剂的有效性的观点出发，优选为动脉内给予、静脉内给予及脑室内给予，从减轻对象者的负担的观点出发，更优选为静脉内给予、肌肉内给予、鼻腔内给予。
就本发明的抗炎症剂及神经疾病治疗剂而言，其用量(给予量)可以根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)及本发明的抗炎症剂及神经疾病治疗剂的剂型等而不同，从发挥充分的抗炎症剂及神经疾病治疗剂的治疗效果的观点出发，有优选其量较多的倾向，另一方面，从抑制副作用的出现的观点出发，有优选其量较少的倾向。通常，在对成人给予时，以细胞数计，为1×103～1×1012个/次，优选为1×104～1×1011个/次，更优选为1×105～1×1010个/次、进一步优选为5×106～1×109个/次。另外，以患者的单位体重的给予量计，为1×10～5×1010个/kg，优选为1×102～5×109个/kg，更优选为1×103～5×108个/kg、进一步优选为1×104～5×107个/kg。对新生儿给予时，以细胞数计，为1×103～1×1011个/次，优选为1×104～1×1010个/次，更优选为1×105～1×109个/次、进一步优选为5×105～5×108个/次。另外，以患者的单位体重的给予量计，为1×10～5×1010个/kg，优选为1×102～5×109个/kg，更优选为1×103～5×108个/kg，进一步优选为1×104～5×107个/kg。需要说明的是，可以将本用量作为1次量而进行多次给予，还可以将本用量分成多次来给予。
本发明的抗炎症剂及神经疾病治疗剂可以与一或两种以上其它药剂一起给予。作为其它药剂，可列举可以作为抗炎症剂或及神经疾病治疗剂使用的任意药剂。
本发明的间充质干细胞可以用于各种炎症性疾病，作为具体的疾病，可列举软骨分解、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎、骨关节炎、痛风、银屑病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、充血性心力衰竭、脑卒中、主动脉瓣狭窄、肾功能衰竭、狼疮、胰腺炎、过敏、纤维化、贫血、动脉粥样硬化、再狭窄、化疗/放射相关并发症、Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、自身免疫性肝炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、暴发性肝炎、乳糜泻、非特异性结肠炎、克罗恩病、过敏性结膜炎、糖尿病性视网膜病变、干燥综合征、葡萄膜炎过敏性鼻炎、哮喘、石棉病、矽肺、慢性阻塞性肺病、慢性肉芽肿性炎症、囊性纤维化、结节病、肾小球肾炎、脉管炎、皮炎、HIV相关恶病质、脑型疟疾、强直性脊柱炎、麻风病、COPD、肺纤维化、纤维肌痛、食管癌、胃食管反流病、巴雷特食管等。
本发明的间充质干细胞可以用于各种神经疾病，作为具体疾病，可列举自主神经紊乱、霍尔内尔综合征、多系统萎缩症、纯植物神经功能衰竭等植物神经系统紊乱、慢性疼痛、神经病理性疼痛、复合性局部疼痛综合征等疼痛、缺血性脑卒中、短暂性脑缺血发作、颅内出血、蛛网膜下腔出血等脑卒中(脑血管意外)、阿尔茨海默病、脑血管性痴呆、路易体型痴呆、HIV相关痴呆、额颞痴呆等痴呆、痉挛性综合征、手足徐动症或运动障碍综合征(dyskinesia syndrome)以及失调性综合征等脑瘫综合征、蛛网膜下腔出血、脑内出血、脑室内出血等颅内出血、缺氧-缺血、缺血性卒中、低血糖、高钠血症、低钠血症、低镁血症、先天代谢异常等引起的新生儿痉挛性疾病、多发性硬化等脱髓鞘性疾病、吉兰-巴雷综合征、遗传性神经病、包括肌萎缩侧索硬化(ALS)在内的运动神经元疾病、重症肌无力、单神经病、多发神经病、神经丛障碍等外周神经系统障碍、急性横贯性脊髓炎、动静脉畸形、脊髓梗塞(缺血性脊髓障碍)等脊髓障碍、脊髓小脑共济失调、脊髓小脑变性等小脑疾病、脑肿瘤、脑炎、脑膜炎、帕金森病等。另外，也可用于以新生儿为对象的围产期脑损害、新生儿脑病及脑瘫等。
本发明还包括特征在于使用上述SIRT1的表达高的间充质干细胞的炎症性疾病或神经疾病的治疗方法。另外，本发明还包括特征在于使用上述BDNF的表达高的间充质干细胞的炎症性疾病或神经疾病的治疗方法。本发明的治疗方法还可以称为特征在于使用上述本发明的抗炎症剂和/或神经疾病治疗剂的方法。需要说明的是，关于各表述的说明，可以适用上述间充质干细胞、抗炎症剂及神经疾病治疗剂中的说明。
实施例
以下列举实施例及试验例详细地说明本发明，但是本发明不受这些实施例等限定。
[试验1：SIRT1对脐带来源间充质干细胞的转染1]
将脐带来源间充质干细胞(Promocell公司)以15000个细胞/cm2播种于培养容器。24～48小时后，确认细胞为70-90％汇合状态，转染SIRT1的mRNA。具体而言，将mRNA用Optimem培养基(赛默飞世尔公司制)稀释，加入转染试剂(Mirus公司制、Trans-IT(注册商标)脂质体(liposome))，用移液管轻柔地搅拌后，从管的外侧施加振动而进行混合，由此制作mRNA-脂质体复合体。在室温下静置2-5分钟而使其稳定化后，向播种了培养细胞的容器中整体性地每次少量地滴加。之后在37℃下培养24～72小时。SIRT1基因表达使用序列号1及2的引物组通过PCR进行了确认。
[试验2：脐带来源间充质干细胞中的SIRT1表达量的测定]
利用RIPA缓冲液(赛默飞世尔公司、89900)将转染了SIRT1的mRNA的细胞溶解。对得到的细胞溶解物进行电泳(SDS-PAGE法)后，经凝胶上的蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上。之后用1％BSA溶液封闭1小时后，在SIRT1抗体(Abcam公司、ab104833)的1：500稀释液中在室温下浸渍1小时。需要说明的是，SDS-PAGE及印迹中使用了赛默飞世尔公司的试剂盒(NW04120)。将膜用TBST清洗后，使二抗(Abcam公司、ab150113)的1：2000稀释液反应1小时。反应后，对膜进行清洗，通过Chemidoc imager(BioRad公司)上的图像对SIRT1的表达量进行确认(图1)。需要说明的是，将未进行转染的脐带来源间充质干细胞作为对照(Ctrl)，示出转染后24小时及72小时的表达量(图1)。另外，对于作为内标的β微管蛋白，使用罗丹明结合抗体(BioRad公司、12004166)。
[试验3：脐带来源间充质干细胞的抗炎症效果的研究1]
将作为人来源单核细胞的THP1(以下称为“THP1”)以30000个细胞/cm2播种于12孔板，以100nM添加佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(Phorbol12-myristate 13-acetate、以下称为“PMA”、制品编号162-23591、富士胶片和光纯药株式会社)，培养4天。脐带来源间充质干细胞(以下称为“МSC”)及转染了SIRT1的mRNA的脐带来源间充质干细胞(以下称为“SIRT1МSC”)在共培养的前一天以40000个细胞/cm2播种于0.4μm Transwell插件上，进行培养。共培养开始时，向THP1及МSC的孔中添加1ug/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide、以下称为“LPS”、InvivoGen公司制、制品编号14874-24)，将播种了МSC的Trans孔设置于播种了THP1的孔上，共培养3天(37℃、2％CO2)。之后回收THP1细胞溶解物(细胞裂解物、celllysate)，使用Quantstudio1(赛默飞世尔公司)通过qRT-PCR对TNFα基因的表达进行定量。此时，使用序列号3及4的引物组。
与无LPS刺激(未处理组)相比，有LPS刺激(LPS组)时TNFα基因表达上调，通过与МSC的共培养而抑制其表达(МSC组)。通过与SIRT1МSC的共培养，其表达被进一步抑制(SIRT1МSC组)(图2)。由此可知，МSC对炎症有效，特别地，高表达SIRT1的МSC具有优异的抗炎症效果。需要说明的是，SIRT1МSC使用了在通过试验1的项中记载的方法制作后按照常规方法保存的细胞。具体而言，将解冻并在培养瓶中预培养3或4天的细胞回收，播种于Trans孔而使用。
[试验4：脐带来源间充质干细胞的抗炎症效果的研究2]
将THP1以30000个细胞/cm2播种于12孔板，添加200nM的PMA，培养4天。МSC及SIRT1МSC在共培养的前一天以40000个细胞/cm2播种于0.4μmTranswell插件上，进行培养。共培养开始时，向THP1及МSC的孔中添加1μg/mL的LPS，将播种了МSC的Trans孔设置于播种了THP1的孔上，共培养2天(37℃，2％CO2)。之后回收THP1细胞溶解物，与上述同样地利用qRT-PCR对TNFα基因的表达进行定量。另外，将培养上清以400×G离心分离5分钟后，通过ELISA测定上清中的TNFα浓度。需要说明的是，SIRT1МSC使用了在通过试验1的项中记载的方法制作后按照常规方法保存的细胞。具体而言，将解冻并在培养瓶中预培养3或4天的细胞回收，播种于Trans孔而使用。
与无LPS刺激(未处理组)相比，有LPS刺激(LPS组)时TNFα基因表达上调，通过与МSC的共培养其表达被抑制(МSC组)。通过与SIRT1МSC的共培养，其表达被进一步抑制(SIRT1МSC组)(图3)。另外，TNFα浓度与未处理组相比也由于LPS刺激而提高(LPS组)，通过与МSC(МSC组)或SIRT1МSC(SIRT1МSC组)的共培养而受到抑制，与МSC组相比，SIRT1МSC的抑制效果高(图4)。与试验3同样地，可以确认МSC对炎症有效，特别地，高表达SIRT1的МSC具有优异的抗炎症效果。
[试验5：脐带来源间充质干细胞的抗炎症效果的研究3]
将THP1以30000个细胞/cm2播种于12孔板，添加100nM PMA，培养4天。МSC及SIRT1МSC在共培养的前一天以40000个细胞/cm2播种于0.4μmTranswell插件上，进行培养。共培养开始时，向THP1及МSC的孔中添加1μg/mL的LPS而进行LPS刺激，将播种了МSC的Trans孔设置于播种了THP1的孔上，共培养2天(37℃、2％CO2)。之后去除Trans孔，将THP1更换为不含LPS的培养基，在THP1本身中进一步培养1天。将培养上清以400×G离心分离5分钟后，通过ELISA测定上清中的TNFα浓度。TNFα浓度通过与SIRT1МSC的共培养而下降(图5)。由以上可知，高表达SIRT1的МSC具有优异的抗炎症效果。需要说明的是，SIRT1МSC使用按照试验1记载的方法制作后通过常规方法冷冻保存的细胞。具体而言，将解冻并在培养瓶中预培养3或4天的细胞回收，播种于Trans孔而使用。
[试验6：脐带来源间充质干细胞的抗炎症效果的研究4]
将THP1以30000个细胞/cm2播种于12孔板，添加200nM PMA，培养4天。МSC及SIRT1МSC在共培养的前一天以40000个细胞/cm2播种于0.4μmTranswell插件上，进行培养。共培养开始时，向THP1及МSC的孔中添加1μg/mL的LPS而进行LPS刺激，将播种了МSC的Trans孔设置于播种了THP1的孔上，共培养2天(37℃、2％CO2)。之后去除Trans孔，将THP1更换为不含LPS的培养基，在THP1本身中进一步培养1天。之后回收THP1细胞溶解物，与上述试验3同样地通过qRT-PCR对TNFα基因的表达进行定量。与无LPS刺激(未处理组)相比，有LPS刺激(LPS组)时TNFα基因表达上调，通过与МSC的共培养其表达被抑制(МSC组)。通过与SIRT1МSC的共培养，其表达被进一步抑制(SIRT1МSC组)(图6)。与试验3同样地，可知МSC对炎症有效，特别地，高表达SIRT1的МSC具有优异的抗炎症效果。需要说明的是，SIRT1МSC使用按照试验1记载的方法制作后通过常规方法冷冻保存的细胞。具体而言，将解冻并在培养瓶中预培养3或4天的细胞回收，播种于Trans孔而使用。
[试验7：脐带来源间充质干细胞中的BDNF表达量的比较]
将脐带来源间充质干细胞(МSC)及转染了SIRT1的mRNA的脐带来源间充质干细胞(SIRT1МSC)分别以5000个细胞/cm2播种于6孔板(Corning，#3335)，用10％FBS DMEM培养基(Sigma，#D5796)培养24小时、48小时及72小时。培养后，将培养上清以400×G离心分离5分钟后，通过ELISA测定上清中的BDNF(Brain-derived neurotrophic factor；脑源神经营养因子)浓度。可知SIRT1МSC(S)与МSC(М)相比BDNF高表达(图7)。SIRT1МSC中的BDNF浓度相对于МSC而言，培养24小时后为4.45倍，培养48小时后为6.30倍，培养72小时后为7.81倍。另外，通过qRT-PCR对BDNF基因的表达进行定量的结果是，培养72小时后，SIRT1МSC中的BDNF的表达相对于МSC为1.54倍。需要说明的是，qRT-PCR中使用了序列号5及6的引物组。
BDNF作用于中枢神经系统、末梢神经系统的一部分神经元，是促进神经元的维持、生长、分化的因子(Nature 374(6521)：450-3)，还已知对长期记忆很重要(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(7)：2711-6)。可认为，BDNF的表达量增加的SIRT1МSC对中枢神经系统、末梢神经系统的疾病治疗、特别是预期可通过神经元的维持、生长、分化而得到改善的神经疾病的治疗有效。另外，由该实验结果可以说，优选将转染后培养24小时～72小时的细胞用于用来治疗疾病的给予。
[试验8：SIRT1mRNA对脂肪来源间充质干细胞的转染]
将脂肪来源间充质干细胞(Promocell公司)以15000个细胞/cm2播种于培养容器。24～48小时后，确认细胞为70-90％的汇合状态，与试验1同样地转染SIRT1的mRNA。另外，与试验2同样地进行研究，确认脂肪来源间充质干细胞表达SIRT1。
[试验9：与表达SIRT1的脂肪来源间充质干细胞的共培养所带来的、THP1的基因表达的变化]
将THP1以30000个细胞/cm2播种于12孔板，添加200nM的PMA，培养4天。脂肪来源间充质干细胞(以下称为“ADМSC”)及转染了SIRT1的mRNA的脂肪来源间充质干细胞(以下称为“SIRT1ADМSC”)在共培养的前一天以40000个细胞/cm2播种在0.4μmTranswell插件上，进行培养。共培养开始时，向THP1及ADМSC的孔中添加1μg/mL的LPS而进行LPS刺激，将播种了ADМSC的Trans孔设置于播种了THP1的孔上，共培养2天(37℃，2％CO2)。之后回收THP1细胞溶解物，通过qRT-PCR对CD206基因的表达进行定量。此时，使用序列号7及8的引物组。
与无LPS刺激(未处理组)相比，有LPS刺激(LPS组)使CD206基因表达上调。相较于与ADМSC的共培养(ADМSC组)，与SIRT1ADМSC的共培养(SIRT1ADМSC组)中其表达增加(图8)。可知在与高表达SIRT1的ADМSC的共培养中THP1的CD206基因的表达增加。需要说明的是，SIRT1МSC使用按照试验1记载的方法制作后通过常规方法冷冻保存的细胞。具体而言，将解冻并在培养瓶中预培养3或4天的细胞回收，播种于Trans孔而使用。
CD206也称为巨噬细胞甘露糖受体(MMR)，是具有多凝集素受体结构的分子量175kDa的I型单链跨膜糖蛋白，已知是具有抗炎症功能的M2巨噬细胞的标记物之一。通过与高表达SIRT1的ADМSC的共培养、从而THP1的CD206基因的表达增加的上述结果表明，高表达SIRT1的ADМSC可能是通过将组织的巨噬细胞分化诱导为具有抗炎症功能的M2巨噬细胞而间接发挥抗炎症效果的。
[试验10：各种细胞中的SIRT1表达量的比较]
将脐带来源间充质干细胞(МSC、Promocell公司)、与试验1同样转染了SIRT1的mRNA的脐带来源间充质干细胞(SIRT1МSC、Promocell公司)、人非小细胞肺癌细胞(A549、由美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection)获得)、人胎儿肺来源正常成纤维细胞(MRC-5、由美国模式培养物集存库获得)及人小气道上皮细胞(SAEC、lonza公司)各细胞培养至80％汇合，回收各细胞的总RNA，通过定量PCR确认SIRT1的mRNA表达。需要说明的是，MSC及SIRT1MSC使用GM2培养基(Promocell公司)，A549及MRC-5使用包含10％FBS的DMEM培养基，SAEC使用lonza公司的推荐培养基，以各细胞的推荐播种密度进行播种、培养。另外，定量PCR中，使用试验1中记载的序列号1及2的引物组。将设MSC的SIRT1的mRNA表达量为1时的各细胞的SIRT1的mRNA表达量示于表1。
[表1]
相对值
MSC 1.0
SIRT1MSC 38000
A549 0.97
MRC-5 0.87
SAEC 0.60
[试验11：无血清培养基培养MSC的SIRT1导入和其表达量的测定]
将用无血清培养基(乐敦公司制)培养而得的脐带来源间充质干细胞(Promocell公司)取出2.5×105个细胞，在悬浮液的状态下通过电穿孔法转染SIRT1mRNA(赛默飞世尔公司制)。之后播种于6孔板，在37℃下培养24～72小时后确认SIRT1基因表达。SIRT1基因表达使用序列号1及2的引物组通过PCR来确认。将结果示于图9(培养24小时后)及10(培养72小时后)。需要说明的是，图中，Ctrl表示无电穿孔的对照(无mRNA)，E表示有电穿孔的对照(无mRNA)，EGFP表示用电穿孔法导入了GFP mRNA的样品，SIRT1表示用电穿孔法导入了SIRT1 mRNA的样品。
如图9及图10所示，通过电穿孔法转染SIRT1mRNA后培养了24小时的细胞、培养了72小时的细胞中，可以确认到SIRT1基因表达。如上所述，明确了通过对无血清培养基培养MSC使用电穿孔法，能够适宜地导入SIRT1mRNA。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供抗炎症剂及神经疾病治疗剂。
序列表
<110> 日本乐敦制药株式会社（ROHTO Pharmaceutical Co.,Ltd.）
<120> 间充质干细胞、抗炎症剂及神经疾病治疗剂
<130> 80-039-0116_FP4733PCT-W
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 1
agaacccatg gaggatgaaa g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 2
tcatctccat cagtcccaaa tc 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 3
cctctctccc ctggaaagga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 4
agaggctgag gaacaagcac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 5
tttctcgtga cagcatgagc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 6
gacatgcagt gtttgcccc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 7
ccatcgagga agaggttcgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 8
ggtgggttac tccttctgcc 20

Claims (5)

1.一种间充质干细胞，其特征在于，高表达SIRT1。
2.一种间充质干细胞，其特征在于，高表达BDNF。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞，其源自脐带组织。
4.一种抗炎症剂，其含有权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞。
5.一种神经疾病治疗剂，其含有权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞。
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